Физико-химические свойства и регуляция экспрессии изоферментов изоцитратлиазы в разных органах кукурузы

Дьяченко, Екатерина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физико-химические свойства и регуляция экспрессии изоферментов изоцитратлиазы в разных органах кукурузы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические свойства и регуляция экспрессии изоферментов изоцитратлиазы в разных органах кукурузы"

На правах рукописи

Дьяченко Екатерина Владимировна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ИЗОФЕРМЕНТОВ ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ В РАЗНЫХ ОРГАНАХ КУКУРУЗЫ

Специальность 03.00.04. — биохимия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук.

Вороне).

003481373

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Корнеева Ольга Сергеевна кандидат биологических наук Парфёнова Наталья Владимировна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

«Институт фундаментальных проблем биологии РАН»

Защита состоится 20 ноября 2009 года в 1330 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 59

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет».

Автореферат разослан октября 2009 года.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Доктор биологических наук, профессор

Грабович М.Ю.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последнее время изоцитратлиаза (ИЦЛ; КФ 4.1.3.1) является объектом значительного количества исследований, что обусловлено её полифункциональностью. Большинство исследователей, по-прежнему, считают ИЦЛ маркерным ферментом глиоксилатного цикла — важнейшего этапа глюконеогенеза, обеспечивающего синтез углеводов [Епринцев А.Т. и др., 2007, Chen Z. et. al., 2000]. Но несмотря на то, что ИЦЛ является преимущественно глиоксисомальным ферментом и участвует главным образом в глиоксилатном цикле (ГЦ), появились сведения и о наличии второй формы фермента [Deikin G.,2007, Luttik А. Н. et. al., 2000]. Ранее, в зелёных листьях растений была обнаружена внеглиоксисомальная изоформа фермента, существенно отличающаяся от глиоксисомальной изоцитратлиазы жирозапасающих тканей. Локализация этой формы не связана с глиоксисомами и по её внутриклеточному распределению нет чёткой ясности. Вопрос о функциональной значимости второй внеглиоксисомальной изоцитратлиазы так же остаётся дискуссионным, и есть сообщения о её участии в превращении глиоксилата, образующегося при фотодыхании в пероксисомах [Игамбердиев А.У. и др., 1986, Schloss J.Y. et. al., 1982]. Однако, для щитков кукурузы, являющихся метаболически наиболее активной частью семени, была выделена только одна форма ИЦЛ, обеспечивающая функционирование ГЦ [Игамбердиев А.У. и др., 1987, Khan et al., 1992].

В настоящее время появились сообщения по исследованию изоферментного состава изоцитратлиазы в различных организмах. Современные молекулярно-биологические методы позволили в некоторых растениях идентифицировать несколько генов, кодирующих этот ферментный комплекс, состоящий из двух изоферментов, которые выполняют различные функции [Deikin G., 2007].

В последнее время упоминается о разнообразии функций целого суперсемейства изоцитратлиазы (ИЦЛ)/фосфоенолпируват мутазы (ФЕПМ), в состав которого входят семь энзимов, катализирующих образование или расщепление С-С или Р-С связей, в том числе и ИЦЛ [Lu Z. et. al., 2005].

Обзор литературы показал, что в разных организмах содержатся как минимум 2 гена, кодирующих изоцитратлиазу. Так, в геноме Saccharomyces cerevisiae ген /с/1, расположенный в хромосоме 5, кодирует ключевой фермент ГЦ, который отвечает за образование сукцината и глиоксилата из изоцитрата [Fernandez Е., 1992]. Продукт гена /с/2, локализованного в хромосоме 16, находится в митохондриальном матриксе, и обеспечивает работу метилцитратного цикла, катализируя конверсию 2-метилизоцитрата в сукцинат и глиоксилат [Luttik А. Н. et. al., 2000]. В геномах таких растений как Pinns taeda, Arabidopsis thaliana, Glycine max. L. так же обнаружено два гена, кодирующих изоцитратлиазу, которые расположены в разных хромосомах (Yvww.ncbi.nlm.nih.gov/GenbankA Причём мРНК изоцитратлиазы накапливается как во время эмбриогенеза, так и в последующие этапы г ;,/

развитая растительного организма [Zhang J.Z. et. al., 1993, Yuko A. et. al., 2008].

Кукуруза, являющаяся типичным представителем С-4 типа растений, характеризуется сложным сочетанием энергетического и конструктивного обменов. Внутриклеточная локализация изоформ изоцитратлиазы и механизм их метаболической и генетической регуляции в Zea mays L слабо изучены, и поэтому она служит оптимальным объектом исследования роли отдельных изоферментов на разных этапах её онтогенеза.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы являлось исследование физико-химических, регуляторных, кинетических характеристик изоферментов изоцитратлиазы, выделенных из разных органов Zea mays L., и установление их генетической детерминированности и функциональной значимости.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить динамику активности, изоферментный состав и субклеточную локализацию изоцитратлиазы в разных органах Zea mays L в процессе онтогенеза;

2. Получить в гомогенном состоянии препараты изоферментов изоцитратлиазы из щитков и зелёных листьев кукурузы;

3. Исследовать физико-химические свойства полученных в электрофоретически гомогенном состоянии препаратов изоформ ИЦЛ из различных органов кукурузы;

4. Сравнить кинетические и регуляторные характеристики изоферментов изоцитратлиазы;

5. Разработать высокоспецифичные праймеры для идентификации генов ИЦЛ на основе сравнения аминокислотных последовательностей изоцитратлиазы из различных организмов;

6. Провести ОТ-ПЦР анализ мРНК из щитков и листьев кукурузы для идентификации генов, кодирующих изоферменты изоцитратлиазы;

7. Секвенировать участки генов изоферментов изоцитратлиазы из Zea mays L;

8. Провести количественный анализ уровня экспрессии генов изоцитратлиазы в кукурузе на разных этапах онтогенеза методом ПЦР в реальном времени.

Научная новизна. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о способах переключения метаболических потоков в растительной клетке, с помощью изоферментов, обеспечивая растительному организму нормальное развитие.

Изоферментный состав изоцитратлиазы в кукурузе представлен двумя формами исследуемого фермента, имеющими различную электрофоретическую подвижность и специфическую субклеточную локализацию. При функциональном переходе растительного метаболизма от утилизации запасных веществ к фотосинтезу выявлена индукция образования второй изоформы исследуемого фермента.

Получение гомогенных препаратов изоформ изоцитратлиазы из зелёных листьев (ИЦЛ) и из щитков — ИЦЛ1 (глиоксисомальной) и ИЦЛ2

(внеглиоксисомалыюй) позволило исследовать их физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики. Сравнительный анализ свойств выделенных изоформ указывает на значительное сходство по большинству характеристик (Rf, четвертичной структуре, рН^, сродству к субстрату, активации ионами и др.) ИЦЛ2 из щитков с ИЦЛ из зелёных листьев кукурузы.

Подбор праймеров для ИЦЛ, осуществленный нами на основе сравнения аминокислотных последовательностей изоцитратлиазы из различных организмов, а так же секвенирование полученных в ходе ПЦР продуктов, показали, что выделенные после очистки изоформы изоцитратлиазы имеют различную генетическую детерминированность, т.е. являются изоферментами, обладающими различной функциональной значимостью. Нуклеотидная последовательность ампликона /с/1 высокогомологична участку гена /с/1 ZMU69129, кодирующего изоцитратлиазу. Вторая нуклеотидная последовательность /с/2 имеет 100%-ю гомологию с участком гена LOC100277287, кодирующим целое семейство изоцитратлиаз (ИЦЛ)/фосфоенолпируват мутаз (ФЕПМ).

Практическая значимость. Гомогенные препараты изоцитратлиазы находят широкое применение в исследовательской практике, являясь удобным объектом для изучения структуры активных центров лиаз, регуляции ферментативной активности и решения других важных задач энзимологии и молекулярной биологии. Высокоочищенные изоферменты ИЦЛ могут быть использованы для количественного определения изоцитрата в клеточном соке растительных и животных клеток. Изоцитратлиаза может использоваться и в гомогенном иммуноферментном анализе в качестве фермента-маркера, который индуцируется в тканях при экстремальных и патологических состояниях [Попов В.Н. и др., 2000]. Известно о применении в биотехнологических целях носителя с иммобилизованной изоцитратлиазой и изоцитратдегидрогеназой для мониторинга содержания сукцината в непрерывно размешиваемых реакторах [Sohn O.J., 2005].

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по «Физиологии растений», «Биохимии», в спецкурсах «Дыхание растений», «Фотосинтез», «Метаболизм органических кислот», а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 11-ой и 12-ой международных Пущинских конференциях молодых учёных «Биология — наука 21-ого века» (Пущино, 2007, 2008), международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), 3-й международной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (Белгород, 2008); межрегиональных конференциях, посвященных памяти A.A. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2007, 2008, 2009), ежегодных научных

сессиях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2008,2009).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях- 7 статьях и 5 тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (181 источников). Иллюстрационный материал включает 41 рисунок и 6 таблиц.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве объектов исследования использовали различные органы (щитки, зелёные листья, корни) проростков кукурузы (Zea mays L., сорт Воронежская 76), выращенных гидропонным способом, при t = 25°С, с интенсивностью света 25 Ватг/м2.

Определение активности фермента. Активность изоцитратлиазы измеряли спектрофотометрически на СФ - T70+UV-VIS «PG Instruments Ltd» (Англия), по изменению поглощения света при длине волны 324 нм, за счёт образования комплекса фенилгидразина с глиоксилатом [Kornberg, Н. L., 1957].

Определение количества белка. Определение общего количества белка проводили по методу Lowry с совт. [Lowry О.Н. et. al., 1951].

Исследование субклеточной локализации. Исследование субклеточной локализации изоцитратлиазы в щитках кукурузы проводили с помощью дифференциального центрифугирования на центрифуге Eppendorf 5810R (Германия) [Волвенкин С. В., 1999] и изоплотностного центрифугирования, осуществлённого на центрифуге Beckman (США), в градиенте плотности сахарозы [Schnarrenberger С., 1971, Popov V.N., 1998].

Выделение и очистка изоферментов. Для получения высокоочищенных препаратов изоцитратлиазы была использована специальная схема очистки, включающая получение экстракта фермента, гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-25, ионообменную хроматографию на колонке с ДЭАЭ - целлюлозой.

Аналитический электрофорез. Электрофоретические исследования проводили по методу Девиса [Davis В. J., 1964]. Универсальное окрашивание белков осуществляли, используя методику с нитратом серебра [Shevchenko А., 1996]. Специфическую идентификацию фермента выявляли с помощью модифицированного реагента Шиффа [Reeves Н.С., 1972].

Экстракция суммарной РНК. Суммарную РНК выделяли из исследуемого объекта с помощью гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформного метода [Herrington C.S., 1992]

Обратная транскрипция. Проводили с помощью обратной транскриптазы M-MulV ("Fermentas", Литва) согласно с использованием олиго-dT праймера [Okayama Н., 1987].

Подбор праймеров. Осуществляли на основе сравнения аминокислотных последовательностей изоцитратлиазы из разных

организмов. Поиск гомологичных последовательностей в геномах нематоды, прокариот, грибов и растений используя базу данных NCBI (США, http://wvwv.ncbi.nlm.nih.gov/). Для этого проводили выравнивание последовательностей с помощью программы AliBee (http://wwvv.genebee.msu.su/services/malign reduced.html) с целью выявления наиболее консервативных участков. Подобранные на основе аминокислотных последовательностей праймеры проверяли на наличие образование димеров и вторичных структур с помощью программы FAST PCR.

Проведение иолимеразной депной реакдии. Последующую полимеразную цепную реакцию [Епринцев А.Т., 2001, Mullís К.В., 1987] с ген-специфичными вырожденными праймерами проводили с помощью набора реактивов AmpliSence (Хеликон, Россия).

Для ПЦР анализа использовали праймеры: прямой - 5'-TGYGGNCAYATGGGNGG-3'; обратный - 5-DCTRCARTTRTANGC-3'. Температура отжига праймеров кукурузы составляла 49°С. Реакция ПЦР проводилась на приборе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) и Biometra Personal Cycler (Biometra, Германия) со следующими параметрами амплификации: предварительная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 35 циклов: 95°С - 20 с, 49°С- 20 с, 72°С - 30 с, и, наконец, 72°С - 4 мин.

Секвенирование ПЦР-продукта. Разделение фрагментов ДНК проводили методом вертикального электрофореза в ПААГ различной концентрации [Maniatis Т., 1982]. Полученные после электрофоретического разделения фрагменты ДНК экстрагировали из геля по методике, описанной в [Maniatis Т., 1982]. Измеряли концентрацию фрагментов на спектрофотометре NanoDroplOOO и секвенировали в ВНТК «Генной активности» Института биохимии и (Ьизиологии микроорганизмов РАН (Пущино).

Проведение ПЦР в реальном времени. Для выяснения изменения уровня экспрессии генов icll и icl2 кукурузы, проводили ПЦР-РВ на приборе DNA Engine® Thermal Cycler «Chromo4» ("Bio-Rad", США), используя в качестве красителя SYBR Green [Tzachi В., 2003]. Подбор праймеров осуществляли на основе сравнения нуклеотидных последовательностей генов ИЦЛ с использованием программного обеспечения Primer3 [Rozen S., 2000]. Праймеры для ПЦР-РВ анализа были следующими: для icll: прямой - 5'-TTCCCCTAGAGCGTTTCTGA-3 ' ; обратный - 5'-

ATCGCACACCCACTTACCTC-3 для icl2: прямой - 5'-GTCCCAGTCCC AGAA-3 ' ; обратный - 5 '-ATCGAGGACGAGTGG-3 '. Параметры амплификации: предварительная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 35 циклов: 95°С - 20 с, 60°С - 20 с, 72°С - 15 с (детекция) и, наконец, финальная элонгация 72°С - 4 мин. Количество матрицы контролировали с помощью параллельной амплификации 18S рРНК с ген-специфичными праймерами. В качестве отрицательного контроля проводилась амплификация суммарной РНК, не прошедшей этапа обратной транскрипции.

Статистическая обработка данных. Опыты проводили в 3 кратной биологической повторности, аналитическое определение для каждой пробы -

в трех повторностях. Для определения достоверности результатов

применяли метод вариационной статистики. В таблицах и на рисунках приведены данные типичных опытов, где каждое значение есть среднее арифметическое из трёх определений. Для построения графиков применяли программы линейной и параболической аппроксимации. При математической обработке использовали статистический критерий Стъюдента [Лакин Г.Ф., 1990].

АКТИВНОСТЬ, ИЗОФЕРМЕНТНЫЙ СОСТАВ И СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ В РАЗНЫХ ОРГАНАХ ZEA MAYSL Динамика изоцитратлиазной активности в разных органах Zea mays L имеет характерные особенности. В щитках максимальную активность ИЦЛ наблюдали на 4-й день, в период интенсивного протекания глюконеогенеза [Cornah et. al., 2004]. В зелёных листьях — на 14-е сутки, что обусловлено функционированием альтернативного метаболизма [Schloss J.V. et. al., 1982]. Анализ изоферментного состава изоцитратлиазы в онтогенезе показал наличие двух изоформ в щитках (Rf 0,25 и 0,29) и одной формы в листьях, причем значение ее электрофоретической подвижности (0,25) совпадало с величиной Rf одной из форм в щитке (рис.1). В течение исследуемого периода (14 дней) выявлена редукция количества множественных молекулярных форм ИЦЛ в щитках кукурузы. В корнях кукурузы обнаружили низкую активность исследуемого фермента и отсутствие при специфическом окрашивании полос изоферментов в исследуемом объекте. Внутриклеточная локализация изоцитратлиазы связана с глиоксисомальной, пероксисомальной и цитозольной фракциями. Обнаружение активности ИЦЛ в цитозольной фракции, возможно, обусловлено разрушением органоидов при выделении и вымыванием исследуемого фермента в цитоплазматический " ------ г - — матрикс.

ЩИ : i ■ ■ ; : Р — ' • г' '

> ■ , Рис.1. Электрофореграммы специфического

i проявления ИЦЛ в щитках (а) и зеленых

листьях (Ь) кукурузы.

3,10 и 14 - дни прорастания семян кукурузы. Р tr-i-г i ,, : - белковая полоса; F — фронт красителя.

3 10 3 10 н

а Ь

ПОЛУЧЕНИЕ ГОМОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ИЗОФОРМ ИЗОЦИТРАЛИАЗЫ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНОВ КУКУРУЗЫ Изучение физико-химических и регуляторных свойств требует наличия высокоочищенных препаратов. Результаты типичной очистки ИЦЛ из щитков кукурузы представлены в таблице 1. Удельная активность для одной изоформы фермента (ИЦЛ|) равнялась 4,9 Е/мг белка, при этом степень очистки составила 122,5 раза; выход - 5,7%. Для второй изоформы (ИЦЛ2) значение удельной активности составило 4,4 Е/мг белка, а степень очистки

110 раз; выход - 5,7%. Наибольший вклад в получение высокоочищенных изоформ изоцитратлиазы внесло применение ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

Проведение очистки изоцитратлиазы из зеленых листьев 14-дневных проростков кукурузы позволило получить гомогенный препарат исследуемого фермента с удельной активностью 3,05 Е/мг белка, с выходом 10 % и степенью очистки - 113 раз. Определённые величины удельных активностей хорошо согласуются со значениями этих характеристик для ферментных препаратов, выделенных из других растительных объектов - из огурца с удельной активностью 5,8 Е/мг белка [Reynolds S. J., 2000], из семян арахиса - с удельной активностью 3,65 Е/мг белка [Lin S. F. et. al., 2008].

Таблица 1

Стадия очистки Объём, мл Общий белок, мг Общая активност ь, Е Удельная активность, Е/мг белка Выход, % Степень очистки

Гомогенат 6 51,1 1,93 0,04 100 1

Фракционирова ние сульфатом аммония 2 9,6 1,75 0,18 90,7 4,5

Гель-фильтрация на 0-25 2 9,2 1,71 0,19 88,6 4,8

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ- 2 0,023 0,11 4,9 5,7 122,5

2 0,025 0,11 4,4 5,7 110

Электрофоретический анализ очищенных препаратов показал, что при универсальном окрашивании на белки и специфическом проявлении полосы совпадают (рис. 2). В щитках кукурузы присутствуют 2 формы фермента, имеющие разную электрофоретическую подвижность: ИЦД1 с 0,29 и ИЦЛ2 с Яг 0,25 (рис. 2.4 и 2.5). В зелёных листьях - только одна форма фермента с 0,25 (рис. 2.3), совпадающая с величиной

электрофоретической подвижности медленнодвижущейся изоцитратлиазы (Яг 0,25) из щитков кукурузы.

Рис. 2. Электрофореграммы изоформ ИЦЛ в ПААГ.

1 - Специфическое проявление ИЦЛ из щитков кукурузы; 2 — Специфическое проявление ИЦЛ из зелёных листьев кукурузы; 3 — Проявление с нитратом серебра препаратов изоцитратлиазы из зелёных листьев кукурузы; 4 - Проявление с нитратом серебра препаратов ИЦЛ1 из щитков; 5 - Проявление с нитратом серебра препаратов ИЦЛ2 из щитков. Р -белковая полоса; Б — фронт красителя.

НИН ■Л ь ■

j Ï ! 1 f *

" ï ^ ,

щтш- : :

1 2 3 4 5

МОЛЕКУЛЯРНАЯ МАССА И СУБЪЕДИНИЧНОЕ СТРОЕНИЕ ИЗОФОРМ ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ Методом гель-хроматографии на сефадексе 0-200 было установлено, что величина молекулярной массы нативной молекулы ИЦЛ1 из щитков кукурузы составила 164 кДа, а второй изоформы - 208 кДа. В зелёных листьях 14-ти дневных проростков кукурузы величина Мг нативной изоцитратлиазы (207 кДа) практически совпадала со значением этой характеристики для второй формы в щитках (таблица 2).

Использование денатурирующего электрофореза позволило определить величины молекулярных масс субъединиц, которые составили 43 и 48 кДа для ИЦЛ1 и ИЦЛ2 в щитках (рис.3). В зелёных листьях величина Мг субъединицы изоцитратлиазы равнялась 47 кДа.

■П09 с?

I " ■'

г Рис. 3. Вв-.Ха-элсктрофорс! изоформ

изоцитратлиазы из щитков кукурузы.

1 - ИЩ^; 2 - ИЦЛ2; М - маркерные белки: 1-I целлюлаза(94,6 кДа); 2- бычий сывороточный

» альбумин (66,2 кДа); 3-яичный альбумин (45 кДа);

Р . Ыг "... р 4-карбоангидраза (31 кДа); 5-ингибитор трипсина

(21,5 кДа); 6- лизоцим(14,4 кДа).

*4*" • - ЧР

1 М " 2

Сравнение данных полученных, в ходе гель-хроматографии и денатурирующего электрофореза показало, что в щитках (ИЦЛ1 и ИЦЛ2) и листьях (ИЦЛ) кукурузы изоформы имели тетрамерное строение. Интересно отметить, что четвертичная структура изоцитратлиазы из зелёных листьев почти полностью совпадала по молекулярной массе и субъединичному строению со второй формой фермента (ИЦЛ2) из щитков кукурузы.

РЕГУЛЯТОРНЫЕ И КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИЗОФЕРМЕНТОВ ИЦЛ Исследование влияния концентрации ионов водорода на активность ИЦЛ показало, что выделенные формы изоцитратлиазы имели различия по рН оптимуму, составляющему 7,5 для ИЦЛ, и 6,0 для ИЦЛ2 и для ИЦЛ, полученной из зелёных листьев (табл. 2). Большинство исследований проводили с глиоксисомальной изоцитратлиазой [СогпаЬ I. Е. е1 а1., 2004], и можно предположить, что ИЦЛЬ выделенная в нашей работе из щитков как раз и является глиоксисомальной формой, обеспечивающей функционирование глиоксилатного цикла, а изоформа ИЦЛ2 и ИЦЛ, полученная из зелёных листьев участвуют в метаболизации глиоксиловой кислоты в фотодыхании [вио У. е1. а1., 2004] и закислении эндосперма [Щипарёв С.М., 1976].

Таблица 2

Физико-химические и кинетические характеристики изоформ ИЦЛ (п=3, Р<0,05) ___

Характеристики 4-х дневные щитки кукурузы (Zea mays L.) Зелёные листья кукурузы (Zea mays L.)

ИЦЛ, ИЦЛ2 ИЦЛ

Молекулярная масса нативного фермента, Ша 164 208 207

Молекулярная масса субъединиц, Ша 43 48 47

Количество субъединиц 4 4 4

рН оптимум 7,5 6,0 6,0

К„ по изоцитрату, цМ 55,6 83,3 100

В ходе экспериментов по изучению влияния концентрации изоцитрата на активность высокоочищенных препаратов ИЦЛ выявлено разное сродство изоформ к субстрату. ИЦЛЬ полученная из щитков, характеризовалась большим сродством к изоцитрату, а ИЦЛ2 и ИЦЛ из зелёных листьев -меньшим (таблица 2).

Изучение влияния ионов металлов на активность изоформ изоцитратлиазы позволило установить, что глиоксисомальная форма изоцитратлиазы (ИЦЛО является Mg-зaвиcимым ферментом, тогда как ИЦЛ2 и ИЦЛ из зелёных листьев активировались ионами Мп2+, т. о. данные формы фермента являются Мп-зависимыми. Ионы других двухвалентных катионов Са2+; К+ и мало эффективны в регуляции активности изоформ

изоцитратлиазы (рис.4).

Рис.4. Влияние ионов металлов (5 мМ) на активность изоформ

изоцитратлиазы из

щитков и зелёных листьев кукурузы.

1 - ИЦЛ], 2 - ИЦЛ2, 3 - ИЦЛ из зелёных листьев.

Таким образом, ИЦЛ из зеленых листьев, по большинству характеристик (Rf, четвертичной структуре, pHom-, сродству к субстрату, активации ионами и др.) имеет большое сходство с ИЦЛ2 из щитков кукурузы (табл. 2). Поэтому можно предположить выполнение этими формами функций, не связанных с глиоксилатным циклом [Lu Z. et. al., 2005, Chen Z. et. al., 2000, Chen Hsien-Jung et. al., 2000]. Ранее была описана внеглиоксисомальная изоцитратлиаза из зелёных листьев, участвующая в метаболизации фотодыхательного глиоксилата, и мы предполагаем, что вторая изоформа изоцитратлиазы в щитке кукурузы - ИЩЬ также обеспечивает метаболизацию органических кислот, в частности глиоксилата, с помощью синтазной реакции [Игамбердиев А. У., 1990, Schloss J.V., 1982].

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ

ИЗОФЕРМЕНТОВ ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНАХ

Идентификация генов изоцитратлиазы в разных органах кукурузы

Нами были подобраны праймеры на основе сравнения аминокислотных последовательностей белка ИЦЛ организмов разных таксономических групп, при этом было обнаружено 2 высококонсервативных участка, на основе которых были созданы специфические олигонуклеотиды. Из всех объектов исследования была выделена суммарная РНК, на основе которой методом обратной транскрипции получили кДНК, используемую в дальнейшем для проведения полимеразной цепной реакции.

Проведенный ПЦР-анализ кДНК из щитков кукрузы с полученными ген-специфическими праймерами и последующий электрофорез продуктов реакции в 1% агарозном геле выявил наличие двух полос на геле. В зеленых листьях обнаружили только один ПЦР продукт. Это могло бы свидетельствовать об экспрессии двух генов, кодирующих изоцитратлиазу в щитке, тогда как в листьях активным оставался только один из этих генов.

Рис. 5. ПЦР-амплификация генов ИЦЛ Zea mayz L. M - ДНК-маркеры от 100 до 1000 п.н.; 1 - щитки; 2 - зеленые листья.

Определение нуклеотидной последовательности продуктов полученных методом ПЦР

Было проведено секвенирование ампликонов, обнаруженных в ходе ПЦР. В щитках кукурузы получили два продукта, длина которых составляла 387 п.н. (¿с/1) и 498 п.н. (¡ici:2) (рис.6 А и Б).

В зелёных листьях выявлен один продукт, причём по своему составу и длине (499 п.н.) он на 99,6% совпадал с продуктом /с/2 из щитков (рис. 6 В).

Установлено, что нуклеотидная последовательность /с/2 в щитках и зелёных листьях имела 100% гомологию с участком гена hypothetical protein LOC100277287, кодирующего семейство ЩЛ/ФЕПМ в Zea mays L. ПЦР-продукт полностью соответствовал участку гена в области от 704 до 1201

нуклеотида. Помимо этого данная последовательность ПЦР-продукта имела высокий процент сходства (около 96%) с последовательностями генов, ответственных за синтез hypothetical protein, кодирующего мультиэнзимный комплекс ИЦЛ/ФЕПМ из разных организмов (Oryza sativa, Sorghum bicolor и др.). В состав мультиэнзимного комплекса, кодируемого hypothetical protein, входят 7 ферментов, в том числе и изоцитратлиаза [Lu Z. et. al., 2005]. Другая нуклеотидная последовательность (/с/1) в щитках имела 100% гомологию с участком гена /с/1 ZMU69129 в Zea mays L. - и соответствовала участку гена в области от 731 до 1117 нуклеотида. Она довольно сильно отличалась по своему нуклеотидному составу от (/с/2), процент гомологии составил лишь 28,9%. Анализ секвенированного ПЦР-продукта, путем сравнения его с генетической базой данных показал, что эта последовательность имеет высокую степень сходства (около 90%) с последовательностями для гена ИЦЛ из других организмов (Oryza sativa и ДР-)-

тос(тахлсшш1у*ш1госасд1таппшс11ссил

CCGtOTGTCGrCGCGCGuCT'XAGTrCÖCGTCATGSaWCÜiiaCCI} TCCTC^O:KÚCACCGAC<KCGTCGrcG(>;ACGmAT:CAC.AC(:.U ОВГСШСЙШКС^СДСМШСАТАйГСКШСДССАТОаМС ntAGGGGCCAGAGCCTCSKGGCCGT&n'OTCGiXCuGCATCírCGÍKX GCAAGAaWAGGGA(TITa!j0:CATOlAGaACüAOTG'3CTGGCCa CffiCffi'GOTaAl>-rrrniTGAGTGOTfAK!GAC3CCAiraCGuG CCTCGGCCH'CVGCGGGCCAG'jAGAACTCAGCGCAGGCTCCAGGAG

Рис. 6. Нуклеотидные последовательности ПЦР-продуктов из кДНК щитков (/с/1) (А), (/с/2) (Б) и зелёных листьев кукурузы (В).

CAIMC¿AmWA(rrGTCAIGCACATAAAACKTGCTCTAaATGCT

лсашоАаАагоасгаа\олпятлпстлос:иаалс.гат1ас

GCCA.A(XTAmCTCATGAmueCAmTOaAGGGraAAAGCATrra:

ТаЖЛОСйОСАОАТСТТСТАТГГАТгеАТЗСОЛТСИТГАСТАСААа

AGATGi«GCAimtm;CGSnCCACCAGAACITCC.AA.i.CiATaOCAA

ACATmAaA\aG:CXTrG<rrAAAAn'CCMTATI(l\GCCrrGCTüUCT

TGAaGA.«najmCAGGCITGTAGrrATATCCTrrATCCnAGTrGGGfl

TATCWGCCTGCAATlGfACai.TCCTCTAiTn'CCGATAAAAGACGGCflG

ICjrACCTCCACCTAüCarCCTGCCATCTTrrcAaOAGAICAAGGATACA

TTGGGTnCMCCGCIATTAT.\\AGA.\GAClW.CAATACCi,-\2r2MuC

AAGTGAAG

£AMC¿A^¿AffiAAGCrGraTGCÁCATAiAACíTXTGTAGATGCT AGGAA.AÜAGACnranmJCArraTrATOIAGCAAöa.iCAGATKTC GCC.A.AGCTATnnCAia.ATaUGCATTATGCAGGGIGA.AAGttTrTflC TCATGCTG5AGCAaATCnTCTATnATTMTGCCCTr(KTrCAaiAGAj\G AMüAAAGCArmCTGCGun3aACCA(lA.ACJITCCA.AAa.ATGGCAA ACATGTrAGAAGCTGGTGGTA.lA.ACrCCCATAr:(aGCCCTGaG.AACr тА(йштгб(лтгаоаэтше1АТА1СсшАтатгА0ш;(Х!

TATCMTGb7raAATGCA«lATü"TCTA(irrGraATA.iAÍ,GACGGaiG TGrrACCTCCACmGCGrCCTGCCATCITITCAGGAGATrMGGATACA TTGGtHTTCMCCGn'ATrATAAAG.UGAGAA.ACA.ATACCA.ASrGGAC

¿Ж2Ш5

Наличие двух форм фермента в щитке кукурузы и двух ПЦР продуктов может быть результатом работы двух разных генов, отвечающих за синтез двух изоформ ИЦЛ в геноме кукурузы. На свету в зеленых листьях экспрессии подвергается только один ген, о чем свидетельствовал результат ПЦР и наличие одной изоформы ИЦЛ после специфического проявления геля на активность (рис.1). В щитке, где высокий уровень метаболических процессов, обеспечивающих клетки энергией и субстратами для биосинтеза присутствуют два изофермента изоцитратлиазы - ИЦЛ1 и ИЦЛ2, кодируемых соответствующими генами г'с/1 и г'с/2.

Изменение экспрессии генов изоцитратлиазы в разных органах в онтогенезе кукурузы.

Для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени необходимы высокоспецифические праймеры. Поэтому был осуществлён подбор праймеров на основе нуклеотидных последовательностей генов ИЦЛ и полученных нами сиквенсов ПЦР-продуктов с использованием программного обеспечения РптегЗ [Логеп Б., 2000]. С разработанными праймерами для г'с/1 и г'с/2 была проведена полимеразная цепная реакция, с целью подтверждения их высокой специфичности. С праймером для г'с/2 из кДНК из щитков и зелёных листьев получено по одному продукту длиной 499 п.н. С праймером - г'с/1 выявлен только один ПЦР продукт с кДНК из щитков с длиной 380 п.н.. С кДНК зелёных листьев наблюдали отсутствие ПЦР-продукта с праймером для г'с/1 (рис.7).

¡¡вШ:и

Рис. 7. ПЦР амплификация генов изоцитратлиазы со специфическими праймерами в ПААГ.

1 - праймер для г'с/2 + кДНК (лист)

2 - праймер для г'с/2 + кДНК (щиток)

3 - праймер для г'с/1 + кДНК (щиток)

4 — праймер для г'с/1 + кДНК (лист) М - ДНК-маркеры от 100 до 1500 п.н.

Анализ профилей экспрессии генов изоцитратлиазы показал значительные отличия в их функционировании в разных органах Zea mays L. Максимальный уровень экспрессии гена /с/1 характерен для щитка, что обусловлено синтезом глиоксисомальной изоцитратлиазы, связанной с протеканием ГЦ. В течение исследуемого периода экспрессия гена /с/1 уменьшалась и достигала минимального значения на 14-е сутки (рис.9). Для этого периода характерно истощение запаса липидов в щитке [Delkin G., 2007, Comah J. Е. et. al., 2004]. Экспрессия гена г'с/2 имела более сложный характер изменения в онтогенезе кукурузы. Значительная величина этого

показателя была обнаружена в щитках и листьях кукурузы. Этот ген г'с/2 кодирует внеглиоксисомальную форму ИЦЛ.

щита* лист №[№ »08 яет гарень

•W1 I ictt a ¡di

Рис. 8. Уровень экспрессии генов icl на 3-й (А) и 10-е сутки в различных органах Zea mayz L.

щиток лист корень

■ icíl SÍCI2

Рис. 9. Уровень экспрессии генов ici на 14-е сутки в различных органах

Zea mayz L.

Интересно отметить, что наблюдалась корреляция между наличием глиоксисомальной формы изоцитратлиазы в щитке и интенсивностью экспрессии гена ici 1. Профиль экспрессии гена ¿с/2 имеет менее лабильный характер в течение 14-ти дней. Его высокая экспрессия обуславливает синтез второй формы ИЦЛ в щитке, обеспечивающей метаболизацию органических кислот, в частности глиоксилата с помощью синтазной реакции [Schloss J.V., 1982]. Утилизация глиоксилата запускает процесс закисления эндосперма, что необходимо для эффективного гидролиза запасных веществ, на этапе прорастания [Щипарёв С.М., 1976]. В листовых пластинах кукурузы ген /с/2 обеспечивает синтез изоформы изоцитратлиазы, которая посредством той же

синтазной реакции участвует в метаболизации фотодыхательного глиоксилата [Schloss J.V., 1982].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные по изменению изоцитратлиазной активности в разных органах кукурузы свидетельствуют об участии исследуемого фермента в осуществлении функционирования различных метаболических путей. Известно, что ИЦЛ обеспечивает протекание глюконеогенеза и, в частности, его важнейшего звена — глиоксилатного цикла. Однако, сообщалось и о наличие внеглиоксисомальной формы изоцитратлиазы, участвующей в функционировании фотодыхания и метаболизации органических кислот [Игамбердиев А.У., 1986, Hunt L., 1977].

Наличие двух молекулярных форм ИЦЛ в Zea mays L установлено в нашей работе электрофоретическими исследованиями. Выявленные формы изоцитратлиазы имеют различную электрофоретическую подвижность, при этом полученные данные указывают, что медленнодвижущаяся — ИЦЛ2 (Rf 0,25) и быстродвижущаяся в полиакриламидном геле ИЦЛ1 (Rf 0,29) изоформы локализованы, в глиоксисомальной, пероксисомальной и цитозольной фракциях. Можно предположить, что наличие изоцитратлиазной активности в цитоплазматической фракции обусловлено методическими погрешностями, приводящими к частичному разрушению органоидов при их выделении. Интересно отметить, что внутриклеточное распределение изоцитратлиазы в сое (Glycine max L) связано с глиоксисомальной и пероксисомальной фракциями [Delkin G., 2007]. Причём в момент функционального перехода растительных тканей, вызванного сменой типа питания в клетках, одновременно присутствуют как глиоксисомы, так и пероксисомы с соответствующей им системой ферментов. После зеленения семядолей сои, профиль экспрессии генов, ответственных за глиоксисомальную функцию резко снижается, и преобладает фотодыхательная деятельность пероксисом [Delkin G., 2007].

При использовании многостадийной схемы очистки получены изоформы изоцитратлиазы из щитков кукурузы в гомогенном состоянии с удельной активностью одной формы 4,9 Е/мг белка (ИЦЛО, а другой - 4,4 (ИЦЛ2) Е/мг белка. Из зелёных листьев выделен препарат исследуемого фермента с удельной активностью 3,05 Е/мг белка, выходом 10% и степенью очистки - 113 раз. Важную роль в разделении высокоочищенных препаратов двух изоформ сыграла стадия очистки с использованием ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Применение линейного градиента КС1, позволило получить высокую эффективность очистки и выход изоферментов. Ранее несколько форм фермента были описаны в сосне и в сое, в которых изоцитратлиаза обнаруживается, по крайней мере, в трех различных формах [Ruchti М., 1986, Pinzauti G., 1982].

Установлены с помощью гель- хроматографии на Сефадексе G-200 и денатурирующего электрофореза (SDS-электрофореза) различия в величинах молекулярных масс нативных изоформ и молекулярных масс субъединиц. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что изоцитратлиаза в большинстве случаев имеет несколько субъединиц, с молекулярной массой около 60 кДа [Giachetti Е., 1987], однако сообщается о колебании величин Мг субъединиц фермента в пределах от 25 до 80 кДа [Ying L.U., 2005], что часто обусловлено не только видовыми различиями, но и методическими погрешностями.

Показано, что в щитке кукурузы ИЦЛ1 и ИЦЛ2 являются тетрамерами с молекулярной массой 164 кДа и 208 кДа соответственно. В некоторых видах встречается иная молекулярная структура изоцитратлиазы: тримерная для фермента из прорастающей пыльцы сосны Р. densiflora [Chigen Т., 1986], димерная и пентамерная для фермента из огурца [Frevert J., 1980].

Интересно отметить, что в зелёных листьях изоцитратлиаза почти полностью совпадает по значению молекулярной массы и субъединичному строению со второй формой фермента (ИЦЛ2) из щитков кукурузы.

Кроме того, установлено, что формы изоцитратлиазы имеют различия по величинам pH оптимумов, составляющим 7,5 для ИЦЛ1 и 6,0 для ИЦЛ2 и для изоформы ИЦЛ, полученной из зелёных листьев. Известно, что для ИЦЛ, выделенной из различных источников значение pH от варьирует в пределах pH 7,0 — 7,5 и зависит от природы используемого буфера [Ranaldi F., 2003]. Различия обнаруживаются также при анализе сродства разных изоформ изоцитратлиазы к субстрату. ИЦЛ1 из щитков кукурузы имеет наибольшее сродство к изоцитрату (Км 55,6 (J.M), а ИЦЛ2 и ИЦЛ из зелёных листьев характеризовались меньшим значением этого показателя. Величины К„ по изоцитрату для разных изоформ составляли для ИЦЛ1 - 55,6 рМ, для ИЦЛ2 - 83,3 рМ (из щитков), а для изоцитратлиазы из зелёных листьев — 100 цМ. Выявлено, что глиоксисомальная форма изоцитратлиазы (ИЦЛ]) является Mg-зависимым ферментом, тогда как ИЦЛ2 и ИЦЛ из зелёных листьев активировались ионами Мп2+, т. е. данные формы фермента являются Мп-зависимыми. Катионы других металлов: Са2+; К+ и Na+ оказались мало эффективны в регуляции активности изоформ изоцитратлиазы. Выявленные физико-химические свойства и регуляторные характеристики чётко указывают на сходство изоформы изоцитратлиазы, выделенной из зелёных листьев, с ИЦЛ2 из щитков кукурузы.

Наличие сложной системы регуляции активности изоформ ИЦЛ подтверждается молекулярно-генетическим анализом, который был проведен на дрожжах и арабидопсисе и других биологических объектах. В клетках дрожжей Yarrowia lipolytica показано, что генезис изоцитратлиазной активности осуществляется тремя генами (кг/1, /с/2, /с/3) [Förster А. et. al., 2007]. В геноме Arabidopsis thaliana присутствуют два гена ИЦЛ, расположенных в разных хромосомах (wvvw.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).

icl2. Наличие двух форм фермента в щитке кукурузы и двух ПЦР продуктов с ген-специфическими праймерами может быть результатом работы двух разных генов, кодирующих ИЦЛ в геноме кукурузы.

Путём секвенирования, полученных в ходе ПЦР ампликонов, было установлено, что нуклеотидные последовательности (ici2) в щитках и зелёных листьях полностью совпадали друг с другом по составу и имели 100% гомологию с участком гена hypothetical protein LOC100277287. Этот ген кодирует мультиэнзимный комплекс ИЦЛ/ФЕПМ в Zea mays L, в состав которого входят семь ферментов, в том числе и изоцитратлиаза [Lu Z. et. al., 2005]. Вторая нуклеотидная последовательность /с/1 в щитках высокогомологична участку гена, ответственного за синтез изоцитратлиазы в кукурузе [Paek N.C. et. al., 1998].

Анализ профилей экспрессии генов изоцитратлиазы показал значительные отличия их функционирования в разных органах Zea mays L. Максимальный уровень экспрессии гена /с/1 характерен для щитка, что обусловлено синтезом глиоксисомальной изоцитратлиазы, связанной с протеканием ГЦ. В течение исследуемого периода экспрессия гена ici 1 уменьшалась и достигала минимального значения на 14-е сутки. Для этого периода характерно истощение запаса липидов в щитке [Щипарёв С.М., 1976,. Cornah J. Е et. al., 2004]. Экспрессия гена icïl имеет более сложный характер изменения в онтогенезе кукурузы. Значительная величина этого показателя обнаружена в щитках и листьях кукурузы. Ген /с/2 кодирует внеглиоксисомальную форму ИЦЛ. Интересно отметить, что наблюдается корреляция между наличием глиоксисомальной формы изоцитратлиазы в щитке и интенсивностью экспрессии гена ici 1. Профиль экспрессии гена /с/2 имеет менее лабильный характер в течение 14-ти дней. Его высокая экспрессия обуславливает синтез второй формы ИЦЛ2 в щитке, обеспечивающей метаболизацию органических кислот, в частности глиоксилата с помощью синтазной реакции [Schloss J.V., 1982]. Утилизация глиоксилата запускает процесс закисления эндосперма, что необходимо для эффективного гидролиза запасных веществ, на этапе прорастания [Щипарёв С.М., 1976]. В листовых пластинах кукурузы ген ic/2 обеспечивает синтез изоформы изоцитратлиазы, которая посредством той же синтазной реакции участвует в метаболизации фотодыхательного глиоксилата [Schloss J.V., 1982].

Таким образом, в кукурузе выявлены две молекулярные формы изоцитратлиазы, для которых характерна органоспецифичность и разная функциональная значимость. Получение в гомогенном состоянии препаратов изоформ исследуемого фермента позволило выявить значительные различия в их физико-химических, кинетических и регуляторных характеристиках. Методами молекулярной биологии установлено, что выделенные изоформы имеют различную генетическую детерминированность, т.е. являются изоферментами, обеспечивающими протекание различных физиолого-биохимических процессов в растительной клетке. На основании полученных данных предлагается гипотетическая схема регуляции образования изоферментов ИЦЛ и их физиолого-биохимическая значимость при

функциональном обусловленного

переходе растительного организма,

сменой типов питания Свис.10).

ЩИТОК

/с/2

(шстозп1Ю)

Гицролш 1 белкев !

/С/1

(тмтчпя)

1ЩЛ i

Глшдш i /

-0.fi- И;0 I х

liir.-yp.-i- ЩМКШШ!^

СО; ^^

Il70Tnrrj.nT

"""'I.........

у Ацпдт

■ ^ эндосперм»

Сткшшзт

Углгболы

Лншиы

глмокспсома

Рис. 10. Гипотетическая схема регуляции образования изофермептов изоцитратлиазы и их физиолого-биохимическая значимость.

LOC100277287 - ген hypothetical protein, кодирующий внеглиоксисомальную форму (ИЦЛ 2), /с/1 ZMU69129 — ген , кодирующий глиоксисомальную форму (ИЦЛ 1) в Zea mays L.

ВЫВОДЫ

1. Динамика изоцитратлиазной активности в разных органах Zea mays L имеет характерные особенности. В щитках максимальную активность ИЦЛ наблюдали на 4-й день, в период интенсивного протекания глюконеогенеза. В зелёных листьях - на 14-е сутки, что обусловлено, по-видимому, индукцией функционирования фотодыхательного метаболизма.

2. Множественные молекулярные формы изоцитратлиазы, выявленные в разных органах кукурузы характеризуются тканевой специфичностью и различной внутриклеточной локализацией. В щитках функционируют глиоксисомальная (Rf 0,25) и внеглиоксисомальная (Rf 0,29) изоформы фермента, а в зелёных листьях — только внеглиоксисомальная (Rf 0,25). Внеглиоксисомальная форма ИЦЛ обнаруживается в пероксисомах и цитоплазме.

3. Применение многостадийной очистки позволило получить в электрофоретически гомогенном состоянии препараты двух изоферментов изоцитратлиазы из щитков и одного из зелёных листьев кукурузы. Удельная активность одной изоформы (ИЦЛО составила 4,9 Е/мг белка, при этом выход 5,7 %, степень очистки 122,5 раз. Вторая изоформа (ИЦЛ2), очищенная из щитков, характеризовалась величиной удельной активности равной 4,4 Е/мг белка ( в листьях 3,05 Е/мг белка) и выходом 5,7 % (10%) и степенью очистки 110 раз (113 раз).

4. Установлено, что ИЦЛ] и ИЦЛ2 из щитков кукурузы являются гомотетрамерами и отличаются по значениям молекулярных масс белковых молекул (164 и 208 кДа соответственно) и по величинам Мг субъединиц (43 и 48 кДа). Изоцитратлиаза из зеленых листьев имеет большое сходство по своим физико-химическим характеристикам с формой ИЦЛ2 из щитков.

5. Выявленные кинетические свойства (Кк) и регуляторные характеристики (рНопг, активация ионами металлов) изоформ изоцитратлиазы свидетельствуют о высокой степени различия между ИЦЛ] и ИЦЛ2, что по-видимому, указывает на их различную генетическую детерминированность.

6. Применение программного анализа гомологичных последовательностей изоферментов ИЦЛ позволило разработать и синтезировать праймеры для идентификации генов, кодирующих исследуемую ферментную систему. С помощью ОТ-ПЦР в мРНК кукурузы обнаружены два гена изоцитратлиазы.

7. Данные по определению нуклеотидных последовательностей полученных ГЩР-продуктов показали, что исследуемые изоформы ИЦЛ являются изоферментами, т.е. генетически детерминированными белковыми молекулами. Так, нуклеотидная последовательность ампликона с длинной 380 п.н. высокогомологична участку гена ich 2MU69129, кодирующего

изоцитратлиазу. Вторая нуклеотидная последовательность

icll имеет 100%-ю гомологию с участком гена LOC100277287, кодирующим целое семейство изоцитратлиаз (ИЦЛ)/фосфоенолпируват мутаз (ФЕПМ). Следовательно, обнаруженные изоформы ИЦЛ являются изоферментами, т.е. генетически детерминированными белками.

8. Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени установлена зависимость уровня экспрессии генов изоцитратлиазы от этапов онтогенеза и типов органов Zea mays L. Максимальный уровень экспрессии гена icll характерен для щитка, что обусловлено синтезом глиоксисомальной формы изоцитратлиазы — ИЦЛь связанной с протеканием ГЦ, который активно функционирует на этапе прорастания. Анализ профилей экспрессии гена icl2 показал чёткую корреляцию интенсивности его функционирования от типа органа. Высокая экспрессия icl2 в щитках и зелёных листьях кукурузы обеспечивает синтез внеглиоксисомальной формы ИЦЛ, участвующей, в частности, в метаболизации органических кислот при закислении эндосперма и фотодыхательном метаболизме.

9. Разработана гипотетическая схема регуляции синтеза изоферментов ИЦЛ и их физиолого-биохимическая роль в переключении метаболических потоков в растительной клетке при физиологическом переходе, обусловленном сменой типов питания.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Дифференциальная экспрессия изоформ изоцитратлиазы в щитках и зелёных листьях Zea mays L. / А.Т. Епринцев, Е.В. Маслова (Дьяченко1)...[и др.] // Современная физиология растений: от молекул до экосистем : тез. докл. междунар. конф. - Сыктывкар, 2007 г. 4.1, С. 71-73.

2. Исследование физико-химических свойств изоферментов изоцитратлиазы из щитков кукурузы / Е.В. Маслова (Дьяченко) [и др.] // 11-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология наука XXI века» : тез. докл., 29 октября-2 ноября. - П., 2007. - С. 152.

3. Очистка и физико-химические свойства изоцитратлиазы из щитков кукурузы / Е.В. Дьяченко ГМаслова) [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2007. - Вып.9. - С. 110115.

4. Субклеточная локализация активности изоцитратлиазы из щитков кукурузы / Е.В. Маслова (Дьяченко") [и др.] // Вестн. Воронеж, гос. ун-та. Сер. Химия. Биология. Фармация. - 2007. - №2. - С. 71 -74.

5. Маслова Е.В. ("Дьяченко) Разделение изоферментов изоцитратлиазы из щитков кукурузы с помощью ионнообменной хроматографии / Е.В. Маслова, Чан Тхи Хоанг Куен, А.Т. Епринцев // Сорбционные и хроматографические процессы,-2008.-Т.8, вып. 2.-С. 297-303.

6. Изоферментный состав изоцитратлиазы в разных органах Сз и С4 растений / Е.В. Маслова (Дьяченко) [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. — Воронеж, 2008., вып.10. - С. 160-164.

7. Регуляция активности изоформ изоцитратлиазы в онтогенезе высших растений / Е.В. Маслова (Дьяченко') [и др.] // 12-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология наука XXI века» : тез. докл., 10- 14нояб.-П.,2008.-С. 194.

8. Физико-химические и кинетические характеристики изоформ изоцитратлиазы из кукурузы / А.Т. Епринцев, Е.В. Дьяченко (Маслова) ...[и др.] // Биохимия. - 2009. - Вып. 74, №5. - С. 528-532.

9. Использование сорбентов различной природы для разделения изоферментов малатдегидрогеназы и изоцитротлиазы / Е.В. Маслова (Дьяченко) [и др.] // Материалы Зей Международной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» : тез. докл., Белгород, 22 -24 сент. 2008 г. - Б., 2008. - С. 242 - 245.

10. Регуляторные аспекты функционирования изоформ изоцитратлиазы в различных органах Zea mays L. / А.Т. Епринцев, Е.В. Маслова (Дьяченко) [и др.] // Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений : тез. докл., конф, Екатеринбург, 6-10 октяб. 2008 г. - Е., 2008. - С. 166-167.

11. Кинетические свойства изоцитратлиазы из С3 и С4 растений / А.Т. Епринцев, Е.В. Дьяченко (Маслова)...[и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. — Воронеж, 2009. вып. 11. - С. 78-82.

12. Получение и свойства изоформ изоцитратлиазы из семядолей Glycine max L. / А.Т. Епринцев, Е.В. Дьяченко (Маелова)...[и др.] II Прикладная биохимия и микробиология. -2010. -Т.46, №1. - С. 1-6.

Работы №5, №8 и №11 опубликованы в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК.

Подписано в печать 14.10.09. Формат 60*84 1/16. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 163

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательско-пояиграфического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дьяченко, Екатерина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Выделение и получение препаратов изоцитратлиазы в высокоочищенном состоянии из разных организмов

1.1.1. Механизм действия изоцитратлиазы

1.1.2. Характеристика способов выделения изоцитратлиазы из растений, животных и бактерий

1.1.3. Пространственная структура и конформационное состояние молекулы изоцитратлиазы

1.1.3.1. Молекулярная масса и субъединичное строение фермента

1.1.3.2. Пространственная структура молекулы изоцитратлиазы, особенности вторичной, третичной структуры

1.2. Регуляция активности изоцитратлиазы на разных этапах развития организмов и её физиолого-биохимическая роль

1.2.1. Распространение изоцитратлиазы в организмах различных таксономических групп

1.2.1.1. Распространение ферментов ГЦ у микроорганизмов

1.2.1.2. Функционирование глиоксилатного цикла у грибов3 j

1.2.1.3. Распространение изоцитратлиазы у низших и высших растений

1.2.1.4. Изоцитратлиаза в тканях животных

1.2.2.Субклеточная локализация изоцитратлиазы

1.2.2.1. Микротельца в растениях

1.2.2.2. Внутриклеточная локализация ИЦЛЗУ

1.2.3. Изоферментный состав

1.2.4. Регуляторные и кинетические характеристики изоцитратлиазы 41 1.2.4.1. рН оптимум/4 j

1.2.4.2. Температурный оптимум

1.2.4.3. Константа Михаэлиса

1.2.4.4. Влияние катионов металлов

1.2.4.5. Регуляция метаболитами

1.2.5. Физиологическое значение изоформ ИЦЛ у различных организмов

1.3. Молекулярные аспекты функционирования изоцитратлиазы в различных организмах

1.3.1. Экспрессия и регуляция фермента^g

1.3.1.1. Экспрессионная регуляция ИЦЛ

1.3.1.2. Генетические механизмы регуляции синтеза ИЦЛ

1.3.2. Характеристика структурной организации генетического материала изоцитратлиазы

1.3.3. Эволюционные аспекты ферментов ГЦ

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Объект и методы исследования^

2.1.1. Объект исследования

2.1.2. Методы исследования

2.1.2.1. Определение активности изоцитратлиазы

2.1.2.2. Определение количества белка

2.1.2.3. Исследование субклеточной локализации

2.1.2.4. Схема очистки изоцитратлиазы

2.1.2.5. Электрофоретические исследования белков

2.1.2.5.1. Определение гомогенности ферментов^q

2.1.2.5.2. Специфическое проявление изоцитратлиазы

2.1.2.5.3. Определение молекулярной массы субъединиц ферментов методом DS-Na-ПААГ-электрофореза

2.1.2.6. Хранение высокоочищенных ферментативных препаратов изоцитратлиазы

2.1.2.7. Определение молекулярной массы нативного фермента

2.1.2.8. Исследование кинетических и регуляторных характеристик изоформ изоцитратлиазы

2.1.2.9. Экстракция суммарной РНК

2.1.2.10. Проведение обратной транскрипции^

2.1.2.11. Подбор праймеров

2.1.2.12. Проведение полимеразной цепной реакции

2.1.2.13. Секвенирование ПЦР-продукта^

2.1.2.13.1. Экстракция фрагментов ДНК из ПААГ

2.1.2.14. Проведение ПЦР в реальном времени

2.1.2.15. Статистическая обработка данныхgg

2.2. Результаты и их обсуждения^

2.2.1. Физиолого-биохимические аспекты функционирования изоформ изоцитратлиазы в растениях

2.2.1.1. Динамика активности изоцитратлиазы в растениях с различным типом основного метаболизма

2.2.1.2. Электрофоретические исследования изоферментного состава изоцитратлиазы в растениях с разным типом основного метаболизма

2.2.1.3. Динамика активности ИЦЛ и ключевых ферментов основных метаболических путей в онтогенезе кукурузы 732.2.1.4. Электрофоретическая подвижность изоцитратлиазы в разных органах Zea mays L при проростании

2.2.1.5. Исследование субклеточной локализации изоцитратлиазы в щитках кукурузы

2.2.2. Очистка, физико-химические, кинетические и регуляторные изоформ изоцитратлиазы из разных органов Zea mays L g

2.2.2.1. Очистка изоформ ИЦЛ из щитков

2.2.2.2. Очистка изоцитратлиазы из проростков кукурузы

2.2.2.3. Электрофоретические исследования изоцитратлиазы gg

2.2.2.4. Молекулярная масса изоформ изоцитратлиазы gg

2.2.2.5. Изучение влияния концентрации изоцитрата на активность ИЦЛ из щитков и зеленых листьев кукурузы

2.2.2.6. Изучение влияния концентрации ионов водорода на активность ИЦЛ из щитков и зеленых листьев кукурузы

2.2.2.7. Влияние катионов металлов на активность изоформ изоцитратлиазы из щитков и зеленых листьев кукурузы

2.2.2.8. Влияние глицина и гликолата на активность изоферментов изоцитратлиазы

2.2.2.9. Оптимизация условий хранения высокоочищенных изоформ изоцитратлиазы

2.2.3. Молекулярные аспекты функционирования изоферментов изоцитратлиазы в различных органах Zea mays L

2.2.3.1. Идентификация генов изоцитратлиазы методом ПЦР в щитках и зелёных листьях кукурузы

2.2.3.1.1. Подбор праймеров^

2.2.3.1.2. Идентификация генов изоцитратлиазы методом ОТ-ПЦР

2.2.3.2. Определение нуклеотидной последовательности продуктов полученных методом ПЦР

2.2.3.3. Изменение экспрессии генов изоцитратлиазы в онтогенезе в различных органах кукурузы^ j g

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химические свойства и регуляция экспрессии изоферментов изоцитратлиазы в разных органах кукурузы"

Актуальность проблемы. В последнее время изоцитратлиаза (ИЦЛ; КФ 4.1.3.1) является объектом значительного количества исследований, что обусловлено её полифункциональностью. Большинство исследователей, по-прежнему, считают ИЦЛ маркерным ферментом глиоксилатного цикла — важнейшего этапа глюконеогенеза, обеспечивающего синтез углеводов [5, 39]. Но несмотря на то, что ИЦЛ является преимущественно глиоксисомальным ферментом и участвует главным образом в глиоксилатном цикле (ГЦ), появились сведения и о наличии второй формы фермента [51, 112]. Ранее, в зелёных листьях растений была обнаружена внеглиоксисомальная изоформа фермента, существенно отличающаяся от глиоксисомальной изоцитратлиазы жирозапасающих тканей. Локализация этой формы не связана с глиоксисомами и по её внутриклеточному распределению нет чёткой ясности. Вопрос о функциональной значимости второй внеглиоксисомальной изоцитратлиазы так же остаётся дискуссионным, и есть сообщения о её участии в превращении глиоксилата, образующегося при фотодыхании в пероксисомах [18, 157]. Однако, для щитков кукурузы, являющихся метаболически наиболее активной частью семени, была выделена только одна форма ИЦЛ, обеспечивающая функционирование ГЦ [16, 88].

В настоящее время появились . сообщения по исследованию изоферментного состава изоцитратлиазы в различных организмах. Современные молекулярно-биологические методы позволили в некоторых растениях идентифицировать несколько генов, кодирующих этот ферментный комплекс, состоящий из двух изоферментов, которые выполняют различные функции [51].

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Дьяченко, Екатерина Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Динамика изоцитратлиазной активности в разных органах Zea mays L имеет характерные особенности. В щитках максимальную активность ИЦЛ наблюдали на 4-й день, в период интенсивного протекания глюконеогенеза. В зелёных листьях — на 14-е сутки, что обусловлено, по-видимому, индукцией функционирования фотодыхательного метаболизма.

3. Применение многостадийной очистки позволило получить в электрофоретически гомогенном состоянии препараты двух изоферментов изоцитратлиазы из щитков и одного из зелёных листьев кукурузы. Удельная активность одной изоформы (ИЦЛ1) составила 4,9 Е/мг белка, при этом выход 5,7 %, степень очистки 122,5 раз. Вторая изоформа (ИЦЛ2), очищенная из щитков, характеризовалась величиной удельной активности равной 4,4 Е/мг белка ( в листьях 3,05 Е/мг белка) и выходом 5,7 % (10%) и степенью очистки 110 раз (113 раз).

4. Установлено, что ИЦЛ1 и ИЦЛ2 из щитков кукурузы являются гомотетрамерами и отличаются по значениям молекулярных масс белковых молекул (164 и 208 кДа соответственно) и по величинам Мг субъединиц (43 и 48 кДа). Изоцитратлиаза из зеленых листьев имеет большое сходство по своим физико-химическим характеристикам с формой ИЦЛ2 из щитков.

5. Выявленные кинетические свойства (Км) и регуляторные характеристики (рНопт, активация ионами металлов) изоформ изоцитратлиазы свидетельствуют о высокой степени различия между ИЦЛ] и ИЦЛ2, что по-видимому, указывает на их различную генетическую детерминированность.

7. Данные по определению нуклеотидных последовательностей полученных ПЦР-продуктов показали, что исследуемые изоформы ИЦЛ являются изоферментами,, т.е. генетически детерминированными белковыми молекулами. Так, нуклеотидная последовательность ампликона с длинной 380 п.н. высокогомологична участку гена /с/1 ZMU69129, кодирующего изоцитратлиазу. Вторая нуклеотидная последовательность /с/2 имеет 100%-ю гомологию с участком гена LOCI00277287, кодирующим целое семейство изоцитратлиаз (ИЦЛ)/фосфоенолпируват мутаз (ФЕПМ). Следовательно, обнаруженные изоформы ИЦЛ являются изоферментами, т.е. генетически детерминированными белками.

8. Методом полимеразной цепной реакции в реальном времени установлена зависимость уровня экспрессии генов изоцитратлиазы от этапов онтогенеза и типов органов Zea mays L. Максимальный уровень экспрессии гена icll характерен для щитка, что обусловлено синтезом глиоксисомальной формы изоцитратлиазы — ИЦЛЬ связанной с протеканием ГЦ, который активно функционирует на этапе прорастания. Анализ профилей экспрессии гена icl2 показал чёткую корреляцию интенсивности его функционирования от типа органа. Высокая экспрессия icl2 в щитках и зелёных листьях кукурузы обеспечивает синтез внеглиоксисомальной формы ИЦЛ, участвующей, в частности, в метаболизации органических кислот при закислении эндосперма и фотодыхательном метаболизме. 9. Разработана гипотетическая схема регуляции синтеза изоферментов ИЦЛ и их физиолого-биохимическая роль в переключении метаболических потоков в растительной клетке.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные по изменению изоцитратлиазной активности в разных органах кукурузы свидетельствуют об участии исследуемого фермента в осуществлении функционирования различных метаболических путей. Известно, что ИЦЛ обеспечивает протекание глюконеогенеза и, в частности, его важнейшего звена - глиоксилатного цикла. Однако, сообщалось и о наличие внеглиоксисомальной формы изоцитратлиазы, участвующей в функционировании фото дыхания и метаболизации органических кислот [18, 80].

Наличие двух молекулярных форм ИЦЛ в Zea mays L установлено в нашей работе электрофоретическими исследованиями. Выявленные формы изоцитратлиазы имеют различную электрофоретическую подвижность, при этом полученные данные указывают, что медленнодвижущаяся - ИЦЛ2 (Rf 0,25) и быстродвижущаяся в полиакриламидном геле ИЦЛ1 (Rf 0,29) изоформы локализованы, в глиоксисомальной, пероксисомальной и цитозольной фракциях. Можно предположить, что наличие изоцитратлиазной активности в цитоплазматической фракции обусловлено методическими погрешностями, приводящими к частичному разрушению органоидов при их выделении. Интересно отметить, что внутриклеточное распределение изоцитратлиазы в сое {Glycine max L) связано с глиоксисомальной и пероксисомальной фракциями [51]. Причём в момент функционального перехода растительных тканей, вызванного сменой типа питания в клетках, одновременно присутствуют как глиоксисомы, так и пероксисомы с соответствующей им системой ферментов. После зеленения семядолей сои, профиль экспрессии генов, ответственных за глиоксисомальную функцию резко снижается, и преобладает фото дыхательная деятельность пероксисом [51].

ИЦЛ2) Е/мг белка. Из зелёных листьев выделен препарат исследуемого фермента с удельной активностью 3,05 Е/мг белка, выходом 10% и степенью очистки - 113 раз. Важную роль в разделении высокоочищенных препаратов двух изоформ сыграла стадия очистки с использованием ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Применение линейного градиента КС1, позволило получить высокую эффективность очистки и выход изоферментов. Ранее несколько форм фермента были описаны в сосне и в сое, в которых изоцитратлиаза обнаруживается, по крайней мере, в трех различных формах [151, 135].

Получение гомогенных препаратов изоферментов ИЦЛ из щитков и зеленых листьев кукурузы позволило провести сравнительное исследование их физико-химических, кинетических и регуляторных характеристик. Установлены с помощью гель-хроматографии на. Сефадексе G-200 и денатурирующего электрофореза (SDS-электрофореза) различия в величинах молекулярных масс нативных изоформ и молекулярных масс субъединиц. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что изоцитратлиаза в большинстве случаев имеет несколько субъединиц, с молекулярной массой около' 60 кДа [174], однако сообщается-о колебании величин Mr субъединиц фермента в пределах от 25 до 80 кДа [177], что часто обусловлено не только видовыми различиями, но и методическими погрешностями.

Показано, что в щитке кукурузы ИЦЛ1 и ИЦЛ2 являются. тетрамерами с молекулярной массой 164 кДа и 208 кДа соответственно. В.некоторых видах встречается иная молекулярная структура изоцитратлиазы: тримерная для фермента из прорастающей пыльцы сосны P. densiflora [41], димерная и пентамерная для фермента из огурца [63].

Кроме того, установлено, что формы изоцитратлиазы имеют различия по величинам рН оптимумов, составляющим 7,5 для ИЦЛ] и 6,0 для ИЦЛ2 и для изоформы ИЦЛ, полученной из зелёных листьев. Известно, что для ИЦЛ, выделенной из различных источников значение рН 0пт варьирует в пределах рН 7,0 - 7,5 и зависит от природы используемого буфера [143]. Различия обнаруживаются также при анализе сродства разных изоформ изоцитратлиазы к субстрату. ИЦЛ1 из щитков кукурузы имеет наибольшее сродство к изоцитрату (Км 55,6 |iM), а ИЦЛ2 и ИЦЛ из зелёных листьев характеризовались меньшим значением этого показателя. Величины Км по изоцитрату для разных изоформ составляли для ИЦЛ1 - 55,6 рМ, для ИЦЛ2 - 83,3 |iM (из щитков), а для изоцитратлиазы из зелёных листьев - 100 цМ. Выявлено, что глиоксисомальная форма изоцитратлиазы (ИЦЛ1) является Mg-зависимым ферментом, тогда как ИЦЛ2 и ИЦЛ из зелёных

Л I листьев активировались ионами Мп , т. е. данные формы фермента являются Мп-зависимыми. Катионы других металлов: Са2+; К+ и Na+ оказались мало эффективны в регуляции активности изоформ изоцитратлиазы. Выявленные физико-химические свойства и регуляторные характеристики чётко указывают на сходство изоформы изоцитратлиазы, выделенной из зелёных листьев, с ИЦЛ2 из щитков кукурузы.

Наличие сложной системы регуляции активности изоформ ИЦЛ подтверждается молекулярно-генетическим анализом, который был проведен на дрожжах и арабидопсисе и других биологических объектах. В клетках дрожжей Yarrowia lipolytica показано, что генезис изоцитратлиазной активности осуществляется тремя генами (/с/ 1, icll, /с/3) [61]. В геноме Arabidopsis thaliana присутствуют два гена ИЦЛ, расположенных в разных хромосомах (www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).

Проведенный в нашей работе подбор праймеров, осуществленный на основе сравнения аминокислотных последовательностей изоцитратлиазы из различных организмов позволил выявить в кукурузе два гена ИЦЛ — icll и /с/2. Наличие двух форм фермента в щитке кукурузы и двух ПЦР продуктов с ген-специфическими праймерами может быть результатом работы двух разных генов, кодирующих ИЦЛ в геноме кукурузы.

Путём секвенирования, полученных в ходе ПЦР ампликонов, было установлено, что нуклеотидные последовательности (/с/2) в щитках и зелёных листьях полностью совпадали друг с другом по составу и имели 100% гомологию с участком гена hypothetical protein LOCI00277287. Этот ген кодирует мультиэнзимный комплекс ИЦЛ/ФЕПМ в Zea mays L, в состав которого входят семь ферментов, в том числе и изоцитратлиаза [111]. Вторая нуклеотидная последовательность icll в щитках высокогомологична участку гена,„ответственного за синтез изоцитратлиазы в кукурузе [131].

Анализ профилей экспрессии генов изоцитратлиазы- показал значительные отличия их функционирования в разных органах, Zea mays L. Максимальный уровень экспрессии гена icll характерен для щитка, что-обусловлено синтезом глиоксисомальной изоцитратлиазы, связанной с протеканием ГЦ. В течение исследуемого периода экспрессия гена icll уменьшалась и. достигала минимального значения на 14-е сутки. Для этого периода характерно истощение запаса липидов в щитке [26, 45]. Экспрессия гена /с/2 имеет более сложный-характер изменения» в онтогенезе кукурузы. Значительная- величина этого показателя обнаружена в щитках и листьях кукурузы. Ген /с/2 кодирует внеглиоксисомальную форму ИЦЛ. Интересно отметить, что наблюдается корреляция между наличием глиоксисомальной формы изоцитратлиазы. в щитке и интенсивностью» экспрессии гена. /с/1. Профиль экспрессии гена /с/2 имеет менее лабильный характер в течение 14-ти дней. Его высокаяокспрессия обуславливает синтез второй формы ИЦЛ2 в, щитке, обеспечивающей метаболизацию органических кислот, в частности глиоксилата с помощью синтазной реакции [157]. Утилизация глиоксилата запускает процесс закисления эндосперма, что необходимо для эффективного гидролиза запасных веществ, на этапе прорастания' [26]. В листовых пластинах кукурузы ген /с/2 обеспечивает синтез изоформы изоцитратлиазы, которая посредством той же синтазной: реакции участвует в метаболизации фотодыхательного глиоксилата [157].

Таким, образом, в, кукурузе выявлены две молекулярные формы изоцитратлиазы, для которых характерна* органоспецифичность. и разная функциональная значимость. Получение в гомогенном состоянии препаратов изоформ исследуемого фермента позволило выявить значительные различия в их физико-химических, кинетических и регуляторных характеристиках. Методами молекулярной биологии установлено, что выделенные изоформы имеют различную генетическую детерминированность, т.е. являются изоферментами, обеспечивающими протекание различных физиолого-биохимических процессов в растительной клетке. На основании полученных данных предлагается гипотетическая схема регуляции образования изоферментов ИЦЛ и их физиолого-биохимическая значимость при функциональном переходе растительного организма, обусловленного сменой типов питания (рис.41).

ЩИТОК с/2

LOCI00277287) 1

ИЦЛ 2

1сП

ZMU69129)

НО;

Ш шгш

СО;

Гидролп белков I

Глицин

ШШШЛ!

Аццдоз эндосперма 1

ИЦЛ 1 I

I I

Ацетил Со-а

Липиды

Рис. 41. Гипотетическая схема регуляции образования изоферментов изоцитратлиазы и их физиолого-биохимическая значимость. LOC100277287 - ген hypothetical protein, кодирующий внеглиоксисомальную форму (ИЦЛ 2), /с/1 ZMU69129 - ген , кодирующий глиоксисомальную форму (ИЦЛ 1) в Zea mays L.

128

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дьяченко, Екатерина Владимировна, Воронеж

1. Волвенкин С. В. Субклеточная локализация и свойства ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс с аллоксановым диабетом / С.В. Волвенкин, В.Н. Попов, А.Т. Епринцев // Биохимия. 1999. -Т. 64, вып. 9. — С.1185-1191.

2. Грабович М.Ю. Особенности углеродного метаболизма у бесцветных серобактерий Macromonas bipunctata / М.Ю. Грабович, Г.А. Дубинина, В.В. Чурикова // Микробиология. 1993. -Т.62, вып. 3. - С. 421-429.

3. Детерман Г. Гель-хроматография / Г. Детерман. — М.: Мир, 1970. -173с.

4. Диксон М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб; перевод с англ. JI.M. Гинодмана, М.И. Левянт; под ред. В.К. Антонова, А.Е. Браунштейна. М.: Мир, 1982. - Т. 3. - 216 с.

5. Епринцев А. Т. Глиоксилатный цикл: универсальный механизм адаптации? / А. Т. Епринцев, В. Н. Попов, М. Ю. Шевченко. М.: ИКЦ Академ.книга, 2007. - 228с.

6. Епринцев А. Т. Очистка и физико-химические свойства изоцитратлиазы из куколок бабочки P.machaon L. / А. Т. Епринцев, М. Ю. Шевченко, В. Н. Попов. // Биохимия. 2004. - Т.69, № 4. - С. 467472.

7. Епринцев А. Т. Экспрессия и регуляция ферментов глиоксилатного цикла / А. Т. Епринцев, М. Ю. Шевченко, В. Н. Попов. Воронеж: Центрально-Черноземное книжное издательство, 2005. -224с.

8. Епринцев А.Т. Полимеразная цепная реакция как универсальный метод диагностики и идентификации генов / А.Т. Епринцев, Е.А. Москалёв, В.Н. Попов // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. 2001. -Т. 54, №1. - С. 9-14.

9. Епринцев А.Т. Роль изоформ малатдегидрогеназы в регуляции анаболических процессов у бесцветных серобактерий Beggiatoaleptomitiformis Д-402 / A.T. Епринцев, М.И. Фалалеева, М.Ю. Грабович // Микробиология. 2004. - Т. 73, № 4. -С. 437-442.

10. Особенности структурной организации и экспрессионной регуляции изоформ МДГ из Rhodobacter sphaeroides штамма 2R / A.T. Епринцев и др. // Биохимия. 2009. - Т. 74, №7. С. 977-984.

11. Глиоксилатный цикл растений / А. А. Землянухин и др.. — Воронеж: ВГУ, 1986. 148с.

12. Игамбердиев А. У. Микротельца в метаболизме растений / А. У. Игамбердиев. — Воронеж: ВГУ. 1990. 148с.

13. Игамбердиев А.У. Исследование кинетических свойств и модификаций аминокислотных остатков изоцитратлиазы из щитка кукурузы / А.У. Игамбердиев, А.А. Землянухин // Биохимия. 1987. - Т. 52, вып. 8. - С. 1286-1293.

14. Игамбердиев А.У. Роль пероксисом в организации метаболизма растений / А.У. Игамбердиев // Соросовский Образовательный журнал. 2000. - Т.6, № 12. - С. 113-124.

15. Игамбердиев А.У. Внеглиоксисомальная форма изоцитратлиазы высших растений / А.У. Игамбердиев, А. А. Землянухин, И.В. Мещерякова //Физиология растений. 1986. - Т. 33, вып.6. С. 11131120.

16. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высш. шк. 1990. - 351с.

17. Остерман JI.A. Исследование биологических макромолекул / Л.А. Остерман. -М.: Мир. 1983. 297с.

18. Индукция ферментов глиоксилатного цикла в различных тканях голодающих крыс / В.Н. Попов и др. // Известия РАН, Серия биологическая. 2000. - № 6.- С.663-667.

19. Сравнительный анализ ключевого фермента глиоксилатного цикла, изоцитратлиазы, из организмов разных систематических групп / В.Н. Попов и др. // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. — 2005.-№6.-С.317-329.

20. Роль ключевых ферментов глюконеогенеза при адаптации крыс к пищевой депривации / М. Ю. Шевченко и др. // Физиология и психофизиология мотиваций. Межрегиональный сборник научных работ.- Воронеж: ВГУ 2003. - вып. 6. - С.87-91.

21. Щипарёв С.М., Чупрова Г.В., Полевой В.В. / Вестник ЛГУ, Биология, -1976. — Т.21. С. 314-319.

22. The role of the glyoxylate cycle in the symbiotic fungus Tuber borchii: expression analysis and subcellular localization / S. Abba' et. al. // Curr Genet. 2007. -Vol.52, №3. - P. 159-70.

23. Insights into corn genes derived from large-scale cDNA Sequencing / N. N. Alexandrov et. al. // Plant Mol Biol. 2009. -Vol. 69. - P. 179-194.

24. Armin R. Effect of red light and gibberellic acid on lipid metabolism in germinating spores of the fern Anemia phyllitidis / Armin R. // Physiologia Plantarum. 1981. - Vol. 54, №1. - P. 58 - 62.

25. Promoter analysis of the acetate-inducible isocitrate lyase gene (acu-3) from Neurospora crassa / M. Bibbins et. al. I I Biochim Biophys Acta. 1998. -Vol.144, №2.-P. 320-325.

26. Blackburn P. Ribonuclease inhibitor from human placenta: interaction with derivatives of ribonuclease A / P. Blackburn, B.L. Jailkhani // J Biol Chem. -1979. Vol. 254. - P. 12488-93.

27. The structure and domain organization of Escherichia coli isocitrate lyase / K. L. Britton et. al. I I Acta Crystallogr. 2001. -Vol. 57. - P. 1209-1218.

28. The crystal structure and active site location of isocitrate lyase from the fungus Aspergillus nidulans / K. Britton et. al. I I Struct. Folding Des. — 2000.-Vol.8.-P. 349-362.

29. Anaerobic central metabolic pathways active during polyhydroxyalkanoate production in uncultured cluster 1 Defluviicoccus enriched in activated sludge communities // L.C. Burow et. al. // FEMS Microbiology Letters. -2009. -Vol.298, №1, P. 79 - 84.

30. Transient occurrence of seed germination processes during coffee post-harvest treatment / G. Bytof et. al. // Selmar Ann Bot (Lond). 2007. -Vol.100, №1.-P. 61-67.

31. Canovas D. Developmental regulation of the glyoxylate cycle in the human pathogen Penicillium marneffei / D. Canovas, A. Andrianopoulos // Mol Microbiol. 2006. -Vol.62, №6. - P. 1725-1738.

32. Non-coordinate expression of peroxisome biogenesis, «-oxidation and glyoxylate cycle genes in mature Arabidopsis plants / W. L. Charlton et. al. // Plant Cell Rep. 2005. -Vol.23. - P. 647-653.

33. Are Isocitrate Lyase and Phosphoenolpyruvate Carboxykinase Involved in Gluconeogenesis during Senescence of Barley Leaves and Cucumber Cotyledons? / Z. Chen et. al. // Plant and Cell Physiology. 2000. -Vol.41, №8.-P. 960-967.

34. Isolation and characterization of an isocitrate lyase gene from senescent leaves of sweet potato / Chen Hsien-Jung et. al. // J. of plant physiology. -2000. Vol. 157, №6. -P. 669-676.

35. Chigen T. Purification and Some Properties of Isocitrate Lyase from the Pollen of Pinus densiflora Sieb. et Zucc. / T. Chigen, E. Shin-ichiro, K. Teizo // Agricultural and Biological Chemistry. 1986. -Vol.50, №2. - P. 409-416.

36. Chomczynski P. Single-Step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. 1987. - Vol. 162. - P. 156-159.

37. Cioni M. Comparative biochemistry of the glyoxylate cycle / M. Cioni, G. Pinzauti, P. Vanni // Сотр. Biochem. Physiol. 1981. - Vol.70, №1. - P. 1-26.

38. Fat-to-glucose interconversion by hydrodynamic transfer of two glyoxylate cycle enzyme genes / P. Cordero et. al. // Lipids Health Dis. 2008. -Vol.7, №49. - P. 123-134.

39. Lipid Utilization, Gluconeogenesis, and Seedling Growth in Arabidopsis Mutants Lacking the Glyoxylate Cycle Enzyme Malate Synthase / J. E. Cornah et. al. // Biol. Chem. -2004. -Vol.279, №41. -P. 42916-42923.

40. Cots J. Germination, senescence and pathogenic attack in soybean {Glycine max. L.): identification of the cytosolic aconitase participating in the glyoxylate cycle / J. Cots, F. Widmer // Plant Sci. 1999. - Vol.149, №3. -P. 95-104.

41. Davis В. J. Disc-electrophoresis II. Method and application to human Serum protein / B. J. Davis // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1964. - Vol.121. - P. 404-427.

42. Can sugars be produced from fatty acids? A test case for pathway analysis tools // L.F. de Figueiredo et. al. // Bioinformatics. — 2009. — Vol.25, №1. -P.152-8.

43. De los Reyes B.G. Differential induction of glyoxylate cycle enzymes by stress as a marker for seedling vigor in sugar beet {Beta vulgaris) / B. G. De los Reyes, S. J. Myers, J. M. McGrath // Mol. Genet. Genomics. 2003. -Vol.269, №5.-P.692-698.

44. Purification and properties of isocitrate lyase-from Aspergillus nidulans, a model enzyme to study catabolite inactivation in filamentous fungi / J.R. De Lucas et. al. //Microbiol. 1997.-Vol.101. - P.410-414.

45. Delkin". G. Specific elements of the glyoxylate pathway play a significant role in the functional transition of the soybean cotyledon during seedling development / G. Delkin and L. Vodkin //BMC Genomics. 2007. - Vol.8, №468.-P. 1-22.

46. Demaggio A. E. Biochemistry of Fern Spore Germination. Glyoxylate and Glycolate cycle activity in Onoclea sensibilis L. / A. E. Demaggio, C. Greene // Plant Physiol. -1980. -Vol.66. P. 922-924.

47. Identification of the aceA gene encoding isocitrate lyase required for the growth of Pseudomonas aeruginosa on acetate, acyclic terpenes and leucine / A.L. Diaz-Рёгег et. al. // FEMS Microbiol Lett. 2007. -Vol.269, №2. -P. 309-316.

48. Studies on the regulation and localisation of the glyoxylate cycle enzymes in Saccharomyces cerevisiae / W. Duntze et. al. // European Journal of Biochemistry. 1969. - Vol.10. - P. 83-89.

49. Eastmond P J. Re-examining the role of the glyoxylate cycle in oilseeds // P.J. Eastmond, I.A. Graham // Trends Plant Sci. 2001. - Vol.6, №5. -P.72-77.

50. Analysis of the regulation, expression, and localisation of the isocitrate lyase from Aspergillus fumigatus, a potential target for antifungal drug development / F. Ebel et. al. // Fungal Genet Biol. 2006.- Vol.43, №7. -P.476-489.

51. Eckardt N.A. Peroxisomal citrate synthase provides exit route from fatty acid metabolism in oilseeds / N.A. Eckardt // Plant Cell. 2005. - Vol.17, №6.-P. 1863-1865.

52. Fargeix C. Soybean (Glycine max. L.) and bacteroid glyoxylate cycle activities during nodular senescence / C. Fargeix, K. Gindro, F. Widmer // J. Plant Physiol. -2004. Vol. 161. - P. 183-190.

53. Fernandez E. The ICLl gene from Saccaaromyces cerevisiae II E. Fernandez, F. Moreno, R. J. Rodicio // Biochem. 1992. - Vol.204, №1. -P. 983-990.

54. Flavell R. B. Metabolic role, regulation of synthesis, cellular localization, and genetic control of the glyoxylate cycle enzymes in Neurospora crassa / R. B. Flavell, D. O. Woodward // Journal of Bacteriology. 1971. -Vol.105.-P. 200-210.

55. Overexpression of the ICLl gene changes the product ratio of citric acid production by Yarrowia lipolytica II A. Forster et. al. // Appl Microbiol Biotechnol. -2007. -Vol.77, №4. P. 861-870.

56. Francesco R. Multisite Inhibition of Pinus pinea Isocitrate Lyase by Phosphate / R. Francesco, P. Vanni and E. Giachetti // Plant Physiol. -2000.-Vol.124, №3.-P. 1131-1138.

57. Frevert J. Occurrence and biosynthesis of glyoxysomal enzymes in ripening cucumber seeds / J. Frevert, W. Koller, H. Kindl // Physiol.Chem. 1980. -Vol.361, №10. -P.1557-1565.

58. Characterization of the glyoxysomal isocitrate lyase genes of Aspergillus nidulans (acuD) and Neurospora crassa (acu-3) / L.D. Gainey et. al. // Curr Genet. 1992. -Vol. 21, №1. - P. 43-47.

59. Modification of the active site of isocitrate lyase from Pinus pinea / E. Giachetti et. al. // Life Sci. Adv. 1993. - Vol. 12, №3. - P. 159-167.

60. Giachetti E. Effect of Mg2+ and Mn2+ on isocitrate lyase, a non-essentially metal-ion-activated enzyme. A graphical approach for the discrimination of the model for activation / E. Giachetti, P. Vanni // Biochem. 1991. — Vol. 276, №5.-P. 223-230.

61. Dual role of isocitrate lyase 1 in the glyoxylate and methylcitrate cycles in Mycobacterium tuberculosis / T. A. Gould et. al. // Mol. Microbiol. -2006 Vol. 61, №4. -P.940-947.

62. Godavari H. R. Isocitrate Lyase in Green Leaves / H. R. Godavari, S. S. Badour, E. R. Waygood // Plant Physiol. 1973. - Vol.51, №5. - P. 863867.

63. Residues С123 and D58 of the 2-methylisocitrate lyase (PrpB) enzyme of Salmonella enterica are essential for catalysis / T. L. Grimek et. al. // J. Bacteriol. 2003. -Vol. 185, -P. 4837-4843.

64. Crystal structure of 2-methylisocitrate lyase (PrpB) from Escherichia coli and modelling of its ligand bound active centre / C. Grimm et. al. // J. Mol. Biol. 2003. -Vol. 328. - P. 609-621.

65. Transcriptome of Arabidopsis leaf senescence / Y. Guo et. al. // Plant Cell EnViron. 2004. -Vol.27. - P. 521-549.

66. Hamel R.D. Modulation of TCA cycle enzymes and aluminum stress in Pseudomonas fluorescens / R.D. Hamel, V.D. Appanna // J Inorg Biochem. -2001.-Vol. 87, №1. -P. 1-8.

67. Harrison-Lowe N. Isolation of glyoxysomes from pumpkin cotyledons / N. Harrison-Lowe, L.J. Olsen // Curr Protoc Cell Biol. 2006. - Vol. 43, №1. -P. 443-447.

68. Herrington C.S. Diagnostic Molecular Pathology: A Practical Approach / C.S. Herrington, J.O.D. McGee // Oxford: Oxford Univ. Press, 1992. - P. 296.

69. Holmes R. P. The absence of glyoxylate cycle enzymes in rodent and embrionic chick liver / R. P. Holmes // Biochim. Biophys. Acta. 1993. — Vol. 1158. -P.47-51.

70. Horswill A. R. Salmonella typhimurium LT2 catabolizes propionate via the 2-methylcitric acid cycle / A. R. Horswill, J. C. Escalante-Semerena // J. Bacteriol. -1999. -Vol.181.-P. 5615-5623.

71. Activity staining of isocitrate lyase after electrophoresis on either native or sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels / W.C. Hou et. al. // Electrophoresis. -2001. -Vol:22, №13. -P. 2653-2658.

72. Hunt L. Intracellular location of isocitrate'lyase in leaf tissue / L. Hunt, J. Fletcher // Plant Science Letters. -1977. -Vol.10, №3. P. 243-247.

73. Idnurm A. Isocitrate lyase is essential for pathogenicity of the fungus Leptosphaeria maculans to canola (Brassica napus) / A. Idnurm, B. J. Howlett // Eukaryot. Cell. 2002. - Vol.1. - P.719-724.

74. Jameel S. H. Caenorhabditis elegans: purification of isocitrate lyase and the isolation and cell-free translation of poly (A+) RNA. / S. H. Jameel, B. McFadden // Exp. Parasitol. 1985. - Vol.59. - P.337-346.

75. Janssen J. A cDNA clone for isocitrate lyase from tomato / J. Janssen // Plant Physiol. -1995. -Vol.108, №3. -P. 13-39.

76. Jones J.D. The glyoxylate cycle: does it function in the dormant or active bear? / J.D. Jones, P. Burnett, P. Zollman // Сотр. Biochem. Physiol. — 1999. -Vol.124, №2. -P.177-179.

77. Kabsch W. Dictionary of protein secondary structure pattern-recognition of hydrogen-bonded and geometrical features / W. Kabsch, C. Sander //

78. Biopolymers. 1983. - Vol.22. - P. 2577-2637.

79. Kamel M. Y. Biochemical studies of tick embriogenesis. Purification and partial characterisation of isocitrate lyase from eggs of the tick Hyalomma dromedarii / M. Y. Kamel, A. S. Fahmy // Сотр. Biochem. Physiol. B. — 1982.-Vol. 72. — P.107-115.

80. A regulatory factor, Fillp, involved in derepression of the isocitrate lyase gene in Saccharomyces cerevisiae / T. Kanai et. al. // European Journal of Biochemistry. 2001. -Vol.256, №1, -P. 212 - 220.

81. Khan F.R. Isocitrate Lyase from Flax. Terminal Residues, Composition, Active Site, and Catalysis / F.R. Khan, B. A. McFadden // Plant Physiol. -1982. -Vol.70, №4. P. 943-948.

82. Kim K.W. Glyoxysomal Nature of Microbodies Complexed with Lipid Globules in Botryosphaeria dothidea / K.W. Kim, E.W. Park, K.S. Kim // Phytopathology. 2004. - Vol.94, №9. - P. 970-977.

83. Evolution of glyoxylate cycle enzymes in Metazoa: evidence of multiple horizontal transfer events and pseudogene formation / F.A. Kondrashov et. al. //Biol Direct. -2006. -Vol.1, №31. P. 658-667.

84. Kornberg, H. L., Synthesis of cell constituents from C2-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / H. L. Kornberg, H. A. Krebs // Nature. 1957. — Vol.179, №.4568. - P. 988-991.

85. Function and transcriptional regulation of the isocitrate lyase in Pseudomonas aeruginosa / U. Kretzschmar et. al. // Arch Microbiol. -2008 B.190, №2. -P.151-158.

86. The purification and characterization of phosphonopyruvate hydrolase, a novel carbon-phosphorus bond cleavage enzyme from Variovorax sp Pal2 / A. N. Kulakova et. al. // J. Biol. Chem. 2003. -Vol.278. - P. 2342623431.

87. The roles of the glyoxylate and methylcitrate cycles in sexual development and virulence in the cereal pathogen Gibberella zeae / S.H. Lee et. al. // Eukaryot Cell. 2009. - Vol. 157. - P. 1139-1147.

88. Inhibition of Candida albicans isocitrate lyase activity by sesterterpene sulfates from the tropical sponge Dysidea sp. / D. Lee et. al. // Bioorg Med Chem Lett. 2008. -Vol. 18, №20. - P: 5377-5380.

89. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. -Vol.227. - P. 680-685.

90. Isocitrate lyase from Mycobacterium tuberculosis promotes survival of Mycobacterium smegmatis within macrophage by suppressing cell apoptosis / J.M. Li et. al. // Chin Med J (Engl).- 2008: -Vol.121, №12. P: 11141123.

91. Differential expression of isocitrate lyase in P. marneffeiphagocytized by nonstimulated and stimulated murine macrophages / J. Li et. al. // Chinese. 2007. -Vol.27, №5. - P. 631-634.

92. Lingard M.J. Peroxisome-associated matrix protein degradation in Arabidopsis / M.J. Lingard, M. Monroe-Augustus, B; Bartel// Natl Acad Sci U S A. -2009. Vol.106, №11. - P. 4561-4567.

93. Purification; identification, and characterization of peanut isocitrate lyase / S. F. Lin et. al. II J Agric Food Chem. -2008.- Vol.56, №6. -P.1845-1851.

94. Liu F. Induction of glyoxylate cycle expression in Caenorhabditis elegans: a fasting response throughout larval development / F. Liu, J. D. Thatcher, H. F. Epstein // Biochemistry. 1997. - Vol. 36. - P.255-260.

95. Liu F. Bifimctional glyoxylate cycle protein of Caenorhabditis elegans: a developmentally regulated protein of intestine and muscle / F.1.u, J. D. Thatcher, J. M. Barral // Dev. Biol. 1995. - Vol.169. - P.399-414.

96. Conformational flexibility of PEP-mutase / S. Liu et. al. // Biochemistry. 2004. -Vol.43. - P. 4447-53.

97. Dissociative phosphoryl transfer in PEP mutase catalysis: Structure of the enzyme/sulfopyruvate complex and kinetic properties of mutants / S. Liu et. al. // Biochemistry.-2002.-Vol.41.-P. 10270-10276.

98. Crystal structures of 2-methylisocitrate lyase in complex with product and with isocitrate inhibitor provide insight into lyase substrate specificity, catalysis and evolution / S. Liu et. al. // Biochemistry. — 2005. -Vol.44. -P. 2949-2962.

99. Effects of CO2 on respiratory metabolism in ripening banana fruit / S. Liu et. al. // Postharvest Biology and Technology. — 2004. Vol.33, №1. -P. 27-34.

100. Lorenz M. C. The glyoxylate cycle is required for fungal virulence / M. C. Lorenz, G. R. Fink//Nature. -2001. -Vol.412. -P.83-86.

101. Protein measurement with Folin phenol reagent / O.H. Lowry et. al. // J. Biol. Chem. 1951. - Vol.193, №1. - P. 265-275.

102. Diversity of function in the isocitrate lyase enzyme superfamily: the Dianthus caryophyllus petal death protein cleaves alpha-keto and alpha-hydroxycarboxylic acids / Z. Lu et. al. // Biochemistry. 2005. - Vol.44. -P.16365-16376.

103. The Saccharomyces cerevisiae ICL2 Gene Encodes a Mitochondrial 2-Methylisocitrate Lyase Involved in Propionyl-Co-A Metabolism / A. H. Luttik et. al. // Journal of Bacteriology. 2000. - Vol.182, №5. - P. 70077013.

104. Malhotra O.P. Isolation and characterization of isocitrate lyase of caster endosperm / O.P. Malhotra, P.K. Srivastava // Archives of Biochemistry and Biophysics. -1982. -Vol. 214. P. 164-171.

105. Maniatis T. Molecular cloning / T. Maniatis, E.F. Frisch // J.

106. Sambrook// Cold Spring Harbor Lab. 1982. - Vol.65. - P. 141-146.

107. Masaaki U. Properties of isocitrate lyase from an alkane-utilizable yeast, Candida tropicalis / U. Masaaki, M. Ueda, T. Matsuki // Agr. And Biol. Chem. 1986. - Vol.50, №1. - P.127-134.

108. Menendez J. The ICL1 gene of Pichia pastoris, transcriptional regulation and use of its promoter / J. Menendez, I. Valdes, N. Cabrera // Yeast. 2003. - Vol.20, №13. - P. 1097-1108.

109. Overexpression of isocitrate lyase-glyoxylate bypass influence on metabolism in Aspergillus niger / S. Meijer et. al. // Metab. Eng. 2009. -Vol.11, №2. - P. 107-123.

110. L-Malyl-coenzyme A — Methylmalyl-coenzyme A lyase is involved in acetate assimilation of the isocitrate lyase-negative bacterium Rhodobacter capsulatus / M. Meister et. al. // J. Bacteriol. 2005. - Vol.187, № 4. - P. 1415-1425.

111. Millerd A. Role of isocitrate lyase in the synthesis of oxalic acid in plants / A. Millerd, R. K. Morton, J. R. Wells // Nature. 1962. -Vol.196.-P. 955-956.

112. Mullen R. T. Isocitrate lyase from germinated loblolly pine megagametophytes: enzyme purification and immunocharacterization / R. T. Mullen, D. J. Gifford // Plant Physiol, and Biochem. 1995. - Vol.33, №1. -P.87-95.

113. Mullen R.T. Regulation of two loblolly pine (Pinus taeda L.) isocitrate lyase genes in megagametophytes of mature and stratified' seeds and during postgerminative growth / R.T. Mullen, D.J. Gifford // Plant Mol Biol. -1997. Vol.33, №4. - P. 593-604.

114. Mullis K.B. Specific synthesis of DNA in vitro via- a polymerase-catalyzed chain reaction / K.B. Mullis, F.A. Faloona // Methods Enzymol. -1987.- №155.-P. 335-350.

115. Munir E. Purification and Characterization of Isocitrate Lyase from the Wood-Destroying Basidiomycete Fomitopsis palustris Grown on

116. Glucose / E. Munir, T. Hattori, M. Shimada // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2002. -Vol.399, №2. - P. 225-231.

117. Murray C. J. Modeling the impact of global tuberculosis control strategies / C. J. Murray, J. A. Salomon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998. -Vol.95, №13. -P. 881-886.

118. Molecular characterization of a bifunctional glyoxylate cycle enzyme, malate synthase/isocitrate lyase, in Euglena gracilis / M. Nakazawa et. al. // Comp Biochem Physiol В Biochem Mol Biol. -2005.- Vol.141, №4. -P.445-452.

119. Nguyen A.T. Metal-catalyzed oxidation induces carbonylation of peroxisomal proteins and^ loss of enzymatic activities / A.T. Nguyen, R.P. Donaldson // Arch Biochem Biophys. 2005. - Vol.439, №1. - P.25-31.

120. Okayama H. High-efficiency cloning of full-length cDNA; construction and screening of cDNA expression libraries for mammalian cells / H. Okayama // Methods Enzymol. 1987. - Vol. 154. - P. 3-28.

121. Ono K. Presence of glyoxylate cycle enzymes in the mitochondria of Euglena gracilis / K. Ono, M. Kondo, T. Osafiine // J. Eukaryot. Microbiol. 2003. - Vol.50, №2. - P.92-96.

122. Расу В. J. Distribution of Isocitrate Lyase in Induced and De-adapting Cells of the Green Alga Chlorellafusca / B. J. Расу, С. F. Thurston // Journal of General Microbiology. 1987. -Vol.133. - P. 3341-3346.

123. Inhibition of germination gene expression by Viviparous-1 and ABA during maize kernel development / N.C. Paek et. al. // Mol Cells. 1998. -Vol.8, №3.-P. 336-342.

124. Penfield S. Storage reserve mobilization and seedling establishment in Arabidopsis / S. Penfield, H.M. Pinfield-Wells, I.A. Graham // The

125. Arabidopsis Book American Society of Plant Biologists. — 2006. —Vol. 54. — P.l-17.

126. Reserve mobilization in the Arabidopsis endosperm fuels hypocotyls elongation in the dark, is independent of abscisic acid, and requires phosphoenolpyruvate carboxykinasel / S. Penfield et. al. // Plant Cell. -2004.-Vol. 16, №8.-P. 2705-2718.

127. Phue J. N. Transcription levels of key metabolic genes are the cause for different glucose utilization pathways in E. coli В (BL21) and E. coli К (JM109) / J. N. Phue, J. Shiloach // J. Biotechnol. 2004. - Vol. 109; №2. -Р.2Г-30.

128. Pinzauti G. Isocitrate lyase of conifers (Pinus pined) / G. Pinzauti, E. Giachetti, P. Vanni // Int. J. Biochem. 1982. - Vol. 14, №4. - P.267-275.

129. Polanowski AJ. Soybean isocitrate lyase: Purification, immunoassay and N-terminal sequence / A.J. Polanowski, R.L. Obendorf // Plant Physiol. Biochem. -1991.-Vol.29.-P. 119-129.

130. Cloning, overexpression and mechanistic studies of carboxyphosphonoenolpyruvate mutase from Streptomyces hygroscopicus / S. J. Pollack et; al. // Eur. J. Biochem. 1992. -Vol.209. - P.735-743.

131. Popov V.N. Induction of glyoxylate cycle enzymes in rat liver upon food starvation / V. N. Popov, A. U. Igamberdiev, C. Schnarrenberger // FEBS Lett. 1996. - Vol. 390. - P. 258-260.

132. Popov V.N. Glyoxylate cycle enzymes are present in liver peroxisomes of alloxan-treated rats / V. N. Popov, S. V. Volvenkin, A. T. Eprintsev // FEBS Lett. 1998. - Vol. 440. - P.55-58.

133. Pracharoenwattana I. When is a peroxisome not a peroxisome? / I.

134. Pracharoenwattana; S.M. Smith // Trends Plant Sci. 2008. -Vol.13, №10. -P. 522-527.

135. The role of isocitrate lyase and the glyoxylate cycle in Escherichia coli growing under glucose limitation / R. Prasad Maharjan et. al. //Res Microbiol. -2005 Vol.156, №2. -P. 178-183.

136. Ranaldi F. Enzyme catalysis im microgravity: steady-state kinetic analysis of the isocitrate lyase reaction / F. Ranaldi, P. Vanni^E. Giachetti // Biophys Chem. 2003. - Vol.103, №2. - P. 169-177.

137. Reeves H.C. Determination; of isocitrate lyase activity in polyacrylamide gels / H.C. Reeves, M.J. Volk // Anal. Biochem. 1972. -Vol. 48, №2.-P. 437-441.

138. Rozen S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers / S. Rozen, IT. Skaletsky // Methods Mol. Biol. 2000. Vol. 132.-P. 365-386.

139. Isocitrate lyase from Phycomyces blakesleeanus. The role of Mg2+ ions, kinetics and evidence for two; classes of modifiable thiol; groups / J; Rua et. ab. // Biochem J. 1990. -Vol. 272, №2. - P.359-367.

140. Ruchti M. Isocitrate Lyase from Germinating Soybean Cotyledons: Purification and Characterization / M. Ruchti, F. Widmer // Journal of Experimental-Botany. 1986: - Vok 37, №11. — P.U685-1690/ •

141. Aspergillus; fumigatusi does not require fatty acid: metabolism via isocitrate lyase for development of invasive aspergillosis / F. Schobel et. аЩ[/1 Infect Immum 2007. -Voh75< №3*; -P. 1237-1244.

142. Schloss J.V. Inhibition of isocitrate: lyase by 3-nitropropionate, a-, reaction-intermediate: analogue / J.V. Schloss/ W. W. Cleland II Biochemistry. 1982.-Voh21, №18. -P. 4420^4427.

143. Biochemical and Structural; Studies of Malate Synthase from Mycobacterium tuberculosis / С. V. Smith et. al. // J. Biol. Chem. — 2003. -Vol.278.-P. 1735-1743

144. Sohn O.J. Flow injection analysis system for monitoring of succinic acid in Biotechnological processes / OJ. Sohn, K.A. Han, J.I. Rhee // Talanta Links. 2005. - Vol.65, №1. - P. 185-191.

145. Song S. Can the glyoxylate pathway contributes to fat-indused hepatic insulin: resistance? / Si Song // Med. Hypotheses; 2000. - Vol. 54. - P:739-747.

146. Mycobacterium tuberculosis ketopantoate hydroxymethyltransferase: Tetrahydrofolate-independent hydroxymethytransferase and enolization reactions with R-keto acids / M. Sugantino et. al. // Biochemistry. 2003. -Vol.42.-P. 191-200.

147. Sequence and analysis of chromosome, V of the plant Arabidopsis tha liana / A. Theologis et. al. II Nature. 2000. -Vol.408.-P. 816-820.

148. Tzachi В. Kinetic Outlier Detection (KOD) in real-time PCR / / B. Tzachi //Nucleic Acids Research. 2003. - Vol. 31. - P. 105-109.

149. The glyoxylate cycle in germinating Ginkgo biloba seeds / P. Vanni et. al.,// Can. J. Biochem. 1973. - Vol.51, №6. - P. 961-964.

150. Isocitrate lyase activity is required for virulence of the intracellular pathogen Rhodococcus equi / D. M. Wall et. ah. // Infect. Immun. -2005.-Vol.73, №10. -P.6736-6741.

151. The cold-inducible icl gene encoding thermolabile isocitrate lyase of a psychrophilic bacterium, Colwellia maris / S. Watanabe et. al. // Microbiology. -2002 Vol.148. -P.2579-2589.

152. Ying L.U. Anaerobic Induction of Isocitrate Lyase and Malate Synthase in Submerged Rice Seedlings Indicates the Important Metabolic

153. Role of the Glyoxylate Cycle / L.U. Ying, W.U. Yong-Rui, H. Bin // Acta Biochimica et Biophysica Sinica. -2005. -Vol.37, №6. -P. 406-414.

154. Yanik T. A protective association between catalase and isocitrate lyase in peroxisomes / T. Yanik, R.P. Donaldson // Arch Biochem Biophys. 2005. - Vol.435, N2. - P. 243-252.

155. Gene expression profiling in the human pathogenic dermatophyte Trichophyton rubrum during growth on proteins / C. Zaugg et. al. // Eukaryot Cell. 2009.-Vol.8, №2.- P.241-250.

156. Two classes of isocitrate lyase genes are expressed during late embryogeny and postgermination in Brassica napus L / J.Z. Zhang et. al. // Molecular and General Genetics. 1993. -Vol.238, №2. - P. 177-184.

157. Zelitch I. Synthesis of Glycolate from Pyruvate via Isocitrate Lyase by Tobacco Leaves in Light / I. Zelitch // Plant Physiol. -1988. -Vol.86, №2. -P.463-468.

Информация о работе

Дьяченко, Екатерина Владимировна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Физико-химические свойства и регуляция экспрессии изоферментов изоцитратлиазы в разных органах кукурузы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы