Изоцитратлиаза из сои

Чан Тхи Хоанг Куен

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изоцитратлиаза из сои
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изоцитратлиаза из сои"

На правах рукописи

Чан Тхи Хоанг Куен

ИЗОЦИТРАТЛИАЗА ИЗ СОИ: ОЧИСТКА, КАТАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ ¡с1, И Ш2 И РЕГУЛЯЦИЯ ИХ ЭКСПРЕССИИ

Специальность 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

- 9 ДЕК 2010

Воронеж-2010

004616240

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Корняева Ольга Сергеевна кандидат биологических наук Семенова Елена Васильевна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук «Институт биофизики клетки РАН»

Защита состоится « 17 » декабря 2010 года в 1330 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 59.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет».

Автореферат разослан « » ноября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Грабович М. Ю.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последнее время ферменты глиоксилатного цикла являются объектами значительного количества исследований. Глиоксилатный цикл выступает важнейшим этапом глюконеогенеза, т. к. осуществляет синтез из двух молекул ацетил-КоА одной молекулы сукцината, используемой в дальнейших реакциях, что обеспечивает синтез углеводов. Этот метаболический процесс имеет широкое распространение в природе, функционируя в различные физиологические периоды жизни многих организмов. В жирозапасающих тканях растений основной функцией глиоксилатного цикла считается участие в глюконеогенезе при мобилизации запасных жиров. У высших растений малатсинтаза и особенно изоцитратлиаза присутствуют в тканях, активно утилизирующих жиры. Обычно активность глиоксилатного цикла коррелирует с содержанием жира в семенах. Епринцев А. Т. с соавт. (2007) показали, что при прорастании семян запасные жиры, являющиеся водонерастворимыми, превращаются в углеводы, которые дальше транспортируются к метаболически активным точкам, где утилизируются в энергетических и анаболических процессах. Физиологическая роль глиоксилатного цикла для растений - важный этап глюконеогенеза, обеспечивающий растущий организм в условиях гетеротрофного питания доступными формами органического вещества.

Ключевыми ферментами глиоксилатного цикла являются изоцитратлиаза (ИЦЛ; КФ 4.1.3.1) и малатсинтаза. Изоцитратлиаза - фермент «метаболической вилки», как правило, является матриксным энзимом глиоксисом [Игамбердиев А. У., 1990]. ИЦЛ легко высвобождается из органелл после осмотического шока, причём при наличии нескольких изоформ фермента никаких различий в их локализации не наблюдалось. Ферменты в одинаковой степени солюбилизируются из глиоксисом в растворимую фракцию при выделении органелл и одинаково хорошо освобождаются из них при осмотическом шоке. При градиентном фракционировании клеточных органелл процент солюбилизации изоцитратлиазы из глиоксисом оказывался неодинаковым для разных растений. В семядолях сои было обнаружено две формы изоцитратлиазы в глиоксисомах. Однако, в настоящее время, в ряде работ показано, что в зелёных листьях изоцитратлиаза локализована в пероксисомальной фракции [Makoto Hayashi, 2006]. В клетке могут одновременно присутствовать пероксисомальная и глиоксисомальная ИЦЛ, выполняющие по всей видимости, различные функции в метаболизме растительной клетки [Yvonne Nyathi, 2006]. Два уникальных фермента глиоксилатного цикла изоцитратлиаза и малатсинтаза присутствуют в развивающихся семенах, листьях, пыльце и в других органах (корнях, лепестках и плодах), а также в различных типах клеточных культур и т. д.. После прорастания, важнейшей функцией масличной пероксисомы в Arabidopsis sp. является трансформация жирных кислот в углеводы до начала фотоавтотрофного роста. Ферменты глиоксилатного цикла изоцитратлиаза и малатсинтаза преобразуют ацетил-КоА из жирных кислот в субстраты

глюконеогенеза и находятся в пероксисомах зрелых прорастающих семян и саженцев [Lingard М. J., 2009].

К настоящему времени ИЦЛ очищена до гомогенного состояния из многих видов микроорганизмов, грибов [Kazuo N. et. al., 1989], высших растений [Игамбердиев А. У. и др., 1990], нематод [Liu F., 1997], клещей [Kamel М. Y., 1982], насекомых [Епринцев А. Т. и др., 2004] и крыс [Popov V.N., 1996]. Известно, что изоцитратлиаза в растениях представлена несколькими изоформами, имеющими различную локализацию в клетке.

В последнее время сообщается об использовании этого фермента при диагностике заболеваний растений. Так, Бауер П. с соавт. [Bowyer P. et. al., 2000] показали, что созданная ими конструкция гибрида промотора гена ИЦЛ Neurospora crassa с геном флуоресцирующего белка, экспрессировалась и заметно индуцировалась во время инфекции в паразите пшеницы Tapesia yallundae.

В настоящее время одной из важнейших культур в растительном мире признана соя, семена которой являются великолепной комбинацией жирных кислот и высокоценного растительного белка, в связи с чем служат объектом большого количества исследований. Отличительной особенностью сои является самое высокое содержание фосфолипидов по сравнению с другими культурами. Фосфолипиды способствуют регенерации мембран, увеличивают детоксикационную способность печени, обладают антиоксидантной активностью, снижают у диабетиков потребность в инсулине, предотвращают дегенеративные изменения в нервных клетках, мышцах, укрепляют капилляры. Полиненасыщенные жирные кислоты являются предшественниками в биосинтезе гормоноподобных веществ — простагландинов, одной из многочисленных функций которых является препятствование отложению холестерина в стенках кровеносных сосудов, приводящего к образованию атеросклеротических бляшек. Наличие очень большого количества токоферолов в соевом масле обусловливает его способность в наибольшей степени повышать защитные свойства организма, замедлять старение. Поэтому представляется чрезвычайно важным охарактеризовать регуляторные свойства ферментов сои в прорастающих семенах и особенно при смене типов питания.

Цель работы. Целью нашей работы являлось получение в гомогенном состоянии препаратов изоформ изоцитратлиазы из сои, изучение их физико-химических, регуляторных и кинетических характеристик, выявление генетической детерминированности и исследование уровня экспрессии генов изоцитратлиазы у прорастающих семян. Задачи исследования.

1. Выявить динамику активности, изоферментный состав и субклеточную локализацию изоцитратлиазы в проростках сои.

2. Получить электрофоретически гомогенные ферментные препараты изоцитратлиазы из проростков сои.

3. Изучить физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики изоцитратлиазы.

4. Разработать высокоспецифические праймеры для идентификации генов ИЦЛ с использованием методов сравнительной геномики.

5. Провести ОТ-ПЦР анализ мРНК для идентификации генов, кодирующих изоферменты изоцитратлиазы.

6. Секвенировать участки генов изоферментов изоцитратлиазы из сои и провести сравнительный анализ с генами ИЦЛ других организмов.

7. Провести количественный анализ уровня экспресии генов изоцитратлиазы сои на разных этапах онтогенеза методом ПЦР в реальном времени.

Научная новизна. Изменение в динамике активности изоцитратлиазы на первых этапах прорастания связано с мобилизацией запасных жиров и липидов. Выявлена чёткая зависимость генезиса активности изоцитратлиазы от сорта сои и условий выращивания.

Полученные результаты изучения субклеточной локализации изоцитратлиазы позволяют предположить, что в клетке изоцитратлиаза может находиться в глиоксисомальной, пероксисомальной и цитоплазматической фракциях. Большая часть активности изоцитратлиазы сосредоточена в пероксисомах, тогда как в цитоплазме активность фермента находится в пределах загрязнения.

Получение гомогенных препаратов изоформ изоцитратлиазы из проростков сои позволило исследовать их физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики.

В данной работе праймеры для амплификации гена ИЦЛ были подобраны на основе сравнительного анализа последовательностей нуклеотидов изоцитратлиазы из различных организмов. Секвенирование полученных в ходе ПЦР-продуктов показало, что выделенные после очистки изоформы изоцитратлиазы имеют различную генетическую детерминированность, т. е. являются изоферментами, обладающими различной функциональной значимостью.

Выявлена зависимость изменения уровня экспрессии генов г'с/; и ¡с/гЛт времени прорастания семян и зеленения проростков сои. Полученные данные по динамике экспрессии генов изоцитратлиазы позволяют оценить изменение скорости функционирования глиоксилатного цикла и выдвинуть предположение, о его роли в метаболизме при прорастании семян и переходе их к фотосинтезу» В первые дни прорастания зародыш ещё не способен к фотосинтезу и получает необходимую энергию в процессе дыхания. Происходит активация глюконеогенетических процессов, физиологическая роль которых заключается в мобилизации запасных веществ. Однако, по мере зеленения проростков функцию обеспечения растения энергией берёт на себя фотосинтез, в связи с чем необходимость в глюконеогенезе значительно снижается по сравнению с первыми днями.

Практическая значимость. С помощью четырёхстадийной очистки с высокой эффективностью можно получать электрофоретически гомогенные

препараты изоформ ИЦЛ. Использование изоформ изоцитратлиазы, выделенных из семядолей семян сои, открывает большие возможности для применения фермента в качестве аналитического реагента и создания на его основе биосенсоров для биохимических и кинетических анализов, в частности, для определения концентрации глиоксиловой кислоты (прямая реакция) или изоцитрата (обратная реакция) в биохимических пробах.

Материалы диссертационной работы используются в ходе учебного процесса на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета, при чтении лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии, спецкурсов по энзимологии и генетической инженерии, кроме того, они находят применение при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на студенческой научной конференции по итогам работы за 2006 год (ВГПУ, 2007), 12-й международной Пущинской конференции молодых учёных «Биология — наука 21-ого века» (Пущино, 2008), международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), 3-й международной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (Белгород, 2008), межрегиональных конференциях, посвященных памяти А. А. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2007, 2008,2009,2010).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях — 7 статьях и 5 тезисах.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (215 источников). Иллюстрационный материал включает 36 рисунков, 6 таблиц.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В качестве объектов исследования использовали различные сорта сои: вьетнамский «DT-84», белорусский «Игорь» и «Воронежский-31», выращенные гидропонным способом в темноте и на свету при 25°С для моделирования физиологического перехода, обусловленного изменением типа питания с гетеротрофного на автотрофный.

Схема очистки изоцитратлиазы. Для получения высокоочищенных препаратов ИЦЛ были модифицированы применяемые схемы очистки [Остерман Л. А., 1983], включающие следующие этапы:

1. Гомогенизация материала в среде выделения.

2. Высаливание сульфатом аммония (NH4)2S04.

3. Гель-фильтрация на сефадексе G-25.

4. Хроматография на ионообменнике ДЭАЭ-целлюлозе.

5. Гель-хроматография на сефадексе G-150.

Определение активности фермента. Активность изоцитратлиазы измеряли спектрофотометрически на СФ-2000 (Россия), по изменению поглощения света при длине волны 324 нм, за счёт образования комплекса фенилгидразина с глиоксилатом [Kornberg Н. L., 1957].

Определение количества белка. Общее количество белка определяли по методу Лоури с соавт. [Lowry О. Н. et. al., 1951].

Электрофоретнческне исследования белков. В ходе исследований использовался метод диск-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). Пробы на гомогенность окрашивали 0,05%-м раствором кумасси бриллиантового голубого G-250 или раствором нитрата серебра. Специфическое проявление ИЦЛ проводили с помощью модифицированного реагента Шиффа [Reeves Н. С., 1972].

Определение молекулярной массы нативного фермента. Для исследования молекулярной массы нативной ИЦЛ использовали гель-хроматографию через колонку с сефадексом G-200 [Детерман Г., 1970].

Определение массы субъединиц фермента. Для определения молекулярной массы субъединиц применяли метод SDS-ПААГ-электрофореза [Hou W. С. et. al., 2001, Остерман Л. А., 1983].

Исследование субклеточной локализации. Исследование субклеточной локализации проводили с помощью дифференциального центрифугирования [Волвенкин С. В., 1999] на центрифуге Eppendorf 581 OR (Германия) и изоплотностного центрифугирования на центрифуге Beckman (США) в градиенте плотности сахарозы [Schnarrenberger С., 1971, Землянухин А. А. и др., 1996, Popov V. N. et. al., 1998].

Экстракция суммарной РНК.

Суммарную РНК выделяли из объекта с использованием двух различных методов: гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформного метода [Herrington С. S., 1992] и с помощью колонок Bio-Rad (США), оптимизированных для выделения суммарной РНК из жирных и волокнистых тканей.

Выделение геномной ДНК. Геномную ДНК выделяли с помощью фенол-хлороформной экстракции в присутствии мочевины (http://molbiol.ru/ protocol/14_06.htmn

Определение количества РНК. Концентрацию РНК в растворе определяли спектрофотометрически на СФ-2000 при длине волны 260 нм.

Определение количества ДНК. Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (ND Technologies, США).

Обратная транскрипция. Для проведения обратной транскриции использовали MulLV-обратную транскриптазу (фермент ретровирусов, синтезирующих цепь ДНК на РНК матрице). В качестве праймера использовали олиго-^Т)20, что позволило получить ДНК, комплементарную мРНК [Okayama Н., 1987].

Подбор праймеров. Осуществляли в наиболее консервативных участках

гена на основе сравнения последовательностей ИЦЛ из разных организмов. Последовательности были взяты из баз данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) И Ensembl (http://www.cnsembl.org/index.htmn. Выравнивание осуществляли с помощью программы ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/ClustalW2') и Jalview 2.5 (http://en.bio-soft.net/format/Jalview. html).

Полимеразная цепная реакция. Проводили ПЦР на приборе «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) со следующими параметрами амплификации: предварительная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 35 циклов: денатурация при 95°С - 20 сек, отжиг 48°С - 20 сек, удлинение 72°С - 30 сек.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Для выявления уровня экспрессии генов и её изменения проводили ПЦР в реальном времени на приборе DNA Engine® Thermal Cycler «Chromo4» ("Bio-Rad", США). В качестве красителя использовали SYBR Green I [Tzachi В., 2003]. Для ПЦР-РВ были специально подобраны геноспецифические праймеры:

для ich: прямой - 5-TTCCCCTAGAGCGTTTCTGA-3';

обратный - 5'-ATCGCACACCCACTTACCTC-3';

для ich прямой - 5'-GTCCCAGTCCCAGАА-3';

обратный - 5'-ATCGAGGACGAGTGG-3'.

Параметры амплификации: предварительная денатурация при 95°С в течение 5 мин, затем 35 циклов: 95"С - 20 сек, 60°С - 20 сек, 72°С - 15 сек (детекция) и наконец, финальная элонгация 72°С - 4 мин.

Выделение ДНК из полиакриламидных гелей. Полосы ДНК вырезали из ПААГ и экстрагировали по методике, описанной в [Маниатис, 1984].

Секвенирование ПЦР-продуктов. В основе автоматического секвениро-вания лежит метод ферментативного копирования с использованием терминирующих ddNTP, при этом терминирующие субстраты содержат флуоресцентные метки. Автоматическое секвенирование использует флуоресцентные метки на ddNTP, включает две стадии: проведение терминирующих реакций и разделение продуктов этих реакций с помощью электрофореза. Как правило, автоматизирована лишь вторая стадия, т. е. разделение меченных фрагментов ДНК в ПААГ, получение спектра эмиссии флуорофоров и последующий обсчет собранных данных. После проведения капиллярного электрофореза, результат детектируют на компьютере. Последовательное считывание отличающихся по цвету фракций даёт возможность выстроить последовательность нуклеотидов в секвенируемом фрагменте.

Концентрацию экстрагированных ампликонов измеряли на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (США). Секвенирование ПЦР-продуктов проводили в ООО «Евроген» (Москва).

Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот.

Электрофорез РНК и ДНК обычно проводили в 1% агарозном геле с использованием трис-ацетатного буфера 1х ТАЕ (40 мМ трис, pH 8,2; 0,1% уксусная кислота, 50 мМ ЭДТА) с напряжением 100 В в течение 40 мин.

Электрофорез ПЦР-продуктов и очистку ампликонов проводили на 5% ПААГ с напряжением 200 - 250 В и силой тока 70-110 мА. Электрофорезный буфер (1х ТВЕ) включал в себя: 0,89 М трис, 0,89 М борная кислота, 20 мМ ЭДТА, рН 7,5.

Статистическая обработка данных. Опыты проводили в трёх повторностях. Аналитическое определение для каждой пробы осуществляли в двух повторностях. В таблице и на рисунках приведены данные типичных опытов, где каждое значение есть среднее арифметическое. При математической обработке использовали статистический критерий Стьюдента [Лакин Г. Ф., 1990].

ДИНАМИКА АКТИВНОСТИ ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ СОИ РАЗНЫХ СОРТОВ

Изучение динамики активности изоцитратлиазы из Glycine max L. сортов вьетнамского «DT-84», белорусского «Игорь», «Воронежский-31» показало, что она имеет колоколообразный вид. Максимальные значения удельной активности изоцитратлиазы при прорастании семян сои на свету наблюдали на 5-й день у вьетнамского сорта «DT-84» и сорта «Воронежский-31», на 3-й у растений белорусского сорта «Игорь». В темноте картина динамики активности отличается только у сорта «Воронежский-31» (рис. 1,2).

Рис. 1. Динамика активности Рис. 2. Динамика активности

изоцитратлиазы в сое на свету изоцитратлиазы в сое в темноте

1 - вьетнамский сорт «ОТ-84», 2 - сорт «Воронежский-31», 3 - белорусский сорт «Игорь»

В условиях гетеротрофного питания метаболизм растительного организма осуществляет мобилизацию запасных веществ с большей интенсивностью. Анализ полученных данных по динамике изоцитратлиазной активности показывает сортовую специфичность, обусловленную генотипическими свойствами сортов сои.

СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ СОИ

Субклеточную локализацию изоцитратлиазы определяли методом дифференциального центрифугирования, в ходе которого выделили пероксисомальную и цитоплазматическую фракции. Как видно из полученных данных, активность ИЦЛ распределилась по фракциям неравномерно (таб. 1). Наибольшая активность фермента сосредоточена преимущественно в осадке (84,26%), содержащем грубую фракцию пероксисом. Полученные результаты позволяют предположить, что исследуемый фермент имеет преимущественно пероксисомальную локализацию, поскольку активность фермента в цитоплазме находится в пределах загрязнения.

Таблица 1. Локализация изоцит ратлиазы в семядолях сои п=3, Р<0,05

Фракции Фермент V, мл Общая активность, Е Уд. акт., Е/мг белка Процент содержания фермента, %

Цитоплазма ИЦЛ 2 0,82 0,15 15,74

Каталаза 2 1,08 0,20 21,34

Пероксисомы ИЦЛ 2 4,39 0,97 84,26

Каталаза 2 3,98 0,88 78,66

При специфическом проявлении гелей, содержащих пробы полученных фракций ИЦЛ, было установлено наличие белковых зон, которые обладали активностью ИЦЛ. В суммарной фракции гомогената и фракции пероксисом наблюдали наличие двух изоформ фермента с 0,28 и 0,44 (рис. 3).

$!!! 1{|й1йй1н!|I

Щфф,ЩЩШ 2 ЩтШЯШтШ

ШШШРЯ

,___

А Б в

Для разделения грубой фракции пероксисом, применяли изоплотностное центрифугирование в градиенте плотности сахарозы. Как видно из полученных данных (таб. 2), распределение суммарной активности ИЦЛ в пероксисомах и цитоплазме не одинаково. Большая часть (79,20%) активности ИЦЛ сосредоточена в пероксисомах, в цитоплазме активность фермента составила

Рис. 3. Специфическое проявление изоформ изоцитратлиазы из семядолей проростков сои в ПААГ после разделения на фракции

А - суммарная фракция, Б - цитоплазма, В - пероксисомы; 1,2- белковые полосы, Ф - фронт красителя

20,10%. Следовательно, внутриклеточная локализация изоцитратлиазы связана с глиоксисомальной, пероксисомальной и цитоплазматической фракциями.

Таблица 2. Активность маркерных ферментов, п=3, Р<0,05

Фракции Ферменты V, мл Общая активность, Е Удельная активность, Е/ мг белка Процент содержания фермента, %

ИЦЛ 0,989 0,014 20,10

Растворимая фракция Каталаза 22 0,779 0,011 12,90

СДГ 0,651 0,009 13,14

лдг 5,599 0,081 92,26

ИЦЛ 0,033 0,014 0,67

Митохондрии Каталаза 1 0,028 0,013 0,46

СДГ 4,200 1,84 84,76

лдг 0,398 0,043 6,56

ИЦЛ 3,891 2,016 79,20

Пероксисомы Каталаза 1 5,250 2,720 86,70

сдг 0,104 0,054 2,10

ЛДГ 0,071 0,037 1,17

ОЧИСТКА ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ ИЗ СОИ РАЗНЫХ СОРТОВ

Использование модернизированной схемы очистки позволило получить гомогенные препараты изоферментов ИЦЛ из сои разных сортов (таб. 3).

Таблица 3. Результаты очистки изоцитратлиазы из сон разных сортов, п=3, Р<0,05

Сорт Изо форма Удельная активность, Е/мг белка Выход, % Степень очистки

Игорь 1 5,09 19,60 101,80

2 5,75 16,10 115,00

Воронежский-31 1 2,18 3,87 72,67

2 2,82 4,99 94,00

ОТ-84 1 2,50 9,77 62,50

2 3,56 10,87 89,00

Так, параметры препаратов фермента из сои вьетнамского сорта «ОТ-84» составляли: удельная активность для одной изоформы фермента (ИЦЛ,) равнялась 2,50 Е/мг белка, при этом степень очистки составила 62,50 раза, выход - 9,77 %. Для второй изоформы (ИЦЛ2) значение удельной активности

составило 3,56 Е/мг белка, а степень очистки - 89,00 раз, выход - 10,87% (таб. 4). Максимальную элюцию одной из форм наблюдали при концентрации градиента 66,67 мМ раствора хлорида калия, а второй - при 100 мМ .

Таблица 4. Очистка изоцигратлиазы из сои вьетнамского сорта «DT-84», п=3, Р<0,05

Стадии очистки Объём, мл Общий белок, мг Общая активность, Е Удельная активность, Е/мг белка Выход, % Степень очистки

Гомогенат 18 197,52 8,19 0,04 100 1

Фракционирование сульфатом аммония 2 41,48 6,75 0,16 82,42 4,00

Гель-фильтрация на G-25 3 37,25 6,33 0,17 77,29 4,25

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 1 2 0,32 0,80 2,50 9,77 62,50

2 2 0,25 0,89 3,56 10,87 89,00

Таким образом, применение ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе с линейным градиентом концентрации раствора КС1 позволило получить в высокоочищенном состоянии две изоформы изоцитратлиазы из сои разных сортов. Наличие двух изоформ исследуемого фермента позволяет предположить их различную генетическую детерминированность [Mullen R. Т. et. al, 1997].

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОЧИЩЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ИЗОЦИТРАТЛИАЗЫ

Проведенный электрофоретический анализ очищенных препаратов ИЦЛ из сои разных сортов показал, что в полиакриламидном геле, при окрашивании нитратом серебра, раствором кумасси бриллиантового голубого G-250 и специфическом проявлении модифицировании реагентом Шиффа выявили две белковые полосы с Rf - 0,28 и Rf - 0,44 (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграммы ^ препаратов ИЦЛ из семядолей проростков сои

1 А - окрашивание изоформ нитратом серебра,

2 Б - окрашивание изоформ раствором кумасси,

В - специфическое проявление гомогената, 1 - белковая полоса с Rf- 0,28 (ИЦЛ,), 2 - белковая полоса ф с Rf-0,44 (ИЦЛг),Ф-фронт

красителя бромфенолового синего

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ, КИНЕТИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Молекулярная масса и субъединичное строение изоформ ИЦЛ

С помощью гель-хроматографии на сефадексе в-200 было установлено, что величина Мг нативной молекулы ИЦЛ, из семян сои составила 272 кДа, величина Мг второй изоформы - 246 кДа. Методом БОЗ-ПААГ-электрофореза было получено, что молекулярная масса субъединицы ИЦЛ, и ИЦЛ2 составила

66 кДа (рис. 5). Следовательно, ИЦЛ, и ИЦЛ2 состоят из четырёх одинаковых субъединиц, т. е. являются гомотетрамерами.

Рис. 5. Определение молекулярной массы субъединии ИЦЛ методом SDS-ПААГ-электрофореза

I - ИЦЛ 1,2- ИЦЛ2, Ф - фронт красителя

М - маркерные белки (кДа): I - целлюлаза (94,6),

II - бычий сывороточный альбумин (66,2), III - яичный альбумин (45), IV - карбоангидраза (31), V - ингибитор трипсина (21,5), VI - лизоцим (14,4)

Влияние концентрации изоцитрата на активность ИЦЛ

Изучение каталитических характеристик двух изоформ ИЦЛ показало, что обе изоформы фермента подчиняются кинетике Михаэлиса - Ментен. Константа Михаэлиса, характеризующая сродство изоцитратлиазы к субстрату для первой изоформы составляла 16 мкМ (рис. 6), для второй изоформы - 50 мкМ (рис. 7), т. е. первый изофермент обладает большим сродством к субстрату.

Рис. 6. Величина константы Михаэлиса Рис. 7. Величина константы Михаэлиса

по изоцитрату для ИЦЛ, по изоцитрату для ИЦЛ2

Влияние катионов металлов на активность изоформ изоцитратлиазы

ИЦЛ, является Мя-зависимым ферментом, тогда как ИЦЛ2

активировалась ионами Мп2+, т. е. является Мп-зависимой. В присутствии или Мп2+ в концентрации 5 мМ достигается максимальная активация ИЦЛ. Другие одно- и двухвалентные катионы Са2+, К+ и №+ мало влияют на активность изоформ ИЦЛ.

Влияние глицина и гликолата на активность изоферментов ИЦЛ

Глицин активировал ИЦЛ! в концентрации 5 мкМ. Дальнейшее увеличение концентрации приводило к снижению активности фермента. Максимальную активность ИЦЛ[ наблюдали в присутствии гликолата с концентрацией 100 мкМ (рис. 8). ИЦЛ2 проявляла наибольшую активность при 5 мкМ глицина и гликолата (рис. 9). Такие отличия по влиянию важнейших интермедиатов фотодыхательного метаболизма свидетельствуют о различных функциональных характеристиках исследуемых изоформ.

6 мкМ 20 мкМ 100 мкМ S ыкМ 20 МкМ 100 МкМ

контроль 10 ЦК M 50 мкМ 500 MKfd контроль 10 мкМ 50 мнМ 500 мкМ

Концентрация Концентрация

Рис. 8. Влияние глицина и гликолата на Рис. 9. Влияние глицина и гликолата на

активность ИЦЛ[ активность ИЦЛ2

I - контроль, ¡¡¡J - глицин, , — гликолат

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ ici, И icl2 И РЕГУЛЯЦИЯ ИХ ЭКСПРЕССИИ

Подбор праймеров

Поскольку геном сои пока полностью не аннотирован, то праймеры для дальнейшей работы нужно было подбирать, опираясь, в первую очередь, на методы сравнительной геномики. С помощью базы данных National Center for Biotechnology Information (NCBI) были получены последовательности нуклеотидов ИЦЛ разных организмов: грибов (Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus fumigatus) и растений (Arabidopsis thaliana). Они были выравнены между собой с помощью программы CIustalW2 и проанализированы для выявления наиболее консервативных участков гена ИЦЛ. Было обнаружено несколько участков высокой гомологии, и в двух из них были подобраны прямой и обратный праймер для амплификации:

ИЦЛ PCR - 5'-TCTAYRTYTCYGGYTGGCAGWG-3'

ИЦЛКТ - 5'-TCCKGCCATRTGNCCACAYTTCT-3'

Оптимальная температура отжига данных праймеров составляет 48°С.

Экстракция суммарной РНК

При выделении РНК с помощью гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформного метода выделили общую РНК без следов деградации (рис. 10 А). При выделении РНК с помощью метода выделения общей жировой РНК и волокнистых комплектов с помощью колонок Bio-Rad использовали однофазный раствор с эффективным соотношением фенола и гуанидин-изотиоцианата. Проводили лизис клеток и тканей, депротеинизацию РНК и инактивацию эндонуклеаз за один шаг. Получили качественную РНК с достаточно большей концентрацией (рис. 10 Б).

Выделение геномной ДНК с мочевиной

Этот метод позволяет одновременно выделить и геномную ДНК, и суммарную клеточную РНК достаточно высокого качества (рис. 10 В). Следовательно, при последующей обработке ДНКазой I можно получить РНК. При воздействии РНКазой А в растворе остаётся ДНК для дальнейших экспериментов.

(В) (Г)

I нномная ДИК

§8 1-ЦНК

28S рРНК 18S рРНК

Is (А)

128S рРНК 18S рРНК

(Б)

jpSSpPHK р 18S рРНК

Рис. 10. А - Суммарная РНК, выделенная гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформным методом, Б - суммарная РНК, выделенная с помощью колонок Bio-Rad, В - геномная ДНК, выделенная в присутствии мочевины, Г ДНК, полученной методом обратной транскрипции мРНК

В результате сравнения трёх независимых методов выделения суммарной клеточной РНК можно сказать, что наиболее приемлемым для ОТ-ПЦР является метод выделения на специализированных колонках Bio-Rad. Остальные 2 метода также могут быть использованы для получения препаратов РНК, но требуют обязательной последующей обработки ДНКазой I.

Обратная транскрипция

Для проведения обратной транскрипции использовали M-MulV-обратную транскриптазу (фермент ретровирусов, синтезирующих цепь ДНК

на РНК матрице). Данный фермент состоит из одного типа субъединиц и проявляет 5'—>3' праймер-зависимую полимеразную активность, эффективную только в отношении матриц РНК. В качестве затравочного праймера использовали о%о-(с1Т)2о праймер (рис. 10 Г).

Полимеразная ценная реакция

В ходе ПЦР пробы комплементарной ДНК проростков сои было получено два продукта (рис. 11).

Секвенирование

С помощью метода выделения ДНК из полиакриламидных гелей получили ампликоны в гомогенном состоянии (рис. 12) с концентрацией 38,9 нг/мкл и 31,5 нг/мкл, соответственно.

Рис. 11. ПЦР-амплификация генов ИЦЛ

М - маркер, 1 - ПЦР-продукты

Рис. 12. Электрофорез на ампликоны П ЦР-продуктов

М - маркер, 1 - первый ампликон, 2 - второй ампликон

В результате секвенирования первого продукта была прочитана последовательность длиной 298 н.п., которая на 98,3% соответствует кДНК ИЦЛ из клонотеки Glycine тах sa92d05.yl Gm-cl004 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nucest/4437078'?rid=55byvvuh01n&blast_rank=2&log$^nucltop&report=genbank1 (рис. 13) и 97,9% - Glycine тах sam76e08.yl Gm-cl069 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nucest/19453657?rid=55bvvvuh01n&blast_rank=7&log$=nucltop&ieport=genbank). При выравнивании последовательности нуклеотидов первого продукта с изоцитратлиазой Arabidopsis thaliana (http://www.ncbi.nlni.nih.gov/nuccore/NM_ 113067.3). Saccharomyces cerevisiae, томата Solanum lycopersicum (http://www.ncbi.nih.gov/nuccore/395045) и с Aspergillus fumigatus Af293

(http://www.ncbi. nlm-nih.gov/nucleotide/70993265?report=aenbank&log$=nucltop&blast_rank=

1&RID=AHKCBDG3014) получили процент гомологии 60,3%; 63,9%; 47,8% и 67,2%, соответственно.

ict i/!-2$B l5n-ciaO'/<-59ö Gm-o 106&1-650

1ЫЮ-2ЭВ

Gm-c iOOVi-вЭб 184 ©

еи-с ioea"-66o 313 f

¡si irt-гэе

10ЭМ-696 242 I GB< MSS/1-550 501 I

id i/i-298

&n-c 320 I

Gis-o М6М-0вО 439 I

249

Gm-c MOW-5Эв G«-C joesKJ-seo

ö'ÄI

ЯШШ 312

Рис. 13. Сравнение нуклеотидной последовательности ПЦР-продукта (/с/,) из кДИК с кДНК ИЦЛ из клонотеки Glycine max Gm-cl004 и Gm-c1069

У второго продукта была прочитана последовательность длиной 594 н.п, которая на 98,5% соответствует кДНК ИЦЛ из клонотеки Glycine max GMFL01-09-J11 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/210142555? report=genbank &log$=nucltop&blast rank= 1 &RID=AV849EB70INI и 88,2% - Glycine max GMFL01-15-P18 nittp://www.ncbi.nlrn.nih.gov/nucleotide/210142986?report=genbank&logS=nucltop &blast_rank=3&RID=AV849EB701N1. При аналогичном выравнивании последовательности нуклеотидов второго продукта с генами ИЦЛ выявили процент гомологии 47,2%; 49,4%; 47,8% и 43,1%, соответственно.

Полученные продукты отличаются по своему нуклеотидному составу друг от друга и имеют гомологию между собой 19,9%.

JJVM56C "fi^'IR ...........................1560

Р<в>*-179* 151 ■ . 'о,* ' . - tUft ■■•'.■lu ISC" ".I- Z . '( js - • в/. -■ • ■ Г.. ' I

,с1У1-5Э4 339 *"Г?СЗ<ЗАС^йАЙ?7ТйА**ТЙ? f * ТТЛ? Jйй" ASAA : ? Г&УТЗ ATCSASSS Г«$ЙАААФ1Э

jf?/s-i5eo ................................................................................

Pi&i-i:9< 1593 . эт IT - i.f А7|ШЩ|т|||лАтъ|р^ To|StT*c|iAGAACсЩтоат тас§тlf|^fTA.AGc|pAG-|а|тт|Щл

jivt-toeo - - -......----- - -...................................

1075 06icTTi<Ji:ceiT0ceiTeTie®r^eGT^^TA^TalcAACTTpAiAiT§eP^TCA;^TTTe 529 СА1еАг:|т TGClGOG riG rGlTic«:iG&Pii;ATTiAA^GT СААОШТ|С§А1 liicliAGTotlbAAA

Рис. 14. Сравнение нуклеотидной последовательности ПЦР-продукта (/с/2) из кДНК с кДНК ИЦЛ из клонотеки Glycine max GMFL01-09-J11 и GMFL01-15-P18

Экспрессия генов ich и icl2 при прорастании сои

В данной работе показана зависимость изменения уровня экспрессии

генов ich и icl2 от дней экспозиции при прорастании семян и зеленении проростков сои (рис. 15, 16).

Динамика изменения экспрессии генов ich и icl2 при прорастании семян и зеленении проростков сои показала, что относительные концентрации транскриптов генов ich и icl2 являются максимальными на 3-й день экспозиции, а к 6-му дню значительно снижаются. К 9-му дню наблюдается отсутствие транскрипции ich, в то время как уровень экспрессии icl2 возрастает. Изменение уровня экспрессии исследуемых генов чётко коррелирует с динамикой активности ИЦЛ в сое при прорастании, являясь одним из важных механизмов её регуляции.

£ 45

н/о н/о

9 10 ДНИ

Ê 15

-.□А

Дни

Рис. 15. Относительный уровень экспрессии гена ich в ходе онтогенеза сои

н/о - не обнаружено

Рис. 16. Относительный уровень экспрессии гена ¡с12 в ходе онтогенеза сон

Полученные данные по динамике экспрессии генов изоцитратлиазы позволяют оценить изменение скорости функционирования глиоксилатного цикла и выдвинуть предположение о его роли в метаболизме при прорастании семян и переходе их к фотосинтезу. В первые дни прорастания зародыш еще не способен к фотосинтезу и получает необходимую энергию в процессе дыхания. Происходит активация глюконеогенетических процессов, физиологическая роль которых заключается в мобилизации запасных веществ. Однако, по мере зеленения проростков функцию обеспечения растения энергией берёт на себя фотосинтез, в связи с чем необходимость в глюконеогенезе значительно снижается по сравнению с первыми днями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ полученных данных по динамике изоцитратлиазной активности показывает сортовую специфичность, обусловленную их генотипическими свойствами. Изменение в динамике активности изоцитратлиазы на первых этапах прорастания связано с мобилизацией запасных жиров и липидов. Выявлена чёткая зависимость генезиса активности изоцитратлиазы от сорта сои

и условий выращивания.

Большая часть активности изоцитратлиазы сосредоточена в пероксисомах, активность фермента в цитоплазме находится в пределах загрязнения. В некоторых публикациях есть сообщения, что внутриклеточное распределение изоцитратлиазы в сое связано с глиоксисомальной и пероксисомальной фракциями. В момент функционального перехода растительных тканей, вызванного сменой типа питания в клетках, одновременно присутствуют как глиоксисомы, так и пероксисомы с соответствующей им системой ферментов [Delkin G. et. al., 2007].

С помощью многостадийной очистки можно получать в электрофотретически гомогенном состоянии препараты двух изоферментов изоцитратлиазы из сои разных сортов. Применение ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе с линейным градиентом концентрации КС1 позволило получить в высокоочищенном состоянии две изоформы изоцитратлиазы из семядолей Glycine max L. с Rf - 0,28 (ИЦЛ,) и Rf - 0,44 (ИЦЛ2) и провести их сравнительный анализ. Использование изоформ изоцитратлиазы, выделенных из семядолей сои, открывает большие возможности для применения фермента в качестве аналитического реагента и создания на его основе биосенсоров для биохимических и кинетических анализов, в частности для определения концентрации глиоксиловой кислоты (прямая реакция) или изоцитрата (обратная реакция) в биохимических пробах [Bassi A. S. et. al.,1999, Shi L. et. al., 2009].

Получение в электрофоретически гомогенном состоянии ключевого фермента глиоксилатного цикла изоцитратлиазы из семян сои позволило провести сравнительное исследование физико-химических, кинетических и регуляторных свойств изоцитратлиазы. Установлено, что основные свойства изучаемого фермента мало отличаются по своим характеристикам (молекулярной массе, сродству к различным субстратам, рН оптимуму, влиянию катионов металлов и т. д.) от ИЦЛ из других организмов. Было выявлено, что ИЦЛ, и ИЦЛ2 состоят из четырёх одинаковых субъединиц с молекулярной массой 66 кДа, т. е. являются гомотетрамерами. Согласно большинству данных литературы, изоцитратлиаза из других объектов, как правило, имеет чётное число субъединиц с молекулярной массой 60 кДа. Выделенные и очищенные до гомогенного состояния изоформы изоцитратлиазы обладают различным сродством к субстрату. Это свидетельствует, главным образом, о различии форм изоцитратлиазы, что позволяет предположить их различную генетическую детерминированность [Mullen R. Т., 1997]. Было выявлено, что глиоксисомаль-ная форма изоцитратлиазы (ИЦЛ)) является Mg-зависимым ферментом, тогда как ИЦЛ2 активировалась ионами Мп2+, т. е. является Mn-зависимой. Другие

одно- и двухвалентные катионы Са2+, К+ и Na+ мало эффективны в регуляции активности изоформ изоцитратлиазы. Полученные нами данные коррелируют с результатами, проведёнными на других объектах исследования. ИЦЛ, выделенной из семядолей проростка Lupinus, необходимо присутствие Mg2+

тоже в концентрации 5 мМ, при этом достигается максимальная активация ИЦЛ [Vinccenzini et al., 1986 ].

Большое внимание было уделено молекулярным аспектам функционирования изоферментов изоцитратлиазы, т. е. идентификации генов ici, и ici2 и регуляции их экспрессии. В нашей работе был использован метод подбора праймеров по последовательности нуклеотидов из различных организмов. Нам удалось получить два продукта гена изоцитратлиазы. Было выявлено, что в семенах сои существуют два гена ИЦЛ - icl¡ и icl2. Нуклеотидная последовательность icl¡ имеет 98,3% гомологию с кДНК ИЦЛ из клонотеки Glycine max sa92d05.yl Gm-cl004; 97,9% - Glycine max sam76e08.yl Gm-cl069. У второго продукта была прочитана последовательность длиной 594 н.п.. Эта последовательность нуклеотидов на 98,5% соответствует кДНК ИЦЛ из клонотеки Glycine max GMFL01-09-J11 и 88,2% - Glycine max GMFL01-15-P18. Полученные продукты отличаются по своему нуклеотидному составу друг от друга и имеют гомологию между собой 19,9%. Следовательно, наличие двух форм фермента и двух ПЦР-продуктов с геноспецифическими праймерами является результатом работы двух разных генов, кодирующих ИЦЛ в геноме сои.

В данной работе выявлена зависимость изменения уровня экспрессии генов icl¡ и ici2 от времени прорастания семян и в процессе зеленения проростков сои. Изменение уровня экспрессии исследуемых генов чётко коррелирует с полученными данными о суммарной активности ИЦЛ в сое при прорастании, и, вероятно, является одним из механизмов её регуляции. После зеленения семядолей сои, профиль экспрессии генов, ответственных за глиоксисомальную функцию резко снижается, и преобладает фотодыхательная деятельность пероксисом [Delkin G., 2007]. Данные по динамике экспрессии генов изоцитратлиазы позволяют оценить изменение скорости функционирования глиоксилатного цикла и выдвинуть предположение о его роли в метаболизме при прорастании семян и переходе их к фотосинтезу. В первые дни прорастания зародыш ещё не способен к фотосинтезу и получает необходимую энергию в процессе дыхания. Происходит активация глюконеогенетических процессов, физиологическая роль которых заключается в мобилизации запасных веществ. Однако, по мере зеленения проростков функцию обеспечения растения энергией берёт на себя фотосинтез, в связи с чем интенсивность в глюконеогенезе значительно снижается по сравнению с первыми днями.

На основании полученных результатов разработана гипотетическая схема участия изоферментов изоцитратлиазы в регуляции мобилизации запасных жиров и фотодыхания в клетках семядолей сои в процессе функционального перехода. Установлена различная генетическая детерминированность изоформ исследуемого фермента. Предполагается, что функционирование в клетках зелёных растений ИЦЛ2 не связано с работой глиоксилатного цикла (рис. 17).

Жирные тепа

ТАГ

Глиоксисома

ЖК

Изоцит] А Цитрат

^ п Оксало- 1'

/Щитохондрия^ Мал

ЖЕЛТЫЕ (ЭТИОЛИРОВАННЫЕ^ СЕМЯДОЛИ

Манат

Сукцинат •

Глиоксияат

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ!

ПЕРЕХОД|

ЖЁЛТО-ЗЕЛЁНЫЕ СЕМЯДОЛИ

Глицин Гшколат,

Хлоропласт

' Изоцитрат

Фосфогпикояат

2-ОГ ■* \

Плутам ат

-'Сукцинат -4-

-Ппикояат^ Глиокснпат Глицин

Гяутамат''*' 2-ОГ

га : *н2о-

н,о.

------Глицерат-

Гидроси-" пируват

- Серии -

Сукцинат Глицин

НАОН СОг

ИН3 ■АСерин

V-

Пероксисоыа

ФОТОДЫХАНИЕ ЗЕЛЕНЫХ СЕМЯДОЛЕЙ

Рис. 17. Гипотетическая схема участия изоферментов изоцитратлиазы в регуляции мобилизации запасных жиров и фотодыхания в клетках семядолей сои в процессе функционального перехода

ГЦ - глиоксилатный цикл, ТАГ - триацилглицерол. ЖК - жирные кислоты, ФЕП - фосфоенолпируват, 2-ОГ - 2-оксоглутарат,

1 - липаза, 2 - малатдегидрогеназа, 3 - цитратсиктаза, 4 - аконитатгидратаза, 5 - изоцитратлиаза (ИЦЛ|), 6 — малатсинтаза,

А - рибулёзо-бисфосфаткарбоксилаза. В - гликолатоксидаза, С - каталаза

ВЫВОДЫ

1. Динамика активности изоцитратлиазы из Glycine max L. сортов вьетнамского «DT-84», белорусского «Игорь», «Воронежский-31» показала, что она имеет колоколообразный вид. Максимальные значения удельной активности изоцитратлиазы при прорастании сои на свету наблюдали на 5-й день у вьетнамского сорта «DT-84» и сорта «Воронежский-31», 3-й у растений белорусского сорта «Игорь». В темноте картина динамики активности отличается только у растений сорта «Воронежский-31».

2. В семядолях проростков сои присутствуют две формы фермента - ИЦЛ1 с относительной электрофоретической подвижностью Rf - 0,28 и ИЦЛ2 с Rf-0,44. Исследуемый фермент имеет преимущественно пероксисомальную локализацию, поскольку величина активности фермента в цитоплазме находится в пределах загрязнения. Функции выделенных изоформ в семядолях семян сои различны: первая изоформа обеспечивает функционирование глиоксилатного цикла, а вторая участвует в метаболизме органических кислот.

3. Использование модифицированной схемы очистки позволило получить гомогенные препараты изоферментов изоцитратлиазы из сои разных сортов. Так, параметры препаратов фермента из сои вьетнамского сорта «DT-84» составили: удельная активность ИЦЛ, 2,50 Е/мг белка, при этом степень очистки 62,50 раза; выход - 9,77 %. Для второй изоформы (ИЦЛ2) значение удельной активности равнялось 3,56 Е/мг белка, а степень очистки - 89,00 раз; выход - 10,87%.

4. Значения молекулярной массы первого изофермента составляло 272 кДа, а второго - 246 кДа. С помощью гель-хроматографии на сефадексе G-200 и SDS-ПААГ-электрофореза было установлено, что ИЦЛ, и ИЦЛ2 состоят из четырёх одинаковых субъединиц, т. е. являются гомотетрамерами с молекулярной массой субъединиц 66 кДа. Выделенные изоферменты отличались по электрофоретической подвижности и четвертичной структуре.

5. Механизм ферментативного действия изучаемого фермента подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Значения константы Михаэлиса, характеризующие сродство изоцитратлиазы к субстрату (изоцитрату) для первой изоформы составляли 16 мкМ, для второй изоформы - 50 мкМ, т. е. первый изофермент обладает большим сродством к субстрату.

6. Комплекс Mg2+ с изоцитратом является истинным субстратом ИЦЛ. Глиоксисомальная форма изоцитратлиазы (ИЦЛ,) является Mg-зависимым ферментом, тогда как ИЦЛ2 активировалась ионами Мп2+, т. е. является Мп-зависимой. Другие одно- и двухвалентные катионы Са2+, К+ и Na+ мало эффективны в регуляции активности изоформ изоцитратлиазы.

7. Влияние различной концентрации фотодыхательных метаболитов -глицина и гликолата на активность изоформы ИЦЛ показало, что глицин активировал ИЦЛ] в концентрации 5 мкМ. Дальнейшее увеличение концентрации приводило к понижению активности фермента. Максимальную

активность ИЦЛ] наблюдали в присутствии гликолата с концентрацией 100 мкМ. Было обнаружено, что ИЦЛ2 проявляла наибольшую активность при 5 мкМ глицина и гликолата.

8. Были использованы различные методики выделения РНК. Подобранные нами праймеры позволили получить два ПЦР-продукта гена изоцитратлиазы.

9. Секвенирование полученных ампликонов подтвердило их специфичность, а методами сравнительной геномики было установлено, что гомология гена ici, с кДНК ИЦЛ Glycine max sa92d05.yl Gm-cl004 и кДНК ИЦЛ Glycine max sam76e08.yl Gm-cl069 составляет 98,3 и 97,9%, соответственно. Для icl2 она равняется 98,5% и 88,2% гомологии с кДНК Glycine max GMFL01-09-J11 и кДНК Glycine max GMFL01-15-P18, соответственно.

10. Динамика экспрессии генов icl¡ и icl2 при прорастании семян и зеленении проростков сои показала, что относительные концентрации транскриптов генов ici, и icl2 являются максимальными на 3-й день экспозиции, а к 6-му дню значительно снижаются. К 9-му дню наблюдается отсутствие транскрипции ici,, в то время как уровень экспрессии icl2 возрастает. Физиологический переход (зеленение) обусловливает доминирование фотосинтеза и снижение интенсивности глюконеогенеза. Изменение уровня экспрессии исследуемых генов чётко коррелирует с динамикой активности ИЦЛ в сое при прорастании, являясь одним из важных механизмов её регуляции.

11. Разработана гипотетическая схема регуляции функционирования изоферментов изоцитратлиазы в сое показывающая, что функциональный переход растений к автотрофному питанию вызывает интенсификацию экспрессии icl2. Функционирование данного изофермента (ИЦЛ2) не связано с работой глиоксилатного цикла.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Роль гликолатоксидазной активности в регуляции фотодыхания у С3 и С4 растений / А. Т. Епринцев, А. Е. Семенов, Чан Тхи Хоанг Куен [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Выпуск 9. -Воронеж: ВГУ, 2007. - С. 193-197.

2. Дифференциальная экспрессия изоформ изоцитратлиазы в щитках и зелёных листях Zea mayz L. / А. Т. Епринцев, Е. В. Маслова, Чан Тхи Хоанг Куен [и др.] // Современная физиология растений: от молекул до экосистем: тез. докл. междунар. конф. - Сыктывкар, 2007., Ч. 1, С. 71-73.

3. Очистка и физико-химические свойства изоцитратлиазы из щитков кукурузы / Е. В. Маслова, Чан Тхи Хоанг Куен [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2007,- Вып. 9. -С. 110-115.

4. Разделение изоферментов изоцитратлиазы из щитков кукурузы с

* í

помощью ионообменной хроматографией / А. Т. Епринцев, Е. В. Маслова, Чан Тхи Хоанг Куен [и др.] // Сорбционные и хроматографические процессы. -2008. - Т. 8, Вып. 2. - С. 297-303.

5. Изоферментный состав изоцитратлиазы в разных органах U3 и С^ растений / Е. В. Маслова, Чан Тхи Хоанг Куен [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2008., Вып. 10. -С. 160-164.

6. Использование сорбентов различной природы для разделения изоферментов малатдегидрогеназы и изоцитратлиазы / Чан Тхи Хоанг Куен [и др.] // Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья: материалы III междунар. науч. конф. - Белгород, 2008. - С. 242-245.

7. Регуляция активности изоцитратлиазы в онтогенезе высших растений / Е. В. Маслова, Чан Тхи Хоанг Куен [и др.] // 12-я международная пущинская школа-конференция молодых учёных: сборник тезисов, Пущино, 2008. - С. 194.

8. Регуляторные аспекты функционирования изоформ изоцитратлиазы в различных органах Zea mays L. / А. Т. Епринцев, Е. В. Маслова, Чан Тхи Хоанг Куен [и др.] // Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений: тезисы докладов международной научной конференции, Екатеринбург, 2008. - С. 166-167.

9. Кинетические свойства изоцитратлиазы из Сз и С4 растений / Е. В. Дьяченко, А. В. Сальников, Чан Тхи Хоанг Куен [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2009., Вып. 11. -С. 78-82.

10. Физико- химические и регуляторные свойства изоформ изоцитратлиазы из растений / Чан Тхи Хоанг Куен [и др.] // 14-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных: сборник тезисов, Пущино, 2010. - С. 67.

11. Динамика активности изоцитратлиазы в прорастающих семенах сои (Glycine max L.) разных сортов / Чан Тхи Хоанг Куен. А. Т. Епринцев // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. - Воронеж, 2010., Вып. 12.-С. 123-129.

12. Получение и свойства изоформ изоцитратлиазы из семядолей Glycine max L. / А. Т. Епринцев, Е. В. Дьяченко, Чан Тхи Хоанг Куен [и др.] II Прикладная биохимия и микробиология. - 2010. - Т. 46, № 1. - С. 103-108.

Работы № 4, 12 опубликованы в изданиях, рекомендованных Перечнем

ВАК.

Подписано в печать 12.11.10. Формат 60*84 '/,„. Усл. псч. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 1432.

Отпечатано с готового орипшал-макста в типографии Издательско-по л и графического центра Воронежского государственного университета. 394000, Воронеж, ул. Пушкинская, 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чан Тхи Хоанг Куен

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Распространение глиоксилатного цикла, динамика активности изоцитратлиазы в растениях и её изоферментный состав.

1.1.1. Распространение глиоксилатного цикла.

1.1.1.1. Распространение глиоксилатного цикла у растений.

1.1.1.2. Распространение глиоксилатного цикла у микроорганизм ов.

1.1.1.3. Распространение глиоксилатного цикла у животных.

1.1.2. Динамика активности изоцитратлиазы в растениях.

1.1.3. Изоферментный состав.1.

1.2. Субклеточная локализация изоцитратлиазы.

1.3. Анализ схемы очистки изоцитратлиазы.

1.3.1. Разрушение клеток и экстракция.

1.3.2. Фракционирование солями.

1.3.3. Гель-фильтрация.

1.3.4. Аффинная хроматография.

1.3.5. Ионообменная хроматография.

1.4. Кинетические и регуляторные свойства изоцитратлиазы.

1.4.1. Колебание значений константы Михаэлиса-Ментен.

1.4.2. Значения рН оптимума.

1.4.3. Величины температурного оптимума.

1.4.4. Влияние катионов металлов.

1.4.5. Действие метаболитов.

1.5. Молекулярные аспекты функционирования изоферментов изоцитратлиазы.

1.5.1. Идентификация генов изоцитратлиазы.

1.5.2. Роль дифференциальной экспрессии генов в адаптации и развитии организмов и факторы экспрессии.

1.5.2.1. Роль дифференциальной экспрессии генов.

1.5.2.2. Факторы экспрессии.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Цель и задачи.

2.2. Объекты и методы исследования.

2.2.1. Объекты исследования.

2.2.2. Методы исследования.

2.2.2.1. Схема очистки изоцитратлиазы.

2.2.2.1.1. Получение экстрактов.

2.2.2.1.2 Высаливание сульфатом аммония.

2.2.2.1.3. Гель-фильтрация на сефадексе С-25.

2.2.2.1.4. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.

2.2.2.1.5. Гель-хроматография на сефадексе 0-150.

2.2.2.2. Определение активности ферментов.

2.2.2.3. Определение количества белка.

2.2.2.4. Определение молекулярной массы нативного фермента.

2.2.2.5. Электрофоретические исследования.

2.2.2.5.1. Определение гомогенности ферментов.

2.2.2.5.2. Специфическое проявление изоцитратлиазы.

2.1.2.5.3. Определение молекулярной массы субъединиц фермента методом ЗБЗ-ПААГ-электрофореза.

2.2.2.6. Субклеточная локализация изоцитратлиазы.

2.2.2.6.1. Дифференциальное центрифугирование.

2.2.2.6.1. Изоплотностное центрифугирование.

2.2.2.7. Кинетические характеристики и регуляция активности ферментов.

2.2.2.7.1. Величины константы Михаэлиса-Ментен.

2.2.2.7.2. Значения рН оптимума.

2.2.2.7.3. Влияние катионов металлов на активность изоформ.

2.2.2.7.4. Регуляция метаболитами.

2.2.2.8. Разработка условий длительного хранения изоцитратлиазы.

2.2.2.9. Идентификация генов ich и ich и регуляция их экспрессии.

2.2.2.9.1. Экстракция суммарной РНК по методу фенол-хлороформной экстракции.

2.2.2.9.2. Экстракция суммарной РНК помощью колонок Bio-Rad.

2.2.2.9.3. Выделение геномной ДНК с мочевиной.

2.2.2.9.4. Определение количества РНК.

2.2.2.9.5. Определение количества ДНК.

2.2.2.9.6. Проведение обратной транскрипции мРНК.

2.2.2.9.7. Подбор праймеров.

2.2.2.9.8. Проведение полимеразной цепной реакции.

2.2.2.9.9. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени.

2.2.2.9.10. Выделение ДНК из полиакриламидных гелей.

2.2.2.9.11. Секвенирование ПЦР-продукта.

2.2.2.9.12 Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот.

2.2.2.10. Статистическая обработка данных.

2.3. Результаты и их обсуждение.

2.3.1. Динамика активности изоцитратлиазы в прорастающих семенах сои разных сортов.

2.3.2. Субклеточная локализация изоферментов изоцитратлиазы в прорастающих семенах сои.

2.3.3. Очистка изоцитратлиазы из сои разных сортов.

2.3.3.1. Очистка изоцитратлиазы из сои вьетнамского сорта

DT-84».

2.3.3.2. Очистка изоцитратлиазы из сои сорта Воронежский-31».

2.3.3.3. Очистка изоцитратлиазы из сои белорусского сорта «Игорь».

2.3.4. Электрофоретический анализ очищенных препаратов изоцитратлиазы.

2.3.5. Физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики.

2.3.5.1. Молекулярная масса и субъединичное строение изоформ изоцитратлиазы.

2.3.5.2. Влияние концентрации изоцитрата на активность изоцитратлиазы.

2.3.5.3. Значения pH оптимума.

2.3.5.4. Влияние катионов металлов на активность изоформ.

2.3.5.4. Влияние глицина и гликолата на активность изоферментов изоцитратлиазы.

2.3.6. Условия длительного хранения изоцитратлиазы.

2.3.7. Идентификация генов ich и ich и регуляция их экспрессии.

2.3.7.1. Подбор праймеров.

2.3.7.2. Идентификация генов методом ОТ-ПЦР.

2.3.7.3. Секвенирование ПЦР-продуктов.

2.3.7.4. Уровень экспрессии генов icl¡ и ich в онтогенезе проростков сои.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изоцитратлиаза из сои"

Актуальность проблемы. В последнее время ферменты глиоксилатного цикла являются объектами значительного количества исследований. Глиоксилат-ный цикл выступает важнейшим этапом глюконеогенеза, т. к. осуществляет синтез из двух молекул ацетил-КоА одной молекулы сукцината, используемой в дальнейших реакциях, что обеспечивает синтез углеводов. Этот метаболический процесс имеет широкое распространение в природе, функционируя в различные физиологические периоды жизни многих организмов. В жирозапасающих тканях растений основной функцией глиоксилатного цикла считается участие в глюконеогенезе при мобилизации запасных жиров. У высших растений малатсинтаза и, особенно, изоцитратлиаза присутствуют в тканях, активно утилизирующих жиры. Обычно активность глиоксилатного цикла коррелирует с содержанием жира в семенах. Епринцев А. Т. с соавт. (2007) показали, что при прорастании семян запасные жиры, являющиеся водонерастворимыми, превращаются в углеводы, которые дальше транспортируются к метаболически активным точкам, где утилизируются в энергетических и анаболических процессах. Физиологическая роль глиоксилатного цикла для растений — важный этап глюконеогенеза, обеспечивающий растущий организм в условиях гетеротрофного питания доступными формами органического вещества [12].

Ключевыми ферментами глиоксилатного цикла являются изоцитратлиаза (ИЦЛ; КФ 4.1.3.1) и малатсинтаза. Изоцитратлиаза — фермент «метаболической вилки», как правило, является матриксным ферментом глиоксисом [19]. ИЦЛ легко высвобождается из органелл после осмотического шока, причём при наличии нескольких изоформ фермента никаких различий в их локализации не наблюдалось. Ферменты в одинаковой степени солюбилизируются из глиоксисом в растворимую фракцию при выделении органелл и одинаково хорошо освобождаются из них при осмотическом шоке. При градиентном фракционировании клеточных органелл процент солюбилизации изоцитратлиазы из глиоксисом оказывался неодинаковым для разных растений. В семядолях сои было обнаружено две формы изоцитратлиазы в глиоксисомах. Однако, в настоящее время, в ряде работ показано, что в зелёных листьях изоцитратлиаза локализована в пероксисомальной фракции [88]. В клетке могут одновременно присутствовать пероксисомальная и глиоксисомальная ИЦЛ, выполняющие по всей видимости, различные функции в метаболизме растительной клетки [141]. Два уникальных фермента глиоксилатного цикла изоцитратлиаза и малатсинтаза присутствуют в развивающихся семенах, листьях, пыльце и в других органах (корни, лепестки и плоды), а также в различных типах клеточных культур и т. д. После прорастания важнейшей функцией масличной пероксисомы в АгаЫс1ор31$ зр. является трансформация жирных кислот в углеводы до начала фотоавтотрофного роста. Ферменты глиоксилатного цикла изоцитратлиаза и малатсинтаза преобразуют ацетил-КоА из жирных кислот в субстраты глюконеогенеза и находятся в пероксисомах зрелых проросших семян и саженцев [117].

К настоящему времени ИЦЛ очищена до гомогенного состояния из многих видов микроорганизмов, грибов [ЮЗ], высших растений [19], нематод [118], клещей [101], насекомых [10] и крыс [157]. Известно, что изоцитратлиаза в растениях представлена несколькими изоформами, имеющими различную локализацию в клетке.

В последнее время сообщается об использовании этого фермента при диагностике заболеваний растений. Так, Бауер П. С соавт. (Р. Во\ууег е1. а1., 2000) показали, что созданная ими конструкция гибрида промотора гена ИЦЛ АТеигоярога сгазяа с геном флуоресцирующего белка, экспрессировалась и заметно индуцировалась во время инфекции в паразите пшеницы Тарез1а уа11ипс1ае [53].

В настоящее время одной из важнейших культур в растительном мире признана соя, семена которой являются великолепной комбинацией жирных кислот и высокоценного растительного белка, в связи с чем служат объектом большого количества исследований. Отличительной особенностью сои является самое высокое содержание фосфолипидов по сравнению с другими культурами. Фосфолипиды способствуют регенерации мембран, увеличивают детоксика-ционную способность печени, обладают антиоксидантной активностью, снижают у диабетиков потребность в инсулине, предотвращают дегенеративные изменения в нервных клетках, мышцах, укрепляют капилляры. Полиненасыщенные жирные кислоты являются предшественниками в биосинтезе гормоноподобных веществ —- простагландинов, одной из многочисленных функций которых является препятствование отложению холестерина в стенках кровеносных сосудов, приводящего к образованию атеросклеротических бляшек. Наличие очень большого количества токоферолов в соевом масле обусловливает его способность в наибольшей степени повышать защитные свойства организма, замедлять старение. Поэтому представляется чрезвычайно важным охарактеризовать регуляторные свойства, ферментов сои в прорастающих семенах и особенно при смене типов питания.

2. Получить электрофоретически гомогенные ферментные препараты изоцитратлиазы из проростков сои.

3. Изучить физико-химические, кинетические и регуляторные характеристики изоцитратлиазы.

5. Провести ОТ-ПЦР анализ мРНК для идентификации генов, кодирующих изоферменты изоцитратлиазы.

7. Провести количественный анализ уровня экспрессии генов изоцитратлиазы сои на разных этапах онтогенеза методом ПЦР в реальном времени.

В данной работе праймеры для амплификации гена ИЦЛ были подобраны на основе сравнительного анализа последовательностей нуклеотидов изоцитратлиазы из различных организмов. Секвенирование полученных в ходе ПЦР продуктов показало, что выделенные после очистки изоформы изоцитратлиазы имеют различную генетическую детерминированность, т. е. являются изоферментами, обладающими различной функциональной значимостью.

Выявлена зависимость изменения уровня экспрессии генов и 1с12 от времени прорастания семян и зеленения проростков сои. Полученные данные по динамике экспрессии генов изоцитратлиазы позволяют оценить изменение скорости функционирования глиоксилатного цикла и выдвинуть предположение о его роли в метаболизме при прорастании семян и переходе их к фотосинтезу. В первые дни прорастания зародыш ещё не способен к фотосинтезу и получает необходимую энергию в процессе дыхания. Происходит активация глюконеогенетических процессов, физиологическая роль которых заключается в мобилизации запасных веществ. Однако, по мере зеленения проростков функцию обеспечения растения энергией берёт на себя фотосинтез, в связи с чем интенсивность глюконеогенеза значительно снижается по сравнению с первыми днями.

Практическая значимость. С помощью четырёхстадийной очистки с высокой эффективностью можно получать электрофоретически гомогенные препараты изоформ изоцитратлиазы. Использование изоформ ИЦЛ, выделенных из семядолей семян сои, открывает большие возможности для применения фермента в качестве аналитического реагента и создания на его основе биосенсоров для биохимических и кинетических анализов, в частности, для определения концентрации глиоксиловой кислоты (прямая реакция) или изоцитрата (обратная реакция) в биохимических пробах.

2008), международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), 3-й международной конференции «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья» (Белгород, 2008), межрегиональных конференциях, посвященных памяти А. А. Землянухина «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2007, 2008, 2009, 2010).

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (212 источников). Иллюстрационный материал включает 36 рисунков, 6 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Чан Тхи Хоанг Куен

ВЫВОДЫ

1. Динамика активности изоцитратлиазы из Glycine max L. сортов «Воронежский-31», вьетнамского «DT-84» и белорусского «Игорь» показала, что она имеет колоколообразный вид. Максимальные значения активности изоцитратлиазы при прорастании сои на свету наблюдали на 5-й день у вьетнамского сорта «DT-84» и сорта «Воронежский-31», на 3-й день — у растений белорусского сорта «Игорь». В темноте картина динамики активности отличается только у растений сорта «Воронежский-31».

2. В семядолях проростков сои присутствуют две формы фермента — ИЦЛ, с относительной электрофоретической подвижностью Rf— 0,28 и ИЦЛ2 с. Rf— 0,44. Исследуемый фермент имеет преимущественно пероксисо-мальную локализацию, поскольку величина активности фермента в цитоплазме находится в пределах загрязнения. Функции выделенных изоформ в семядолях семян сои различны: первая изоформа обеспечивает функционирование глиоксилатного цикла, а вторая участвует в метаболизме органических кислот.

3. Использование модифицированной схемы очистки позволило получить гомогенные препараты изоферментов изоцитратлиазы из сои разных сортов. Так, параметры препаратов фермента из сои вьетнамского сорта «DT-84» составили: удельная активность ИЦЛ1 2,50 Е/мг белка, при этом степень очистки 62,50 раза; выход — 9,77 %. Для второй изоформы (ИЦЛ2) значение удельной активности равнялось 3,56 Е/мг белка, а степень очистки — 89,00 раз; выход — 10,87 %.

4. Значения молекулярной массы первого изофермента составляло 272 кДа, а второго — 246 кДа. С помощью гель-хроматографии на сефадексе G-200 и SDS-ПААГ-электрофореза было установлено, что ИЦЛ, и ИЦЛ2 состоят из четырёх одинаковых субъединиц, т. е. являются гомотетрамерами с молекулярной массой субъединиц 66 кДа. Выделенные изоферменты отличались по электрофоретической подвижности и четвертичной структуре.

5. Механизм ферментативного действия изучаемого фермента подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Значения константы Михаэлиса, характеризующие сродство изоцитратлиазы к субстрату (изоцитрату), для первой изоформы составляли 16 мкМ, для второй изоформы — 50 мкМ, т. е. первый изофермент обладает большим сродством к субстрату.

6. Комплекс Mg2+ с изоцитратом является истинным субстратом ИЦЛ. Глиоксисомальная форма изоцитратлиазы (ИЦЛ,) является Mg-зависимым ферментом, тогда как ИЦЛ2 активировалась ионами Мп2+, т. е. является Mn-зависимой. Другие одно- и двухвалентные катионы (Са2+, К+ и Na+) мало эффективны в регуляции активности изоформ изоцитратлиазы.

7. Влияние различной концентрации фотодыхательных метаболитов — глицина и гликолата на активность изоформы ИЦЛ показало, что глицин активировал ИЦЛ, в концентрации 5 мкМ. Дальнейшее увеличение концентрации приводило к понижению активности фермента. Максимальную активность - ИЦЛ ( наблюдали в присутствии гликолата с концентрацией 100 мкМ. Было обнаружено, что ИЦЛ2 проявляла наибольшую активность при 5 мкМ концентрации глицина и гликолата.

9. Секвенирование полученных ампликонов подтвердило их специфичность, а методами сравнительной геномики было установлено, что гомология гена icl 1 с кДНК ИЦЛ Glycine max sa92d05.yl Gm-cl004 и кДНК ИЦЛ Glycine max sam76e08.yl Gm-cl069 составляет 98,3 % и 97,9 %, соответственно. Для icl2 она равняется 98,5 % и 88,2 % гомологии с кДНК Glycine max GMFL01-09-J11 и кДНК Glycine max GMFL01-15-P18, соответственно.

10. Динамика экспрессии генов ici] и icl2 при прорастании семян и зеленении проростков сои показала, что относительные концентрации транскриптов генов ici 1 и icl2 являются максимальными на 3-й день экспозиции, а к 6-му дню значительно снижаются. К 9-му дню наблюдается отсутствие транскрипции ici], в то время как уровень экспрессии icl2 возрастает, что обусловлено физиологическим переходом (зеленением), вызывающим доминирование фотосинтеза и снижение интенсивности глюконеогенеза. Изменение уровня экспрессии исследуемых генов чётко коррелирует с динамикой активности изоферментов ИЦЛ в сое при прорастании, являясь одним из важных механизмов их функциональной регуляции.

И. Разработана гипотетическая схема регуляции функционирования изоферментов изоцитратлиазы в сое, показывающая, что функциональный переход растений к автотрофному питанию вызывает интенсификацию экспрессии icl2. Функционирование данного изофермента (ИЦЛ2) не связано с работой глиоксилатного цикла.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Большая часть активности изоцитратлиазы сосредоточена в пероксисомах, активность фермента в цитоплазме находится в пределах значений загрязнения. В некоторых публикациях есть сообщения, что внутриклеточное распределение изоцитратлиазы в сое связано с глиоксисомаль-ной и пероксисомальной фракциями. В момент функционального перехода растительных тканей, вызванного сменой типа питания в клетках, одновременно присутствуют как глиоксисомы, так и пероксисомы с соответствующей им системой ферментов [68].

С помощью многостадийной очистки можно получать в электрофотрети-чески гомогенном состоянии препараты двух изоферментов изоцитратлиазы из сои разных сортов. Применение ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе с линейным градиентом концентрации КС1 позволило получить в высокоочищенном состоянии две изоформы изоцитратлиазы из семядолей Glycine max L. с Rf — 0,28 (ИЦЛ,) и Rf — 0,44 (ИЦЛ2) и провести их сравнительный анализ. Использование изоформ изоцитратлиазы, выделенных из семядолей сои, открывает большие возможности для применения фермента в качестве аналитического реагента и создания на его основе биосенсоров для биохимических и кинетических анализов, в частности для определения концентрации глиоксиловой кислоты (прямая реакция) или изоцитрата (обратная реакция) в биохимических пробах [47, 183].

Получение в электрофоретически гомогенном состоянии ключевого фермента глиоксилатного цикла изоцитратлиазы из семян сои позволило провести сравнительное исследование физико-химических, кинетических и регуляторных свойств изоцитратлиазы. Установлено, что основные свойства изучаемого фермента мало отличаются по своим характеристикам (молекулярной массе, сродству к различным субстратам, рН оптимуму, влиянию катионов металлов и т. д.) от ИЦЛ из других организмов. Было выявлено, что ИЦЛ, и ИЦЛ2 состоят из четырёх одинаковых субъединиц с молекулярной массой 66 кДа, т. е. являются гомотетрамерами. Согласно большинству данных литературы, изоцитратлиаза из других объектов, как правило, имеет чётное число субъединиц с молекулярной массой 60 кДа. Выделенные и очищенные до гомогенного состояния изоформы изоцитратлиазы обладают различным сродством к субстрату. Это свидетельствует, главным образом, о различии форм изоцитратлиазы, что позволяет предположить их различную генетическую детерминированность [135]. Было выявлено, что глиоксисомальная форма изоцитратлиазы (ИЦЛ[) является Mg-зависимым ферментом, тогда как ИЦЛ2 активировалась ионами Мп2+, т. е. является Mn-зависимой. Другие одно- и двухвалентные катионы (Са2+, К+ и Na+) мало эффективны в регуляции активности изоформ изоцитратлиазы. Полученные нами данные коррелируют с результатами, проведёнными на других объектах исследования. ИЦЛ, выделенной из семядолей проростка Lupinus, необходимо присутствие Mg2+ тоже в концентрации 5 мМ, при этом достигается максимальная активация ИЦЛ [203].

Большое внимание было уделено молекулярным аспектам функционирования изоферментов изоцитратлиазы, т. е. идентификации генов ici! и icl2 и регуляции их экспрессии. В нашей работе был использован метод подбора праймеров по последовательности нуклеотидов из различных организмов. Нам удалось получить два продукта гена изоцитратлиазы. Было выявлено, что в семенах сои существуют два гена ИЦЛ — ici 1 и icl2.

Нуклеотидная последовательность iclj имеет 98,3 % гомологию с к ДНК ИЦЛ из клонотеки Glycine max sa92d05.yl Gm-cl004; 97,9% — Glycine max sam76e08.yl Gm-cl069. У второго продукта была прочитана последовательность длиной 594 н.п. Эта последовательность нуклеотидов на 98,5 % соответствует кДНК ИЦЛ из клонотеки Glycine max GMFL01-09-J11 и 88,2 % — Glycine max GMFL01-15-P18. Полученные продукты отличаются по своему нуклеотидному составу друг от друга и имеют гомологию между собой 19,9 %. Следовательно, наличие двух форм фермента и двух ПТ IP-продуктов с геноспецифическими праймерами является результатом работы двух разных генов, кодирующих ИЦЛ в геноме сои.

В данной работе выявлена зависимость изменения уровня экспрессии генов iclj и icl2 от времени прорастания семян и в процессе зеленения проростков сои. Изменение уровня экспрессии исследуемых генов чётко коррелирует с полученными данными о суммарной активности ИЦЛ в сое при прорастании, и, вероятно, является одним из механизмов её регуляции. После зеленения семядолей сои, уровень экспрессии генов, ответственных за глиоксисомальную функцию, резко снижается, и преобладает фотодыхательная деятельность пероксисом [68]. Данные по динамике экспрессии генов изоцитратлиазы позволяют оценить изменение скорости функционирования глиоксилатного цикла и выдвинуть предположение о его роли в метаболизме при прорастании семян и переходе их к фотосинтезу. В первые дни прорастания зародыш ещё не способен к фотосинтезу и получает необходимую энергию в процессе дыхания. Происходит активация глюконеогенетических процессов, физиологическая роль которых заключается в мобилизации запасных веществ. Однако, по мере зеленения проростков функцию обеспечения растения энергией берёт на себя фотосинтез, в связи с чем интенсивность глюконеогенеза значительно снижается по сравнению с первыми днями.

ЖЁЛТЫЕ (ЭТИОЛИРОВАННЫЕ^ СЕМЯДОЛИ

Глутамат — 2-ОГ •

Изоцитрат ицл2

Глицин Гликолат

Глиоксилат?-^-Глицин-V»- Глицин

Глутамат н,о

2-ОГ о2

-----Глицерат-^-1^^^" Серии ----Серии

ФОТОДЫХАНИЕ ЗЕЛЁНЫХ СЕМЯДОЛЕЙ

Рис. 36. Гипотетическая схема участия изоферментов ИЦЛ в мобилизации запасных жиров и фотодыхании в клетках семядолей сои в процессе функционального перехода.

ГЦ — глиоксилатный цикл, ТАГ — триацилглицерол, ЖК — жирные кислоты, ФЕП — фосфоренол пиру ват, 2-ОГ — 2-оксоглутарат, 1 — липаза, 2 — малатдегидрогеназа, 3 — цитратсинтаза, 4 — аконитатгидра-таза, 5 — изоцитратлиаза (ИЦЛ,), 6 — малатсинтаза, Р — рибулёза-бисфосфаткарбоксилаза, Г — гликолатоксидаза, К — каталаза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чан Тхи Хоанг Куен, Воронеж

1. Айала Ф. Современная генетика в 3-х т. / Ф. Айала. — М.: Мир, 1988. — 998 с.

2. Березин И. В. Основы физической химии ферментативного катализа / И. В. Березин, К. Мартинек. — М.: Высш. шк., 1977. — 280 с.

3. Березов Т. Т. Биологическая химия: Учебник.— 3-е изд., перераб. и доп. / Т. Т. Березов, Б. Ф.Коровкин. —М.: Медицина, 1998. — 704 с.

4. Волвенкин С. В. Субклеточная локализация и свойства ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс с аллоксановым диабетом / С. В. Волвенкин, В. Н. Попов, А. Т. Епринцев // Биохимия. — 1999. — Т. 64, Вып. 9. —С. 1185-1191.

5. Гродзинский А. М. Краткий справочник по физиологии растений / А. М. Гродзинский, Д. М. Гродзинский. —- Киев: Наукова думка, 1973. — 273 с.

6. Детерман Г. Гель-хроматография / Г. Детерман. — М.: Мир, 1970. — 173 с.

7. Диксон М. Ферменты: в 3-х т. / М. Диксон, Э. Уэбб; перевод с англ. Л. М. Гинодмана, М. И. Левянт; под ред. В. К. Антонова, А. Е. Браунштейна. — М.: Мир, 1982. — 1117 с.

8. Епринцев А. Т. Полимеразная цепная реакция как универсальный метод диагностики и идентификации генов / А. Т. Епринцев, Е. А. Москалёв, В. Н. Попов // Системный анализ и управление в биомедицинскихсистемах. — 2001. — T. 54, №1. — С. 9-14.

9. Епринцев А. Т. Очистка и физико-химические свойства изоцитратлиазы из куколок бабочки P. machaon L. / А. Т. Епринцев, М. Ю. Шевченко, В. Н. Попов. // Биохимия. — 2004. — Т. 69, № 4. — С. 467-472.

10. Епринцев А. Т. Экспрессия и регуляция ферментов глиоксилатного цикла / А. Т. Епринцев, В. Н. Попов, М. Ю. Шевченко. — Воронеж.: Центрально-Черноземное книжное издательство, 2005. —224с.

11. Епринцев А. Т. Глиоксилатный цикл: Универсиальный механизм адаптации? / А. Т. Епринцев, В. Н. Попов, М. Ю. Шевченко. — М.: ИКЦ «Академкнига», 2007. — 228 с.

12. Землянухин JL А. Очистка и свойства изоцитратлиазы из подсолнечника / JI. А. Землянухин, А. У. Игамбердиев, А. А. Землянухин // Биохимия. — 1984. — Т. 49, Вып. 3. — С. 387-393.

13. Землянухин А. А. Регуляция активности изоцитратлиазы в растениях конопли / А. А. Землянухин, А. У. Игамбердиев // Физиология растений. — 1985. — Т. 32, Вып. 4. — С. 739-746.

14. Землянухин А. А. Глиоксилатный цикл растений / А. А. Землянухин, JI. А. Землянухин, А. Т. Епринцев, А. У. Игамбердиев / ВГУ. — Воронеж, 1986. — 148 с.

15. Землянухин А. А. Большой практикум по физиологии растений. Учеб. пособие / А. А. Землянухин / JI. А. Землянухин. — Воронеж: ВГУ, 1996. — 188с.

16. Игамбердиев А. У. Внеглиоксисомальная форма изоцитратлиазы высших растений / А. У. Игамбердиев, А. А. Землянухин, И. В. Мещерякова // Физиология растений. — 1986. — Т. 33, Вып.6. — С. 1113-1120.

17. Игамбердиев А. У. Исследование кинетических свойств и модификаций аминокислотных остатков изоцитратлиазы из щитка кукурузы / А. У. Игамбердиев, А. А. Землянухин // Биохимия. — 1987. — Т. 52, Вып. 8. — С. 1286-1293.

18. Игамбердиев А. У. Микротельца в метаболизме растений / А. У. Игамбердиев / ВГУ. — Воронеж, 1990. — 148 с.

19. Игамбердиев А. У. Роль пероксисом в организации метаболизма растений / А. У. Игамбердиев // Соросовский Образовательный журнал. — 2000.—Т. 6, № 12. —С. 113-124.

20. Климова М. А. Физико-химические и кинетические характеристики изоцитратлиазы из МасвомопаБ ШрипММа / М. А. Климова // Весник ВГУ. Серия. Химия, Биология, Фармация. — 2004. — №2. ■— С. 139-141.

21. Климова А. Т. Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств: Учебно-методическое пособие для вузов (Практикум) / М. А. Климова, А. Т. Епринцев. — Воронеж: Изд-во ВГУ, 2008,— 36 с.

22. Коэн Ф. Регуляция ферментативной активности / Ф. Коэн — Москва: Мир, 1986. — 144 с.

23. Лакин Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин. — Москва: Высшая школа, 1990. — 352 с.

24. Лебкова Н. П. Субстратное обеспечение энергетического гомеостаза при голодании / Н. П. Лебкова // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 1991. — № 11. — С.475-480.

25. Ленинджер А. Биохимия / А. Ленинджер. — М.: Мир, 1985. — 1056 с.

26. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук. — М.: Мир, 1984. — 480с.

27. Маслова Е. В. Субклеточная локализация активности изоцитратлиазы из щитков кукурузы / Е. В. Маслова, Д. Н. Федорин, В. Ю. Башмаков и др. // Вестник ВГУ. Серия: Химия, Биология, Фармация. — 2007. — №2. —С. 71-74.

28. Мауэр Г. Диск-электрофорез / Г. Мауэр / Пер. с англ. — Москва: Мир, 1971. —222 с.

29. Остерман JI. А. Исследование биологических макромолекул / Л. А. Остерман. — Москва: Мир, 1983. — 297 с.

30. Северина С. Е. Практикум по биохимии / С. Е. Северин, Г. А. Соловьева. — М.: Изд-во МГУ. — 1989. — 509 с.

31. Скоупс Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. — М.: Изд-во Мир. — 1985. —358 с.

32. Соколовский В. Ю. Действие стрессоров на дифференциальную экспрессию генов в ходе развития Neurospora crassa / В. Ю. Соколовский, Т. А. Белозерская // Успехи биол.химии. — 2000. — Т. 40. — С. 85-152.

33. Страйер Л. Биохимия; Пер. с англ. / Л. Страйер. — М.: Мир, 1984 — Т. 1 — 232 с.

34. Чернышов Г. А. Вероятность и статистика в биологии и химии / Г. А. Чернышев, В. H Стариков. — Воронеж: ВГУ, 1998. — 270 с.

35. Чиков В. И. Фотодыхание / В. И. Чиков // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. — № 11. — С. 2-8

36. Шевченко М. Ю. Выделение и очистка изоцитратлиазы из куколок бабочки P. machaon L. / M. Ю. Шевченко, Е. А. Москалёв, А. Т. Епринцев // Биология — наука XXI века: Материалы 7-й Пущинской конф. молодых учёных, Пущино. — 2003. — Т. 1. — С. 390-391.

37. Шевченко М. Ю. Очистка изоцитратлиазы из печени эмбрионов Gallus domesticus L. / M. Ю. Шевченко и др. // Сорбционные хроматографи-ческие процессы . — 2006. — Т. 6, Вып. 5. — С. 851-854.

38. Abba S. The role of the glyoxylate cycle in the symbiotic fungus Tuber borchii:expression analysis and subcellular localization/ S. Abba // Biomedical and Life Sciences. — 2007. — Vol. 52, No. 3-4. — P. 159-170.

39. Arai Y. Proteomic Analysis of Highly Purified Peroxisomes from Etiolated Soybean Cotyledons / Y. Arai // Plant and Cell Physiology. — 2008.— Vol. 49, I. 4. — P. 526-539.

40. Asakura M. Multiple Contributions of Peroxisomal Metabolic Function to Fungal Pathogenicity in Colletotrichum lagenarium / M. Asakura, T. Okuno, Y. Takano // Applied and Environmental Microbiology. — 2006. — Vol. 72, No. 9. — P. 6345-6354.

41. Atomi H. Peroxisomal Isocitrate Lyase of the «-Alkane-Assimilating Yeast: Gene Analysis and Characterization / H. Atomi et. al. // Journal of Biochemistry. — 1990. — Vol. 107, No. 2. — 262 p.

42. Bahk Y. Y. Acidic isocitrate lyase from Acinetobacter calcoaceticus Grown on malonat / Y. Y. Bahk // Korean Biochem. — 1987. — Vol. 20, No. 2. — P. 191-197.

43. Bailon P. Affinity chromatography. Methods and protocols / P. Bailon // Humana Press. — 2000. — 240 p.

44. Bassi A. S. Carbon Paste Biosensor Based on Crude Soybean Seed Hull Extracts for Phenol Detection / A. S. Bassi, C. McGrath // J. Agric. Food Chem. — 1999. — Vol. 47. — P. 322-326.

45. Beeching J. R. Nucleic acid (cDNA) and amino acid sequences of isocitrate lyase from castor bean / J. R. Beeching // Plant Molecular Biology. — 1987. — Vol. 8, No. 6. —P. 471-475.

46. Bellion E. Two Distinct Isocitrate Lyases from a Pseudomonas Species / E. Bellion // J Bacteriol. — 1975. — Vol. 122, No. 2. — P. 557-564.

47. Bentrup K. H. Z. Characterization of Activity and Expression of Isocitrate Lyase in Mycobacterium avium and Mycobacterium tuberculosis / K. H. Z. Bentrup //Journal of Bacteriol. — 1999. — Vol. 181, No. 23. — P. 7161-7167.

48. Birnboim H. C. A rapid alkaline extraction procedure for screeningrecombinant plasmid DNA / H. C. Birnboim, J. Doly // Nucleic Acid Res. — 1979,—Vol. 7. —P. 1513-1523.

49. Blackburn P. Ribonuclease inhibitor from human placenta: interaction with derivatives of ribonuclease A / P. Blackburn, B. L. Jailkhani // J Biol Chem. — 1979. — Vol. 254. — P. 12488-12493.

50. Bowyer P. Use of an isocitrate lyase promoter—GFP fusion to monitor carbon metabolism of the plant pathogen Tapesia yallimdae during infection of wheat / P. Bowyer, E. Mueller, J. Lucas // Mol. Plant Pathol. — 2000. — V. 1, No. 1.—P. 253-262.

51. Britton K. L. The structure and domain organization of Escherichia coli isocitrate lyase / K. L. Britton // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. — 2001.—Vol. 57, Part9.—P. 1209-1218.

52. Cánovas D. Developmental regulation of the glyoxylate cycle in the human pathogen Penicillhtm marneffei / D. Cánovas, A. Andrianopoulos // Mol Microbiol. —2006. —Vol. 62, No. 6. —P. 1725-1738.

53. Chaves R. S. Isocitrate lyase localisation in Saccharomyces cerevisiae cells / R. S. Chaves//Gene. — 1997. —Vol. 198,1. 1-2. —P. 165-169.

54. Chomczynski P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / Chomczynski P., Sacchi N. // Anal. Biochem. — 1987. — Vol. 162. — P. 156-159

55. Cioni M. Comparative biochemistry of the glyoxylate cycle / M. Cioni, G. Pinzauti, P. Vanni // Comp. Biochem. Physiol. — 1981. — Vol.70, No. 1. — P. 1-26.

56. Comai L. Coordinate Expression of Transcriptionally Regulated Isocitrate Lyase and Malate Synthase Genes in Brassica napus L / L. Comai // The Plant Cell. — 1989.—Vol. 1,1 3.— P. 293-300.

57. Davis B. J. A new high-resolution electrophoresis method / B. J. Davis, L. Ornstein // Delivered at the society for the study at the New York Academy of Medicine. — 1959.—P. 112-118.

58. Davis W. L. Glyoxylate cycle in the rat liver: effect of vitamin D3-treatment / W. L. Davis, J. L. Matthews, D. B. Goodman // Faseb J. — 1989. — Vol. 3. — P. 1651-1655.

59. Davis W. L. Hibernation activates glyoxylate cycle and gluconeogenesis in black bear brown adipose tissue / W. L. Davis, D. B. Goodman, L. A. Crawford // Biochim Biophys Acta. — 1990. — Vol. 1051, No. 3. — P. 276-278.

60. Davis W. L. Evidence for the glyoxylate cycle in human liver / W. L. Davis, D. B. Goodman // Source Anatomical Record. — 1992. — V. 234, No. 4. — P. 461-468.

61. De Bellis L. Localization of glyoxylate-cycle marker enzymes in peroxisomes of senescent leaves and green cotyledons / L. De Bellis, P. Picciarelli, L. Pistelli // Planta. — 1990. — Vol. 180, No. 3. — P. 435-439.

62. De Hoop M. J. Import of proteins into peroxisomes and other microbodies / M. J. De Hoop, A. B. Geert // Biochem J. — 1992. — Vol. 286. — P. 657-669.

63. De Lucas J. R. Purification and properties of isocitrate lyase from Aspergillus nidulans, a model enzyme to study catabolite inactivation in filamentous fungi / J. R. De Lucas et. al. // Microbiol. — 1997. — Vol. 101. — P. 410414.

64. Delkin G. Specific elements of the glyoxylate pathway play a significant role in the functional transition of the soybean cotyledon during seedling development / G. Delkin, L. Vodkin // BMC Genomics. — 2007. — Vol. 8, No. 468.—P. 1-22.

65. Dunn M. F. Major roles of isocitrate lyase and malate synthase in bacterial and fungal pathogenesis / M. F. Dunn, J. A. Ramírez-Trujillo, I. Hernández-Lucas // Microbiology. —2009. —Vol. 155,1. 10.—P. 3166-3175.

66. Eastmond P. J. Postgerminative growth and lipid catabolism in oilseeds lacking the glyoxylate cycle / P. J. Eastmond, V. Germain, P. R. Lange // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2000. — Vol. 97,1. 10. — P. 5669-5674.

67. Eprintsev A. T. Physicochemical and kinetic characteristics of isoforms of isocitrate lyase from corn / A. T. Eprintsev, E. V. Maslova, D. N. Fedorin et. al. // Biochemistry (Mosc). — 2009. — Vol. 74,1. 5. — P. 528-532.

68. Ernesto J. M. tuberculosis isocitrate lyases 1 and 2 are jointly required for in vivo growth and virulence / J. Ernesto // Nature Medicine. — 2005. — Vol. 11. — P. 638-644.

69. Eubel H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis / H. Eubel, L. J. Heazlewood, A. H. Millar // Plant Proteomics, Methods in Molecular Biology. — 2007. — Vol. 355. — P. 49-62.

70. Fargeix C. Soybean (Glycine max L.) and bacteroid glyoxylate cycle activities during nodular senescence / C. Fargeix, K. Gindro, F. Widmer // J. Plant Physiol. — 2004. — Vol. 161. — P. 183-190.

71. Fernandez E. The ICL1 gene from Saccaaromyces cerevisiae II E. Fernandez, F. Moreno // Biochem. — 1992. — Vol. 204, No. 1. — P. 983-990.

72. Firenzuoli A. M. Enzymes of glyozylate cycle in conifers / A. M. Firenzuoli, P. Vanni, E. Mastronuzzi // Plant Physiol. — 1968. — V. 43, No. 7. — P. 11251128.

73. Forster A. Overexpression of the ICL1 gene changes the product ratio of citricacid production by Yarrowia lipolytica // A. Forster et. al. // Appl Microbiol Biotechnol. — 2007. — Vol. 77, No. 4. — P. 861-870.

74. Frevert J. Purification and Glycoprotein Nature of Glyoxysomal Isocitrate Lyase from Cucumber Cotyledons / J. Frevert, H. Kindl // Eur J Biochem. — 1978. — Vol. 92. — P. 35-43.

75. Frevert J. Occurrence and biosynthesis of glyoxysomal enzymes in ripening cucumber seeds / J. Frevert, W. Koller, H. Kindl // Physiol.Chem. — 1980. — Vol. 361, No. 10.—P. 1557-1565.

76. Gemmrich A. R. Isocitrate lyase in germinating spores of the fern Anemia phyllitids / A. R. Gemmrich // Phytochemistry. — 1979. — Vol. 18, No. 6. — P. 1143-1146.

77. Giachetti E. Effect of Mg2+ and Mn2+ on isocitrate lyase, a non-essentially metal-ion-activated enzyme A graphical approach for the discrimination of the model for activation / E. Giachetti, P. Vanni // Biochem J. — 1991. — Vol. 276. — P. 223-230.

78. Godavari H. R. Isocitrate lyase in green leaves / H. R. Godavari// Plant Physiol. — 1973. — Vol. 51, No. 6 — P. 863-867.

79. Goodman D. B. Glyoxylate cycle in toad urinary bladder: possible stimulation by aldosterone / D. B. Goodman, W. L. Davis, R. G. Jones // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1980. — Vol. 77, No. 3. — P. 1521-1525.

80. Guo Y. Transcriptome of Arabidopsis leaf senescence / Y. Guo et. al. // Plant Cell EnViron. — 2004. — Vol. 27. — P. 521-549.

81. Hashimoto K. Peroxisomal localization of a myosin XI isoform in Arabidopsis thaliana / K. Hashimoto, H. Igarashi, S. Mano et. al. // Plant Cell Physiol. — 2005. — Vol. 46. — P. 782-789.

82. Hayashi M. Functional transformation of plant peroxisomes / M. Hayashi, K. Toriyama, M. Kondo et. al. // Cell Biochemistry and Biophysics. — 2000. — Vol. 32,1. 1-3.—P. 295-304.

83. Hayashi M. Arabidopsis thaliana — A model organism to study plantperoxisomes / M. Hayashi, M. Nishimura // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). —2006.—Vol. 1763,1. 12. — P. 1382-1391.

84. Holmes R. P. The absence of glyoxylate cycle enzymes in rodent and embrionic chick liver / R. P. Holmes // Biochim. Biophys. Acta. — 1993. — Vol. 1158. —P. 47-51.

85. Hou W. C. Activity staining of isocitrate lyase after electrophoresis on either native or sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels / W. C. Hou et. al. // Electrophoresis. — 2001. — Vol. 22, No. 13. — P. 2653-2658.

86. Hoyt J. C. Purification and Characterization of Acinetobacter calcoaceticus Isocitrate Lyase / J. C. Hoyt // J Bacteriol. — 1991. — Vol. 173, No. 21. — P. 6844-6848.

87. Hunt L. Subcellular Localization of Isocitrate Lyase in Nongreen Tissue Culture Cells / L. Hunt // Plant Physiology. — 1978. — Vol. 61. — P. 10101013.

88. Hynes M. J. Genetic Analysis of the Role of Peroxisomes in the Utilization of Acetate and Fatty Acids in Aspergillus nidulans / M. J. Hynes // Genetics. — 2008. —Vol. 178.—P. 1355-1369.

89. Idnurm A. Isocitrate Lyase Is Essential for Pathogenicity of the Fungus Leptosphaeria maculans to Canola (Brassica napus) / A. Idnurm, B. J. Howlett // Eukaryot Cell. — 2002. — Vol. 1, No. 5. — P. 719-724.

90. Idnurm A. Peroxisome Function Regulates Growth on Glucose in the Basidiomycete Fungus Cryptococcus neoformans / A. Idnurm // Eukdaryotic Cell. — 2007. — Vol. 6, No. 1. — P. 60-72.

91. Ishii A. Isozymes of Isocitrate Dehydrogenase from an Obligately Psychrophilic Bacterium, Vibrio Sp. Strain ABE-1: Purification,and

92. Modulation of Activities by Growth Conditions / A. Ishii // The Journal of Biochemistry. — 1987. — Vol. 102,1. 6. — P. 1489-1498.

93. John P. C. L. The Purification and Properties of Isocitrate Lyase from Chlorella / P. C. L. John // Biochem J. — 1967. — Vol. 105, No. 1. — P. 409416.

94. Kamel M. Y. Biochemical studies of tick embriogenesis. Purification and partial characterisation of isocitrate lyase from eggs of the tick Hyalomma dromedarii / M. Y. Kamel, A. S. Fahmy // Comp. Biochem. Physiol. B. — 1982.—Vol. 72. —P. 107-115.

95. Karlekar K. Salt mediated changes in some enzymes of carbohydrate metabolism in halotolerant Cladosporium sphaerospermum / K. Karlekar, T. V. Parekh, H. S. Chhatpar 11 Journal of Biosciences. — 1985. — Vol. 9, No. 3-4.—P. 197-201.

96. Kazuo N., Amano Y., Nakadate M. // Ferment and Bioeng. 1989. — V. 67. No. 3. —P. 153-157.

97. Khan F. R. Purification and properties of isocitrate lyase from flax seedlings / F. R. Khan, M. Saleemuddin, M. Siddiqi et. al. //Arch. Biochem. Biophys. — 1977.—Vol. 183. —P. 13-23.

98. Khan F. R. McFadden B. A. Embryogenesis and the glyoxylate cycle // FEBS Lett. — 1980.-Vol. 115. —P. 312-314.

99. Khan F. R. Isocitrate Lyase from Flax. Terminal Residues, Composition, Active Site, and Catalysis / F. R. Khan, B. A. McFadden // Plant Physiol. — 1982. — Vol. 70, No. 4. — P. 943-948.

100. Kochlcina V. M. Isolation, Purification, and Crystallization of Aspartate Aminotransferase from Wheat Grain / V. M. Kochkina // Biochemistry

101. Moscow). — 2004. — Vol. 69, No. 8. — P. 897-900.

102. Kornberg H. L. Synthesis of cell constituents from C2-units by a modigied tricarboxylic acid cycle / H. L. Kornberg, H. A. Krebs // Nature. — 1957. — Vol.179. — P. 988-991.

103. Kretzschmar U. Function and transcriptional regulation of the isocitrate lyase in Pseudomoncis aeruginosa / U. Kretzschmar et. al. // Arch Microbiol. — 2008.—Vol. 190, No. 2.—P. 151-158.

104. Kunze M. A central role for the peroxisomal membrane in glyoxylate cycle function / M. Kunze, I. Pracharoenwattana, S. M. Smith et. al. // Biochim Biophys Acta. — 2006. — Vol. 1763.—P. 1441-1452.

105. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during te assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. — 1970. — V. 227. — P. 680-683.

106. Large P. J. Subcellular location of the enzymes of purine breakdown in theyeast Candida famata grown on uric acid / P. J. Large, H. R. Waterham, M. Veenhuis // FEMS Microbiology Letters. — 1990. — Vol. 72, I. 3. — P. 303307.

107. Lee M. S. Oilseed isocitrate lyases lacking their essential type 1 peroxisomal targeting signal are piggybacked to glyoxysomes / M. S. Lee, R. T. Mullen, R. N. Trelease // Plant Cell. — 1997. — Vol. 9. — P. 185-197.

108. Li J. Differential expression of isocitrate lyase in P. marneffei phagocytized by nonstimulated and stimulated murine macrophages / J. Li et. al. // Chinese. — 2007. — Vol. 27, No. 5. — P. 631-634.

109. Lin S. F. Purification, Identification, and Characterization of Peanut Isocitrate Lyase / S. F. Lin, P. L. Ong, C. R. Jhou et. al. // J Agric Food. Chem. —2008. — Vol. 26. — P. 1845-1851.

110. Lingard M.J. Peroxisome-associated matrix protein degradation in Arabidopsis / M. J. Lingard, M. Monroe-Augustus, B. Bartel // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2009. — Vol. 106, No. 11. — P. 45614566.

111. Liu F., Thatcher J. D., Epstein H. F. // Biochemistry. — 1997. — V. 36, No. 1. — P. 255-260.

112. Liu S. Crystal structures of 2-methylisocitrate lyase in complex with product and with isocitrate inhibitor provide insight into lyase substrate specificity, catalysis and evolution / S. Liu et. al. // Biochemistry. — 2005. — Vol.44. — P. 2949-2962.

113. Lopez M. Enzyme activity and dynamics in near-anhydrous conditions / M. Lopez, V. Kurkal-Siebert, R. Dunn //. Nature proceedings. — 2009. — hdl: 10101/npre.2009.3884.1.

114. Lopez-Boado Y. S. Purification of isocitrate lyase from Saccharomyces cerevisiae / Y. S. Lopez-Boado, P. Herrero, M. Fernandez et. al. // Yeast. — 1988. — Vol. 4, Issue 1. — P. 41-46.

115. Lowry O. H. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O. H. Lowry, N. J. Rosenbourgh, A. L. Farr, R. J. Randall // J. Biol. Chem. — 1951.—V. 194. —P. 265-275.

116. Luttik A. H. The Saccharomyces cerevisiae ICL2 Gene Encodes a Mitochondrial 2-Methylisocitrate Lyase Involved in Propionyl-Co-A Metabolism / A. H. Luttik et. al. // Journal of Bacteriology. — 2000. — Vol. 182, No. 5. —P. 7007-7013

117. MacKintosh C. Purification and regulatory properties of isocitrate lyase from Escherichia coli ML308 / C. MacKintosh, H. G. Nimmo // Biochem J. — 1988. — Vol. 250. —P. 25-31.

118. Maharjan R. P. The role of isocitrate lyase and the glyoxylate cycle in Escherichia coli growing under glucose limitation / R. P. Maharjan et. al. // Res Microbiol. — 2005. — Vol.156, No. 2. — P. 178-183.

119. Malhotra 0. P. Isolation and characterization of isocitrate lyase of castor endosperm / O. P. Malhotra, P. K. Srivastava // Arch Biochem Biophys. — 1982.—Vol. 214,No. 1. —P. 164-171.

120. Mano S. Plant peroxisomes / S. Mano, N. Nishimura // Vitam Horm. — 2005. —Vol. 72. —P. 111-154.

121. Masaaki U. Properties of isocitrate lyase from an alkane-utilizable yeast, Candida tropicalis I / U. Masaaki, M. Ueda, T. Matsuki et. al. // Agr. And Biol. Chem.— 1986.— Vol. 50, No. 1.—P. 127-134.

122. Mateos R. M. Peroxisomes from pepper fruits (Capsicum annuum L.): purification, characterisation and antioxidant activity / R. M. Mateos // J Plant Physiol.—2003.—Vol. 160,1. 12. —P. 1507-1516.

123. Masayoshi M. Isolation, Hyperexpression, and Sequencing of the ace A Gene Encoding Isocitrate Lyase in Escherichia coli / M. Masayoshi // J. of Bacteriology. — 1988. — Vol. 170,1. 10. — P. 4528-4536.

124. McFadden B. A. Itaconate, an Isocitrate Lyase-Directed Inhibitor in Pseudomonas indigofera / B. A. McFadden // J Bacteriol. — 1977. —Vol. 131, No. 1.—P. 136-144.

125. McKinney J. D. Persistanse of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase / J. D. McKinney, Z. U. Honer, K. Bentrup // Nature. — 2000. — Vol. 406. — P. 735738.

126. Mullen R. T. Isocitrate lyase from germinated loblolly pine megagametophytes: enzyme purification and immunocharacterization / R. T. Mullen, D. J.

127. Gifford // Plant Physiol, and Biochem. — 1995. — Vol. 33, No. 1. — P. 87-95.

128. Muñir E. New role for glyoxylate cycle enzymes in wood-rotting basidiomycetes in relation to biosynthesis of oxalic acid / E. Muñir, J. Yoon , T. Tokimatsu et. al. // Journal of Wood Science. — 2001. — Vol. 47, No. 5. — P. 368-373.

129. Muñoz-Elias E. J. M. tuberculosis isocitrate lyases 1 and 2 are jointly required for in vivo growth and virulence / E. J. Muñoz-Elias, J. D. McKinney // Nature Medicine. — 2005. — Vol. 11. — P. 638-644.

130. Nguyen A. T. Metal-catalyzed oxidation induces carbonylation of peroxisomal proteins and loss of enzymatic activities / A. T. Nguyen, R. P. Donaldson // Arch Biochem Biophys. — 2005. — Vol.439, No.l. — P. 25-31.

131. Nishimura M. Leaf peroxisomes are directly transformed to glyoxysomes during senescence of pumpkin cotyledons / M. Nishimura, Y. Takeuchi, L. De Bellis, I. Hara-Nishimura // PROTOPLASMA. — 1993. — Vol. 175, No. 3-4,—P. 131-137.

132. Nyathi Y. Plant peroxisomes as a source of signalling molecules / Y. Nyathi, A. Baker//Biochim Biophys Acta. — 2006. — Vol. 1763,1. 12. —P. 1478-1495.

133. Okay ama H. High-efficiency cloning of full-length cDNA; construction and screening of cDNA expression libraries for mammalian cells / H. Okayama // Methods Enzymol. — 1987. — Vol. 154. — P. 3-28.

134. Olsen L. J. Targeting of Glyoxysomal Proteins to Peroxisomes in Leaves and

135. Roots of a Higher Plant / L. J. Olsen, W. F. Ettinger, B. Damsz et. al. // Plant Cell. — 1993. — Vol. 5,1. 8. — P. 941-952.

136. Ono K. Purification and Characterization of Isocitrate Lyase from Ethanol-grown Euglena gracilis / K. Ono, M. Okihashi, H. Inui // Journal of Eukaryotic Microbiology. — 1994 . — Vol. 41,1. 6. — P. 536-539.

137. Ono K. Presence of glyoxylate cycle enzymes in the mitochondria of Euglena gracilis / K. Ono, M. Kondo, T. Osafune // Journal of Eukaryotic Microbiology. —2003. — Vol. 50,1. 2. — P. 92-96.

138. Onyeocha I. Targeting of castor bean glyoxysomal isocitrate lyase to tobacco leaf peroxisomes / I. Onyeocha, R. Behari, D. Hill, A. Baker // Plant Mol Biol. — 1993. — Vol. 22. — P. 385-396.

139. Palma J. M. Proteome of plant peroxisomes: new perspectives on the role of these organelles in cell biology / J. M. Palma, F. J. Corpas, L. A. del Rio // Proteomics. — 2009. — Vol. 9. — P. 2301-2312.

140. Phue J. N. Transcription levels of key metabolic genes are the cause for different glucose utilization pathways in E. coli B (BL21) and E. coli K (JM109) / J. N. Phue, J. Shiloach // J. Biotechnol. — 2004. — Vol. 109, No. 2. —P. 21-30.

141. Piekarska K. The activity of the glyoxylate cycle in peroxisomes of Candida albicans depends on a functional (3-oxidation pathway: evidence for reduced metabolite transport across the peroxisomal membrane / K. Piekarska, G.

142. Hardy, E. Mol et. al. // Microbiology. — 2008. — Vol. 154. — P. 30613072.

143. Pinzauti G. Isocitrate lyase of conifers {Pinus pined) / G. Pinzauti, E. Giachetti, P. Vanni // Int. J. Biochem. — 1982. — Vol.14, No. 4. — P. 267-275.

144. Piques M. Ribosome and transcript copy numbers, polysome occupancy and enzyme dynamics in Arabidopsis / M. Piques, W. X. Schulze, M. Hôhne et. al. // Mol Syst Biol. — 2009. — Vol. 5, No. 314.

145. Pistelli L. Effect of Leaf Senescence on Glyoxylate Cycle Enzyme activities / L. Pistelli, P. Perata, A. Alpi // Australian Journal of Plant Physiology. — 1992. — Vol. 19, tto. 6. — P. 723-729.

146. Pistelli L. Evidences of glyoxylate cycle in peroxisomes of senescent cotyledons / L. Pistelli // Plant Sci. — 1995. — Vol. 109, No. 1. — P. 13-21.

147. Polanowski A. J. Soybean isocitrate lyase: Purification, immunoassay and N-terminal sequence / A. J. Polanowski, R. L. Obendorf // Plant Physiol. Biochem. — 1991. — Vol. 29. — P. 119-129.

148. Popov V.N. Induction of glyoxylate cycle enzymes in rat liver upon food starvation / V. N. Popov, A. U. Igamberdiev, C. Schnarrenberger et. al. // FEBS Lett. — 1996. — Vol. 390. — P. 258-260.

149. Popov V.N. Glyoxylate cycle enzymes are present in liver peroxisomes of alloxan-treated rats / V. N. Popov, S. V. Volvenkin, A. T. Eprintsev // FEBS Lett. — 1998. — Vol. 440. — P. 55-58.

150. Pracharoenwattana I. When is a peroxisome not a peroxisome? / I. Pracharoenwattana, S. M. Smith // Trends Plant Sci. — 2008. — Vol. 13. — P. 522-525.

151. Ranaldi F. Multisite Inhibition of Pinns pinea Isocitrate Lyase by Phosphate / F. Ranaldi, P. Vanni, E. Giachetti // Plant Physiol. — 2000. — Vol. 124. — P. 1131-1138.

152. Ranaldi F. Enzyme catalysis in microgravity: steady-state kinetic analysis of the isocitrate lyase reaction, F. Ranaldi, P. Vanni, E. Giachetti // Biophys

153. Chem. —2003.— Vol. 103.— P. 169-177.

154. Reeves H. C. Determination of isocitrate lyase activity in poly aery lamide gels / H. C. Reeves, M. J. Volk // Anal. Biochem. — 1972. — Vol. 48, No. 2. — P. 437-441.

155. Regev-Rudzki N. Yeast Aconitase in Two Locations and Two Metabolic Pathways: Seeing Small Amounts Is Believing / N. Regev-Rudzki, S. Karniely, N. N. Ben-Haim et. al. // MBoC in Press. — 2005. — Vol. 16, I. 9. — P. 4163-4171.

156. Rehman A. Cysteine 195 has a critical functional role in catalysis by isocitrate lyase from Escherichia coli / A. Rehman, B. A. McFadden // Curr. Microbiol. — 1997. — Vol. 35. — P. 267-269

157. Reiss U. Isocitrate lyase from the free-living nematode, Turbatrix aceti.

158. Purification and properties / U. Reiss, M. Rothstein // Biochemistry. —1974. — Vol. 13. —P. 1796-1800.

159. Reynolds S. J. Regulation of expression of the cucumber isocitrate lyase gene in cotyledons upon seed germination and by sucrose / S. J. Reynolds, S. M. Smith // Plant Molecular Biology. — 1995. — Vol. 29, No. 5. — P. 885-896.

160. Rickie B. T. Ontogeny of cotton seeds: gametogenesis, embryogenesis, germination, and seedling growth / B. T. Rickie, K. D. Chapman // Physiology of cotton. — 2010. — P. 332-341.

161. Robertson E. F. Purification and characterization of isocitrate lyase from Escherichia coli / E. F. Robertson, H. C. Reeves // Current microbiology. — 1986 . —Vol. 14, No. 6. — P. 347-350.

162. Rua J. Isocitrate lyase from Phycomyces blakesleeanus. The role of Mg2+ ions, kinetics and evidence for two classes of modifiable thiol groups / J. Rua, D. de

163. Arriaga, F. Busto et. al. // Biochem J. — 1990 . — Vol. 272. — P. 359-367.

164. Rubin H. Subcellular localization of glyoxylate cycle enzymes in Suum ascaris larvae / H. Rubin, R. N. Trelease // J Cell Biol. — 1976. — Vol. 70. — P. 374-383.

165. Ruchti M. Isocitrate Lyase from Germinating Soybean Cotyledons: Purification and Characterization / M. Ruchti, F. Widmer // Journal of Experimental Botany. — 1986. — Vol. 37, No. 1. — P. 1685-1690.

166. Sariaslani F. S. Control of Isocitrate Lyase in Nocardia salmonicolor / F. S. Sariaslani, A. W. Westwood, I. J. Higgins // Journal of General Microbiology. — 2001. — Vol. 91. — P. 315-324.

167. Schnarrenberger C. Development of microbodies in sunflower cotyledons and castor bean endosperm during germination / C. Schnarrenberger, A. Oeser, N.E. Tolbert // Plant Physiol. — 1971. — Vol. 48, No. 5. — P. 566-574.

168. Schöbel F. Aspergillus fumigatus Does Not Require Fatty Acid Metabolism via Isocitrate Lyase for Development of Invasive Aspergillosis Felicitas / F. Schöbel, O. Ibrahim-Granet, R Ave // Infection and Immunity. — 2007. — Vol. 75,No. 3.—P. 1237-1244.

169. Sharma V. Structure of isocitrate lyase, a persistence factor of Mycobacterium tuberculosis / V. Sharma, H. Bentrup, J. D. McKinney et. al. // Nat. Struct. Biol. — 2000. — Vol.7. — P. 663-668.

170. Shevchenko A. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained Polyacrylamide / A. Shevchenko, H. Wilm, O. Vorm // Anal. Chem. — 1996. —Vol. 68.—P. 850-858.

171. Shi L. Hydrogen peroxide biosensor based on direct electrochemistry of soybean peroxidase immobilized on single-walled carbon nanohorn modified electrode / L. Shi, X. Liu, W. Niu, H. Li et. al. // Biosens Bioelectron. — 2009. —Vol. 24, —P. 1159-1163.

172. Shiio I. Isocitrate lyase from Pseudomonas indigoferal. Preparation, amino acid composition and molecular weight / I. Shiio, T. Shiio, B. A. McFadden // Biochim. Biophys. Acta. — 1965. — Vol. 96,1. 1. — P. 114-122.

173. Siddiqui A. A. Cloning and expression of isocitrate lyase from human round worm Strongyloides stercoralis / A. A. Siddiqui, C. S. Stanley, S. L. Berk // Parasite. — 2000. — Vol. 7. — P. 233-236.

174. Simanshu D. K. Crystal structure of Salmonella typhimurium 2-methylisocitrate lyase (PrpB) and its complex with pyruvate and Mg2+ / D. K. Simanshu et. al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2003. —Vol. 311.— P. 193-201.

175. Singh V. K. Kinetic modeling of tricarboxylic acid cycle and glyoxylate bypassin Mycobacterium tuberculosis, and its application to assessment of drug targets / V. K. Singh, I. Ghosh // Theor Biol Med Model. — 2006.

176. Sjogren R. E. Evidence for Multiple Forms of Isocitrate Lyase in Neurospora crassa / R. E. Sjogren, A. H. Romano // J Bacteriol. — 1967. —■ Vol. 93. — R 1638-1643.

177. Song S. Can the glyoxylate pathway contributes to fat-indused hepatic insulin resistance? / S. Song // Med. Hypotheses. — 2000. — Vol. 54. — P. 739-747.

178. Stabenau H. Glycolate metabolism in green algae / H. Stabenau, U.Winkler // Physiologia Plantarum. — 2005. — Vol. 123,1. 3. — P. 235-245.

179. Surendranathan K. K. Properties of an Mg2 ^-independent isocitrate lyase from gamma irradiated preclimacteric banana {Musa cavendishii) / K. K. Surendranathan, P. M. Nair // Proc. Indian Acad. Sci. — 1978. — Vol. 87, Ser. B, No. 4.— P. 119-126.

180. Taylor K. M. Localization and targeting of isocitrate lyases in Saccharomyces cerevisiae / K. M. Taylor, C. P. Kaplan, X. Gao // Biochem J. — 1996. — Vol. 319.—P. 255-262.

181. Theologis A. Sequence and analysis of chromosome 1 of the plant Arabidopsis thaliana / A. Theologis et. al. //Nature. — 2000. — Vol. 408. — P. 816-820.

182. Turley R. B. Characterization of a cDNA clone encoding the complete amino acid sequence of cotton isocitrate lyase / R. B. Turley, S. M. Choe, R. N.

183. Trelease // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Gene Structure and Expression. — 1990. —Vol. 1049,-1. 2. —P. 223-226.

184. Tzachi B. Kinetic Outlier Detection (KOD) in real-time PCR / / B. Tzachi // Nucleic Acids Research. — 2003. —Vol. 31. —P. 105-109. .

185. Uhrigshardt H. Evidence for an operative glyoxylate cycle in the thermoacidophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius / H. Uhrigshardt et. al. // FEBS Lett. — 2002. — Vol. 513. — P. 223-229.

186. Van den Bosch H. Biochemistry of peroxisomes / H. Van den Bosch // Annual Review of Biochemistry. — 1992. — Vol. 61. — P. 157-197.

187. Vanni P. Studies on isocitrate lyase isolated from Lupinus colyledons / P. Vanni, M. T. Vincenzini, F. M. Nerozz et. al. // Can. J. Biochem. — 1979. — Vol.57, No. 9. —P. 1131-1137.

188. Vincenzin M. T. Isolation and properties of isocitrate lyase from Lupinus seed/ M. T. Vincenzini, F. Nerozzi, F. F. Vincieri // Phytochemistry. — 1980. — Vol. 19,1. 5, — 1980, P. 769-774.

189. Volvenkin S. V. Subcellular Localization and Properties of Glyoxylate Cycle Enzymes in the Liver of Rats with Alloxan Diabetes / S. V. Volvenkin, V. N. Popov, A. T. Eprintsev // Biochemistry (Mosc). — 1999. — Vol. 64. — P. 994-999.

190. Wall D. M. Isocitrate Lyase Activity Is Required for Virulence of the1.tracellular Pathogen Rhodococcits equi / D. M. Wall, P. S. Duffy, C. DuPont // Infect Immun. — 2005. — Vol. 73. — P. 6736-6741.

191. Watanabe S. Purification and Characterization of a Cold-adapted Isocitrate Lyase and a Malate Synthase from Colwellia maris, a Psychrophilic Bacterium / S. Watanab // Biosci Biotechnol Biochem. — 2001. — Vol. 65. — P. 1095-1103.

192. Wolfson P. J. Inhibition of Isocitrate Lyase: the Basis for Inhibition of Growth of Two Arthrobacter Species by Pyruvate / P. J. Wolfson, T. A. Krulwich // Journal of bacteriology. — 1972. — P. 356-364.

193. Zhang J. Z. Isocitrate Lyase and Malate Synthase Genes from Brassica napus L. Are Active in Pollen / J. Z. Zhang, D. L. Laudencia-Chingcuanco, L. Comai et. al. // Plant Physiol. — 1994. — Vol. 104,1. 3. — P. 857-864.

194. Zhang J. Z. DNA sequences that activate isocitrate lyase gene expression during late embryogenesis and during postgerminative growth / J. Z. Zhang, C. M. Santes, M. L. Engel et. al. // Plant Physiol. — 1996. — Vol. 110,1. 4. — P. 1069-1079.

Информация о работе