Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболитная и экспрессионная регуляция аконитатгидратазной и изоцитратлиазной активности в растениях с разным типом метаболизма

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Метаболитная и экспрессионная регуляция аконитатгидратазной и изоцитратлиазной активности в растениях с разным типом метаболизма"

На правах рукописи

Никитина Марина Викторовна

Метаболитная и экспрессионная регуляция аконитатгидратазной и изоцитратлиазной активности в растениях с разным типом метаболизма

Специальность 03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 ¿¿К 2014

Воронеж —2014

005556686

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты: Ершова Антонина Николаевна,

доктор биологических наук, профессор, Воронежский государственный педагогический университет, кафедра биологии растений и животных, заведующая

Гойкалова Ольга Юрьевна,

кандидат биологических наук, доцент Воронежский государственный университет инженерных технологий, кафедра биохимии и биотехнологии, доцент

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки «Институт физиологии растений» им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

Защита состоится 19 декабря 2014 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.02 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, аудитория 335.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и сайте Воронежского государственного университета: http:// www.science.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан « » 2014 г.

Ученый секретарь

sffy^-iiJ-Jk.

диссертационного совета - ° Брехова Любовь Ивановна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Важнейшим направлением современной физиологии и биохимии растений является исследование ферментативных механизмов регуляции метаболических процессов, обеспечивающих жизнедеятельность растительного организма. Несмотря на значительное количество исследований по аконитатгидратазе (АГ) (КФ 4.1.2.3.) и изоцитратлиазе (ИЦЛ) (КФ 4.1.З.1.), остаются невыясненными многие вопросы, связанные с их ролью в осуществлении функционирования цикла трикарбоновых кислот, глиоксилатного пути, а также метаболизма органических кислот и превращения двухуглеродных соединений в фотодыхании. Интенсивность и координация работы этих важнейших метаболических потоков осуществляется на разных уровнях организации ферментных систем и дифференциальной экспрессии их генов. Субклеточная локализация, изоферментный состав, метаболитная регуляция аконитатгидратазы и изоцитратлиазы в растениях с разным типом основного метаболизма практически не изучены. Для решения этих проблем необходимо проведение исследований, связанных с разработкой препаративных способов получения энзимов в электрофоретически гомогенном состоянии и выяснением их генетической детерминированности. Для установления генетической детерминации аконитазы и изоцитратлиазы необходима разработка специфических праймеров, которые позволят с применением полимеразной цепной реакции в реальном времени выяснить дифференциацию экспрессии генов этих энзимов на разных стадиях онтогенеза. В данном исследовании использовались растения кукурузы и амаранта, являющиеся типичными представителями, осуществляющими фотосинтез по С4-типу. Сравнительный анализ функционирования АГ и ИЦЛ из С4-растений с аналогичными данными из Сз-растений (соя) позволит уточнить функциональную значимость этих энзимов. Кроме того, для некоторых объектов исследований характерна способность к накоплению в больших количествах аконитовой кислоты в транс-форме (кукуруза). Неясным остается механизм метаболитной регуляции ферментативной активности ЦТК и ГЦ у объектов, называемых «аконитовыми аккумуляторами».

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование метаболитной и экспрессионной регуляции изоферментов аконитатгидратазы и изоцитратлиазы, выделенных и очищенных до электрофоретически гомогенного состояния из кукурузы, сои и амаранта.

Для выполнения целей были поставлены следующие задачи.

1. Исследовать органную специфичность изоферментного состава аконитазы и изоцитратлиазы при прорастании растений.

2. Изучить субклеточную локализацию изоферментов АГ и ИЦЛ в кукурузе, сое и амаранте.

3. Получить в электрофоретически гомогенном состоянии изоферменты аконитатгидратазы и изоцитратлиазы из растений с помощью многостадийной схемы очистки.

4. Провести изучение типа и механизма ингибирования аконитатгидратазы из растений с помощью транс-аконитовой кислоты и других органических кислот.

5. Выяснить степень ингибирования изоцитратлиазной активности в кукурузе, сое и амаранте конечными продуктами глюконеогенеза.

6. Исследовать влияние активных форм кислорода (перекиси водорода) на функционирование изоферментов аконитатгидратазы и изоцитратлиазы, выделенных из растений.

7. Подобрать специфические праймеры для идентификации генов аконитатгидратазы. Исследовать экспрессионную регуляцию генов аконитатгидратазы в проростках кукурузы и амаранта.

8. С помощью специфических праймеров для генов /с11 и /с/2 и ПЦР-РВ исследовать зависимость уровня экспрессии генов на стадии прорастания.

9. Разработать гипотетическую схему регуляции функционирования изоферментов АГ и ИЦЛ на экспрессионном и метаболитном уровнях.

Научная новизна. Полученные результаты имеют важное значение для понимания роли изоферментов АГ и ИЦЛ в механизмах трансформации метаболических потоков в растительной клетке. Субклеточная локализация изоферментов АГ и ИЦЛ свидетельствует об их участии в таких важнейших процессах, как ЦТК, глиоксилатный цикл, метаболизм органических кислот и обмен двухуглеродных соединений фотодыхания. Получены данные, свидетельствующие о важной роли транс-аконитата и конечных продуктов глюконеогенеза в регуляции функционирования митохондриальных и цитоплазматических изоформ аконитатгидратазы и изоцитратлиазы в растениях с различным типом основного метаболизма. Молекулярно-биологические аспекты исследований позволили разработать специфические праймеры для идентификации генов исследуемых энзимных систем и показать, что множественные молекулярные формы АГ и ИЦЛ являются изоферментами, то есть генетически детерминированными формами. Выявлено, что функционирование аконитазной и изоцитратлиазной активности регулируется экспрессией соответствующих генов, кодирующих эти ферменты.

Практическая значимость. Выделение в электрофоретически гомогенном состоянии препаратов изоферментов аконитатгидратазы и изоцитратлиазы из кукурузы, амаранта и сои позволяет использовать их в научно-исследовательских целях для изучения регуляторных особенностей ферментативных реакций, физико-химических характеристик ферментов. Кроме того, гомогенные препараты изоферментов могут служить в качестве маркеров для иммуноферментного анализа тканей организмов, находящихся в экстремальных условиях. Материалы диссертации используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете

ВГУ при чтении лекций по «Физиологии растений», «Биохимии», а также спецкурсов «Молекулярная биология», «Энзимология», «Метаболизм органических кислот» и др. Полученные данные используются при проведении практикумов и выполнении курсовых, бакалаврских и магистерских работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Аконитатгидратазная и изоцитратлиазная активности в проростках всех исследованных растений характеризуются наличием изоферментного состава, представленного, как правило, двумя множественными молекулярными формами с различной относительной электрофоретической подвижностью. Для изоферментов характерна специфичная субклеточная локализация.

2. Установлены особенности внутриклеточного распределения АГ и ИЦЛ. Аконитатгидратаза локализована в митохондриях и цитоплазме. Изоцитратлиаза связана с глиоксисомальной и цитозольной фракциями. Такое субклеточное распределение активности исследуемых ферментов обусловлено их физиологической ролью - обеспечением функционирования ЦТК, глиоксилатного цикла, метаболизма органических кислот и превращения двухуглеродных соединений фотодыхания.

3. Применение многостадийной схемы очистки, включающей гель-хроматографию и ионообменную хроматографию, позволяет получить электрофоретически гомогенные препараты изоферментов исследуемых энзимов из кукурузы, сои и амаранта.

4. Выявлены особенности метаболитной регуляции активности АГ и ИЦЛ. Установлено, что аконитатгидратаза ингибируется транс-аконитовой кислотой по конкурентному типу. Кроме того, митохондриальный изофермент аконитазы более чувствителен к транс-аконитату. Изоцитратлиазная активность сильно ингибируется конечными продуктами глюконеогенеза (глюкозо-1-фосфатом и глюкозо-6-фосфатом).

5. Молекулярно-биологические исследования показали, что изучаемые изоформы АГ и ИЦЛ являются изоферментами, то есть генетически детерминированными белками. Профиль экспрессии генов АГ и ИЦЛ, осуществленный с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени, указывает на его корреляцию с динамикой аконитазной и изоцитратлиазной активности в прорастающих семенах растений.

Апробанпя работы.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 14-ой международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука 21-го века» (Пущино, 2010), на 7-й съезде Общества физиологов растений России международной научной школе «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Н. Новгород, 2011), межрегиональных конференциях, посвященных памяти А. А. Землянухина

«Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013), ежегодных научных сессиях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского госуниверситета.

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 14 публикациях - 10 статьях и 4 тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (208 источников). Иллюстрационный материал включает 13 таблиц и 43 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования. Исследования проводили на растениях с различным типом метаболизма: соя (Glycine max L., сорт Игор), кукуруза (Zea mays сорта «Воронежская 76»), амарант (Amaranthus caudatus L. сорта «Рыжик»), выращенные гидропонным способом при температуре 25°С.

Определение активности исследуемых Ферментов. Активность изоцитратлиазы и аконитатгидратазы определяли с помощью спектрофотометрического метода на СФ-2000 при длине волны равной 324 и 240 им, соответственно [Епринцев А.Т. и др., 2007].

Выделение и очистка Ферментов. Очистку ферментов осуществляли по следующей схеме: 1. Гомогенизация материала. 2. Высаливание сульфатом аммония. 3. Гель-фильтрация на сефадексе G-25. 4. Хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой с использованием линейного градиента KCl (50 - 150 мМ) для изоцитратлиазы и KCl (60 - 120 мМ) для аконитатгидратазы.

Электпофоретические исследования белков. Электрофоретическое исследование проводили по методу Девиса [Davis B.J., 1994]. Универсальное окрашивание на белок осуществляли нитратом серебра [Nesterenko M.V. et al., 1994]. Специфическое проявление на активность ИЦЛ проводили с использованием модифицированного реагента Шиффа [Komberg H.L., 1957]. Для специфической идентификации АГ использовали тетразолиевый метод.

Субклеточная локализация. Исследование субклеточной локализации энзимов проводили с помощью дифференциального центрифугирования на центрифуге Eppendorf 5810R (Германия) и изоплотностного центрифугирования в градиенте сахарозы на центрифуге Backman (США).

Регуляция активности щоцитпатлиазы и аконитазы. Регуляторные свойства ИЦЛ и АГ исследовали на электрофоретически гомогенных препаратах. Определение констант ингибирования проводили с помощью графика зависимости 1/V от [S][Диксон М., 1982].

Выделение суммарной клеточной популяции РНК и получение кДНК. Суммарную клеточную РНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции

[Chomczynski Р., 1987]. Обратную транскрипцию проводили с использованием ревертазы M-MuLV (Fermentas, Литва).

Проведение ПЦР в реальном времени. Для выяснения изменения уровня экспрессии генов аконитазы и изоцитратлиазы кукурузы и амаранта применяли метод полимеразной цепной реакции в реальном времени на приборе Chromo4 (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green I [Епринцев А.Т. и др, 2001]. Использовали следующие нуклеотидные последовательности к гену acol: прямой - 5'-GCTGAGCGGTACCAGCAGGC-3'; обратный - 5'-GCGGGTCTCCTGAG AGGCC А-3'; к гену асо2\ прямой - 5'-CCGCCTTCCTGTTC AGTTTG-3'; обратный - 5'-

TGTAGAGGGAGTGCTGTCATCAA-3'. Температура отжига для обеих пар праймеров составляла 60 °С.

Праймеры для ПЦР-РВ анализа экспрессии генов изоцитратлиазы были следующими: для icll: прямой 5'-GCCACTTGAATAGTT-3', обратный - 5'-ACATAAGGCAACTTC-3', температура отжига 54°С; для г'с/2: прямой 5'-GGATAGGACTTACTA-3', обратный - 5'- AGCTTGTCCTTAGAA-3', температура отжига 56 °С. Количество матрицы контролировали с помощью параллельной амплификации фактора элонгации ef-la с ген-специфичными праймерами [NicotN. et al., 2005]. Определение относительного уровня экспрессии исследуемых генов проводили с применением 2"лдс'-метода [Livak K.J., et al., 2001].

Статистическая обработка данных. Опыты проводили в 5-8 биологических повторностях, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. Полученные данные обрабатывали с применением стандартных статистических методов с помощью критерия Стьюдента [Лакин Г.Ф., 1990].

РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Нзоферментный состав акоиитатгидратазы из растений с различным типом метаболизма В нашем исследовании получены данные по изоферментному составу аконитазы в разных органах кукурузы, сои и амаранта. Анализ полученных результатов показывает, что в кукурузе в зависимости от исследуемого органа обнаруживается от 1 до 2 множественных форм фермента. Аконитатгидратаза в семенах и корнях кукурузы имеет одну изоформу с относительной элекгрофоретической подвижностью - 0,58. В пробах из листьев и щитков кукурузы выявлены две формы исследуемого фермента, характеризующиеся

разными значениями Rf (рис. 1).

Данные распределения изоформ АГ в разных органах сои, приведенные на рисунке 1, свидетельствуют, что в семенах этого растительного организма функционирует одна-единственная форма аконитазы с относительной электрофоретической подвижностью 0,54.

А

Б

В

.-N _N *-14

Рз

;............. <_Р

штшшттшт&ш *--' Р ^ш^мг^жш? «-- р лришмииОГ^-г^

1 - 1 ^ 12 3 12 3

Рис. 1. Изоферментный состав АГ в различных органах кукурузы (А), сои (Б) и амаранта (В). N - граница разделяющего и концентрирующего гелей, Р] , Р2 -белковые полосы, Р - фронт красителя, 1 - семена, 2 - корни, 3 - щитки, 4 - листья

Анализ данных по элекгрофоретическому исследованию изоферментного состава аконитазы в амаранте свидетельствует о том, что в листьях этого растения появляется вторая изоформа фермента. Так, быстродвижущаяся форма аконитатгидратазы характеризовалась значением Яг 0,50, а относительная электрофоретическая подвижность медленнодвижущейся изоформы равнялась 0,45 (рис. 1). Одна форма обеспечивает работу цикла трикарбоновых кислот, а вторая участвует в метаболизации органических кислот, в том числе в функционировании важнейшего анаболического процесса - глиоксилатного пути.

Изоферментный состав изоцитратлиазы в органах растений Анализ изоферментного состава ИЦЛ в кукурузе показал наличие двух изофор.м в семенах, щитках, корнях и листьях (рис. 2). Так, быстродвижущаяся изоформа ИЦЛ характеризовалась относительной электрофоретической подвижностью 0,30, а медленнодвижущаяся - 0,25. Аналогичная картина наблюдается при анализе сои и амаранта Быстродвижущаяся форма ИЦЛ сои характеризуется величиной относительной электрофоретической подвижности равной 0,44, а медленнодвижущаяся - 0,28. Для быстродвижущейся формы ИЦЛ из амаранта характерна величина относительной электрофоретической подвижности, равная 0,30, для медленнодвижущейся значение составляло 0,24 (рис. 2).

Следовательно, данные по изоферментному составу изоцитратлиазы в разных органах кукурузы, сои и амаранта показывают наличие у большинства объектов двух изоформ исследуемого энзима. Учитывая, что обязательной функцией ИЦЛ является участие энзимов в функционировании глиоксилатного цикла (маркерный фермент), можно предположить, что вторая изоформа

выполняет другие метаболические функции, связанные с ее лиазной или синтазной активностями.

А Б В

л^^да/ ,*¥»»«* -м — ЛЯГ

--N ----N. „- ы

__ р2

*—Г: ; :—~р.

-Р1 ._р

1 2 з I Г 1 2 3 12 3

Рис. 2. Изоферментный состав ИЦЛ в различных органах кукурузы (А), сои (Б) и амаранта (В). N - граница разделяющего и концентрирующего гелей, Рь Р2 -белковые полосы, Р - фронт красителя, 1 - семена, 2 - корни, 3 - щитки, 4 - листья.

Внутриклеточное распределение активности АГ н ИЦЛ

Наличие двух изоформ, обнаруженных в исследуемых растениях, как правило, указывает на их различную функциональную значимость и специфическую внутриклеточную локализацию. Как видно из полученных данных, приведенных в таблице 1, аконитатгидратазная активность обнаружена в цитоплазматической (47%), митохондриальной (41%) и глиоксисомальной фракциях (12%). Уровень перекрестного загрязнения отдельными фракциями не превышал 8%, что соответствует методическим условиям выделения фракций и разделения их в условиях изоплотностного центрифугирования.

Анализ распределения изоцитратлиазной активности имеет свои характерные особенности (табл. 1).

Таблица 1.

Субклеточная локализация аконитатгидратазной и изоцитратлиазной активностей в

кукурузе (1 - Е/мг белка, 2 - % от общей активности) (п = 5; р < 0,05)

Фракция Цитоплазма Митохондрии Глиоксисомы

органоидов 1 2 1 2 1 2

АГ 0,308 47 0,679 41 0,365 12

ИЦЛ 0,219 23 0,096 5 1,462 72

Катал аза 0.211 22 0,089 5 0.988 73

сдг 0,027 4 0,064 93 0,012 3

Основная доля активности изоцитратлиазы сосредоточена в глиоксисомальной фракции и составляет 72% от общей активности изоцитратлиазы в клетке. Значительное количество активности этого фермента обнаружено в

цитоплазме (12%), что может быть следствием элюции фермента из микротелец в процессе выделения и центрифугирования.

Результаты исследования субклеточной локализации аконитатгидратазной и изоцитратлиазной активностей приведены в таблице 2. Анализ полученных данных свидетельствует, что аконитатгидратаза встречается, главным образом, в митохондриальной (40%) и цитоплазматической фракциях. В глиоксисомах обнаружено примерно 10% активности этого энзима. По-видимому, данное количество АГ в глиоксисомалыюй фракции связано с перекрестным загрязнением.

Активность изоцитратлиазы в проростках амаранта обнаружена в глиоксисомальной, митохондриальной и цитоплазматической фракциях. Однако, анализ результатов субклеточного разделения ИЦЛ, приведенный в таблице 2, показывает, что доминирующее количество этого фермента обнаруживается в глиоксисомах, где изоцитратлиазная активность составляет 71%.

Таблица 2.

Субклеточная локализация аконитазы и изоцитратлиазы в проростках амаранта

(1 - Е/мг белка, 2 - % от общей активности) (п = 5;р < 0,05)

Фракция органоидов Цитоплазма Митохондрии Глиоксисомы

1 2 1 2 1 2

АГ 0,327 50 0,596 40 0,348 10

ИЦЛ 0,226 24 0,181 5 1,128 71

Каталаза 0,236 18 0,085 4 0,998 78

сдг 0,041 5 0,073 92 0,028 3

Данные, приведенные в таблице 3, показывают особенности внутриклеточного распределения аконитатгидратазной и изоцитратлиазной активностей в листьях сои. Аконитатгидратаза обнаружена в цитоплазме, митохондриях и глиоксисомах клеток. Наибольшая активность наблюдалась в митохондриальной фракции, где аконитатгидратазная активность составляла 63%. Внутриклеточное распределение изоцитратлиазной активности характеризуется доминированием этого показателя в глиоксисомальной фракции, где она составляла 71% от общей активности ИЦЛ в растительной клетке.

Таблица 3.

Внутриклеточное распределение аконитатгидратазы и изоцитратлиазы

в тканях сои (1 - Е/мг белка, 2 - % от общей активности) (п = 5; р < 0,05)

Фракция Цитоплазма Митохондрии Глиоксисомы

органоидов 1 2 1 2 1 2

АГ 0,329 34 0,401 63 0,896 3

ИЦЛ 0,197 26 0,073 3 1,652 71

Каталаза 0,202 19 0,057 4 1,130 77

СДГ 0,016 3 0,089 94 0,012 3

Значительное количество активности ИЦЛ обнаружено в цитоплазме (34%) и незначительное содержание зафиксировано в митохондриальной фракции (3%).

Аналитическое рассмотрение полученных результатов позволяет заключить, что субклеточная локализация АГ и ИЦЛ в кукурузе, сое, амаранте имела сходное распределение независимо от типа основного обмена исследуемых растений.

Очистка аконнтатгидратазы из растении

Использование многостадийной схемы очистки, включающей высаливание сульфатом аммония, гель-фильтрацию на сефадексе G-25, ионообменную хроматографию и гель-хроматографию на сефадексе G-150, позволяет получать препараты ферментов цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного пути с высокой удельной активностью, большой степенью очистки и значительным выходом ферментативной активности [Остерман Л.А., 1981].

Анализ полученных результатов очистки изоформ аконнтатгидратазы из растений с различным типом метаболизма (табл. 4) свидетельствует, что применение пятистадийной схемы очистки позволило получить препараты исследуемого фермента в высокоочищенном или гомогенном состояниях. Данные по величинам удельной активности, степени очистки и выхода ферментативной активности, приведенные в таблице 4, указывают, что для гомогенных препаратов аконитазы из кукурузы, сои и амаранта наблюдаются незначительные колебания значений этих показателей.

Таблица 4.

Результаты очистки аконитазы из тканей различных растений (п - 3; р < 0,05)

Название растений -объектов исследования Изоформа Удельная активность, Е/мг белка Степень очистки Выход, %

Кукуруза АГ, 3,95 79 j

АГ, 5,09 100 3

Соя АГ, 5,2 80 3

АГ, 5,4 83 3

Амарант АГ, 5,8 128 4

АГ, 6,0 133 4

АГ] и АГ2 - изоферменты.

Из всех изучаемых растений получено две формы аконнтатгидратазы, причем эффективное разделение изоферментов было обеспечено применением ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. Степень очистки аконнтатгидратазы из разных растений варьировала в значительной мере от 79 до 133 раз в зависимости от объекта выделения. Самым консервативным показателем был выход активности ферментов, составляющий от 3 до 4%.

Следует отметить, что данные характеристики АГ вполне сопоставимы с результатами очисток фермента из других объектов, в том числе животного происхождения [Епринцев А.Т. и др., 2007].

Анализ основных показателей очищенных препаратов изоцитратлиазы

из различных растений Для выполнения целей и задач исследования необходимо было получить гомогенные препараты изоформ изоцитратлиазы из кукурузы, сои и амаранта. В нашей работе использовали схемы очистки, разработанные на кафедре биохимии и физиологии клетки, для получения высокоочшценных препаратов изоформ изоцитратлиазы из растений [Епринцев А.Т. и др., 2005, Куен Ч.Т.Х. и др., 2008]. Применение четырехстадийной схемы позволило получить изоферменты изоцитратлиазы с высокими значениями удельной активности.

Так, быстродвижущаяся форма ИЦЛ из кукурузы имела величину удельной активности 2,85 Е/мг белка, а медленнодвижущаяся - 3,1 Е/мг белка. Максимальные значения этого показателя были характерны для сои и амаранта. Интересно отметить, что быстродвижущиеся формы ИЦЛ из сои и амаранта обладали более высокой удельной активностью. Так, величина удельной активности этой формы из сои составляла 4,25 Е/мг белка. Характерной особенностью используемой схемы очистки изоцитратлиазы было использование ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, причем применение этой стадии позволило получить препараты двух изоформ исследуемого фермента из кукурузы, сои и амаранта.

Основные показатели очистки изоферментов ИЦЛ

Таблица 5.

Название растений — объектов исследования Изофермент Удельная активность, Е/мг белка Степень очистки Выход, %

Кукуруза ИЦЛ, 2.85 62 8

ИЦЛ2 3.10 65 8,5

Соя ИЦЛ, 4,25 87 7

ИЦЛ2 3,60 71 6,5

Амарант ИЦЛ, 3,63 57 9

ИЦЛ; 4,05 67 8

пределах от 57 до 87 раз. На наш взгляд, это было обусловлено разным значением величины удельной активности в гомогенате исследуемых растений. Следует отметить, что для очистки изоцитратлиазы из растительных объектов характерен значительно более высокий уровень выхода ферментативной активности, который колебался от 6,5 у сои до 9% у амаранта (табл. 5).

Метаболитная регуляция аконитатгидратазы и изоцнтратлназы в растениях

Характерной особенностью метаболизма растительной клетки является способность накапливать в больших количествах органические кислоты. Так, транс-аконитовая кислота может достигать значительных концентраций в кукурузе, сахарном тростнике, копытне европейском и других растениях, которые называются «аконитовыми аккумуляторами» [Chen X.J., et al., 2005, Tong W.H., 2007]. Из литературных данных известно, что транс-аконитат является сильным конкурентным ингибитором аконитазы животного происхождения [Епринцев А.Т. и др., 2005]. В связи с этим значительный интерес представляют данные, полученные в работе по величинам констант ингибирования и типа ингибирования, приведенные в таблице 6. Сравнительный анализ результатов ингибирования транс-аконитовой кислотой изоформ АГ из сои и амаранта показывает четко выраженную тенденцию, которая заключается в большей устойчивости к этому интермедиату аконитатгидратазы, локализованной в цитоплазме. Так, для сои значение К; для цитоплазматического изофермента равняется 2,46 мМ, а для митохондриального - 1,89 мМ. Для амаранта характер корреляции значений констант ингибирования имеет аналогичный характер в сравнении с кукурузой и соей.

Таблица 6.

Величина констант ингибирования транс-аконитатом изоферментов АГ из

растений с различным типом метаболизма (п - 5; р < 0,05)

Название вида растения Значение К (цитрат), мМ Значение Kj (изонитрат), мМ

1 2 1 2

Кукуруза 2,56 3,845 1,77 2,58

Соя 1,89 2,46 1.34 1,89

Амарант 1,55 2,05 1,45 1,79

1 - АГ из митохондрий; 2 - АГ из цитоплазмы

При использовании в качестве субстрата изолимонной кислоты были получены данные, свидетельствующие о конкурентном типе ингибирования аконитатгидратазы, выделенной и очищенной до гомогенного состояния из кукурузы, сои и амаранта.

Регуляция активности аконитатгидратазы органическими кислотами Изучение регуляторного влияния органических кислот на функционирование аконитатгидратазы из исследуемых растений проводили с использованием таких важнейших интермедиатов, как малат, сукцинат, фумарат, глиоксилат. Результаты, приведенные в таблице 7, показывают, что все использованные соединения вызывали тормозящее действие на функционирование аконитазы по конкурентному типу.

Таблица 7.

Величины констант ингибирования изоферментов АГ из растений с _различным типом метаболизма (п = 5; р < 0,05)

Название вида растения Значение К;, мМ

Сукцинат Малат Фумарат Глиоксилат

Кукуруза 1 1,75 2.14 1,24 2,05

2 2,06 2,86 1,72 2,18

Соя 1 1,63 1,79 1,37 1,98

2 1,78 1,84 1,54 2,15

Амарант 1 1,35 1,96 1,7 1,27

2 1,69 1,87 1,62 1,36

1 - АГ из митохондрий; 2 - АГ из цитоплазмы

Анализ значений констант ингибирования, определенных по Диксону и Уэббу, показывает варьирование величины этого показателя от 1,24 до 2,86 мМ. Наибольшее тормозящее действие оказывал фумарат, который, ингибируя активность фермента по конкурентному типу, имел величину К, в пределах от 1.24 до 1,72 мМ. Определенная закономерность обнаружена для разных изоформ фермента.

Так, митохондриальная изоформа обладала меньшей устойчивостью практически ко всем исследованным органическим кислотам. Величина К, малатом для митохондриалыюй формы АГ составляла 2,14 мМ, а для цитоплазматической - 2,86 мМ. Особое место в механизмах ингибирования аконитазы занимает глиоксилат. Значения констант ингибирования для обеих форм фермента колеблются незначительно и составляют от 2,05 до 2,18 для кукурузы, для фермента из сои показатели варьировали от 2,15 до 1,98 мМ, а для амаранта - от 1,27 до 1,36 мМ. Характер тормозящего действия исследованных органических кислот указывает на конкурентный тип ингибирования аконитатгидратазы из кукурузы, сои и амаранта. Анализ результатов проведенного исследования может свидетельствовать о возможной регуляторной роли этих интермедиатов в функционировании АГ в цикле трикарбоновых кислот и глиоксилатном пути.

Действие интермедиатов глюконеогенеза на активность нзоцитратлиазы

В нашей работе были проведены исследования ингибиторного действия глюкозо-1-фосфат и глюкозо-6-фосфат на изоформы изоцитратлиазы, обнаруженные в кукурузе, сое и амаранте. Как видно из полученных данных, приведенных в таблице 8, глюкозо-1-фосфат и глюкозо-6-фосфат вызывают тормозящее действие на функционирование изоформ исследуемого фермента. Характерной тенденцией является большая устойчивость изоцитратлиазы из глиоксисом к исследуемым интермедиатам. Кроме того, анализ значений констант ингибирования для глюкозо-1-фосфата и глюкозо-6-фосфата свидетельствует, что

конечные продукты глюконеогенеза обладают сильным тормозящим действием на активность ИЦЛ.

Таблица 8.

Величина констант ингибирования изоферментов ИЦЛ из растений с различным типом метаболизма (п = 5; р < 0,05)

Название вида растения Значение К, (глюкозо-1-фосфат), мМ Значение Kj (глюкозо-6-фосфат), мМ

Кукуруза 1 0,973 2,106

2 0,745 1,723

Соя 1 1,105 1,972

2 0,986 1,654

Амарант 1 0,896 1,841

2 0,751 1,645

1 - ИЦЛ из цитоплазмы; 2 - ИЦЛ из глиоксисом

Воздействие перекиси водорода на активность аконитатгидратазы и изоцитратлиазы

Активные формы кислорода играют важную роль в регуляции активности ферментов окислительного метаболизма. Наибольший вклад в изучение этих биохимических механизмов внесен исследователями по влиянию перекиси водорода на функционирование различных ферментных систем. В нашей работе учитывались факторы, обеспечивающие взаимодействие перекиси водорода с железо-серным кластером, входящим в состав аконитатгидратазы [W. Н. Tong and Т. A. Rouault, 2007]. Кроме того, сравнивалось тормозящее действие перекиси водорода на активность аконитатгидратазы, выделенной из митохондриальной и цитоплазматической фракции растительных клеток.

Обнаружена различная устойчивость к перекиси водорода цитоплазматической и митохондриальной форм аконитазы, выделенной из кукурузы. Митохондриальная форма АГ подвергалась более сильному тормозящему эффекту по сравнению с цитоплазматической формой. Так, инкубация исследуемого фермента с 20 мкМ Н202 вызывала торможение активности митохондриальной формы на 50% от первоначальной активности, а для цитоплазматического изофермента выявлено ингибирование на 25%. Следует отметить, что анатиз полученных данных позволяет сделать заключение о том, что высокие концентрации этого вещества (100-300 мкМ) оказывают очень сильный тормозящий эффект.

Установлены особенности инактивирующего действия различных концентраций 1120: на цитоплазматическую и митохондриальную формы аконитазы, выделенную из амаранта. Все основные тенденции тормозящего действия перекиси водорода на аконитатгидратазную активность в амаранте

сохраняются и аналогичны выявленным и описанным ранее изменениям функционирования аконитазы из кукурузы и сои.

Для проведения сравнительного изучения влияния перекиси водорода на активность изоцитратлиазы использовали концентрации этой формы активного кислорода в тех же значениях, что и при исследовании АГ. Концентрация перекиси водорода в модельных опытах колебалась от 20 до 300 мкМ. При проведении данных экспериментов использовали гомогенные или высокоочищенные препараты изоферментов изоцитратлиазы из разных растений. Анализ полученных данных показал, что инкубация глиоксисомального и цитоплазматического изоферментов ИЦЛ с перекисью водорода в обозначенных концентрациях не приводила к изменению функционирования энзима. Сравнение действия этого вещества на глиоксисомальную и цитоплазматическую формы фермента также показало практически полную устойчивость изоцитратлиазы. При длительной экспозиции (5-6 мин) можно было отметить небольшую активацию, составляющую 2-3% от контроля, для цитоплазматической формы изоцитратлиазы. Более краткосрочное действие НгСЬ в концентрациях от 20 до 300 мкМ не вызывало изменения в функционировании изоцитратлиазы, что свидетельствует о достаточно эффективной защите молекулы биокатализатора от активных форм кислорода.

Экспресснонная регуляция аконитазной активности при прорастании растений

Анатиз результатов исследования уровня транскрипции гена асо! методом количественного ПЦР в реальном времени показывает, что количество мРНК исследуемого гена значительно варьирует в щитках семян кукурузы при их прорастании (рис. 3).

Данные по экспрессионной активности гена асо! в щитках кукурузы свидетельствуют о неоднородности уровня экспрессии митохондриальной формы аконитазы в щитках при прорастании семян. Резкое уменьшение транскрипции гена асо1 к 9-му дню прорастания, вероятно, обусловлено снижением скорости мобилизации запасных веществ семени в связи с переходом к автотрофному типу питания.

Кроме того, была выявлена зависимость изменения уровня экспрессии гена асо2 при прорастании семян кукурузы. Расчетные значения относительной концентрации транскрипта гена асо2 в разных образцах кДНК представлены на рисунке 3, из которого видно, что в щитках с первого по третий день наблюдается определенный уровень экспрессии исследуемого гена, достигающий максимума на третий день прорастания. Начиная с четвертого дня, экспрессия гена асо2 уменьшается, и уже с 5-го дня экспрессия гена цитоплазматической формы аконитатгидратазы полностью прекращается.

, 7 -

ir

Ó o -j .

O

3

5

9

Рис. 3. Экспрессия генов аконитазы в щитках кукурузы при прорастании семян: белые столбики (цитоплазматическая), серые (митохондриальная).

дни

Полученные результаты по динамике экспрессии генов аконитазы позволяют оценить изменение скорости функционирования ЦТК в щитках семян кукурузы и выдвинуть предположение о его роли при гетеротрофном типе питания и при переходе к фотосинтезу. В отсутствие фотосинтеза проросток получает необходимую энергию за счет работы цикла Кребса и ЭТЦ. Происходит резкая активизация всех метаболических процессов и мобилизация запасных веществ, окисляющихся через ЦТК, что подтверждается высокой скоростью экспрессии гена acol. После 5-го дня прорастания происходит переход растений к автотрофному типу питания, и функция обеспечения растения энергией переходит к фотосинтезу. При этом ЦТК ингибируется, и происходит резкое уменьшение концентрации мРНК гена митохондриальной формы аконитазы по сравнению с первыми днями. В данном случае проросток, перешедший к автотрофному типу питания, не нуждается в запасных питательных веществах, что приводит к резкому снижению скорости экспрессии генов acol и асо2 к пятому дню прорастания семян, когда начинает функционировать фотосинтетический аппарат.

Схожие данные получены при исследовании экспрессии генов acol и асо2 при прорастании семян амаранта. Показана зависимость изменения уровня экспрессии генов acol и асо2 при прорастании семян амаранта. Расчетные значения относительной концентрации транскрипта гена acol в разных образцах кДНК представлены на рисунке 4, из которого видно, что в исследуемых растениях ген митохондриачьной формы аконитазы активно транскрибируется на протяжении всего периода прорастания, однако максимума уровень данного показателя достигает на третий день прорастания. В последующие дни эксперимента обнаружено снижение интенсивности накопления мРНК гена acol в семенах амаранта.

Начиная с пятого дня, уровень экспрессии гена acol уменьшается, и к девятому дню прорастания достигает значения 50% от максимального значения (третий день). Резкое снижение интенсивности экспрессии исследуемого гена коррелирует с таковым показателем для гена митохондриальной формы АГ в щитках кукурузы и обусловлено переключением основного энергетического метаболизма клетки на автотрофный тип питания.

£ 5 з

с 1 2,5

? 8 2

^ О)

8 |1,5

г I 1

° п 0,5

Рис. 4. Экспрессия генов аконитазы при прорастании семян амаранта: белые столбики (цитоплазматическая), серые

(митохондриальная).

Экспрессия генов изоцитратлиазы в проростках семян амаранта

Результаты исследования полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами к генам изоцитратлиазы показывают, что в геноме амаранта, на стадии прорастания семян экспрессируются одновременно два гена изоцитратлиазы (рис. 5). _

Рис. 5. Результаты полимеразной цепной реакции на матрице кДНК, выделенной из проростков амаранта сорта «Рыжик» на 3 день прорастания. М-маркеры; 1 - продукты амплификации с вырожденными праймерами.

1 м

Проведенный ПЦР в реальном времени со специфическими праймерами к генам /с/7 и /с/2 (рис. 6) позволил установить, что максимальная экспрессия обоих генов наблюдается на 1-2 дни прорастания семян амаранта. Высокая скорость транскрипции генов /с/У и /с/2 обусловлена необходимостью синтеза большого количества белков глиоксисомальной и внеглиоксисомальной форм исследуемого фермента. Глиоксисомальная форма ИЦЛ принимает активное участие в протекании глюконеогенеза, в частности, глиоксилатного цикла. Данный путь необходим для мобилизации запасных веществ семени, например липидов. поскольку в первые дни прорастания растения осуществляют гетеротрофный тип питания [Епринцев А.Т. и др. 2007]. Функция дополнительной, внеглиоксисомальной формы изоцитратлиазы, вероятно, заключается в осуществлении реакции синтеза органических кислот (изоцитрат), накопление которых приводит к закислению внутренней среды клетки. Более кислое значение рН способствует увеличению скорости гидролиза жирных кислот, необходимых для протекания глюконеогенетических процессов.

1,2

Рис. 6. Относительный уровень экспрессии генов изоцитратлиазы в проростках амаранта: белые столбики

(глиоксисомальная), серые

(цито плазматическая).

с

О

0)

о

° 0,2 ■

п.-гп л м Д П

о

о

2 3

4 5 6 7 8 9 10 дни прорастания

В дальнейшем экспрессионная активность гена /с!1 постепенно снижается. После 4-х дней экспозиции наблюдается практически полное ингибирование скорости синтеза мРНК исследуемого гена. Уменьшение концентрации транскрипта гена \с11 совпадает с этапом перехода растений к фотосинтетической активности, и, как следствие, роль запасных компонентов нивелируется. В то же время, экспрессия гена /с/2 после 4-го дня прорастания тоже уменьшается, что также связано со снижением интенсивности использования запасных веществ, используемых при развитии растительного организма в первые периоды прорастания. Но в последующем периоде развития наблюдается увеличение скорости его экспрессии. Интенсификация экспрессии гена /с/2 к 6 дню может быть связана с переходом растения к автотрофному типу питания и функционированием второй формы изоцитратлиазы в листьях, где она, по-видимому, выполняет функцию утилизации фотодыхательного глиоксилата.

В результате исследования установлено, что в суммарной вытяжке РНК обнаруживаются две мРНК генов изоцитратлиазы. Полученные данные по динамике экспрессии генов изоцитратлиазы позволяют оценить изменение скорости функционирования глиоксилатного цикла и выдвинуть предположение о его роли в метаболизме при прорастании семян и переходе к фотосинтезу.

На начальных этапах развития проростка он еще не способен к фотосинтезу и получает необходимую энергию и биосинтетические эквиваленты в процессе дыхания и пластического обмена. В этот период наблюдается активация глкжонеогенетических процессов, физиологическая роль которых заключается в мобилизации запасных веществ, таких как липиды. Максимальная скорость накопления транскриптов генов изоцитратлиазы наблюдается в первые три дня прорастания, что связано с необходимостью индукции глиоксилатного цикла в этот период. Высокий уровень транскрипции гена \с11 в первые три дня экспозиции связан с необходимостью синтеза большого количества изоцитратлиазы при прорастании семян для интенсивной работы глиоксилатного цикла. В то же время.

высокая экспрессия гена icI2 в этот же период прорастания, вероятно, связана с индукцией изофермента ИЦЛ. участвующего в анаплеротических реакциях. На 3-4 день развития снижается потребность в метаболизации запасных жиров, выключается глюконеогенез, что приводит к ингибированию экспрессии данного гена. Увеличение экспрессии гена icl2 на 5-7 день экспозиции можно объяснить тем, что к указанному сроку в проростках формируется фотосинтетический аппарат и ИЦЛ2 принимает участие в утилизации фотодыхательного глиоксилата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование разработанных на кафедре биохимии и физиологии клетки многостадийных схем очистки ферментов позволило получить из кукурузы, амаранта и сои электрофоретически гомогенные препараты изоферментов аконитатгидратазы и изоцитратлиазы. Электрофоретические исследования подтвердили, что полученные препараты являются гомогенными. Характеристики очищенных ИЦЛ и АГ имеют значения, аналогичные препаратам ферментов, полученных из других источников [Епринцев А.Т. и др., 2007, 2005, Куен Ч.Т.Х. и др, 2008].

С помощью электрофоретического исследования было выявлено, что аконитатгидратаза и изоцитратлиаза в проростках кукурузы, сои и амаранта характеризуются наличием изоферментного состава. Ранее в наших исследованиях и литературных публикациях сообщалось о изоферментном полиморфизме данных энзимов [Епринцев А.Т. и др. 2007].

Результаты изучения внутриклеточного распределения аконитатгидратазной и изоцитратлиазной активности показали специфические особенности субклеточной локализации исследуемых ферментов. Функционирование цикла Кребса и глиоксилатного пути обеспечивается изоферментами АГ, и ИЦЛЬ локализованными, соответственно, в митохондриальной и глиоксисомальной фракциях растительных клеток. Вторая форма аконитатгидратазы, обнаруженная в цитоплазматической фракции, по-видимому, участвует в функционировании метаболизма органических кислот и в каталитическом превращении трикарбоновых кислот (цитрат —► изоцитрат), обеспечивающих работу глиоксилатного пути. Регуляцию метаболизма двухуглеродных соединений фотодыхательного метаболизма осуществляет изоформа ИЦЛ2, сосредоточенная в цитоплазме. Обнаруженная в работе аконитатгидратазная активность в глиоксисомах и изоцитратлиазная в митохондриях, является, по нашему мнению, следствием перекрестного загрязнения при выделении фракций клеток.

Анализ данных электрофоретических исследований распределения изоформ изоцитратлиазы и аконитазы в субклеточных фракциях кукурузы показывал, что множественные формы проявляют специфичность субклеточной локализации. В глиоксисомах обнаружены быстро движущиеся формы исследуемых ферментов с Rf 0.29 и 0.58. соответственно. В цитозольной фракции при специфическом проявлении обнаружили два изофермента ИЦЛ с Rf 0,29 и Rf 0,24 и одна АГ с Rf

0,53. Следует отметить, что медленнодвижущиеся изоформы были специфичны для этого компартмента и, по-видимому, для них характерна своя уникальная метаболическая функция.

Результаты исследования метаболитной регуляции аконитатгидратазы и изоцитратлиазы в разных растениях позволили установить определенные закономерности. Показано, что наибольшая устойчивость к транс-аконитовой кислоте характерна для АГ из кукурузы, которая способна в процессе жизнедеятельности накапливать значительные количества этого интермедиата [Землянухин A.A., 1995].

Изоцитратлиазная активность сильно ингибируется конечными продуктами глюконеогенеза (глюкозо-1 -фосфатом и глюкозо-6-фосфатом). Определенные константы и тип ингибирования показывают, что глиоксисомальная форма ИЦЛ более устойчива (К, = 0,745 мМ) по сравнению с цитоплазматической (К, = 0,973 мМ).

Важной частью исследования являлось выяснение экспрессионной активности генов, кодирующих изучаемые энзимы. Установлено, что уровень экспрессии генов acol и асо2 максимален в первые дни прорастания семян, причём для гена acol наблюдалась экспрессия на протяжении всего периода прорастания семян кукурузы и амаранта. Полученные результаты свидетельствуют о дифференциальной экспрессии генов аконитатгидратазы при развитии растения, что обусловлено разной функциональной ролью ее изоферментов.

kli ic!2 Ядро асо2 acol

Рис. 7. Гипотетическая схема метаболитной и экспрессионной регуляции функционирования изоферментов аконитатгидратазы и изоцитратлиазы в растительной клетке (_«. сильное ингибирование; —> слабое ингибирование).

цитоплазма

тр он с-(№ОН а inoaa я ни слота Н.,02

Анализ экспрессии генов, кодирующих изоцитратлиазу, показал, что гены /с/7 и /с/2 транскрибируются на протяжении всего периода прорастания семян, и, вероятно, также принимают участие в формировании разных функциональных форм ИЦЛ. Транскрипция гена /с/7 четко совпадает с активацией процессов метаболизации запасных жиров и, предположительно, данный ген кодирует соответствующий изофермент. Экспрессия гена /с/2, вероятно, обуславливает синтез дополнительной формы ИЦЛ для осуществления анаплеротических реакций.

Таким образом, полученные данные по метаболитной и экспрессионной регуляции изоферментов АГ и ИЦЛ из исследуемых растений позволили разработать гипотетическую схему функционирования этих ферментных систем в растительной клетке (рис. 7).

ВЫВОДЫ

1. Аконитатгидратаза и изоцитратлиаза в проростках кукурузы, сои и амаранта характеризуются наличием изоферментного состава, представленного одной или двумя множественными молекулярными формами с различной относительной электрофоретической подвижностью и спецификой внутриклеточного распределения.

2. Внутриклеточное распределение аконитатгидратазной и изоцитратлиазной активности имеет специфические особенности. Аконитатгидратаза локализована в цитоплазматической и митохондриальной фракциях. Изоцитратлиазная активность обнаружена в глиоксисомальной и цитозольной фракциях. Такое субклеточное распределение активности исследуемых ферментов связано с их физиологической ролью обеспечения функционирования ЦТК (АГ), глиоксилатного цикла (ИЦЛ), метаболизма органических кислот и метаболизма двухуглеродных соединений фото дыхания.

3. С помощью многостадийной схемы очистки получены в электрофоретически гомогенном состоянии препараты АГ и ИЦЛ из исследованных растений. Электрофоретические исследования подтвердили, что полученные препараты являются гомогенными. Удельная активность АГ из кукурузы, сои и амаранта имела значение от 3,95 до 6,0 Е/мг белка. Значение выхода фермента из растений колебалось от 3 до 4%. Параметры очистки изоферментов ИЦЛ составляли - уд. активность от 2,85 до 4,25 Е/мг белка; выход - от 6,5 до 9%.

4. Выявлен конкурентный механизм ингибирования аконитатгидратазы из растений с помощью транс-аконитовой кислоты. Показано, что наибольшая устойчивость к этому интермедиату характерна для АГ из кукурузы, которая способна в процессе жизнедеятельности накапливать значительные количества этого интермедиата. Кроме того, установлено, что митохондриальный изофермент аконитазы более чувствителен к транс-аконитату (К, = 2,6 мМ) по сравнению с цитоплазматической формой фермента (К; = 3,5 мМ).

5. Изоцитратлиазная активность сильно ингибируется конечными продуктами глкжонеогенеза (глюкозо-1 -фосфатом и глюкозо-6-фосфатом). Определенные константы и тип ингибирования показывают, что глиоксисомальная изоформа ИЦЛ более устойчива (К, = 0,745 мМ) по сравнению с цитоплазматическим изоферментом (K¡ = 0,973 мМ).

6. Исследовано ингибирующее действие различных концентраций перекиси водорода на изоферменты АГ, имеющие различную субклеточную локализацию. Установлено, что митохондриальный изофермент аконитазы более чувствителен к перекиси водорода по сравнению с цитоплазматической изоформой АГ.

7. Использование специфических праймеров для митохондриальной и цитоплазматической форм аконитатгидратазы позволило идентифицировать их транскрипты в суммарной вытяжке РНК. Активная экспрессия генов обеих форм аконитазы в щитках кукурузы и семенах амаранта обусловлена необходимостью синтеза пептидов для протекания энергетических и биосинтетических процессов в клетках растущего растительного организма.

8. Установлено, что уровень экспрессии генов acol и асо2 максимален в первые дни прорастания семян, причём ген acol сохранял высокую активность на протяжении всего прорастания семян кукурузы и амаранта. Полученные результаты свидетельствуют о дифференциальной экспрессии генов аконитатгидратазы при развитии растения, что обусловлено разной функциональной ролью ее изоферментов.

9. Анализ экспрессии генов, кодирующих изоцитратлиазу, показал, что гены icll и icl2 транскрибируются во все периоды прорастания семян, и, вероятно, также принимают участие в формировании разных функциональных форм ИЦЛ. Транскрипция гена icll четко совпадает с активацией процессов метаболизации запасных жиров и, предположительно, кодирует соответствующий изофермент. Экспрессия гена ic!2, вероятно, обуславливает синтез дополнительной формы для осуществления анаплеротических реакций.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изофер.ментный состав изоцитратлиазы в разных органах СЗ- и С4- растений / Е.В. Маслова [и др.] // Организация н регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. работ. —Воронеж, 2008. — Вып. 10. - С. 160-164.

2. Регуляция активности изоформ изоцитратлиазы в онтогенезе высших растений / Е.В. Маслова [и др.] // Биология - наука 21 века : 12-я междунар. Путинская шк.-конф. молодых ученых, 10-14 нояб. 2008 г. : сб. тез. — 2008. — С. 94.

3. Регуляторные аспекты функционирования изоформ изоцитратлиазы в различных органах Zea mms L. / А.Т. Епринцев [и др.] // Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений : тез. докл. Междунар. науч. конф., Екатеринбург, 6-10 окт. 2008 г. — Екатеринбург, 2008. — С. 166-167.

4. Некоторые регуляторные свойства изоцитратлиазы из семядолей сои / М.В. Зайчикова (Никитина) [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. работ. — Воронеж, 2009. — Вып. 11. - С. 90-95.

5. Очистка цитоплазматической аконитатгидратазы и исследование ее регуляторных свойств / М.В. Зайчикова (Никитина) [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. работ. — Воронеж, 2010. — Вып. 12. - С. 97-102.

6. Регуляция экспрессии изоцитратлиазы в семядолях сои на этапах прорастания семян / Т.В. Лыкова [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. работ. —Воронеж, 2010. — Вып. 12. - С. 137-141.

7. Применение ионообменной хроматографии для получения высокоочищенных препаратов аконитатгидратазы / М.А. Альнассер, [и др.] // Сорбционные и хроматографические процессы. — Воронеж, 2010. — Т. 10, вып. 6. - С. 943-949. — ISSN 1680-0613.

8. Чан Тхи Хоанг Куен. Физико-химические и регуляторные свойства изоформ изоцитратлиазы из растений / Чан Тхи Хоанг Куен, М.В. Зайчикова (Никитина), A.B. Сальников // Биология - наука XXI века : сб. тез. 14-й Междунар. Пущинской шк,-конф. молодых ученых. —Пущино, 2010. —Т. 1. - С. 67.

9. Физико- химические и регуляторные свойства аконитазы в организмах разного уровня организации / Зайчикова М.В. (Никитина) [и др.] // Биология - наука XXI века : сб. тез. 14-й Междунар. Пущинской шк.-конф. молодых ученых. — Пущино, 2010. — Т. 1. - С. 25-26.

10. Регуляторные и кинетические характеристики цитоплазматической аконитатгидратазы из растительных и животных тканей / М.В. Зайчикова (Никитина), [и др.] // Вестник Воронежского государственного университета. Сер. Химия. Биология. Фармация. — Воронеж, 2010. — № 2. - С. 81-84. — ISSN 02345439.— ISSN 1609-0675.

11. Выделение аконитатгидратазы из щитков кукурузы и исследование ее внутриклеточной локализации / М.В. Зайчикова (Никитина) [и др.] // Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий : 7-й Съезд О-ва физиологов растений России, 4-10 июля 2011 г. Н. Новгород : Инновации в биологии для развития биоиндустрии сельскохозяйственной продукции Междунар. науч. шк. : материалы докл. Ч. 1. — Н. Новгород, 2011. — С. 262-263.

12. Епринцев А.Т. Изоферменты изоцитратлиазы и их роль у организмов разного уровня организации /А.Т. Епринцев, A.B. Сальников, Зайчикова М.В. (Никитина) // Успехи современной биологии - Москва, 2013. - Т. 133, № 6. - С. 531-544.

13. Никитина М.В. Регуляция транс-аконитатом аконитатгидратазной активности в растениях с разным типом основного метаболизма / Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. работ. — Воронеж, 2014.— Вып. 16.-С. 103-108.

14. Разработка специфических праймеров для идентификации генов изоцитратлиазы из амаранта / Сальников A.B., [и др.] // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. работ. — Воронеж, 2014. — Вып. 16.-С. 136-142.

Работы №7, 10, 12 опубликованы в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК.

Подписано в печать 20.10.2014 г. Формат 60х80'Лб Бумага кн.-журн.

П.л. 1,0. Гарнитура Тайме. Тираж 80 экз. Заказ № 10811. Типография ФГБОУ ВПО ВГАУ 394087, Воронеж, ул. Мичурина, 1.