Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие транскрипционного фактора STATI с сигнальными белками в нормальных и трансформированных клетках

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие транскрипционного фактора STATI с сигнальными белками в нормальных и трансформированных клетках"

На правах рукописи УДК 576. 36: 576. 835.5

ЕВДОНИН ¿¿Ц^лМ* Антон Леонидович

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА 8ТАТ1 С СИГНАЛЬНЫМИ БЕЛКАМИ В НОРМАЛЬНЫХ Н ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ

03.00.25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1998

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ дифференцировки клеток Института цитологи РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

В.А.Поспелов

Институт цитологии РАН, С-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

А. П. Перевозчиков НИИ экспериментальной медицины РАМН, С-Петербург

доктор биологических наук, профессор Н.В.Томилин

Институт цитологии РАН, С-Петербург

Ведущее учреждение: Биолого-почвенный факультет

Санкт-Петербургского государственного университета, С-Петербург

Защита состоится 1998 года в _ /3

на заседании Диссертационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Реферат разослан мая 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета ____ Л.Н.Писарева

доктор биологических наук ! I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из важнейших проблем современной клеточной биологии является выяснение механизмов регуляции пролиферации клеток эукариот. Основные исследования в этой области сосредоточены на изучении проведения сигнала, запускаемого действием ростовых факторов. Действие лигандов приводит к активации клеточных рецепторов, которые являются стартовыми точками каскада белок-белковых взаимодействий с участием сигнальных молекул, приводящих к ответу клетки на сигнал - началу процессов пролиферации, дифференцировки, апо,птоза.

Недавно открытый путь проведения сигнала в клетке с участием белков семейства STAT привлекает внимание исследователей тем, что эти белки являются транскрипционными факторами, способными активироваться благодаря фосфорилированию единственного в их молекуле тирозина непосредственно клеточными рецепторами. Особенностью STAT-пути проведения сигнала в клетке является отсутствие большого числа промежуточных компонентов между клеточными рецепторами, локализованными на клеточной поверхности, и самими транскрипционными факторами STAT, взаимодействующими со специфическими регуляторными элементами генов.

Несмотря на интенсивные исследования транскрипционных факторов семейства STAT многие вопросы, касающиеся их участия в процессах пролиферации, дифференцировки и апоптоза остаются невыясненными. В настоящее время в литературе появляются данные о том, что STAT-путь передачи сигнала не является полностью автономным. Так, показана связь белков семейства STAT с МАР-киназой - ключевым белком Ras-зависимого пути передачи сигнала в клетке, а также с фосфоинозитндЗ-киназой - белком фосфоинозитидного пути передачи сигнала (David et al., 1995; Pffefer et al., 1997). Вопрос о взаимодействии транскрипционных факторов семейства STAT с другими сигнальными белками и о функциональном значении такого взаимодействия остается открытым.

Известно, что опухолевые клетки выходят из-под контроля организма и

не нуждаются в ростовых факторах для осуществления процесса клеточной пролиферации. Вопросы функционировании транскрипционных факторов STAT в трансформированных клетках: взаимодействие с рецепторами, уровень фосфорилирования, ДНК-связывающая активность, транс-активирующие свойства, взаимодействие с белками других сигнальных путей, а также внутриклеточной локализации пока изучены недостаточно. Адекватной клеточной системой для исследования нарушений сигнальных путей являются трансформанты, полученные из первичных клеток с помощью доминаетно-дейсгвующих онкогенов с известным механизмом действия. В настоящей работе были использованы первичные эмбриональные фибробласты крысы (REF) и трансформанты, полученные введением комплеменгирующих онкогенов El Aad5 и cHa-Ras (E1A+Ha-Ras). Как было показано ранее, в клетках E1A+Ha-Ras транскрипционные факторы, принадлежащие Ras-зависимому пути передачи сигнала, дерегулированы (Поспелова и др., 1996). Кроме трансформантов El A+Ha-Ras, была также использована клеточная линия А-431, имеющая происхождение из опухоли человека и содержащая большое число рецепторов эпидермального фактора роста.

Цель и задачи исследования.

В связи с вышеизложенным, в настоящей работе поставлены следующие основные задачи:

1. Исследовать статус фосфорилирования по тирозину STAT1 в нормальных эмбриональных фибробластах крысы (REF) и клетках REF, трансформированных онкогенами E1A+Ha-Ras.

2. Выяснить возможные механизмы конститутивной активации белков STAT1 и STAT3 в эмбриональных фибробластах крысы, трансформированных онкогенами E1A+Ha-Ras.

3. Исследовать взаимодействие белков STAT1 и STAT3 с цитоплазматическими белками, принадлежащими к другим сигнальным путям, в нормальных и трансформированных клеточных линиях.

4. Проанализировать внутриклеточное распределения белков семейства STAT в клеточных линиях, отличающихся степенью трансформации и уровнем организации цитоскелета.

Научная новизна. Показано, что в клетках, трансформированных онкогенами EIA+Ha-Ras, транскрипционный фактор STAT1 конститутивно фосфоршшрован по тирозину, независимо от присутствия или отсутствия ростовых факторов. В нормальных эмбриональных фибробластах крысы и клетках эпидермоидной карциномы человека А-431 STAT1 фосфорилируется только после воздействия на клетку сыворотки или эпидермального фактора роста (ЭФР). Впервые показано, что в клетках EIA+Ha-Ras конститутивно фосфорилирован по тирозину рецептор ЭФР, что, вероятно является причиной конститутивной активации белка STAT1.

Помимо конститутивного тирозинового фосфорилирования STAT1 в клетках EIA+Ha-Ras, впервые показано конститутивное взаимодействие STATI с МАР-киназой - одним из ключевых компонентов Ras-зависимого пути передачи сигнала. Таим образом в клетках EIA+Ha-Ras имеет место перекрест сигнальных путей: STAT-пути и Ras-зависимого МАР-киназного сигнального каскада.

Во всех исследованных клеточных линиях обнаружена связь STAT1 с фосфоинозитид-специфической фосфолипазой Cyl, что указывает также на пересечение STAT- и фосфоинозитидного путей передачи сигнала.

Впервые показана связь белков семейства STAT с цитоскелетнымн фракциями в клеточных линиях с разным уровнем организации цитоскелета. Теоретическое и практическое значение работы. Анализ функционального состояния белков STAT1 и STAT3 в нормальных и трансформированных клеточных линиях, проведенный в данной работе, позволил выявить механизм конститутивной активации этих транкрипционных факторов в трансформантах EIA+Ha-Ras. Наиболее важным механизмом дерегуляции STAT-пути является конститутивное фосфорилирование рецептора ЭФР (ЭФР-Р) и связанное с этим фосфорилирование сигнальных белков, являющихся субстратами ЭФР-Р, в том числе STAT1 и STAT3.

Большое практическое значение для клеточной биологии и молекулярной онкологии имеют полученные данные о способности белков STATI и STAT3 образовывать комплексы с белками других сигнальных путей: МАР-киназой (Ras-зависимый путь) и ФЛСу! (фосфоинозитидным путь).

Отработан метод получения антител против 38 С-концевых аминокислот белка5ТАТ1, основанный на получении слитого белка GST-STAT1.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на 2-ом биохимическом съезде (Москва, 1997) на совместных семинарах лабораторий молекулярных основ дифференцировки клеток, физиологии клеточного цикла и отдела клеточных культур Института цитологии РАН. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 152 публикации. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и иллюстрирована 28 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Клеточные линии и их культивирование

В работе использовали эмбриональные фибробласты крысы (REF) и эмбриональные фибробласты крысы, трансформированные ранним районом El А аденовируса человека 5-го типа и онкогеном c-Ha-Ras (El A+Ha-Ras), полученные Т.В. Поспеловой, а также клетки эпидермоидной карциномы человека А-431, полученные из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН). Клетки А-431 переводили на среду, содержащую 0.5% сыворотки на 18 - 24 ч, затем обрабатывали эпидермальным фактором роста (ЭФР) в концентрации 100 нг/мл. Клетки REF переводили на среду, содержащую 0.5% сыворотки на 48 ч, после чего стимулировали добавлением 10% сыворотки. Клетки El А + Ha-Ras переводили на среду, содержащую 0.5% сыворотки на 24 ч, после чего инкубировали либо с ЭФР, либо с эмбриональной сывороткой.

2. Бактериальные штаммы

В работе использовался штамм Escherihia coli DH5a. Бактерии выращивали на среде LB. Для селекции ампициллин-устойчивых клонов в среду добавляли ампициллин в концентрации 50 мкг/мл.

3. Трансформация бактерий плазмидной ДНК

Трансформацию бактерий плазмидной ДНК проводили по стандартной методике (Маниатис и др., 1984).

4. Получение сыворотки против С-концевой аминокислотной

последовательности белка р91

Нами были получены антитела, узнающие 38 С-концевых аминокислотных остатков, отличающих р91 от его "короткой формы" р84. Эти поликлональные антитела использовали для иммунопреципитации белка STAT1. Для этого с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) был амплифицирован фрагмент ДНК, размером 114 п.н, кодирующий 38 С-концевых аминокислотных остатков белка р91. При проведении ПЦР использовались праймеры: 5'-GGATCCTTCTAGACTTCAGACCAC-3\ комплементарный 5'-концу нуклеотидной последовательности, кодирующей 38 С-концевых аминокислот р91 и несущий ВашН1-сайт, и 5 '-ACTGTGTTCATCATACTG-3 комплементарный З'-концу этой последовательности. В качестве матрицы был использован ген Stall человека, клонированный в плазмиде pBluescript, любезно предоставленный Дж. Е. Дарнеллом мл. Продукт ПЦР был клонирован в вектор pGEXl по BamHl и Smal - сайтам. Скрининг полученных клонов проводили по индукции продукта - слитого белка GST-p91. Слитый белок GST-p91 (глутатион-8-трансфераза - р91) был выделен и очищен с помощью глутатион-S-Сефарозы, согласно протоколу фирмы "Pharmacia". Полученным пептидом иммунизировали кролика согласно общепринятым схемам иммунизации. Сыворотку крови кролика проверяли на содержание специфических антител к белку STAT1 и использовали в дальнейшей работе для иммунопреципитации.

5.Антитела

В работе использовали моноклональные антитела: против N-концевой последовательности белка STATI, PY20 против фосфорилированного тирозина, против фосфоинозитид-специфической фосфолипазы Су1 (все антитела "Transduction Laboratories"), а также поликлональные антитела: против МАР-киназы, STAT3 иФЛСу1 ("Santa Cruz Biotechnology"). В качестве вторых антител использовали козьи антитела против иммуноглобулинов мыши или кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена ("Sigma"). В качестве вторых

антител для имунофлуоресценции использовали козьи антитела против иммуноглобулинов кролика коньюгированные с флуоресцеинизотиоцанатом (FITC) (Sigma). STAT1 имунопреципитировали с помощью полученной нами сыворотки против 38 С-концевых аминокислот белка STAT1. Рецептор ЭФР (ЭФР-Р) иммунопреципитировали моноклональными антителами МаЫ08 на внеклеточный домен ЭФР-Р человека, любезно предоставленные проф. Дж. Шлессинджером (Нью-Йоркский университет, США).

6. Иммунопреципитация и иммуноблотинг

Клетки лизировали RIPA буфером (Fu, Zhang, 1992). Белки лизатов разделяли электрофорезом в присутствии 0.1% SDS: в 7.5%-ном геле при выявлении STAT1 и в 10%-ном геле при выявлении МАР-киназы. На дорожку наносили 50 мкг белка. Для иммунопреципитации STAT1 использовали поликлональные антитела против р91. Иммунопреципитированные белки разделяли электрофорезом в присутствии SDS, после фореза белки переносили на мембрану Immobilon Р ("Amersham"). Неспецифическое связывание антител блокировали инкубацией мембраны в 5%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 1 часа. Мембрану, обрабатывали первыми антителами в соответствующем разведении 1 ч, затем мембрану инкубировали со вторыми антителами. Выявление специфических белков производили методом усиления хемолюминесценции (ECL," Amersham").

7. Клеточное фракционирование

Фракционирование клеток проводили согласно методу МакБрайда и соавт ( McBride et al., 1991). Клетки разрушали в буфере, стабилизирующем цитоскелет, затем центрифугированием осаждали ядерную фракцию и неразрушенные клетки. После этого супернатант центрифугировали и разделяли цитозольную фракцию и фракции, содержащие мембраны и цитоскелетные элементы. Осадок ресуспендировали в буфере, содержащем 1% Тритон Х-100, при этом мембранные белки оказывались в супернатанте, а нерастворимый в детергенте осадок представлял собой цитоскелетную фракцию.

8. Иммунофлуоресцентный анализ

Клетки окрашивали согласно общепринятой методике. Фиксацию проводили 4% раствором формалина. Пермеабнлизацию проводили 0.5%

Тритоном Х-100. С целью блокирования неспецифического связывания антител препараты инкубировали в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 1 ч. В том же растворе проводили последующие стадии окраски с первыми и вторыми антителами.. Препараты анализировали во флуоресцентном микроскопе Zeiss и фотографировали на пленку Kodak.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Фосфорилирование транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 в эмбриональных фибробластах крысы, трансформированных онкогенами E1A+Ha-Ras.

Ранее было показано, что в нормальных эмбриональных фибробластах крысы (клетки REF) ростовые факторы (сыворотка, ЭФР) повышают ДНК-связывающую активность транскрипционного фактора STAT1 и вызывают его транспорт в ядро клетки (Поспелов и др., 1996). Напротив, клетки REF, трансформированные онкогенами E1A+Ha-Ras, характеризуются конститутивной ДНК-связывающей активностью и постоянной ядерной локализацией белка STAT1 (Поспелов и др., 1996). Поскольку известно, что способностью к транспорту в ядро и к связыванию с ДНК обладает только фосфорилированный по тирозину STAT1, представляло большой интерес выяснить уровень фосфорилирования белка STAT1 в этих клетках.

STAT1 иммунопреципитировали из лизатов нестимулированных и стимулированных сывороткой клеток REF. Белки иммунопреципитатов разделяли электрофоретически в полиакриламидном геле, переносили на мембрану и фосфорилированный тирозин выявляли на иммуноблоте с помощью моноклональных антител (рис, 1, а). Оказалось, что в нестимулированных клетках REF STAT1 дефосфорилирован, и с ним не копреципитируют другие фосфоршшрованные по тирозину белки (рис 1,а). В отличие от клеток REF, у трансформантов El A+Ha-Ras, STAT1 фосфорилирован по тирозину независимо от условий культивирования клеток: сывороточное голодание, стимуляция

сывороткой или ЭФР (рис. 1 б). Для того, чтобы выяснить, обусловлена ли дерегуляция активности STAT1 процессом трансформации клетки в целом или повышенной экспрессией онкогена ras были проведены аналогичные эксперименты с клетками А-431. Клетки эпидермоидной карциномы человека А-431 имеют происхождение из опухоли человека. Одной из особенностей этой клеточной линии является высокое содержание рецептора ЭФР на поверхности клетки (Благовещенская и др., 1995). Несмотря на то, что линия А-431 является высокотрансформированной, STAT1 в ней фосфорилируется по тирозину только после стимуляции клеток ЭФР (рис. 1 в). Это согласуется с литературными данными относительно ЭФР-зависимого транспорта в ядро и ДНК-связывающей активности STAT1 в этих клетках (Chin et al., 1996; 1997, Василенко и др., 1997).

REF

E1A+Ha-Ras

А-431

а

б

в

сыв

- сыв ЭФР

- ЭФР

Рис. 1. Тирозиновое фосфорилирование 5ТАТ1 в клетках КЕР (а); Е1А+На-Ка5 (б) и А-431 (в). Преципитация антителами против БТАТЦ выявление антителами против фосфорилированного тирозина.

El A+Ha-Ras

сыв ЭФР

1

- J<t>p-p

Рис.2. Тирозиновое фосфорилирование рецептора ЭФР в клетках E1A+Ha-Ras. Преципитация антителами против ЭФР-Р; выявление антителами против фосфорилированного тирозина.

Известно, что при действии факторов роста и сыворотки происходит фосфорилирование по тирозину рецепторов факторов роста и сопряженное с этим фосфорилирование ряда клеточных белков (Ullrich, Schiessinger, 1990). В голодающих клетках El A+Ha-Ras не только STAT1, но и другие белки -субстраты тирозин-киназы рецептора ЭФР: STAT3 и фосфолипаза Су 1 являются фосфорилированными. В связи с этим можно предположить, что конститутивная активация различных сигнальных белков в этих клетках связана с постоянной активацией, т.е. тирозиновым фосфоролированием различных рецепторов, в частности рецептора ЭФР (ЭФР-Р). Для проверки этого предположения, рецептор ЭФР иммунопреципитировали из лизатов голодающих и стимулированных ЭФР или сывороткой клеток El A+Ha-Ras, и на иммуноблотах выявляли белки, фосфорилированные по тирозину (рис. 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что в клетках E1A+Ha-Ras, независимо от условий культивирования (голодание или стимуляция), ЭФР-Р фосфорилирован по тирозину, т.е. постоянно активирован. Таким образом, можно допустить, что активированное состояние транскрипционного фактора STAT1 в клетках El A+Ha-Ras обусловлено перманентной активностью по крайней мере одного из рецепторов, участвующих в регуляции STAT! (рецептора ЭФР).

2. Взаимодействие STAT1 и STAT3 с другими сигнальными белками.

Известно, что действие цитокинов и ростовых факторов приводит к образованию гомо- и гетеродимеров белков семейства STAT, а также к образованию комплексов этих белков с другими сигнальными белками (Darnell, 1997). Считается, что белки семейства STAT способны образовывать комплексы с другими белками будучи фосфорилироваными по тирозину (т. е. активироваными) (David et al., 1995; Pfeffer et al., 1997). Однако недавно в литературе появились данные о том, что и не фосфорилированный по тирозину STAT1 способен образовывать гетеродимеры STAT1/STAT2 и STAT1/STAT3 в нестимулированных клетках HeLa (Stancato et al., 1996).

В связи с этим возникает вопрос о том, существуют ли комплексы STAT1 с другими сигнальными белками в голодающих клетках, когда белок STAT1 локализован в цитоплазме клеток, как изменяется это взаимодействие при стимуляции ростовыми факторами и чем отличаются комплексы в нормальных клетках и трансформированных клетках.

Для выяснения вопроса об образовании комплексов STAT] с другими сигнальными белками, STAT1 иммунопреципитировали из лизатов клеток REF, ElA+Ha-Ras и А-431, белки преципитатов разделяли электрофоретически, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и на иммуноблотах выявляли белки, копреципитировавшие со STAT1 т.е. образующие с ним комплексы.

Проведенные эксперименты показали, что гетеродимеры STAT1/STAT3 такие димеры существуют и в нестимулированных клетках REF и А-431 (рис. 3), что согласуется с данными Станкато с соавт (Stancato et al., 1996). Следует отметить, что в данных условиях в образовании таких комплексов участвуют только нефосфорилированные по тирозину белки (рис. 1). Стимуляция клеток REF и А-431 сывороткой и ЭФР, соответственно, приводила к увеличению количества гетеродимеров (рис. 3). Иная картина обнаружена в клетках El A+Ha-Ras. В голодающих и стимулированных сывороткой клетках El A+Ha-Ras количество STAT3, копреципитировавшего со STAT1 не меняется (рис. 3, в), при этом STAT1 оказывается связан с медленно-мигрирующими формами STAT3, которые, вероятно, являются фосфорилированными формами этого белка.

Аналогичная картина обнаружена при выявлении и иммунопрецшштатах STAT1 ключевого белка фосфоиночитидного пути передачи сигнала -фосфолипазы Су1 (ФЛСу1). В нестимулированных клетках А-431 и REF нефосфорилированный STAT1 образует комплексы с ФЛСу); стимуляция этих клеток ЭФР или сывороткой приводит к увеличению количества ФЛСу1, копреципигировавшей со STAT1 (рис. 4). В клетках E1A+Ha-Ras количество

s

образовывающихся комплексов STAT1/ ФЛСу1 не зависит от действия ростовых факторов, аналогично тому, что обнаружено при образовании гетеродимеров STAT1/STAT3 (рис. 4).

Следует отметить, что STAT1, STAT3 и ФЛСу1 представляют собой белки - субстраты тирозин-киназной активности рецепторов факторов роста, поэтому не исключена вероятность того, что все эти белки образуют комплексы с рецептором, а не друг с другом. Для проверки такого предположения в иммунопрецшштатах STAT1 из лизатов клеток А-431, обладающих высоким содержанием рецептора ЭФР, выявляли рецептор ЭФР. На рис. 5 видно, что в нестимулированных клетках А-431 рецептор ЭФР не копреципитирует с белком STAT1, а, следовательно, и не участвует в образовании комплексов сигнальных белков в нестимулированных клетках. Действие ЭФР приводит к ассоциации STAT1 с рецептором ЭФР, что согласуется с литературными данными (David et al., 1996).

+ стимуляция

а А-431 б REF

в E1A+Ha-RAS

•-STAT3

-STAT3

-STAT3

Рис. 3. ЭТАП копреципитирует со ЭТАТЗ в клетках А-431 (а), ЯЕР (б) и Е1А+На-Яа5 (в). Преципитация антителами против 8ТАТ1; выявление антителами против 8ТАТЗ.

+ стимуляция

а А-431 б ИЕЕ в Е1А+На-1*А8

Рис. 4. БТАП ко-преципитирует с фосфолипазой Су1 в клетках А-431 (а), ИЕР (б) и Е1 А+На-Яаз (в). Преципитация антителами против 8ТАТ1; выявление антителами против ФЛСу!.

+

. 1

А-431 1

Рис. 5. Рецептор ЭФР ко-преципитирует со STAT1 только в стимулированных действием ЭФР клетках А-431. Преципитация антителами против STAT1; выявление антителами против рецептора ЭФР.

Известно, что МАР-киназа являющаяся ключевым компонентом Ras-зависимого пути передачи сигнала, ассоциируется со STAT1 при воздействии интерферона (5 в клетках U266 (David et al., 1995). В трансформированных клетках А-431 и E1A+Ha-Ras обнаружена копреципитация двух изоформ МАР-киназы (ERK1 и ERK2) со STAT1 (рис. 6). Однако, при стимуляции клеток ростовыми факторами количество МАР-киназы, копреципитировавшей со STAT1 практически не изменялось. Таким образом в трансформированных

-PLC

- PLC

■ -PLC

клетках А-431 и Е1Л+Ма-11ая имеет место конститутивная ассоциация МАР-кииазы со 8ТАТ1.

В 1990г. Ульрих и Шлессинджер предложили гипотезу о существовании латентных (неактивных) комплексов сигнальных белков, в который входят

А-431 E1A+Ha-Ras

ЭФР - сыв ЭФР

Рис. 6. МАР-киназы копреципитируют со STATI в клетках А-431 (а) и E1A+Ha-Ras(6). Преципитация антителами против STAT1; выявление антителами против МАР-киназы.

субстраты рецепторов факторов роста, такие как ФЛСу1 и фосфатидилинозитид-3 киназа (семейство STAT еще не было открыто). Связывая воедино литературные данные об образовании димеров неактивированными белками семейства STAT (Stancato et al., 1996), данные о взаимодействии STAT3 с фосфатидилинозитид-3 киназой с полученными нами результатами можно предположить, что белки семейства STAT участвуют в образовании таких комплексов.

3. Внутриклеточная локализация STAT1 и STAT3

Предположение о том, что элементы цитоскелета участвуют в проведении клеточного сигнала высказываются во многих работах. Однако экспериментальных доказательств связи сигнальных белков с элементами цитоскелета получено не было. В связи с этим возник вопрос о внутриклеточной локализации белков семейства STAT в нестимулированиых клетках.

Для выяснения внутриклеточной локализации сигнальных белков клетки А-431, REF и E1A+Ha-Ras фракционировали по методу МакБрайда (McBride eí al., 1991). При этом выделяли фракцию, содержащую растворимые цитоплазматические белки (цитозоль), фракцию белков, растворимых в 1% Тритоне Х-100, куда попадают в основном мембраны клетки (мембранная фракция) и фракцию, нерастворимую в Тритоне Х-100, представляющую собой цитоскелетные элементы (цитоскелетная фракция) (Diakonova et al., 1995).

В нестимулированных клетках REF и А-431 STAT1 выявляется в цитоскелетной фракции. В стимулированных клетках А-431 STAT1 также выявляется в цитоскелетной фракции, а в клетках REF в этой фракции не обнаруживается (рис.7).

Известно, что в клетках трансформированных ras цитоскелет в той или иной степени дезорганизован (Gloushankova et al., 1997). Эмбриональные фибробласты крысы, трансформированные белками раннего района El А аденовируса человека и онкогеном Ha-Ras (клетки El A+Ha-Ras), обладают фенотипом, характерным для высокотрансформированных клеток: способностью к росту в полумягком агаре, высокой скоростью роста, отсутствием контактного торможения, плохой способностью к распластыванию на субстрате (Поспелова и др., 1990). В клетках Е1А + Ha-Ras STAT1 в детергент-нерастворимой (цитоскелетной) фракции не выявляется (рис.7), что согласуется с полученными ранее данными о преимущественной ядерной локализации этого белка (Поспелов и др., 1996).

STAT3 однако выявлялся как в мембранной, так и в цитоскелетной фракциях клеток El A+Ha-Ras. Несмотря на конститутивную активацию рецептора ЭФР, STAT3 иммунофлуоресцентным методом выявлялся не в ядрах этих клеток, как это было показано для STAT1, а в цитоплазме. Таким образом в клетках REF, трансформированных онкогенами El A+Ha-Ras имеет место разобщение представителей STAT-пути передачи сигнала - STAT1 и STAT3. Можно предположить, что взаимодействие с цитоскелетными элементами препятствует транспорту STAT3 в ядра клеток.

цптозоль мембраны иитоскс.чет

+ + - +

а А-431 _ _ -- * -этат"!

б ЯЕР --- -этап

в Е1А+На-11а5 --- -этап

Рис.7. 8ТАТ1 выявляется в цитоскелетной фракции клеток А-431 (а) и ЯЕБ (б), но отсутствует в цитоскелетной фракции клеток Е1А+На-Каз (в).

6. выводы

1. В эмбриональных фибробластах крысы, трансформированных онкогенами E1A+Ha-Ras, транскрипционный фактор STATI конститутивно фосфорилирован по тирозину независимо от голодания или стимуляции клеток. В нормальных эмбриональных фибробластах крысы STAT1 фосфорилируется по тирозину только при действии ростовых факторов.

2. Рецептор ЭФР в клетках E1A+Ha-Ras конститутивно фосфорилирован по тирозину, т.е. находится в активированном состоянии, что является возможной причиной конститутивного тирозинового фосфорилирования STAT1 и других сигнальных белков в этих клетках.

3. Нефосфорилированный по тирозину белок STAT1 способен образовывать комплексы с нефосфорилированными белками STAT3 и ФЛСу1 в нестимулированных клетках REF и А-431, что указывает на предсуществование таких комплексов.

4. В клетках REF, трансформированных онкогенами E1A+Ha-Ras, постоянно фосфорилированный по тирозину STAT1 взаимодействует с постоянно фосфорилированными STAT3, ФЛСу 1 и МАР-юшазсй, что указывает на пересечение STAT-пути с другими путями передачи сигнала.

5. Обнаружена связь транскрипционных факторов STAT1 и STAT3 с элементами цитоскелета в клетках REF и А-431. В клетках E1A+Ha-Ras STAT1 не ассоциирован с элементами цитоскелета.

6. STAT3 локализован преимущественно в цитоплазме клеток Е1 А+На-Ras и почти не выявляется иммуноморфологическими методами в ядрах клеток как в голодающих, так и в стимулированных клетках. Таким образом, STAT1 и STAT3 оказываются локализованными в разных компартментах клетки.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бурова Е. Б., Василенко К.П., Цупкина Н.В., Чупрета C.B., Евдонин А Л Никольский Н.Н. ЭФР-зависимая активация и ядерно-цитоплазматическин транспорт STAT1 в клетках А431 .//"Второй биохимический съезд". Тезисы стендовых сообщений,Пущино. - 1997. - С. 256.

2. Чупрета C.B., Евдонин А.Л., Творогов Д.Б., Никольский Н.Н., Медведева Н.Д. Связь фосфоинозитид-специфической фосфолипазы Су1 с элементами цитоскелега в клетках А-431.//Цитология. - 1998. - N2. - С. 185 - 189.

3. Евдонин А.Л., Медведева Н.Д., Поспелова Т.В., Поспелов В.А. Транскрипционный фактор p91/Statl конститутивно фосфорилирован по тирозину и связан с МАР-киназой в эмбриональных фибробластах крысы, трансформированных онкогенами El A+Ha-Ras.// Молекулярная биология. -1998. - N4. - С. 6/С -¿/V,

4. Евдонин А.Л., Творогов Д.Б., Цупкина Н.В., Никольский Н.Н., Медведева Н.Д. Участие фосфоинозитид-специфической фосфолипазы Су1 и белка STAT1 в образовании латентных комплексо сигнальных белков.// Цитология. - 1998. -N6. - С. 620 - 627.

Типография "Ступени"

Спб, Менделеевская Линия В.О, д. 5.

___тираж 100 экз. объем 1 п.л.