Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия циклинов фазы G1 в B-зрелоклеточных лимфомах человека

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия циклинов фазы G1 в B-зрелоклеточных лимфомах человека"

005535841

На правах рукописи

Гладких Алина Александровна

Экспрессия циклинов фазы С1 в В-зрелоклеточных лимфомах человека

03.03.04 — клеточная биология и гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 4 ОКТ 2013

Москва 2013

005535841

Работа выполнена на биологическом факультете Московского Государственного Университета им М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук И.А. Воробьев

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук A.A. Штиль (заведующий лабораторией механизмов гибели опухолевых клеток ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН)

Доктор биологических наук, профессор Н.И. Дризе (заведующий лабораторией физиологии кроветворения ФГБУ «Гематологический научный центр МЗСР РФ»)

Ведущая организация: Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Научно-исследовательский Институт морфологии человека»

диссертационного совета Д501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1. Факс:8(495)939-17-46; e-mail: dis_kalsov@mail.ru С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится

на заседании

Автореферат разослан

Н onjüjtA

2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

В-клеточные неходжкинские лимфомы представляют собой гетерогенную группу злокачественных опухолей, как правило, возникающих из зрелых В-клеток. К основным нозологиям этой группы относят В-клеточный хронический лимфолейкоз, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому из клеток маргинальной зоны, волосатоклеточный лейкоз, фолликулярную лимфому, диффузную В-крупноклеточную лимфому (ДВККЛ) и лимфому Беркитта. Суммарно они составляют около 15 % от общего числа опухолей гематопоэтической и лимфоидной ткани (WHO classification of lymphomas, 2008).

Гетерогенность этой группы проявляется в большом количестве вариантов клинической картины, иммунофенотипа опухолевых лимфоцитов и различии в прогнозах заболеваний. Белки, дерегуляция которых играет центральную роль в патогенезе зрелоклеточных лимфоидных опухолей, с одной стороны должны быть эффекторным звеном нескольких сигнальных каскадов, с другой стороны - обладать плейотропностью действия. С этой точки зрения наиболее перспективными кандидатами на роль центральных белков - переключателей в опухолевых В-лимфоцитах представляются циклины группы D и циклины группы Е, чьей канонической функцией является стимуляция выхода клетки из фазы G1 и переход ее в фазу синтеза ДНК.

Для вхождения дифференцированной клетки в пролиферативный цикл необходим митогенный сигнал, в частности, связывание ростовых факторов (EGF, FGF, PDGF, IGF и т.п.) с рецептором и последующая активация ERK1/ERK2 каскада митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК-каскад). Активируемые этим каскадом транскрипционные факторы Мус (Daksis et al., 1994) и АР-1 (Albanese et al., 1995) запускают синтез циклинов DI, D2 и D3, которые образуют комплексы с киназами CDK4 и CDK6 (Bates et al., 1994), обусловливая выход клетки из фазы G1 (Murray, 2004). Синтез циклинов D также регулируется FAK киназой и/или Rho семейством ГТФаз (Zhao et al., 1998; Gille et al., 1999), а активация PI3K пути ингибирует GS КЗ beta-зависимую деградацию циклинов D (Liang et al., 2003). Переход из поздней G1 фазы в S-фазу контролируется циклин-зависимой киназой CDK2 и циклинами El и Е2. Комплекс СОК4/6-циклин D частично фосфорилирует Rb-белки, что приводит к диссоциации гистондеацителазы от комплекса HDAC-Rb-E2F и позволяет E2F запустить синтез циклина Е. Комплекс циклина Е и CDK2 дополнительно фосфорилирует Rb, и тот отсоединяется от E2F, снимая его ингибирование (Gottlieb et al., 1994; Ribes -Zamora et al., 2007).

Гиперэкспрессия циклинов группы D была показана методами иммуногистохимии, проточной флуориметрии и ИФА в некоторых лимфоидных опухолях, в частности?, в

опухолевых лимфоцитах фолликулярной лимфомы (Teramoto et al., 1999), диффузной В -крупноклеточной лимфомы (Filipits et al., 2002), в части опухолевых лимфоцитов В-клеточного хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) (Komaczewaska et al., 2009). Лимфома из клеток мантийной зоны была выделена из группы B-XJIJ1 по наличию транслокации t(lI;14)(ql3;q32), перемещающей ген циклина D1 под промотор гена тяжелой цепи иммуноглобулинов, поэтому в клетках JIKM3 наблюдается наиболее высокий уровень экспрессии циклина D1 (Williams et al., 1995). Несмотря на то, что циклин Е является основным нижележащим эффекторным звеном циклина D (Geng et al., 1999), сведения о его экспрессии в опухолях иммунной системы носят весьма разрозненный и несистематический характер. До недавнего времени оценка уровня экспрессии циклинов проводилась исключительно качественными методами, обладающими относительно низкой чувствительностью, возможно, что использование более чувствительных методов детекции с определением уровня мРНК вместо количества белка позволит выявить не одиночные, а систематические изменения уровня экспрессии циклинов фазы G1 в опухолевых лимфоцитах В-зрелоклеточных лимфом. Цель исследования

Целью данной работы было получение новых знаний об экспрессии мРНК циклинов групп D и Е в нормальной и опухолевой лимфоидной ткани методом ПЦР в реальном времени.

Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить коллекцию образцов кДНК из зрелоклеточных опухолей и нормальной лимфоидной ткани.

2. Определить оптимальные референтные гены для нормализации данных ПЦР в реальном времени.

3. Определить уровень экспрессии мРНК генов циклинов Dl, D2 и D3 в нормальных и опухолевых лимфоцитах.

4. Определить уровень экспрессии мРНК гена циклина El в нормальных и опухолевых лимфоцитах.

Новизна исследования

1. Впервые исследована выборка образцов кДНК, полученной из свежезамороженных образцов лимфоидной ткани от 165 пациентов с известным имунофенотипом опухолевых клеток.

2. Использование корректной стратегии нормализации и наличие трех стабильно экспрессирующихся референтных генов впервые позволило детектировать

повышенный уровень экспрессии мРНК циклинов D1 и Е в опухолевых лимфоцитах по сравнению с нормальной лимфоидной тканью.

3. Предложен новый диагностический метод разделения нозологии В-зрелоклеточных лимфом по уровню экспрессии мРНК циклина D1. Научно-практическая значимость исследования

Полученные результаты могут быть использованы в дифференциальной диагностике лимфоидных опухолей, данные об экспрессии циклинов Gl фазы в лимфоидной ткани могут быть использованы в курсах лекций по гематологии, частной гистологии и клеточной биологии. Апробация работы

Материалы диссертации доложены на: внутреннем семинаре Совета Молодых Ученых в Гематологическом Научном Центре РАМН (2009 год), международной конференции «Experimental Hematology Association» (2010), второй Международной Школе по практической проточной цитометрии (Москва, 2011), 18-й международной конференции «18lh Leipziger Workshop on Cytomics and Congenital Heart Disease» (2013) и обсуждены 23 мая 2013 года на специализированном семинаре кафедры клеточной биологии и гистологии Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 3 тезиса конференций. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 132 страницах машинописи и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», заключения и выводов. Работа содержит 16 рисунков и 14 таблиц. Библиографический материал включает в себя ссылки на 303 источника литературы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Пациенты

Для исследования были выбраны образцы тканей селезенок, лимфоузлов и периферических мононуклеаров крови (48 биопсий селезенки, 23 биопсии лимфоузлов и 94 образца периферических мононуклеаров крови) 165 пациентов на базе гематологического Научного Центра (Москва, Россия). У 33 пациентов был поставлен диагноз ЛКМЗ, и у 97 был поставлен диагноз В-ХЛЛ. Все пациенты не проходили курс

лечения в момент взятия образца крови или биопсии лимфоузла. 35 референтных случаев содержали 2 случая фолликулярной лимфомы, 4 случая диффузной В-крупноклеточной лимфомы, 11 случаев лимфомы из клеток маргинальной зоны и 18 случаев с реактивным лимфаденитом (пролиферация клеток неопухолевой природы). Диагнозы «лимфома из клеток мантийной зоны» и «хронический лимфолейкоз» были поставлены с помощью методов трехцветной проточной цитофлуориметрии и иммуногистохимии, в 1 случае диагноз был поставлен по наличию транслокации и клиническим данным. Цитогенетические данные по транслокации t(l I;14)(ql3;q32) были доступны для 12 пациентов из 33. Средний возраст пациентов с В-ХЛЛ составил 62 года (разброс 48-76 лет), средний возраст пациентов с ЛКМЗ составил 58 лет (разброс 39-75 лет).

Иммуногистохимия и проточная флуориметрия.

Непрямая иммуногистохимическая окраска парафиновых срезов толщиной 4-5 мкм проводилась по стандартной методике (Petrosyan et al., 1999). Пробоподготовку образцов для флуориметрии проводили по стандартной методике, описанной ранее (Gretsov et al., 2004). Для окраски использовали моноклональные антитела к CD5-FITC (клон DK23, DAKO, Дания), CD19-Cy5 (клон HIB19, eBioscience, США), CD23-PE (клон МНМ6, Dako, Дания), FMC7-FITC (клон MCA792F, AbD Serotec, США), CD20-Cy5 (клон 2Н7, eBioscience, США), поверхностное антитело к к - легкой цепи иммуноглобулинов и поверхностное антитело к ^.-легкой цепи иммуноглобулинов (к-FlTC/ Х-РЕ, клон АНМ4907, Invitorgen, США). Полученные пробы анализировались на проточном цитофлуориметре FACsCalibur (BD). Результаты обрабатывались в программе CellQuest (BD Biosciences, США). Отсечки выставлялись по негативным контролям.

Выделение периферических мононуклеаров крови и получение суспензий

Клетки мононуклеаров крови выделяли в градиенте Ficoll-Histopaque (Sigma-Auldrich, США) по стандартной методике. Полученные клетки дважды отмывались в среде RPMI-1640 (Панэко, Россия) и замораживались в жидком азоте. Из кусочков ткани лимфатических узлов и селезенок приготавливалась суспензия в medi-machine (BD Biosciences). Суспензии также замораживались в жидком азоте. Нормальные В-лимфоциты из периферических мононуклеаров крови здоровых доноров выделяли на колонках miniMACS (Miltenyi Biotech GmbH, Germany) по протоколу производителя.

Получение РНК и кДНК

Выделение РНК из замороженных клеток осуществлялось при помощи RNeasy Mini Kit (Qiagen, США) по протоколу производителя. После выделения РНК была дополнительно обработана ДНКазой (Fermentas, США) в течение 30 минут при 37 °С. Концентрация РНК измерялась на спектрофотометре (Genesis UV10, Thermo Electron,

США). Анализ чистоты выделенной РНК проводился по измерению пиков А260/А280 и А260/А230. Среднее соотношение А260/А280 составило 1,85 (диапазон 1,7-1,9), среднее соотношение А260/А230 составило 1,7 (диапазон 1,65-1,95).

Подбор праймеров

Для амплификации ПЦР-РВ использовались е последовательности праймеров, предложенные Vandesompele et al., (2002). Для генов циклинов D2, D3 и циклина Е были написаны следующие праймеры: cyclin D2 sense: 5' - CTG GGG AAG TTG GAA GTG GA -3'; cyclin D2 antisense: 5' - CAA ТСС ACG TCT GTG TTG G; cyclin D3 sense: 5'- GAC CTT TTT GGC CCT CTG T- 3'; cyclin D3 antisense: 5' - GCT TCG АТС TGC TCC TGA C; cyclin El sense: 5' - AGC ACT TCA GGG GCG TCG-3'; cyclin El antisense: 5' - GCC CGC TGC TCT GCT TCT. Результаты ПЦР подтверждались на электрофорезе. Результат ПЦР для гена циклина D1 проверяли с помощью клонирования продукта реакции в вектор pGem-T Easy Vector (Promega) согласно инструкции производителя с последующим сиквенсом вставки. Для того чтобы минимизировать амплификацию геномной ДНК, праймеры были составлены так, чтобы каждую пару разделял хотя бы один интрон. По последним данным, все выбранные нами гены выполняют независимые функции и не имеют общей регуляции.

ПЦР в реальном времени

Количественные ПЦР-реакции в реальном времени проводили на приборе MiniOpticon (Biorad Headquaters, Hercules, California) методом неспецифической детекции с красителем SybrGreen I (Синтол, Россия).

Стандартная ПЦР реакция проводилась в объеме 25 мкл с реактивами фирмы «Синтол» (Россия) и включала в себя 2,5 мкл 10 х кратного ПЦР буфера с Sybr Green I, 2,5 мМ MgCh, 2,5 мМ дНТФ, 1,5 единицы Taq-полимеразы Hot Rescue, 10 пмоль каждого праймера и 5 мкл 5 -кратного разведения кДНК. Условия реакции включали первоначальную денатурацию (при 95 СС) и последующие 40 циклов репликации (95 °С 15 сек, 64 °С ЗОсек, 72 °С 60 сек).

Нормализация данных

В работе была использована методика расчета относительного нормализованного количества кДНК с помощью фактора нормализации (Vandesompele et al., 2002). Результаты были проанализированы с помощью бесплатных приложений для обработки данных ПЦР в реальном времени: GeNorm (Center of medical Genetics, Ghent University hospital, geNorm version 3.5, 2002), NormFinder (Molecular Diagnostic Laboratory, Department of clinical Biochemistry, Aarhus University Hospital, Denmark, 2004) и BestKeeper (FML-Weihenstephan, Centre of Life and Food Science, Technical University of Munich,

Germany, 2003). Для статистического анализа данных и построения графиков использовалась программа GraphPad® Prism (GraphPad Software, version 5, San Diego, CA, USA). Для теста на нормальность распределения использовали критерии д'Агостино-Пирсона и Холмогорова-Смирнова.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Иммунофенотипирование и иммуногистохимия

Классификация исследованных в работе нозологий проводилась по данным проточной флуориметрии (рис.1). Согласно классификации ВОЗ(1), для клеток В-ХЛЛ характерен иммунофенотип CD5+/CD19+/CD23+/FMC7-, для клеток ЛКМЗ характерен иммунофенотип CD5+/CD19+/CD23-/FMC7+, клональность опухолевых клеток подтверждали по экспрессии одного из вариантов легких цепей иммуноглобулинов (каппа или лямбда).

При работе с образцами тканей нозологии «хронический лимфолейкоз» и «лимфома из клеток мантийной зоны» описывали не только по данным проточной цитофлуориметрии, но и по данным иммуногистохимической окраски на циклин D1 и CD23 на парафиновых срезах. Практически все опухолевые лимфоциты В-ХЛЛ экспрессируют CD23, а в лимфоме из клеток мантийной зоны позитивно по CD23 окрашена лишь часть лимфоцитов в редуцированных остаточных фолликулах, тогда как основная масса опухоли вокруг фолликулов является С023-негативной (Рис. 2 В, С). Ядра большей части опухолевых лимфоцитов ЛКМЗ ярко окрашиваются антителами к циклину D1, тогда как за небольшим исключением остальные зрелоклеточные лимфопролиферативные заболевания, включая большинство случаев В-ХЛЛ и лимфомы из клеток маргинальной зоны, являются циклин Dl-негативными. В исследованной выборке ядерное окрашивание опухолевых лимфоцитов антителами к циклину D1 наблюдалось во всех образцах солидных тканей с нозологией ЛКМЗ (12 из 12), пример такого окрашивания приведен на рис. 2, А. В образце ткани лимфоузла с нозологией В-ХЛЛ окрашивание антителами к циклину D1 детектируется лишь в небольшой части ядер лимфоцитов в центрах пролиферации (Рис. 2 D).

По литературным данным в небольшом числе случаев наблюдается ядерное окрашивание антителами к циклину D1 части клеток лимфоузлов с нозологией В-ХЛЛ (Cheuk et al., 2004). Было установлено, что существует группа образцов В-ХЛЛ с гиперэкспрессией этого белка в части лимфоцитов, хотя в большинстве случаев В-ХЛЛ надежно детектировать экспрессию этого белка методом иммуногистохимии не удалось.

Так как отсутствие гиперэкспрессии белка на качественном уровне не всегда

означает отсутствие гиперэкспрессии на уровне мРНК, далее было решено проанализировать уровень экспрессии мРНК гена циклина 01 на выборке пациентов с В-ХЛЛ и лимфомой из клеток мантийной зоны методом количественного ПЦР в реальном времени.

д - в»-,- С!,'т-1-

Рисунок 1. Иммунофенотипические характеристики клеток ЛКМЗ и В—ХЛЛ по данным проточной флуориметрии. (Л) Выделение лимфоцитарного полигона в суспензии клеток ЛКМЗ (В) Коэкспрессия С05/С019 в клетках ЛКМЗ (С) Коэкспрессия С019/С023 в клетках ЛКМЗ (О) Клональность опухолевых клеток ЛКМЗ (Е) Экспрессия ЕМС7 в опухолевых лимфоцитах ЛКМЗ (7-) Выделение лимфоцитарного полигона в суспензии клеток В-ХЛЛ (С) Коэкспрессия С05/Сй19 в клетках В-ХЛЛ (Н) Коэкспрессия С019/С023 в клетках В-ХЛЛ, (I) Клональность опухолевых клеток ЛКМЗ (1) отсутствие экспрессии РМС7 в опухолевых лимфоцитах В-ХЛЛ.

2.2 Подбор референтных генов

Статистическое описание уровня экспрессии кандидатов в референтные гены в лимфоидной ткани.

Для оценки уровня экспрессии гена циклина необходимо было выбрать референтные гены, которые можно использовать в качестве внутренних стандартов при расчете относительного нормализованного количества мРНК исследуемых генов

циклинов фазы 01. Экспрессия таких генов должна быть сопоставима с нормальным уровнем транскрипции мРНК генов циклинов группы О и Е (относительно низкая экспрессия) и при гиперэкспрессии этих мРНК в опухолевых лимфоцитах, кроме того, их экспрессия должна быть стабильной в клетках крови, селезенки и лимфоузлов как в нормальной лимфоидной ткани, так и при различных вариантах неопластической трансформации (Уапс1е5отре1е е! а!., 2002).

Рисунок 2. Иммуногистохимическая окраска на циклин D1 и CD23 на парафиновых срезах лимфоузлов с диагнозами В—ХЛЛ и JIKM3. (А) Ядерное окрашивание опухолевых лимфоцитов J1KM3 на циклин D1, основная масса опухолевых клеток позитивна по циклину D1, х20 (В) Иммуногистохимическое окрашивание лимфоузла с ЛКМЗ на CD23. Цитоплазматическая окраска CD23 в центрах размножения редуцированных фолликулов, вокруг негативные по CD23 опухолевые лимфоциты, х20 (С) Ядерное окрашивание небольшой части лимфоцитов В—ХЛЛ на циклин D1, циклин D1—позитивные лимфоциты находятся в редуцированных центрах размножения, основная часть опухоли циклин D1— негативна, х20 (D) Цитоплазматическая окраска опухолевых лимфоцитов В-ХЛЛ на CD23, основная масса опухоли позитивна по CD23, х20. На врезках дано увеличение хбО.

Для лимфоцитов в качестве кандидатов в референтные гены с предполагаемым высоким уровнем транскрипции (величина порогового цикла от 20 до 25) были выбраны гены B-ACTIN, GAPDH (Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase), В2М (Beta-2-microglobulin) и RPL13A (Ribosomal protein L13a), в качестве референтных генов со средним уровнем транскрипции (величина порогового цикла от 25 до 30) были выбраны гены UBC (Ubiquitin С) и HPRT1 (Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase 1), в качестве референтного гена с низким уровнем транскрипции (величина порогового цикла от 30 и

выше) был выбран ген YWHAZ (Tyrosine 3-monooxygenase tryptophan 5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide).

На предварительном этапе анализа было показано, что экспрессия мРНК выбранных референтных генов детектируется во всех типах лимфоидной ткани, то есть мРНК всех генов удалось обнаружить в образцах клеток крови, лимфоузлов и селезенки. Продукты каждой ПЦР-реакции детектировались с помощью гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле и имели ожидаемую молекулярную массу, совпадающую с размером ампликона

В экспериментах ПЦР в реальном времени специфичность амплификации доказывали по наличию единичного пика на кривой плавления. Для каждого из образцов стандартное отклонение в трипликате всегда было меньше 0,2. Диапазон пороговых циклов и средние значения представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Значения пороговых циклов для экспрессии референтных генов в лимфоидной ткани.

ЕС gene Ct range Ct min Ctmax Mean Cfcfcs.e.m. SD

YWHAZ 3,93 32,01 35,94 33,63 ± 0.06 0,71

UBC 6,53 24,33 30,86 26,90 ± 0.08 1,07

HPRT1 5.24 26.33 31.57 28.73 ± 0.09 1,33

B-ACTIN 5,93 19,80 25,73 22,64 ±0.11 1,44

GAPDH 5,78 21,72 27,51 24,72 ±0.11 1,37

RPL13A 8,15 20,11 28,26 24,73 ±0.15 1,93

B2M 8,30 18,18 26,48 22,06 ±0.16 2,07

В различных типах лимфоидной ткани уровень экспрессии мРНК исследуемых генов не отличался. Эквивалентность экспрессии генов в выборке проверяли с помощью теста Манна-Уитни. По результатам этого теста была доказана эквивалентность экспрессии референтных генов для опухолевой и нормальной лимфоидной ткани (р<0,05). Для проверки на нормальность распределения использовались критерии д'Агостино-Пирсона и Колмогорова-Смирнова. Оказалось, что лишь для 2 из 7 генов, в частности YWHAZ и UBC, выборка данных по экспрессии мРНК имеет вид нормального распределения при проверке двумя критериями (р>0,1, а = 0,05), для остальных генов (HPRT1, GAPDH, B-ACTIN, RPL13A, В2М) выборки данных по уровню экспрессии мРНК не прошли проверку на нормальность распределения, что делает применение к ним t-теста некорректным.

Для определения стабильности уровня экспрессии мРНК исследуемых генов были использованы программы geNorm, ЫоппРт11ег и ВевНСеерег. Программа §еЫогт использует алгоритм последовательного исключения генов—кандидатов на основе их стабильности. Лучшие гены используются для расчета фактора нормализации, определяемого как среднее геометрическое относительных нормализованных количеств кДНК. Для выбранных генов была рассчитана величина V, которая является стандартным отклонением для выборок попарных соотношений уровней экспрессии мРНК исследуемых генов. После этого гены были проранжированы по их мере стабильности М, рассчитываемой как среднее арифметическое для всех величин V. Гены с высоким значением М имеют наименее стабильный уровень экспрессии мРНК, так как чем больше величина М, тем больше величина стандартных отклонений анализируемых выборок. Порядок генов в общей выборке и во всех группах, за исключением ЛКМЗ и С05-негативных лимфом, был одинаковым. Порядок генов, начиная с наиболее стабильного, оказался следующим: и 11ВС, АСТВ, НР11Т1, САРЭН, ЯРЫ ЗА, В2М (Таблица

2).

Таблица 2. Распределение генов по стабильности согласно программам ¿еЫогт и МогтРт(1ег. Наиболее стабильные гены находятся в верхней строчке таблицы.

GeNorm Величина M (мера стабильности) NormFinder Уровень стабильности

YWHAZ 1.13 YWHAZ 0.045

UBC 1.13 UBC 0.049

АСТВ 1.51 В2М 0.053

HPRT1 1.68 RPL13A 0.059

GAPDH 1.79 АСТВ 0.068

RPL13A 2.19 GAPDH 0.068

B2M 2.47 HPRT1 0.087

В группе ЛКМЗ и С05-негативных лимфом GAPDH, АСТВ and HPRT1 менялись местами, но YWHAZ и UBC имели самые низкие значения меры стабильности М, тогда как у RPL13A и В2М значения М были самыми высокими. Анализ значений уровня экспрессии мРНК референтных генов в программе Best Keeper, так же, как и в программе geNorm, в качестве наиболее стабильных выявил гены YWHAZ and UBC как прошедшие установленный порог SD (стандартное отклонение) < 1. Для определения стабильности наших генов-кандидатов также была использоваана программа NormFinder. В качестве

наиболее стабильного гена в программе NormFinder также оказался ген YWHAZ со значением меры стабильности 0,045 и UBC с мерой стабильности 0,049.

Для того чтобы оценить количество генов, необходимое и достаточное для корректной нормализации данных ПЦР в реальном времени, использовали анализ коэффициентов парной вариации в программе geNorm. Для большинства групп, так же как и для целой выборки, наиболее низкое значение парного отклонения (V) было получено для отношения четвертого и пятого генов (V4/5), и варьировало от 0,18 до 0,25 (Рис. 4). Это означает, что различиями в уровне экспрессии мРНК этих генов можно пренебречь, и для эффективной нормализации достаточно трех генов. В группе образцов лимфоидной тканей с нозологией ЛКМЗ и группе, состоящей из образцов ткани лимфатических узлов, минимальное значение V было получено для отношения пятого и шестого генов (V5/6 = 1,9 и 0,22 соответственно). Однако графики линейной регрессии, построенные в парных осях факторов нормализации, показали, что наиболее удачная линеаризация получается для NF3 напротив NF4 (R2 = 0.81), то есть различия в уровне экспрессии этих генов являются незначительными. Таким образом, отношение уровней экспрессии мРНК этих генов остается практически постоянным, что делает необязательным добавление четвертого гена в расчет фактора нормализации.

По итогам анализа с помощью программ geNorm, NormFinder и BestKeeper, гены YWHAZ и UBC имеют наиболее стабильный уровень экспрессии в нормальной и опухолевой лимфоидной ткани. Трех рефрерентных генов, YWHAZ, UBC и В-ACTIN достаточно для корректной нормализации данных ПЦР в реальном времени для лимфоидной ткани.

23. Оценка экспрессии циклина D1 в нормальной и опухолевой лимфоидной

ткани

Популяция В-клеток из образцов периферических мононуклеаров крови здоровых доноров (п=10) была обогащена на колонках Mylteniy Biotech, клетки сортировали по экспрессии пан В-клеточного антигена CD 19, чистота обогащенной популяции составляла от 73 до 93 %. Относительное нормализованное количество кДНК циклина D1 в таких образцах варьировало от 0,00003 до 0,0005. Относительное нормализованное количество кДНК циклина D1 в тех же образцах цельной крови варьировало от 0,00008 до 0,0007, таким образом, в нормальных В- и Т-клетках циклин D1 экспрессируется на очень низком уровне, причем уровень экспрессии циклина D1 не отличается в сортированных В-лимфоцитах и несортированных периферических мононуклеарах крови. Относительное нормализованное количество кДНК в образцах солидных тканей неопухолевой природы D1 варьирует от 0,00001 до 0,002 у разных больных (медиана 0,00007), т. е. экспрессия

гена циклина в образцах воспалительной природы ниже, чем в опухолевых клетках (Рис. 5). В клетках ЛКМЗ относительное нормализованное количество кДНК гена циклина 01 варьирует от 0,04 до 13,55 у разных больных (медиана 0,226) и превышает относительное нормализованное количество кДНК в клетках реактивного лимфаденита на 3 порядка (Таблица 3). Относительное количество кДНК гена циклина 01 в клетках В-ХЛЛ варьирует от 0,00002 до 0,09 (медиана 0,003) и может отличаться на 3 порядка в клетках разных больных с этой нозологией (см. рис. 5).

Рисунок 4. Анализ величин коэффициентов парной вариации для определения количества генов, достаточных для корректной нормализации результатов ПЦР в нормальной и опухолевой Н «2/з ткани.

ЕЗ N/3/4 О 4415 О *.'5/6 П «5/7

Таблица 3. Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина VI в опухолевых клетках и реактивном процессе

Нозология Нормализованное относительное количество кДНК гена циклина О!

диапазон медиана

ЛКМЗ 0,042-13,550 0,2258

В-ХЛЛ 0,00002-0,09 0,003

С05—негативные опухоли 0,00005-0,0044 0,0004

Реактивный процесс 0,00001-0,002 0,00007

В группе образцов С05-негативных лимфом (и = 17), куда входили образцы тканей с нозологиями «фолликулярная лимфома», «лимфома из клеток маргинальной зоны», «диффузная В-крупноклеточная лимфома», относительное нормализованное количество кДНК гена циклина Э1 варьировало от 0,00005 до 0,004 (медиана 0.0004) (см. табл. 3; рис. 5). По уровню экспрессии мРНК гена циклина можно получить статистически

значимые отличия для этой группы от группы образцов ткани с реактивным процессом (р < 0,002, критерий Манна-Уитни), но нельзя различить нозологии внутри нее (р = 0,33 для лимфомы из клеток маргинальной зоны ир = 0,26 для ДВККЛ).

Рисунок 5. Уровень экспрессии мРНК гена циклина й1 в клетках ЛКМЗ, В-ХЛЛ, С05-негативных опухолей и реактивного лимфаденита. Каждое измерение проводили в трипликате, кДИК нормализована по генам У\УНА2, В-АСТ1И и С/ВС. Горизонтальной чертой изображена медиана для каждой группы.

Таким образом, по уровню экспрессии мРНК нозологии В-зрелоклеточных лимфом могут быть расположены следующим образом (начиная с наименьшей) С05-негативные лимфомы, В-ХЛЛ, ЛКМЗ. При этом уровень экспрессии мРНК циклина повышен во всех опухолевых

лимфоцитах по сравнению с нормальными В-клетками. Гиперэкспрессия мРНК циклина наблюдается в клетках В-ХЛЛ в отсутствие транслокации 1(11; 14). Различия в уровне экспрессии мРНК циклина между всеми нозологиями являются статистически достоверными.

3.4. Сравнение различных подходов к нормализации данных ПЦР в реальном времени

Для того чтобы иметь возможность сравнить полученные данные с данными литературы, относительное количество мРНК гена циклина 01 было нормализовано методом ДДС1 (1луак е! а1., 2001) по одному референтному гену, для чего был выбран ген УШНА2, так как его экспрессия является наиболее стабильной в выборке (рис. 6).

Использование этого подхода позволяло разделить выборку по нозологиям, но разница между медианами для групп стала менее достоверной, а различия между группами образцов реактивной лимфоидной ткани и С05-негативных опухолей стали статистически недостоверными (р=0.11, тест Манна-Уитни, Таблица 4). Таким образом, использование одного референтного гена для нормализации данных ПЦР в реальном времени не позволяет достоверно различить нозологии с разницей в уровне экспрессии мРНК менее двух порядков.

10000010000. 1000"

; 100-

у

Рисунок 6. Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина О/ в клетках нормальной и опухолевой лимфоидной ткани. Нормапизация по методу ААС1 с геном У№НА1. Горизонтальной чертой изображены медианы для каждой группы, цифрами указано значение медианы.

Таблица 4. Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина в клетках нормальной и опухолевой лимфоидной ткани. Нормализация по методу ААС/ с геном У1¥НАг.

нозология диапазон медиана среднее ± Б ЕМ

ЛКМЗ 228Л -8192,0 1552,0 2148,0 ± 364,5

В-ХЛЛ 0,2-935,8 16,5 60,4 ± 13,7

СЭ5 -негативные опухоли 0,9 - 65,3 4,2 9,5 ± 3,7

Реактивная лимфоидная ткань 0,4- 14Л 2,5 4,8 ± 1,1

3.4. Пролиферация клеток с гиперэкспрессией мРНК циклина

Пролиферация клеток в образце оценивалась по наличию в клетках пролиферативного маркера Кл-67, оцененного методом проточной флуориметрии. В образцах лимфомы из клеток мантийной зоны пролиферативный индекс варьировал от 0,3 до 44 % (среднее 8,41), пролиферативный индекс в образцах с нозологией В-ХЛЛ варьировал от 0 до 10 % (среднее 3%). На рис. 7 приведен пример типичного окрашивания клеток из суспензии лимфоузлов с нозологиями В-ХЛЛ (рис.7, А, В) и ЛКМЗ (рис.7, С, Э). В выборке отсутствовала корреляция между уровнем экспрессии мРНК гена циклина и количеством пролиферирующих клеток в образцах с нозологией ЛКМЗ, оцененному по маркеру пролиферации Кь67, коэффициент Спирмена для корреляции между количеством К1-67-положительных опухолевых В-клеток и относительным нормализованным количеством мРНК гена циклина был равен - 0,005. Количество мРНК циклина в образцах с нозологией ЛКМЗ не зависело от типа опухолевого роста в ткани: максимальное количество мРНК циклина О! было обнаружено в образцах с

диффузным типом роста опухоли при отсутствии на срезах митотических фигур, а в образцах с бластоидиым вариантом ЛКМЗ оно было относительно низким.

3.5. Пммунофенотипирование лимфом «серой зоны»

В процессе иммунофенотипирования тканей В-зрелоклегочных лимфом была обнаружена группа образцов с имунофенотипическими характеристиками, не соответствующим в полной мере ни одной из нозологий. Такие клетки, как правило, экспрессируют на поверхности маркеры, характерные как для клеток ЛКМЗ (высокий уровень экспрессии поверхностных маркеров С020 и РМС7), так и маркеры, характерные для опухолевых лимфоцитов В-ХЛЛ (экспрессия поверхностного маркера С023). Такие образцы были условно отнесены к нозологии лимфом «серой зоны». Пример иммунофенотипа, характерного для опухолевых лимфоцитов лимфом «серой зоны», приведен на рис. 8. В связи с появлением новой нозологической группы была создана отдельная выборка кДНК, состоящая из 27 образцов ЛКМЗ, 27 образцов В-ХЛЛ, 14 образцов лимфомы из клеток маргинальной зоны (ЛМарЗ), 26 образцов лимфом «серой зоны» и 15 образцов реактивной ткани.

3.6. Экспрессия циклина в группе лимфом «серой зоны»

В новой выборке самый высокий уровень экспрессии мРНК гена циклина Э1 по-прежнему наблюдался в опухолевых лимфоцитах ЛКМЗ (медиана 1,99), в клетках В-ХЛЛ (медиана 0,004) он был снижен по сравнению с клетками ЛКМЗ, но выше, чем в реактивной лимфошшой ткани. Данные об уровне экспрессии мРНК гена циклина 01 в новой выборке представлены в Таблице 5. По экспрессии циклина 01 группа лимфом «серой зоны» разделилась на 2 части: в 7 образцах из 26 относительное нормализованное количество кДНК гена циклина 01 было больше условного порога в 0,1 (диапазон 0,884,07), что дало возможность отнести эти образцы к нозологии «лимфома из клеток мантийной зоны». В 19 образцах из 26 относительное нормализованное количество кДНК было меньше 0,1 (диапазон 0,003-0,078), для этих образцов был исключен диагноз «лимфома из клеток мантийной зоны».

В новой выборке тканей В-зрелоклеточных лимфом появилась группа образцов с иммунофенотипом, промежуточным для клеток ЛКМЗ, В-ХЛЛ и лимфомы маргинальной зоны. Эта группа образцов была условно названа «лимфомы серой зоны». По уровню экспрессии мРНК циклина в этой группе можно однозначно выделить образцы с гиперэкспрессией мРНК циклина Б1, для которых подтверждается транслокация 1(11;14)(ц13;ц32), и которые можно отнести к нозологии «лимфома из клеток мантийной зоны». Остальные образцы без

гиперэкспрессии циклина 1)1 по совокупности иммунофенотипических и молекулярных характеристик были отнесены к нозологиям «хронический лимфолейкоз» и «лимфома из клеток маргинальной зоны». Таким образом, оценка уровня экспрессии мРНК циклина 1)1 в образцах позволяет разделить нозологии В-зрелоклеточных лимфом в тех случаях, когда результаты имунофенотипирования неочевидны.

Рисунок 7. Пролиферация опухолевых лимфоцитов В-ХЛЛ и ЛКМЗ, оцененная по маркеру Ю-67.

(A) Выделение пимфоцитарного полигона в суспензии клеток В-ХЛЛ

(B) 0,12% опухолевых клеток В-ХЛЛ экспрессируют Ю-67 (С) Выделение лимфоцитарного полигона в суспензии клеток ЛКМЗ (О) 7,92% опухолевых лимфоцитов ЛКМЗ экспрессируют Ю-67.

Таблица 5. Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина О! в опухолевых клетках и реактивной лимфоидной ткани (новая выборка)

нозология Нормализованное относительное количество кДНК гена циклина

диапазон медиана

ЛКМЗ 0,078-107,2 1,99

В-ХЛЛ 0,0001-0,1056 0,004

ЛМарЗ 0,0001-0,017 0,0008

Лимфомы «серой зоны» 0,003-4,079 0,04

Реактивный процесс 0,0001-0,0068 0,00054

C05-FITC

СО 19 ЯРЕ СуЬ

Рисунок 8. Пример иммунофенотипического описания образца с нозологией «лимфома из клеток серой зоны». (А) Выделение лимфоцитарного полигона в суспензии клеток (В) Коэкспрессия CD5 и CD19 на опухолевых лимфоцитах (С) Частичная экспрессия CD23 на опухолевых лимфоцитах - (D) Экспрессия FMC7 на части опухолевых лимфоцитов (Е) Клональность опухолевых лимфоцитов

3.7. Экспрессия циклинов D2 и D3 в опухолевых и нормальных лимфоцитах Экспрессия мРНК циклина D2 была выявлена во всех образцах (п=109), за исключением четырех образцов реактивной ткани. Наиболее высокий уровень D2 наблюдался в клетках В-ХЛЛ (медиана 1,424), самый низкий уровень экспрессии наблюдался в опухолевых лимфоцитах лимфомы из клеток маргинальной зоны (медиана 0,0078). По уровню экспрессии мРНК гена циклина D2 можно было достоверно отличить группы образцов CD5 - положительных опухолей (нозологии В-ХЛЛ, ЛКМЗ и лимфомы «серой зоны») от реактивного процесса и группы ЛМарЗ (для всех пар р<0.05, тест Манна-Уитни). Различия в уровне экспрессии мРНК гена циклина D2 между группами В-ХЛЛ, ЛКМЗ и лимфомы «серой зоны» были статистически недостоверными (р=0.19, тест Крускала-Уоллиса), так же, как и различия в уровне экспрессии мРНК гена циклина D2 между опухолевыми лимфоцитами лимфомы из клеток маргинальной зоны и нормальными лимфоцитами реактивной лимфоидной ткани (р=0.13, тест Манна-Уитни).

Данные о диапазоне экспрессии циклина D2 в опухолевых и нормальных В-лимфоцитах представлены в Таблице 6.

Таблица 6. Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина 02 в опухолевых клетках и реактивном процессе.

Нозология Нормализованное относительное количество кДНК гена циклина Э2

диапазон медиана

ЛКМЗ 0,0004-1,235 0,1624

В-ХЛЛ 0,0002-13,27 1,424

Лимфомы «серой зоны» 0,0004-4,858 0,2246

Лимфома из клеток маргинальной зоны 0,0004-0,2381 0,0078

Реактивный процесс 0-0,7889 0,0363 |

В клетках ЛКМЗ, В-ХЛЛ, лимфом «серой зоны» и лимфом маргинальной зоны мРНК гена циклина ЭЗ не детектировалась (отсутствие выхода графика ПЦР-реакции на плато до 40 цикла). мРНК гена циклина ЭЗ была обнаружена в 12 из 14 образцов реактивной ткани (диапазон 0,23-46,99), и на низком уровне в 15 из 26 образцов группы лимфомы «серой зоны» (диапазон 7x10"5 - 0,0627). В оставшихся 11 образцах мРНК гена циклина ЭЗ детектировать не удалось (отсутствие выхода графика ПЦР-реакции на плато до 40 цикла амплификации). Графики уровней экспрессии мРНК генов циклина 02 и 03 в нормальных и опухолевых лимфоцитах приведены на Рис. 9.

3.8. Анализ соотношения уровней экспрессии циклинов группы О Как в нормальных, так и в опухолевых лимфоцитах всех нозологий (ЛКМЗ, В-ХЛЛ, лимфома из клеток маргинальной зоны, лимфомы «серой зоны») отсутствовала корреляция между уровнем экспрессии мРНК гена циклина ОЗ и уровнем экспрессии мРНК гена циклина 02. Также во всех группах образцов отсутствовала значимая корреляция между уровнем экспрессии мРНК генов циклинов ЭЗ и 01 (коэффициент корреляции Спирмена Я < |0,6|).

В группе образцов, полученных от пациентов с В-ХЛЛ, была обнаружена

обратная корреляция между уровнем экспрессии мРНК генов циклинов и 02: в

опухолевых лимфоцитах с низким уровнем экспрессии мРНК гена циклина Э1 повышен

уровень экспрессии мРНК циклина 02 (коэффициент корреляции Спирмена К=-0,81), В

группе лимфом «серой зоны» не наблюдалось значимой корреляции между уровнем

экспрессии мРНК генов циклина и Э2 (коэффициент Спирмена Я—О.55). Однако при

исключении из этой группы 7 образцов с очень высоким уровнем экспрессии мРНК гена

20

циклина (диапазон уровня экспрессии мРНК от 0,88 до 4,07коэффициент корреляции

Рисунок 9. Уровень экспрессии мРНК генов циклина 02 и ОЗ в метках ЛКМЗ, В-ХЛЛ.

Сй5-негативных опухолей и реактивного лимфаденита.

Каждое измерение проводили в трипликате, кДНК нормализована по генам УМНАг, В-АСТ1Ы и ЦВС. Горизонтальными линиями

изображены медианы выборки.

В опухолевых лимфоцитах В-ХЛЛ при отсутствии транслокации 1(11; 14)^13^32) существует обратная зависимость между уровнем экспрессии мРНК циклинов 01 и 02: малое количество мРНК циклина 01 в таких клетках компенсируется большим количеством мРНК циклина 02.

Экспрессия циклина Е в нормальных и опухолевых лимфоцитах мРНК гена циклина Е детектировалась во всех типах лимфоидной ткани (селезенка и лимфоузел) и в периферических мононуклеарах крови. Самый высокий уровень экспрессии циклина Е наблюдался в опухолевых лимфоцитах при В-ХЛЛ (медиана 1,12), самый низкий уровень экспрессии мРНК гена циклина Е наблюдался в клетках реактивной лимфоидной ткани (медиана 0,0002). Наиболее гетерогенной по уровню экспрессии мРНК циклина Е оказалась группа образцов ЛКМЗ: разброс относительного нормализованного количества кДНК гена циклина Е в образцах тканей с этой нозологией составил 4 порядка (Таблица 7). Данные о диапазоне экспрессии циклина Е в нормальных и опухолевых лимфоцитах приведены на рис. 10 и в Таблице 7. При анализе экспрессии циклина Е наиболее интересной оказалась группа При анализе корреляций выяснилось, что в клетках ЛКМЗ существует обратная корреляция между уровнем экспрессии мРНК генов циклина Е и циклина в клетках с высоким уровнем экспрессии мРНК гена циклина Э1 снижена экспрессия мРНК гена циклина Е, коэффициент корреляции Спирмена для двух этих выборок был равен -0,77. При исключении из выборки кДНК четырех образцов ткани с бластоидным вариантом ЛКМЗ

возрастал до -0,78.

^ ^ /

<* 4Г у ¿Г

^ /

I

I ..

I

(агрессивный вариант лимфомы мантийной зоны с активной пролиферацией клеток, которые морфологически близки к бласгам) коэффициент корреляции увеличивался до -0,85. На рис. 10 видно, что в группе образцов лимфом «серой зоны» есть 5 образцов с очень низким уровнем экспрессии циклина Е (выделены красным цветом). В этих же образцах мРНК циклина 01 экспрессируется на высоком уровне (диапазон 0,53-2,56), то

есть по уровню экспрессии мРНК гена циклина 01 эти образцы могут быть отнесены к нозологии ЛКМЗ.

Рисунок 10. Уровень экспрессии мРНК генов циклина Е в нормальных и опухолевых лимфоцитах Горизонтальными линиями изображены медианы выборки. Красным цветом в группе образцов лимфом «серой зоны» выделены образцы с высоким уровнем экспрессии мРНК гена циклина 01. Красным цветом в группе образцов ЛКМЗ выделены образцы кДНК из тканей с бластоидным гистологическим вариантом ЛКМЗ.

Таблица 7. Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина Е в опухолевых клетках и реактивном процессе.

нозология Нормализованное относительное количество кДНК гена циклина Е

диапазон медиана

ЛКМЗ 0,0004-2,990 0,079

В-ХЛЛ 0,11-23,13 1,12

Лимфома из клеток маргинальной зоны 0,22-3,83 0,97

Лимфомы «серой зоны» 0,003-3,69 0,81

Реактивный процесс 0,0001-0,0005 0,0002

Таким образом, количество мРНК циклина Е повышено в опухолевых лимфоцитах всех нозологии В-зрелоклеточных лимфом по сравнению с клетками неопухолевой лимфоидной ткани. В клетках ЛКМЗ существует обратная зависимость между уровнем экспрессии мРНК циклина и циклина Е: чем больше мРНК циклина И1, тем меньше мРНК циклина Е. Исключением являются случаи

ЛКМЗ с бластоидным типом роста опухоли, в которых такая корреляция отсутствует.

Заключение

Довольно долгое время уровень экспрессии циклинов в тканях оценивали по экспрессии белка методом иммуногистохимии. При использовании иммуногистохимии возникали сложности, связанные со специфичностью белкового эпитопа и относительно низкой специфичностью метода, которую невозможно повысить без понижения чувствительности. В 2002 году группа Jain et al. показала, что существует 90% корреляция между уровнем мРНК и белка циклина D1 в лимфоидной ткани, после чего исследователи получили возможность использовать для детекции циклинов более трудоемкий, но и более чувствительный метод полимеразной цепной реакции.

В первой части настоящей работы был проведен анализ экспрессии генов домашнего хозяйства в нормальной и опухолевой лимфоидной ткани, который показал, что наиболее стабильный уровень экспрессии характерен для генов YWHAZ и ubc, причем выбор наиболее стабильных генов не зависит от методики расчета. Нужно отметить, что гены YWHAZ и UBC были единственными, уровни экспрессии мРНК которых имела вид нормального распределения во всей выборке, то есть проведение теста на нормальность распределения в выборке может служить хорошим критерием для предварительной оценки стабильности уровня экспрессии мРНК кандидатов в референтные гены. Таким образом, было показано, что для корректной нормализации данных в реальном времени достаточно использования трех стабильно экспрессирующихся генов, в качестве третьего референтного гена был использован ген В-ACTIN, но недостаточно одного, даже максимально стабильного, гена домашнего хозяйства, если разница в уровне экспрессии гена мишени для них составляет менее двух порядков.

Использование корректной стратегии нормализации и трех стабильных референтных генов впервые позволило получить данные о систематическом превышении уровня мРНК циклинов G1 фазы в образцах ткани В-зрелокпеточных лимфом по сравнению с нормальной лимфоидной тканью. Кроме того, использование этой стратегии позволило разделить между собой нозологические группы лимфомы из клеток мантийной зоны и хронического лимфолейкоза, а также отличить их от С05-негативных лимфом и реактивного лимфаденита. Эти результаты имеют важное значение для диагностики В-зрелоклеточных лимфом, так как позволяют быстро проводить дифференциальную диагностику В-зрелоклеточных лимфом в тех случаях, когда результаты иммунофенотипирования неочевидны (лимфомы так называемой «серой зоны»),

Интересно, что повышенный уровень мРНК циклина D1 наблюдался во всех образцах В-ХЛЛ в отсутствие транслокации t(l I;14)(ql3;q32). В 2012 году вышла статья Gradowski et al. о гиперэкспрессии белка циклина D1 в ядрах клеток пролиферативных центров псевдофолликулов лимфоузлов при В-ХЛЛ, которая подтверждает данные настоящей работы.

Данные о повышенной экспрессии мРНК гена циклина D1 в отсутствие транслокации t(lI;14)(ql3;q32) в клетках В-ХЛЛ и привели к идее о том, что в таких клетках может быть изменен профиль экспрессии мРНК генов циклинов D2 и D3, а также циклина Е, поскольку именно он является основной нижележащей мишенью для циклина D1.

В настоящей работе впервые было показано повышение уровня циклина D2 и циклина Е в опухолевой лимфоидной ткани, а также наличие отрицательной корреляции между уровнем экспрессии мРНК гена циклина D1 и уровнем экспрессии циклина D2 для хронического лимфолейкоза и циклина Е для лимфомы из клеток мантийной зоны.

В результате сравнения данных по уровню экспрессии мРНК циклинов D и Е и уровня пролиферативной активности клеток в образце, оцененного по экспрессии маркера Ki-67, стало ясно, что в опухолевой лимфоидной ткани клетки с высоким уровнем жкспрессии G1 фазы практически не пролиферируют.

В литературе существуют немногочисленные данные о том, что, гиперэкспрессия циклина D1 может не приводить к ускорению пролиферации. В частности, индукция дифференцировки клеток миелолейкоза in vitro сопровождается повышением уровня экспрессии циклина D1 и остановкой деления этих клеток, причем повышение экспрессии циклина D1 сопровождается резким повышением экспрессии ингибитора циклин-зависимых киназ p21 (Ullmannova et al., 2003). Такая же ситуация характерна для опухолевых лимфоцитов волосатоклеточного лейкоза, для которого характерен крайне низкий пролиферативный индекс, гиперэкспрессия циклина D1 и отсутствие транслокации t(ll;14) (Bosch et al., 1995). Эти данные свидетельствуют о том, что альтернативной функцией циклина D1 может быть стимуляция дифференцировки клеток с использованием сложных регуляторных механизмов. Первым вариантом такого механизма может быть связывание циклина D1 с PCNA и cdk-2, что ведет к подавлению репликации ДНК и снижению активности cdk-2 (Fukami-Kobayashi et al., 1999). Второй вариант, по-видимому, связан с регуляторной петлей циклин Dl-p21clp и запретом на выход в S-фазу (Steinmannet al., 1998).

Другая вероятная функция для циклина D1 в клетках ЛКМЗ, и, возможно других лимфом - защита опухолевых клеток от апоптоза. Однако в 2008 году группа Klier et al.

опубликовала статью о последовательном и двойном нокдауне генов циклина Ш и 02 в клетках культуры ЛКМЗ, и отсутствии изменений ни в скорости пролиферации, ни в апоптотическом индексе для этих клеток. Таким образом, в совокупности полученные результаты заставляют предположить, что накопление опухолевых клеток с повышенной экспрессией циклинов 01 фазы в зрелоклеточных лимфомах не связано с ускорением пролиферации, а обусловлено получением клонального преимущества за счет смены профиля транскрипции опухолевых клеток.

Выводы

1. Для корректной нормализации данных ПЦР в реальном времени в лимфоидной ткани достаточно трех стабильно экспрессирующихся референтных генов. Гены

иВС и В-АСТШ являются оптимальными для нормализации данных ПЦР в реальном времени в нормальной и неопластической лимфоидной ткани.

2. По уровню экспрессии гена циклина 01 нозологии располагаются следующим образом, начиная с максимального уровня экспрессии: лимфома из клеток мантийной зоны (медиана 0,23), хронический В-клеточный лимфолейкоз (медиана 0,003), С05-негативные опухоли (медиана 0,0004), реактивная лимфоидная ткань (7х10 5). Относительное нормализованное количество кДНК гена циклина в клетках ЛКМЗ и реактивной лимфоидной ткани отличается на 4 порядка. Различия в уровне экспрессии мРНК циклина 01 между всеми группами образцов являются статистически достоверными.

3. По уровню экспрессии гена циклина Е исследованные нозологии располагаются следующим образом, начиная с максимального уровня экспрессии: хронический В-клеточный лимфолейкоз (медиана 1,12), лимфома из клеток маргинальной зоны (медиана 0,97), лимфомы «серой зоны» (медиана 0,81), лимфома из клеток мантийной зоны (медиана 0,08) и реактивная лимфоидная ткань (медиана 2х10"4). Различия в уровне экспрессии мРНК циклина Е между образцами нормальной и опухолевой лимфоидной ткани являются статистически достоверными.

4. Уровень экспрессии генов циклинов группы О и циклина Е не коррелирует с пролиферативной активностью опухолевых лимфоцитов В-клеточных лимфом, определяемой по маркеру Кд-67.

5. Существует достоверная обратная корреляция для количества мРНК циклина 01 и циклина 02 (в группе образцов В-ХЛЛ) и для количества мРНК циклина и циклина Е (в группе образцов ЛКМЗ).

6. Дерепрессия циклина Э1 и повышение уровня экспрессии циклина Е в опухолевой лимфоидной ткани может играть важную роль в опухолевой трансформации зрелых В-лимфоцитов.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации:

1) Concurrent epigenetic silencing of wnt/p-catenin pathway inhibitor genes in В cell chronic lymphocytic leukaemia.Moskalev EA, Luckert K, Vorobjev IA, Mastitsky SE, Gladkikh AA, Stephan A, Schrenk M, Kaplanov KD, Kalashnikova OB, Pótz O, Joos TO, Hoheisel JD. BMC Cancer. 2012 Jun 6;12:213. doi: 10.1186/1471-2407-12-213.

2) Гладких А.А, Поташникова Д.М., Корнева Е.П., Худолеева O.A., Воробьев И.А., 2011. Сравнительный анализ экспрессии циклина D1 в клетках В-клеточных лимфом и реактивного лимфаденита. Гематология и трансфузиология, 56, 4, с.З-U.

3) D. Potashnikova, A. Gladkikh, Е. Gretsov, N. Barteneva, I. Vorobjev. Expresión of BCR - associated signaling components in sorted B-CLL cells. // Abstracts of the 2nd International Workshop on Practical Cytometry, 26-30 August, 2011. Cytometry B, 82, p. O1-017.

4) Gladkikh A, Potashnikova D, Komeva E, Khudoleeva O, Vorobjev I. Cyclin D1 expression in B-cell lymphomas. Exp Hematol. 2010 Nov;38(l l):1047-57.

5) Gladkikh A, Potashnikova D, Komeva E, Khudoleeva O, Vorobjev I. Cyclin D expression in В -cell lymphomas: a comparative study. Haematologica | 2010; 95(s2), p 516

6) Potashnikova D, Barteneva N, Gladkikh A, Gretsov E, Vorobjev I. Expression of BCR associated molecules in normal and malignant lymphocytes. 18th Leipziger Workshop, 2013, POOL

Благодарности

Автор благодарит своего научного руководителя д.б.н. И.А. Воробьева за неизменную поддержку на протяжении всего времени выполнения работы, своих коллег Д М. Поташникову, Е.П. Корневу, О.А. Худолееву, А.В. Творогову, Т.А. Смирнову, А.В. Пантелеева, С.М. Таугера, без которых эта работа не могла состояться; врачей к.м.н. О.А. Губкину, к.м.н. А.В. Губкина, В.И. Воробьева за предоставленные образцы тканей и консультации; своих оппонентов д.б.н. Н.И. Дризе и д.м.н. А.А. Штиля за конструктивную критику; весь коллектив кафедры клеточной биологии и гистологии МГУ имени М.В. Ломоносова и заведующего кафедрой д.б.н., профессора Г.Е. Онищенко.

26

Подписано в печать 15.10.2013 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1712. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гладких, Алина Александровна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

04201364799

Гладких Алина Александровна

ЭКСПРЕССИЯ ЦИКЛИНОВ ФАЗЫ С1 В В-ЗРЕЛОКЛЕТОЧНЫХ

ЛИМФОМАХ ЧЕЛОВЕКА

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.03.04 - клеточная биология и гистология

Научный руководитель

Доктор биологических наук И.А. Воробьев

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................10

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................49

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ:............................................58

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...............................................93

Глава 5. ВЫВОДЫ....................................................................................................105

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................107

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

CDK - cyclin-dependent kinases

Cdc - cell division cycle kinase

pRb - retinoblastoma protein

p27kip - cyclin-dependent kinase inhibitor p27

MyoD - myogenic differentiation

UTR - untranslated region

МАРК - mitogen -activated protein kinases

MEK - MAPK/ERK kinase

AP-1 - activation protein -1

Fos - FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog

ATF - activation transcription factor

CRE - cAMP responding element

Rac - ras-related C3 botulinum toxin substrate

NFkB - nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells

Jak - Janus activated kinase

FAK - focal adhesion kinase

CD - differentiation cluster

KLF - Kruppel-like factor

Wnt - wingless-type MMTV integration family

Jmj -jumonji domain

Oct-1 - octamer-binding protein

HDAC - histone deacetylase

BCR - B-cell receptor

IgM - immunoglobulin M

GSK3B - glycogen synthase kinase 3beta

YWHAZ - Tyrosine 3-monooxygenase tryptophan 5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide UBC - ubiquitin C

HPRT1 -hypoxantine phosphorybosiltransferase 1

GAPDH - glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

B2M - beta-2 microglobulin

PKRG1 - cGMP-dependent protein kinase-1 gene

TBP - TATA-box-binding protein

CRM - Chromosome region maintenance protein

SCF - ubiquitin ligase specificity factor

MMTV - mouse mammary tumor virus

MUM -1 - melanoma associated antigen (mutated)

SOX-11 - sex determining region Y

MTC - major translocation cluster

STS - sequence tagged site markers

DLEU - deleted in lymphocytic leukemia

KCNRG - potassium channel regulator

ATM - ataxia telangiectasia mutated

RDX - radixin

FDX - ferredoxin 1

ACAT1 -Acetyl-CoA acetyltransferase 1 NPAT - nuclear protein, ataxia telangiectasia mutated locus DDX10 - DEAD box protein 10 TRAIL - TNF-related apoptosis-inducing ligand YAC - yeast artificial chromosome MDM2 - mouse double minute 2 homolog

В-ХЛЛ - хронический В-клеточный лимфолейкоз ДВККЛ - диффузная В-крупноклеточная лимфома ЛКМЗ - лимфома из клеток мантийной зоны ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ИФА - иммуноферментный анализ

ПЦР - полимеразная цепная реакция в реальном времени КСФ - колониестимулирующий фактор БСА - бычий сывороточный альбумин

Введение

Актуальность проблемы

В-клеточные неходжкинские лимфомы представляют собой гетерогенную группу злокачественных опухолей, как правило, возникающих из зрелых В-клеток. К основным нозологиям этой группы относят В-клеточный хронический лимфолейкоз, лимфому из клеток мантийной зоны, лимфому из клеток маргинальной зоны, волосатоклеточный лейкоз, фолликулярную лимфому, диффузную В-крупноклеточную лимфому (ДВККЛ) и лимфому Беркитта. Суммарно они составляют около 15 % от общего числа опухолей гематопоэтической и лимфоидной ткани (1).

Гетерогенность этой группы проявляется в большом количестве вариантов клинической картины, иммунофенотипа опухолевых лимфоцитов и различии в прогнозах заболеваний. Белки, дерегуляция которых играет центральную роль в патогенезе зрелоклеточных лимфоидных опухолей, с одной стороны должны быть эффекторным звеном нескольких сигнальных каскадов, с другой стороны - обладать плейотропностью действия. С этой точки зрения наиболее перспективными кандидатами на роль центральных белков -переключателей в опухолевых В-лимфоцитах представляются циклины группы D и циклины группы Е, чьей канонической функцией является стимуляция выхода клетки из фазы G1 и переход ее в фазу синтеза ДНК.

Для вхождения клетки в пролиферативный цикл необходим митогенный сигнал, в частности, связывание ростовых факторов (EGF, FGF, PDGF, IGF и т.п.) с рецептором и последующая активация ERK1/ERK2 каскада митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК-каскад). Активируемые этим каскадом транскрипционные факторы Мус (2) и АР-1

(3) запускают синтез циклинов Dl, D2 и D3, которые образуют комплексы с CDK4 и CDK6

(4), обусловливая выход клетки из фазы G1 (5). Синтез циклинов D также регулируется FAK киназой и/или Rho семейством ГТФаз (6), (7), а активация PI3K пути ингибирует GSK3beta-3aBHCHMyio деградацию циклинов D (8). Переход из поздней G1 фазы в S-фазу

контролируется циклин-зависимой киназой СОК.2 и циклинами Е1 и Е2. Для начала синтетической фазы также необходимы белки семейства Е2Р, активность которых ингибируется взаимодействием с опухолевыми супрессорами Шэ, р107 и р130. Комплекс СЭК4/6-циклин Э частично фосфорилирует Шэ-белки, что приводит к диссоциации гистондеацителазы из комплекса НОАС-И.Ь-Е2Р и позволяет Е2Р запустить синтез циклина Е. Комплекс циклина Е и СЭК2 дополнительно фосфорилирует ЛЬ, и тот отсоединяется от Е2Р, снимая его ингибирование (9), (10). Гиперэкспрессия циклинов группы Э была показана методами иммуногистохимии, проточной цитофлуориметрии и

иммуноферментного анализа в некоторых лимфоидных опухолях, в частности, в опухолевых лимфоцитах фолликулярной лимфомы (11), диффузной В - крупноклеточной лимфомы (12), в части опухолевых лимфоцитов В-клеточного хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) (13). Лимфома из клеток мантийной зоны была выделена из группы В-ХЛЛ по наличию транслокации 1(11;14)(ц13;я32), перемещающей ген циклина Э1 под промотер гена тяжелой цепи иммуноглобулинов, поэтому в клетках ЛКМЗ наблюдается наиболее высокий уровень экспрессии циклина (14). Несмотря на то, что циклин Е является основным нижележащим эффекторным звеном циклина О (15), сведения о его экспрессии в опухолях иммунной системы носят весьма разрозненный и несистематический характер. До недавнего времени оценка уровня экспрессии циклинов проводилась исключительно качественными методами, обладающими относительно низкой чувствительностью, возможно, что использование более чувствительных методов детекции с определением уровня мРНК вместо количества белка позволит выявить не одиночные, а систематические изменения уровня экспрессии циклинов фазы С1 в опухолевых лимфоцитах В-зрелоклеточных лимфом. Таким образом, целыо данной работы было оценить уровень экспрессии мРНК циклинов группы Э и циклина Е в нормальной и опухолевой лимфоидной ткани методом ПЦР в реальном времени. ' Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить коллекцию образцов кДНК из зрелоклеточных опухолей и нормальной лимфоидной ткани.

2. Определить оптимальные референтные гены для нормализации данных ПЦР в реальном времени.

3. Определить уровень экспрессии мРНК генов циклинов 01, 02 и ОЗ в нормальных и опухолевых лимфоцитах.

4. Определить уровень экспрессии мРНК гена циклина Е1 в нормальных и опухолевых лимфоцитах.

Научная новизна и практическая ценность работы

В данной работе впервые была проанализирована выборка образцов кДНК из свежезамороженных образцов ткани от 165 пациентов с известным иммунофенотипом опухолевых клеток.

На этой выборке было показано, что для корректной нормализации данных ПЦР в реальном времени в лимфоидной ткани достаточно трех стабильно экспрессирующихся генов. Генами, наиболее стабильно экспрессирующимися в нормальных и опухолевых лимфоцитах, являются гены 1ШС и В-АСПЫ.

Использование корректной стратегии нормализации и наличие трех стабильно экспрессирующихся референтных генов впервые позволило детектировать повышенный уровень экспрессии мРНК циклинов 01 и Е в опухолевых лимфоцитах по сравнению с нормальной лимфоидной тканью. Кроме этого, впервые было показано, что по уровню экспрессии мРНК циклина 01 возможно достоверно отличить между собой группы образцов зрелоклеточных лимфом с различными нозологиями. В работе также впервые была показана обратная зависимость для количества мРНК циклинов 01 и 02 (в группе образцов с нозологией «хронический В-клеточный лимфолейкоз) и для циклина 01 и Е (в группе образцов с нозологией «лимфома из клеток мантийной зоны»).

Полученные результаты могут быть использованы в дифференциальной диагностике лимфоидных опухолей, данные об экспрессии циклинов 01 фазы в лимфоидной ткани могут быть использованы в курсах лекций по гематологии, частной гистологии и клеточной биологии.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Введение

В настоящее время под клеточным циклом понимают интервал между завершением митоза в исходной клетке и завершением митоза в ее дочерней клетке (16). Клеточный цикл делится на интерфазу, в которой происходит репликация генетического материала клетки, и митоз, в котором происходит ее деление.

Прохождение клетки по клеточному циклу регулируется особым семейством белков, называемых циклинами. После активации циклины формируют комплексы с циклин-зависимыми киназами (СОК), образуя активные голоферменты, которые фосфорилируют белки-мишени, необходимые для прохождения клетки по клеточному циклу. После открытия сс!с 2 (циклин-зависимой киназы 1) у дрожжей, у человека были открыты 13 СОК и 25 белков-гомологов циклинов.

Оказалось, что действие многих протоонкогенов и опухолевых супрессоров направлено на регуляцию тех или иных комплексов циклин - Сёк. Белковые продукты большинства из них повышают активность циклинзависимых киназ, ответственных за начальные этапы пресинтетической фазы в1 (комплексы циклинов 01 - 03 с Сс1к4 или Сс1к6 в зависимости от типа клеток) и переход из 01 в фазу синтеза ДНК (циклин Е - Сёк2). Кроме того, некоторые протоонкогены и опухолевые супрессоры регулируют активность комплексов циклин А - Сс1к2 (требуется для репликации ДНК) и циклин В - Сс1к1 (другое название Сс1к1 - Сс1с2, необходима для перехода из в2 в митоз).

Из всех циклинов наиболее изученными являются циклины группы О благодаря своей роли в патогенезе различных опухолей. Основным субстратом комплексов циклин О - Сс1к4 и циклин О - Сс1к6 является опухолевый супрессор рШэ и ЯЬ-подобные белки р105 и р130. рШэ и его гомологи дефосфорилированы в неделящихся клетках и в пролиферирующих клетках, находящихся в ранней в 1-фазе (17). В таком состоянии они связывают и

блокируют транскрипционные комплексы Е2Р - ОР (Е2Р-1,-2, -3, -4, -5 и ОР-1, -2, -3), регулирующие активность ряда генов, продукты которых необходимы для начала и прохождения Б-фазы. В частности, Е2Р-ОР регулируют экспрессию генов тимидинкиназы, дигидрофолатредуктазы, циклина Е, циклина А, РСЫА, ДНК-полимеразы а и др.(18). Связывание белков семейства Е2Р с рЯЬ ингибирует их транскрипционную активность. При митогенных сигналах, вызываемых ростовыми факторами, рЯЬ в середине 01-фазы фосфорилируется комплексом циклин О - Сс1к4 (или циклин О - Cdk6), что вызывает высвобождение транскрипционных факторов Е2Р - ОР из комплекса с рЯЬ и их активацию ((17), рис.1). Максимальный уровень экспрессии циклина 01 наблюдается в фазе в1, также он присутствует в фазах в2 и М. Ингибирование циклина 01 в Б-фазе необходимо для ее успешного завершения (19).

Nature Reviews | Molecular Cell Biology

Рисунок 1. Схема функционирования циклинов Э и Е в клеточном цикле (по МШпасЫ е(а1., 1998(17)).

В группу циклинов О входят три белка, называемые циклин 01, 02 и ОЗ, из которых наиболее изученным является циклин Э1. 1.2. Биология циклинов

1.2.1 Функции циклина D1

В настоящее время общепринятой является модель, в которой циклин D1 через связывание с CDK и деацетилазами гистонов выступает основным интегратором внеклеточных сигналов, обеспечивая прохождение клетки из ранней G1 в среднюю G1 фазу. В результате его активности изменяется тонкая структура хроматина, и активируются гены, которые связаны с пролиферацией и дифференцировкой клетки.

Экспрессия циклина D1 повышается при действии на клетки митогенных стимулов (20), факторов роста, таких как эпидермальный фактор роста (EGF) и фактора роста фибробластов (21), аминокислот (22), гормонов, включая андрогены и гастроинтестинальные гормоны (23), (24).

Циклин D1 является регуляторной субъединицей голоферментов, которые фосфорилируют и инактивируют белок ретинобластомы (pRb). pRb работает как привратник, регулирующий выход клетки из фазы G1. Считается, что функция pRb в клетке - подавление экспрессии генов, активных в S-фазе клеточного цикла, через активное связывание факторов транскрипции E2F. pRb взаимодействует с деацетилазами гистонов и белками, изменяющими тонкую структуру хроматина (25), (26). При фосфорилировании С— конца белка RB1 комплексом СОК4/6-циклин D1 происходит его необратимая инактивация, уход гистоновых ацетилаз, освобождение связанных с ним транскрипционных факторов E2F, которые отвечают за формирование комплексов cdk2/cyclin Е и вступление клетки в S-фазу клеточного цикла (27), (28).

Считается, что циклин D1 подавляет ингибиторы CDK-киназ, к которым относятся p27kipI и p27Cipl, что необходимо для эффективной активации комплексов, содержащих CDK2 (29). Связывание Cip/Kip ингибиторов также способствует стабилизации связи между циклином D и CDK4/6 (30).

Expert Reviews in Molecular Medicine © 2008 Cambridge University Press

Рисунок 2. Ингибиторы р27 и р21 блокируют работу циклинов фазы G1 и циклин-зависимых киназ.

Кроме этого, к настоящему моменту накопилось довольно большое количество данных об альтернативных функциях циклина D1, не связанных с выходом клетки из фазы G 1(31).

В частности, циклин D1 является кофактором рецептора эстрогена, причем активация ERalpha с помощью циклина не подавляется антиэстрогенами (32). В некоторых опухолевых тканях (опухоли яичников, молочной железы и аденкокарциномы) циклин D1 ингибирует лиганд-зависимую активность рецептора андрогена, причем механизм этого подавления включает действие гистоновых ацетилаз (33). Кроме этого, циклин D1 регулирует дифференцировку адипоцитов (34) и ингибирует раннюю миогенную дифференцировку, блокируя связывание MyoD с CDK4 (35).

Учитывая вышесказанное, можно заключить, что циклин D1 является одним из ключевых регуляторов деления клетки в ответ на митогенные стимулы, регулирует

транскрипцию множества генов и играет роль в дифференцировке и метаболизме некоторых тканей.

1.2.2. Строение гена циклина D1

Ген циклина Dl у человека изначально был клонирован как транслокация в клетках паратиреоидной аденомы (36). Параллельно был идентифицирован мышиный гомолог циклина D1, найденный как ген макрофагов, отвечающий за пролиферацию в ответ на действие КСФ-1. Ген циклина Dl (CCND1) расположен в длинном плече 11 хромосомы в локусе 11 q 13 и имеет 5 экзонов, которые могут подвергаться альтернативному сплайсингу. Распространенный точечный полиморфизм A/G (A870G) в четвертом интроне гена циклина D1 приводит к появлению двух вариантов мРНК гена циклина (изоформы а и Ь). В изоформе Ь, проходящей альтернативный сплайсинг, последние 55 аминокислот С-конца заменены на более короткую последовательность, кодируемую интроном 4(37). На 3'-конце изоформы циклина Dla находится длинный нетранслируемый регион (З'-UTR), содержащий мРНК-дестабилизирующие элементы, что снижает время полураспада этой изоформы до 30 минут (38). Кроме того, именно с этим участком могут связываться микроРНК miR15/16, которые подавляют трансляцию белка циклина Dl(39), (40). Укороченные транскрипты циклина Dla с З'-UTR последовательностью часто встречаются в клетках опухолей и являются индикаторами неблагоприятного прогноза (38). Укороченные варианты гена циклина D1 выполняют те же функции, что и длинные транскрипты, однако благодаря укороченному концевому участку могут накапливаться в клетке, стимулируя ее прохождение по клеточному циклу (38).

1.2.3. Контроль транскрипции гена циклина D1

В ^трансформированных клетках контроль экспрессии циклина D1 осуществляется через сложный каскад сигналов от внеклеточного матрикса и растворимых факторов роста(41). Этот контроль может быть утерян в процессе трансформации клетки, поэтому довольно часто можно наблюдать гиперэкспрессию циклина D в различных видах опухолей, таких,

как опухоли ткани легких, печени, молочной железы, мозга и иммунной системы(42), (43), (44), (45), (46). С другой стороны, подавление экспрессии циклина D1 является маркером дифференцировки клеток(47),(48),(49). С момента открытия промотора гена циклина D 1(50),(51) было открыто множество транскрипционных факторов, которые регулируют этот промотор или, по крайней мере, связываются с ним(31).

Наиболее изученными активаторами транскрипции гена циклина D1 безусловно являются факторы роста. Митоген-активируемые протеинкиназы (МАРК) играют ведущую роль в активации митотических процессов, и канонический путь Ras-Raf-MEK в сочетании с внеклеточной киназой Erk могут стимулировать экспрессию транскрипционных факторов АР-1, которые включают в себя семейства транскрипционных факторов Fos, Jun и ATF (activating transcription factor)(52),(53). Промотор человеческого гена циклина D1 содержит консенсусный сайт связывания АР-1, который регулируется как белком Jun, так и белком Fos (3),(54). Jun также может формировать комплекс с ATF2 для регуляции цАМФ-чувствителыюго элемента (CRE) (55),(56). ATF2, в свою очередь, формирует комплекс с CRE-связывающим белком и стимулирует активность промотора циклина D1 (57). ATF-зависимая индукция промо�