Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ассоциация полиморфных вариантов генов фолатного цикла с предрасположенностью к развитию онкологических заболеваний и репродуктивных патологий у жителей Западно-Сибирского региона России

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ассоциация полиморфных вариантов генов фолатного цикла с предрасположенностью к развитию онкологических заболеваний и репродуктивных патологий у жителей Западно-Сибирского региона России"

На правах рукописи

ШАДРИНА АЛЕКСАНДРА СЕРГЕЕВНА

АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ ФОЛАТНОГО ЦИКЛА С ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬЮ К РАЗВИТИЮ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РЕПРОДУКТИВНЫХ ПАТОЛОГИЙ У ЖИТЕЛЕЙ ЗАПАДНОСИБИРСКОГО РЕГИОНА РОССИИ

03.01.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005545632

Новосибирск - 2013

005545632

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН

Научный руководитель:

к.б.н. Боярских Ульяна Александровна

Официальные оппоненты:

Рыкова Елена Юрьевна, д.б.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, с.н.с.

Юдин Николай Серафимович, к.б.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, с.н.с

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «20» декабря 2013 г. в «10:00» часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан «/5'» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.х.н., доцент

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Астуальность проблемы. Фолатный цикл является важнейшим звеном метаболизма клетки, функция которого заключается в переносе одноуглеродных фрагментов от одних биологических соединений к другим. Это обуславливает его участие в ряде клеточных процессов, которые затрагивают самые разнообразные стороны жизнедеятельности клетки: синтез нуклеотидов, некоторых липидов и аминокислот, креатина и нейромедиаторов, конверсию гомоцистеина в метионин, детоксикацию ксенобиотиков, метаболизм гормонов, метилирование хроматина и т. д. (Beaudin et al., 2007). Последнее играет важную роль в поддержании структуры и целостности генома и в эпигенетической регуляции экспрессии генов.

Нарушения в системе метаболизма фолатов приводят к появлению разрывов в ДНК, встройке в ДНК урацила, снижению эффективности репарации, повышению уровня гомоцистеина и аномальному метилированию ДНК (Fenech et al., 2001; Duthie et al., 2013; Wei et al., 2003; Jacob et al., 1998). Последствиями таких нарушений могут являться повреждения генов, ответственных за контроль клеточного цикла, дифференцировку, апоптоз, миграцию и др., в том числе ткане- и стадиоспецифичных генов, или их аномальная экспрессия; снижение пролиферативной способности клеток; нарушение правильного расхождения хромосом, а также эффекты, связанные с токсическим действием гомоцистеина (модификация белков и нарушение их функциональных свойств и фолдинга, индукция оксидативного стресса и апоптоза) (Болдырев, 2009). Всё это может лежать в основе развития ряда заболеваний, в том числе онкологических заболеваний и патологий репродукции, таких как мужское бесплодие и врождённые пороки развития плода.

Во многих работах было показано, что потребление фолата снижает риск различных видов неоплазий и врожденных аномалий развития, а также улучшает показатели спермограммы у мужчин (Kennedy et al., 2011; Larsson et a!., 2006, 2007; Lim et al., 2005; Blencowe et al., 2010; Bentivoglio et al., 1993). Таким образом, фолатный цикл, по всей видимости, имеет важное значение в этиологии данных заболеваний. В связи с этим, представляет интерес анализ влияния генетического полиморфизма ферментов фолатного обмена на риск их развития у пациента. Носительство аллелей этих генов, изменяющих функциональные характеристики, стабильность или количество соответствующих ферментов, может нарушать баланс в метаболизме одноуглеродных групп и лежать в основе генетической предрасположенности к данным патологиям. На сегодняшний день идентифицирован ряд полиморфных локусов (нуклеотидных замен, небольших делеций или инсерций) в генах фолатного цикла, которые могут иметь функциональный эффект (Beaudin et al., 2007; Fredriksen et al., 2007;

Feng et al., 2011). Для некоторых из них этот эффект был продемонстрирован в экспериментах in vitro и in vivo (Christensen et al., 1997; Weisberg et al., 1998; Chango et al., 2000). Тем не менее, при исследовании их ассоциации с риском вышеуказанных заболеваний в разных этнических группах полученные результаты часто противоречили друг другу и не позволяли однозначно определить их роль в этиологии изучаемых болезней. Предствляется весьма вероятным, что эффекты генетических локусов варьируют от популяции к популяции. Причинами этого могут быть как различия в действии факторов окружающей среды и образа жизни, специфичные для разных этнических групп, так и разница в частотах аллельных вариантов и сцепление с разными функционально значимыми генетическими локусами. В России на настоящий момент уже проведено несколько исследований, посвященных анализу влияния ряда полиморфных локусов в генах фолатного цикла на риск рака молочной железы, лейкемии и лимфомы и врожденных аномалий развития (Назаренко М.С. с соавт, 2010; Перельмутер В.М. с соавт, 2008; Коваль М.М. с соавт, 2011; Панкова Е.Е. с соавт, 2009; Gra et al., 2008). Представляется целесообразным подтвердить полученные результаты на независимой выборке, а также исследовать ассоцацию ранее не изученных полиморфных локусов в генах данной системы.

Кроме того, для ряда полиморфных локусов остаются значительные пробелы в понимании их функциональных последствий (таких, как влияние на уровень гомоцистеина и других метаболитов и степень метилирования ДНК). В частности, для нуклеотидной замены A2756G (rsl 805087) в гене MTR, кодирующем фермент метионин-синтазу, была обнаружена связь с уровнем гомоцистеина в ряде работ (Harmon et al., 1999; Tsai et al., 2000; Chen et al., 2001; Fredriksen et al., 2007; Kim et al., 2007), но не исследовано влияние на уровень метилирования генома

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение ассоциации полиморфных локусов в генах фолатного цикла с риском онкологических заболеваний и патологий репродукции у жителей Западной Сибири, а также анализ влияния полиморфизма генов фолатного цикла на уровень метилирования ДНК.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать и оптимизовать системы определения генотипов полиморфных локусов в генах фолатного цикла;

2. Выполнить анализ ассоциации аллелей и генотипов полиморфных локусов в генах фолатного цикла с раком молочной железы, неходжкинскими злокачественными лимфомами, врожденными пороками развития плода и идиопатическим мужским бесплодием.

3. Сравнить частоты аллелей изучаемых локусов у жителей Западной Сибири с частотами в популяциях европеоидного и монголоидного происхождения;

4. Выполнить мета-анализ, объединив результаты настоящего исследования с результатами ранее опубликованных работ;

5. Провести анализ влияния генотипов изучаемых полиморфных локусов в генах фолатного цикла на уровень метилирования генома.

Научная новизна. Впервые в мире была исследована ассоциация локуса CBS 844ins68 с риском рака молочной железы, локуса MTHFD1 G1958A - с риском неходжкинских злокачественных лимфом и локусов ВНМТ1 rs 16876512, СUBN rsl907362 и ALDH1L1 rs4646750 - с риском врожденных пороков развития плода. Впервые в популяции русского этнического происхождения была проанализирована ассоциация локусов MTRR A66G, SHMT1 С1420Т и CBS 844ins68 с риском рака молочной железы; локусов MTR A2756G, SHMT1 С1420Т, CBS 844ins68, MTHFD1 G1958A - с риском неходжкинских злокачественных лимфом; локусов SHMT1 С1420Т, CBS 844ins68, MTHFD1 G1958A, ВНМТ1 G742A, ВНМТ1 rsl6876512, CUBN rs 1907362 и ALDHILl rs4646750 - с риском врожденных пороков развития плода и локусов MTHFR С677Т, MTHFR А1298С, SHMT1 С1420Т, MTR A2756G, MTRR A66G, CBS 844ins68 и MTHFD1 G1958A - с риском идиопатического мужского бесплодия.

Впервые было показано влияние локуса MTR A2756G на степень метилирования ДНК. Кроме того, была подтверждена ассоциация локуса MTHFR С677Т со снижением уровня метилирования генома, выявленная в четырех ранее опубликованных исследованиях (Stern et al., 2000; Paz et al., 2002; Friso et al., 2002; Castro et al., 2004).

Теоретическая и практическая значимость. Настоящая работа вносит вклад в изучение функциональной значимости полиморфизма генов фолатного цикла, а также в понимание молекулярно-генетических основ развития рака молочной железы, неходжкинских злокачественных лимфом, врожденных аномалий развития плода и нарушений сперматогенеза у мужчин.

В перспективе, установление роли генетического полиморфизма ферментов фолатного цикла в этиологии этих заболеваний будет способствовать внедрению персонализированного подхода к их профилактике и лечению.

Данные о частотах аллелей и генотипов полиморфных локусов в генах фолатного цикла у жителей Западной Сибири, полученные в настоящем исследовании, вносят вклад в изучение генетических особенностей жителей данного региона.

Апробация результатов. По материалам диссертации опубликовано 13 статей в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных изданий и журналов, рекомендуемых Высшей аттестационной комиссией. Обзор литературы опубликован в виде монографии (Вайнер, А. С., Воронина,

Е. Н., Филипенко, М. JL «Фолатный цикл в организме человека». Издательство: LAP LAMBERT Academic Publishing (2013-07-11), ISBN-13: 978-3-659-42258-4). Результаты работы были представлены на научных конференциях: XLVI, XLVII, XLVIII и XLIX Международные научные студенческие конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008, 2009, 2010, 2011), Междунарнодная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов - 2009» (Москва, 2009), IV и V региональные конференции молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н. В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2009, 2010), Научная конференция «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, 2009), I Всероссийский конгресс «Генетика опухолей кроветворной системы» (Ростов-на-Дону, 2010), Международная конференция «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2010), II научно-практическая конференция «Новые генетические технологии в медицине» (Москва, 2010), XIV Российский онкологический конгресс (Москва, 2010), IV Международная школа молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (Звенигород, 2010), V Всероссийская научно-практическая конференция «Фундаментальные и прикладные исследования в гематологии» (Новосибирск, 2010), II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011), II Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медтицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011), Первая всероссийская научная конференция молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012), V Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013).

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных, заключения, выводов и списка литературы (621 наименование). Работа изложена на 228 страницах, содержит 28 таблиц и иллюстрирована 22 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Разработка систем определения генотипов полиморфных локусов в генах фолатного цикла.

Выбор полиморфных локусов для анализа ассоциации с изучаемыми патологиями основывался на данных литературы и информации о локализации локусов в геноме, их частотах и влиянии на замены аминокислот. Критерием для выбора служила функциональная значимость

локуса (влияние на активность фермента, его стабильность, количество и др.), доказанная в предыдущих исследованиях или предполагаемая в связи влиянием на уровень метаболитов в плазме и клетках и локализацией нуклеотидной замены в гене. Для каждого локуса был выбран оптимальный способ генотипирования в зависимости от нуклеотидного окружения полиморфного участка ДНК. При разработке систем определения генотипов предпочтение отдавали методу ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов как наиболее быстрому и простому в исполнении. Этот метод применяли для определения генотипов локусов MTHFR С677Т (rsl 801133), MTHFR А1298С (rsl 801131), MTR A2756G (rsl805087), MTRR A66G (rsl801394), SHMT1 С1420T (rsl979277), BHMT1 G742A (rs3733890) и ALDH1L1 rs4646750 (пример: рис. 1). Генотипы локусов ВНМТ1 rsl6876512 и CUBN rsl907362 определяли методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени (пример: рис. 2), локусов CBS 844ins68 (rs 72058776) и MTHFD1 G1958A (rs2236225) - методом мультиплексной ПЦР с последующим гидролизом амплификационных фрагментов эндонуклеазой рестрикции и анализом получившихся длин в 8% полиакриламидном геле (рис. 3).

Рисунок 1. Кривые накопления флюоресценции для трех генотипов локуса MTR A2756G и результаты кластеризации образцов в группы на основании интенсивности флюоресценции на конечном цикле ПЦР. а) генотип АА, б) генотип AG, в) генотип GG, г) кластеризация образцов. FAM (fluorescein) - флюоресцеин, R6G (rhodamine 6G) - родамин 6G, RFU (relative fluorescent units)- относительные единицы флюоресценции._

Рисунок 2. Кинетические кривые накопления продуктов амплификации для трех генотипов полиморфного локуса rsl6876512 в гене ВНМТ1, а также графики производных кривых плавления, а) генотип GG, б) генотип GA, в) генотип АА. RFU (relative fluorescent units)- относительные единицы флюоресценции._

-{dRFU)/dT

160

-(dRFU)/dt

специфический

специфический пик ............

-(dRFU)/dT

328 п.н _

404 п н _WëèÊË m__вариант 844ins68 гена

» CBS (27 \ п.н.)

<— вариант 844del68 гена

242 п.н —► ........4P"»1 I Ш; CBS (339 п.н.)

190 п.н ► вариант 1958А гена

157 п.н_^ 1мннМнцЙнм# <_ MTHFD1 (149 п.н.)

147 п.н—► щшт*. м_ вариант! 958G гена

^^ MTHFD1 (\29 п.н.)

Рисунок 3. Определение генотипов полиморфных локусов MTHFD1 G1958A и CBS 844ins68. Элекрофореграмма продуктов гидролиза амплификацонных фрагментов эндонуклеазой рестрикции Bmel81. М - маркёр молекулярных длин pBlSK/MspI, 1-5 - ПЦР-продукты, обработанные рестриктазой Вте181._

Для контроля качества всех разработанных систем генотипирования были отобраны по 3 образца ДНК с разными генотипами по каждому локусу и подтвержена достоверность генотипирования методом секвенирования. Дополнительным признаком достоверности генотипирования было выполнение закона Харди-Вайнберга в тестируемых выборках.

2. Сравнение частот встречаемости аллелей у жителей Западной Сибири с частотами в популяциях европеоидов и монголоидов.

Частоты аллелей и генотипов исследуемых локусов были определены в выборке из 1740 жителей Западной Сибири (табл. 1). Распреление частот для всех локусов соответствовало закону Харди-Вайнберга.

Таблица 1. Сравнение частот встречаемости аллелей исследуемых локусов с частотами в популяциях монголоидного и европеоидного происхождения.

Выборка MAF* | р MAF* P MAF* P

MTHFR 677Т A-fTHFDi 1958A ( '/¡S 844ins68

Западная Сибирь 0.29 0.47 0.07

Монголоиды 0.39 2.7*10"" 0.24 1.7*10"48 0.02 0.001

Европеоиды 0.34 1.5* 10"6 0.45 0.02 0.09 3.4* 10"7

MTHFR I298C A771/7 7 742 A 66G

Западная Сибирь 0.32 0.28 0.55

Монголоиды 0.18 1.6*10"33 0.29 0.60 0.28 1.1*10"78

Европеоиды 0.30 0.09 0.28 0.86 0.56 0.39

.S7/A/77 142ÛT ll/hUTI rs 16876512-A С UBN FS 1907362- A

Западная Сибирь 0.32 0.10 0.04

Монголоиды 0.14 8.2*10" 0.00 0.002 0.03 N/A**

Европеоиды 0.34 0.06 0.13 0.14 0.07 N/A**

MTR 2756G ALDH1LI rs4646750-G

Западная Сибирь 0.20 0.05

Монголоиды 0.14 6.1*10"17 0.01 0.17

Европеоиды 0.20 0.91 0.06 0.65

* - частота редкого аллеля

** - недостаточно данных для расчета

Частоты аллелей у жителей Западной Сибири сравнили с частотами в популяциях европеоидов и монголоидов (взяты из данных литературы) с помощью критерия у_2 (табл. 1). Для локусов MTHFR А1298С, MTR A2756G, MTRR A66G, SHMT1 С1420Т, ВНМТ1 rsl6876512 и MTHFD1 G1958A были показаны значимые различия при сравнении с частотами у монголоидов и незначимые при сравнении с популяциями европеоидов, что является ожидаемым результатом, поскольку русские генетически ближе к европеоидной группе. Тем не менее, частоты локусов MTHFR С677Т и CBS 844ins68 отличались значимо как от европеоидов, так и от монголоидов. Частоты локусов ВНМТ1 G742A и ALDH1L1 rs4646750 не отличались значимо ни от одной из групп.

3. Исследование ассоциации полиморфизма генов фолатного цикла с риском рака молочной железы.

Частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов в генах фолатного цикла определили в выборке из 850 женщин (возраст от 41 до 83 лет, средний возраст - 55.2 ± 9.0 лет) с гистологически верифицированным диагнозом рак молочной железы (РМЖ) и в контрольной группе из 810 женщин (возраст от 19 до 89 лет, средний возраст - 60.2 ±16.1 лет), не имеющих онкологических заболеваний. Отдельно была проанализирована подгруппа из 162 женщин, имеющих высокий уровень рецептора эстрогена в опухолевой ткани. Образцы венозной крови пациенток, из которых была выделена ДНК, были предоставлены Алтайским филиалом Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН. Все женщины принадлежали к европеоидной расе русской этнической группы и проживали на территории Алтайского края РФ.

И в контрольной, и экспериментальных выборках выполнялся закон Харди-Вайнберга для всех локусов (точный критерий). Ассоциацию полиморфных локусов с риском заболевания анализировали методом логистической регрессии. Различия считали статистически значимыми при р < 0.05. Вычисления проводили в пакете статистики GenABEL для языка R. Ни один из проанализированных локусов не показал статистически значимой ассоциации с риском РМЖ, в том числе в проанализированной подгруппе. Чтобы увеличить статистическую мощность исследования, а также оценить суммарный эффект, для наиболее изученных полиморфных локусов MTHFR С677Т, MTHFR А1298С, SHMT1 С1420Т, MTR A2756G и MTRR A66G был выполен мета-анализ. В мета-анализе использовали данные, полученные в настоящей работе, а также результаты ранее опубликованных исследований, удовлетворяющих ряду критериев (в том числе, выполнение закона Харди-Вайнберга в контрольных группах). Мета-анализ для локуса MTHFR С677Т включал данные из 17 исследований, для локуса MTHFR А1298С - из 10 исследований, для локуса SHMT1 С1420Т - из 4 исследований, для локуса MTR A2756G - из 12 исследований и для локуса MTRR A66G - из 7 исследований. Для расчёта обобщённого значения OR (отношения шансов) использовалась модель фиксированных эффектов (Mantel-Haenszel method). Все вычисления выполнялись при помощи пакета статистики GenABEL, rmeta. Мета-анализ не выявил значимой ассоциации с РМЖ ни для одного из исследуемых локусов (табл. 2). Анализ гетерогенности данных, включенных в мета-анализ (х2-тест, уровень значимости р = 0.1) выявил статистически значимую гетерогенность результатов отдельных исследований для локуса SHMT1 С1420Т.

4. Исследование ассоциации полиморфизма генов фолатного цикла с риском неходжкинских злокачественных лимфом.

Группу больных неходжкинскими злокачественными лимфомами (НХЗЛ) составили 146 пациентов гематологического центра МУЗГКБ №2 города Новосибирска. Группа состояла из 73 мужчин и 73 женщин (возраст от 18 до 77 лет, средний возраст 52.4 ± 15.0 лет). Из них 80 человек имели агрессивные, 66 - индолентные лимфомы. Контрольная группа состояла из 540 жителей г. Новосибирска (доноры крови, 200 женщин и 340 мужчин, возраст от 18 до 58 лет, средний возраст - 33.0 ±11.0 лет). Отдельно были проанализированы подгруппы мужчин, женщин, а также пациентов с агрессивными и индолетными лимофмами. Члены контрольной и экспериментальной выборок принадлежали к европеоидной расе русской этнической группы. ДНК была выделена из венозной крови и буккального эпителия.

Таблица 2. Мета-анализ, включающий опубликованные данные об ассоциации Б ИР с риском РМЖ, и данные, полученные в нашей работе. О К -отношение шансов (редкий аллель уб. частый аллель); СЛ. - 95% доверительный интервал; р - уровень статистической значимости._

OR

СЛ.

Больные/ контроль

I етерогеннос гь. />

МГЯ^Д С677Т

1.019

0.975-1.064

0.40

8849/9582

0.17

MTHFR А1298С

1.012

0.959-1.069

0.66

6842/7032

0.95

SHMT1 С1420Т

0.970

0.910-1.035

0.36

4204/4699

0.03

МТЯ А2756С

1.000

0.942-1.061

1.00

7514/8636

0.52

MTRR A66G*

1.017

0.966-1.070

0.53

6413/7055

0.25

* - СЖ и СЛ. рассчитаны для более частого аллеля МТЯЯ 66й

Распределение генотипов в контрольной группе соответствовало закону Харди-Вайнберга для всех локусов (точный критерий). Ассоциацию полиморфных локусов с риском лимфом анализировали методом логистической регрессии (с поправкой на разницу в возрасте между группами). Различия считали статистически значимыми при р < 0.05. Вычисления проводили в пакете статистики СепАВЕЬ для языка Я. Для локуса МТНРО1 С1958А была показана статистически значимая ассоциация со снижением риска НХЗЛ (аллель в: (Ж = 1.382, р = 0.05; генотип вА: СЖ = 2.316,р = 0.01; генотип вв: СЖ = 2.153,р- 0.03). При делении выборки на подгруппы ассоциация этого локуса сохранила значимость в подгруппе женщин (аллель в: СЖ = 2.043, р = 0.009; генотип вА: СЖ = 2.433, р = 0.09;

генотип GG: OR = 4.360, p = 0.009) и пациентов с агрессивными лимфомами (аллель G: OR = 1.664, р = 0.01; генотип GA: OR = 2.549, р = 0.03; генотип GG: OR = 3.266, р = 0.009). В последней подгруппе была также выявлена ассоциация локуса MTRR A66G (аллель MTRR 66G: OR = 0.654, р = 0.04; генотип AG: OR = 0.641, р = 0.23, генотип MTRR 66GG: OR = 0.427, p = 0.04). Остальные локусы не показали ассоциации с HX3JI, в том числе в подгруппах.

Для наиболее изученных локусов MTHFR С677Т, MTHFR А1298С, SHMT1 С1420Т, MTR A2756G и MTRR A66G был выполнен мета-анализ. Для локуса MTHFR С677Т использовались данные из 17 работ, для MTHFR А1298С - из 13 работ, для MTRR A66G - из 4 работ, для MTR A2756G - из 9 работ и для SHMT1 С1420Т - из 8 работ. Для расчёта обобщённого значения OR использовалась модель фиксированных эффектов. Вычисления проводились в пакете статистики GenABEL, rmeta. Мета-анализ выявил ассоциацию локуса MTR A2756G со снижением риска HX3J1 (аллель MTR 2756G: OR = 0.902, р = 0.03, табл. 3). Для остальных локусов значимой ассоциации показано не было. Анализ гетерогенности данных, включенных в мета-анализ (Х2-тест, уровень значимости р = 0.1) вьивил статистически значимую гетерогенность результатов отдельных исследований для всех проанализированных локусов, за исключением SHMT1 С1420Т и MTRR A66G.

Таблица 3. Мета-анализ, включающий опубликованные данные об ассоциации SNP с риском HX3J1, и данные, полученные в нашей работе. OR — отношение шансов (редкий аллель vs. частый аллель); C.I. - 95% доверительный интервал; р - уровень статистической значимости._

¡11

СМ.

Больные/ контроль

Гетерогенность, р

MTHFR С677Т

1.003

0.945-1.065

0.92

4176/7585

0.002

MTHFR А1298С

1.028

0.962-1.099

0.42

3648/6331

0.01

SHMTl С1420Т

1.051

0.973-1.136

0.21

2884/4054

0.10

MTR A2756G

0.902

0.821-0.991

0.03

2602/4756

0.001

MTRR A66G

0.967

0.859-1.088

0.58

894/2625

0.12

* - (Ж и С.1. рассчитаны для более частого аллеля МТШ 66С

5. Исследование ассоциации полиморфизма генов фолатного цикла с риском врожденных пороков развития плода.

Экспериментальная выборка состояла из 280 женщин, имеющих ребёнка с врожденными пороками развития (ВПР) в анамнезе (возраст от 19 до 42 лет, средний возраст 25.8 ± 5.2 лет). ВПР были диагностированы антенатально

10

методом ультразвукового исследования в ходе планового мониторинга, проводимого в Областном перинатальном центре города Кемерово. Критериями исключения при формировании выборки были: ВПР в сочетании с анеуплоидией, диабет или краснуха у матери, применение потенциально тератогенных лекарств во время беременности. Три основные подгруппы — подгруппы женщин, имеющих ребенка с ВПР центральной нервной системы (68 человек), ВПР мочевыделительной системы (55 человек) и ВПР системы кровообращения (ВПР СК, 51 человек) - были проанализированы отдельно. Контрольная группа состояла из 390 женщин без ВПР плода в анамнезе, имеющих 1 и более здоровых детей (возраст от 19 до 41 года, средний возраст 25.3±5.5 лет). Все женщины проживали на территории Кемеровской области и принадлежали к русской этнической группе. ДНК была выделена из венозной крови.

Для всех полиморфных локусов выполнялся закон Харди-Вайнберга в группе контроля (точный критерий). Ассоциацию с риском ВПР анализировали методом логистической регрессии. Различия считали статистически значимыми при р < 0.05. Вычисления проводили в пакете статистики GenABEL для языка R. Была продемонстирована ассоциация локуса MTHFR С677Т с риском врожденных аномалий развития (аллель Т: OR = 1.28,/7 = 0.05, генотип СТ: OR =1.09, р = 0.64, генотип ТТ: OR=1.97, р = 0.02). Тем не менее, значимость ассоциации не сохранилась ни в одной из проанализированных подгрупп. Кроме того, была показана ассоциация локуса MTR A2756G (аллель MTR G: OR = 1.45, р = 0.008; генотип AG: OR = 1.32, р = 0.13, генотип MTR GG: OR = 2.64, р = 0.01). Данный локус также показал ассоациацию в подгруппе ВПР СК (аллель G: OR = 1.78, р = 0.03; генотип AG: OR = 1.17, р = 0.67, генотип GG: OR = 4.99, р = 0.003). В этой подгруппе была также выявлена ассоциация локуса MTHFR А1298С со снижением риска ВПР (аллель С: OR = 0.46, р = 0.005; генотип АС: OR = 0.44, р = 0.02, генотип СС: OR = 0.24, р = 0.06).

В данной части работы мета-анализ не проводился. Для наиболее изученного полиморфного локуса MTHFR С677Т в недавнем времени был опубликован мета-анализ, включающий 25 исследований, в котором была продемонстрирована его ассоциация с риском дефектов нервной трубки (Yan et al., 2012).

6. Исследование ассоциации полиморфизма генов фолатного цикла с риском идиопатического мужского бесплодия.

В экспериментальную группу вошли 275 пациентов Муниципального центра планирования семьи и репродукции города Новосибирска и АНО «Центр новых медицинских технологий в Академгородке» (возраст от 20 до 45 лет, средний возраст 30.5 ± 4.7 лет), у которых было диагностировано бесплодие неизвестного генеза (исключены пациенты, имеющие простатит, уретрит, крипторхизм, аномалии кариотипа, микроделеции AZF-локуса, наличие антиспермальных антител, обструктивные нарушения, сахарный диабет, индекс массы тела >30 кг/м2, а также имеющие профессиональную вредность и перенесшие паротит). 99 пациентов имели диагноз «азооспермия», 83 - «олигозооспермия», остальные имели диагнозы «астенотератозооспермия», «олигоастенотератозооспермия»,

«тератозооспермия» и «астенозооспермия» (в соответствии с руководством ВОЗ пересмотра 1999 г. и строгим критериям Крюгера). Подгруппы мужчин с азоо- и олигозооспермией были проанализированы отдельно. В группу контроля вошли 344 мужчины (доноры крови, возраст от 18 до 58 лет, средний возраст 33.2 ± 11 лет). Все мужчины проживали на территории города Новосибирска и принадлежали к русской этнической группе. ДНК была выделена из венозной крови и спермы.

Распределение генотипов во всех группах соответствовало закону Харди-Вайнберга (точный критерий). Ассоциацию локусов с риском ВПР анализировали методом логистической регрессии. Различия считали статистически значимыми при р < 0.05. Вычисления проводили в пакете статистики GenABEL для языка R. Была выявлена ассоциация локуса MTHFD1 G1958A со снижением риска азооспермии (аллель A: OR = 0.675, р = 0.01; генотип GA: OR = 0.566,р = 0.03; генотип АА: OR = 0.469, р = 0.02) и ассоциация локуса MTR A2756G с риском олигозооспермии (аллель G: OR = 1.571,р = 0.06, генотип AG: OR = 1.190,р = 0.53, генотип GG: OR = 3.067,р = 0.02).

Для наиболее изученного локуса MTHFR С677Т был выполнен мета-анализ, в который были включены результаты нашего исследования и 12 аналогичных работ, в которых изучалось его влияние на риск идиопатического мужского бесплодия. Мета-анализ был выполнен также для подгрупп азооспермии (5 исследований) и олигозооспермии (4 исследования). Для расчёта обобщённого значения OR использовалась модель фиксированных эффектов. Вычисления выполнялись в пакете статистики GenABEL, rmeta. В результате мета-анализ была обнаружена ассоциация аллеля MTHFR 677Т с увеличением риска азооспермии (OR = 1.236;р = 0.001, табл. 4). Анализ гетерогенности данных, включенных в мета-анализ (х2-тест, уровень значимости р = 0.1) выявил статистически значимую гетерогенность результатов отдельных для всех проанализированных групп.

Таблица 4. Мета-анализ, включающий опубликованные данные об ассоциации локуса МТНРК С677Т с риском идиопатического мужского бесплодия, и данные, полученные в нашей работе. СЖ. — отношение шансов (аллель Т уб. аллель С); СЛ. - 95% доверительный интервал; р - уровень статистической значимости.

OR C.I. Р Больные/ контроль Гетерогенность, р

И диопатическ ое мужское ôecn.mas к

1.046 0.990-1.105 0.108 2972/3436 1 00*106

Азооспермия

1 236 1.093-1.398 0.001 871/2078 0 003

Олигозооспермия

1.001 0.992-1.010 0.813 536/1357 0.05

Таким образом, нами был выявлен ряд ассоциаций для полиморфных локусов в генах фолатного цикла с тремя патологиями - неходжкинскими лимфомами, врожденными аномалиями развития и мужским бесплодием. Стоит отметить, что в настоящем исследовании в связи с одновременным анализом большого количества локусов и разбиением выборок жителей Западной Сибири на полугруппы было проведено много сравнений. Введение поправки на множественное сравнение приведёт к снижению номинального уровня статистической значимости на два порядка, который сложно достичь в нашей работе, поэтому выявленные ассоциации целесообразно подтвердить в независимых исследованиях на выборках более крупных размеров.

Наибольший интерес, на наш взгляд, представляют ассоциации локусов MTHFD1 G1958A, MTHFR С677Т и MTR A2756G, выявленные при анализе нескольких патологий и показанные в результате мета-анализов. Полиморфный локус MTHFD1 G1958A приводит к аминокислотной замене Arg653Gln в домене фермента MTHFD1, отвечающем за синтез 10-формилтетрагидрофолата из тетрагидрофолата и формиата (Е.С. 6.3.4.3). 10-формилтетрагидрофолат, получаемый в ходе этой реакции, является необходимым для синтеза пуринового кольца. Кроме того, он участвует в метаболическом пути синтеза тимидилата и метионина (Appling et al., 1991; Fu et al., 2001; Tibbets et al., 2010). Выявленная нами ассоциация замены MTHFD1 G195 8А со снижением риска неходжкинских злокачественных лимфом и мужского бесплодия свидительствует о том, что, вероятно, эта замена может приводить к увеличению активности фермента. Тем не менее, необходимо заметить, что весь ген MTHFD1 находится в протяженном блоке неравновесия по сцеплению, куда входит не только он, но и другие гены, поэтому, возможно, локус MTHFD1 G1958A на самом маркирует какой-то другой функциональный SNP, ассоциированный с данными патологиями.

Ферменты MTHFR (метилентетрагидрофолатредуктаза) и MTR (метионин-синтаза) являются одними из ключевых ферментов для синтеза

метионина из гомоцистеина и дальнейших процессов метилирования. Первый фермент катализирует необратимую реакцию восстановления 5,10-метилентетрагидрофолата до 5-метилтетрагидрофолата (Е.С. 1.5.1.2). Фермент MTR переносит метальную группу от последнего соединения на гомоцистеин с образованием метионина и высвобождением тетрагидрофолата (Е.С. 2.1.1.13) (Beaudin et al., 2007; Leclerc et al., 1996). У людей, имеющих серьезные дефекты этих генов, наблюдается гомоцистеинемия, уметенная отсталось, задержка в развитии, психические расстройства и другие нарушения (Frosst et al., 1995; Leclerc et al., 1996; Gulati et al.; 1996). Функциональность значимость локуса MTHFR С677Т уже доказана. В ряде работ было продемонстрировано, что он снижает активность фермента, приводит к накоплению гомоцистеина и ассоциируется со снижением уровня метилирования генома (Christensen et al., 1997; Weisberg et al., 1998; Chango et al., 2000; Castro et al., 2003; Fredriksen et al., 2007; Tanaka et al., 2009; Stern et al., 2000; Paz et al., 2002; Friso et al., 2002; Castro et al., 2004). Вероятно, эти эффекты лежат в основе его ассоциации с репродуктивными патологиями. Локус в гене MTR является менее изученным. В 5 работах было показано, что аллель 2756G ассоциируется со снижением уровня субстрата MTR - гомоцистеина (Chen et al., 2001; Fredriksen et al., 2007; Harmon et al., 1999; Kim et al., 2007; Tsai et al., 2000). Таким образом, возможно, эта замена активирует фермент MTR. Гомоцистеин при накоплении способен сдвигать равновесие реакции гидролиза S-аденозилгомоцистеина (SAH) в сторону синтеза SAH — ингибитора метилтрасферазных реакций (James et al., 2002). Теоретически, если нуклеотидная замена MTR A2756G активирует фермент, то она может быть ассоциирована с увеличением степени метилирования ДНК. Для локусов MTR A2756G и MTHFR С677Т на следующем этапе работы было выполнено исследование их функиональных эффектов, а именно проанализировано влияние на уровень метилированя генома.

7. Анализ влияния локусов MTR A2756G и MTHFR С677Т на уровень метилирования генома.

Генотипы локусов MTR A2756G и MTHFR С677Т были определены в выборке образцов ДНК от 10352 жительниц города Новосибирска, из которых были отобраны для дальнейшего анализа 80 образцов с генотипом MTR 2756GG и 80 - с генотипом MTR 2756АА. Образцы выбирали таким образом, чтобы обе группы состояли из равных количеств гоомзигот MTHFR 677СС и MTHFR 677ТТ (рис. 4). Такой дизайн исследования позволил уравнять эффект генотипов одного локуса при анализе эффекта другого SNP и таким образом изучить их влияние на степень метилирования ДНК по отдельности. Размер сформированных групп - по 40 образцов на каждое сочетание - был обусловлен встречаемостью генотипов MTR 2756GG (-4%) и MTHFR 677ТТ (-10%).

MTHFR CCIMTR GG n =40 MTHFR TT/MTR GG n =40

MTHFR ОС/MTR AA n =40 MTHFR TT/MTR AA n =40

v V

MTHFR СС n=80 MTHFR TT n=80

MTR GG n=80

МГЯАА n=80

Рисунок 4. Распределение генотипов в анализируемых группах.

В анализируемых группах был определен уровень метилирования ДНК с помощью коммерчески доступного набора реагентов Methyl Flash Methylated DNA Quantification Kit (Colorimetric) («Epigentek», США), в котором используется метод колориметрического иммуноферментного анализа. Для того, чтобы воспользоваться набором, было необходимо определить концентрацию ДНК в каждом из анализируемых образцов. Концентрацию измеряли методом количественной ПЦР в режиме реального времени с использованием TaqMan зонда с помощью системы, разработанной в ходе выполнения работы (рис. 5).

Рисунок 5. Калибровочная кривая для определения концентрации ДНК в образцах методом количественной ПЦР в режиме реального времени.

Соответствие распределения уровня метилирования нормальному оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка. Поскольку во всех группах оно соответствовало нормальному (р > 0.05), для сравнения уровня метилирования в группах использовали ¿-критерий Стьюдента. Равенство дисперсий проверяли с помощью критерия Левена. Дисперсии в анализируемых группах отличались незначимо (р > 0.05), в связи с этим использовали классический /-критерий, учитывающий равные дисперсии. Вычисления проводили в пакете статистики STATISTICA 8.0.

У носителей генотипа MTR 275 6GG был выявлен статистически значимо более высокий уровень метилирования по сравнению с носителями генотипа MTR 2756АА. В случае локуса MTHFR С677Т, у гомозигот по редкому

аллелю наблюдался сниженный уровень метилирования по сравнению с гомозиготами по частому аллелю (табл. 5).

Полученные нами данные подтверждают гипотезу о том, что замена MTR A2756G активирует фермент MTR, а также согласуются с результатами 4-ёх предыдущих исследований (Stern et al., 2000; Friso et al., 2002, Paz et al., 2002; Castro et al., 2004), в которых было показано, что локус MTHFR С611Т ассоциирован с гипометилированием генома.

При анализе сочетаний нами было выявлено, что сочетание MTR 2756GG/MTHFR 677СС приводит к более высокому уровню метилирования по сравнению комбинацией MTR 2756АА1MTHFR 677ТТ, в то время как сочетания генотипов MTR 2756GG/MTHFR 677ТТ и MTR 2156AAIMTHFR 677СС не отличаются статистически значимо друг от друга. Это также свидетельствует о противоположности эффектов этих локусов и их способности компенсировать влияние друг друга.

Таблица 5. Сравнение уровня метилирования ДНК лейкоцитов в группах женщин с различными генотипами по локусам MTR A2756G и MTHFR._

1 Уровень метилирования ДНК Генотип (%), среднее значение ± 1 стандартное отклонение Р

MTR 2756АА (п = 80) MTR 2756GG (п = 80) 4.501 ± 1.621 5.061 ± 1.761 0.0391

MTHFR 677СС (п = 80) MTHFR 677ТТ (п = 80) 5.103 ± 1.767 4.323 ± 1.525 0.0034

MTR 2756GG / MTHFR 677СС (п = 40) MTR 2756АА / MTHFR 677ТТ (п = 40) 5.613 ± 1.768 4.421 ± 1.680 0.0026

MTR 2756GG / MTHFR 677ТТ (п = 40) MTR 2756АА / MTHFR 677СС (п = 40) 4.196 ± 1.315 4.570 ± 1.585 0.2585

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе выполнен анализ влияния полиморфизма генов фолатного цикла на риск четырёх патологий - рака молочной железы, неходжкинских злокачественных лимфом, врожденных аномалий развития и идиопатического мужского бесплодия. Исследование было проведено на выборках этнических русских, проживающих в Западной Сибири. Определение генотипов изучаемых локусов было проведено с использованием систем генотипирования, разработанных в ходе проведения исследования. Ни один из проанализированных локусов не показал ассоциации с риском рака молочной железы в выборке русских, а также в результате мета-анализа, включающего результаты нашей работы и других исследований. По всей видимости, либо проанализированные локусы не влияют на риск этого заболевания, либо эффект их крайне мал. При исследовании вклада аллельных вариантов генов фолатного цикла в генетическую предрасположенность к другим патологиям нами был обнаружен ряд ассоциаций, из которых мы считаем наиболее интересными ассоциации локусов MTHFD1 G1958A, MTHFR С677Т и MTR A2756G, выявленные для нескольких патологий и показанные в результате мета-анализов. Для локусов MTHFR С677Т и MTR A2756G, расположенных в генах ферментов, являющихся непосредственными участниками процесса метилиронивания, было выполнен анализ их функциональных эффектов, а именно исследована взаимосвязь между носительством генотипов и степенью метилирования генома. Нами было показано, что носители генотипа MTR 2756GG имеют более высокий уровень метилирования генома, чем носители MTR 2756АА, что согласуется с гипотезой о том, что эта замена активирует фермент MTR. Для локуса MTHFR С677Т была продемонстрировано снижение уровня метилирования в случае генотипа MTHFR 677ТТ, что подтверждает результаты предыдущих исследований (Stern et al., 2000; Friso et al., 2002, Paz et al., 2002; Castro et al., 2004).

выводы

1. Разработаны и оптимизованы системы определения генотипов полиморфных локусов MTHFR С677Т, MTHFR А1298С, MTR A2756G, MTRR A66G, SHMT1 С1420Т, CBS 844ins68, MTHFD1 G1958A, ВНМТ1 G742A, CUBNrsl907362 и ALDH1L1 rs4646750.

2. Частоты аллелей локусов MTHFR А1298С, MTR A2756G, Л/77?/? A66G, SHMT1 С1420Т, MTHFD1 G1958A и ВНМТ1 rsl6876512 у жителей Западной Сибири статистически значимо отличаются от частот в популяциях монголоидного происхождения и не отличаются значимо от частот в популяциях европеоидного происхождения. Частоты аллелей локусов MTHFR С677Т и CBS 844ins68 значимо отличаются от частот как в популяциях монголоидного происхождения, так и в популяциях европеоидного происхождения. Частоты аллелей локусов ВНМТ1 G742A и ALDH1L1 rs4646750 не отличаются значимо от таковых в популяциях монголоидного и европеоидного происхождения.

3. Показано влияние локусов MTHFD1 G1958A и MTRR A66G на риск неходжкинских злокачественных лимфом, локусов MTHFR С677Т, MTR A2756G и MTHFR А1298С - на риск врожденных пороков развития плода и локусов MTHFD1 G1958A и MTR A2756G - на риск нарушений сперматогенеза у жителей Западно-Сибирского региона России.

4. Показана ассоциация локуса MTR A2756G со снижением риска неходжкинских злокачественных лимфом и локуса MTHFR С677Т с риском азооспермии в мета-анализе, включающем результаты настоящего исследования и ранее опубликованных работ. Для остальных проанализированных локусов мета-анализ не показал ассоциации с риском рака молочной железы, неходжкинских злокачественных лимфом и идиопатического мужского бесплодия.

5. Нуклеотидная замена MTR A2756G приводит к увеличению уровня метилирования генома. Замена MTHFR С677Т ассоциируется со снижением уровня метилирования ДНК.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Вайнер, А. С., Боярских, У. А., Воронина Е. Н., Селезнёва, И. А., Синкина, Т. В., Лазарев. А. Ф., Петрова, В. Д., Филипенко, М. Л. Не выявлено ассоциаций полиморфных локусов генов фолатного цикла (С677Т и А1298С MTHFR, С1420Т SHMT1 и G1958A MTHFD) с риском развития рака молочной железы в Западно-Сибирском регионе России. // Молекулярная биология. - 2010. - Vol. 44. - Р. 816-823.

2. Weiner, A. S., Boyarskih, U. A., Voronina, Е. N., Selezneva, I. A., Sinkina, Т. V., Lazarev, A. F., Petrova, V. D., Filipenko, М. L. Polymorphisms in the folate-metabolizing genes MTR, MTRR, and CBS and breast cancer risk. // Cancer Epidemiol. - 2012. - Vol. 36. - P. e95-el00.

3. Weiner, A. S., Beresina, О. V., Voronina, E. N., Voropaeva, E. N., Boyarskih, U. A., Pospelova, Т. I., Filipenko, M. L. Polymorphisms in folate-metabolizing genes and risk of non-Hodgkin's lymphoma. // Leuk Res. - 2011. - Vol. 35. -P. 508-515.

4. Weiner, A. S., Gordeeva, L. A., Voronina, E. N., Boyarskih, U. A., Shabaldin, A. V., Filipenko, M. L. Polymorphisms in folate-metabolizing genes and risk of having an offspring with congenital anomalies in West Siberian region of Russia: a case-control study. // Prenat Diagn. - 2012. - Vol. 32. - P. 10411048.

5. Weiner, A. S., Boyarskikh, U. A., Voronina, E. N., Tupikin, A. E., Korolkova, О. V., Morozov, I. V., Filipenko, M. L. Polymorphisms in folate-metabolizing genes and risk of idiopathic male infertility: a study on a Russian population and a meta-analysis. // Fertil Steril. - 2013. doi: 10.1016/j .fertnstert.2013.09.014.

6. Weiner, A. S., Boyarskikh, U. A., Voronina, E. N., Mishukova, O.V., Filipenko, M. L. Methylenetetrahydrofolate reductase C677T and methionine synthase A2756G polymorphisms influence on leukocyte genomic DNA methylation level. // Gene. -2014. - Vol. 533. - P. 168-172.

7. Вайнер, А. С., Жечев, Д. А., Кечин, А. А., Кудрявцева, E. А., Гордеева, Л.А., Воронина, E. H., Шабагтдин, А. В., Филипенко, M. Л. Метаболизм фолатов и врожденные аномалии развития. // Мать и дитя в Кузбассе. -2011.-N. 2,-Р. 3-10.

8. Вайнер, А. С., Кудрявцева, Е. А., Жечев, Д. А., Кечин, А. А., Гордеева, Л. А., Воронина, Е. Н., Боярских, У. А., Шабалдин, А. В., Филипенко, М. Л. Исследование ассоциации полиморфизма генов фолатного обмена с риском врожденных аномалий развития. // Мать и дитя в Кузбассе. — 2011. -N. З.-Р. 10-16.

9. Вайнер, А. С., Жечев, Д. А., Ширшова, А. Н., Кудрявцева, Е. А., Кечин, А. А., Гордеева, Л. А., Воронина, Е. Н., Шабалдин, А. В., Филипенко, М.

Л. Система фолатиого обмена и врожденные пороки развития: эффект материнского генотипа. // Мать и дитя в Кузбассе. -2012.-N. 4- Р. 7-12.

10. Вайнер, А. С., Воронина, Е. Н., Кострыкина, Н. А., Филипенко, М. Л. Полиморфные варианты генов фолатного цикла в популяции жителей г. Новосибирска. // Вестник НГУ. - 2008. - Vol. 6.- Р. 13-19.

11. Вайнер, А. С., Березина, О. В., Воропаева, Е. Н., Воронина, Е. Н., Боярских, У. А., Поспелова, Т. И., Филипенко, М. Л. Анализ ассоциации аллельных вариантов генов фолатного цикла с риском развития неходжкинской злокачественной лимфомы. // Молекулярная медицина. — 2011.-N. 2,-Р. 39-47.

12. Березина, О. В., Вайнер, А. С., Поспелова, Т. И., Воронина, Е. Н., Филипенко, М. Л. Ассоциация полиморфных локусов генов фолатного цикла с риском развития агрессивных и индолентных лимфом. // Бюллетень СО РАМН. - 2011. - Vol. 31.- Р. 20-25

13. Березина, О. В., Вайнер, А. С., Воропаева, Е. Н., Воронина, Е. Н., Поспелова, Т. И., Филипенко, М. Л. Влияние однонуклеотидных замен в генах фолатного цикла на риск развития агрессивных неходжкинских лимфом. // Сибирское медицинское обозрение. - 2011. - Vol. 69. - Р. 2226.

14. Вайнер, А. С., Воронина, Е. Н., Филипенко М.Л. Фолатный цикл в организме человека. Издательство: LAP LAMBERT Academic Publishing (2013-07-11), ISBN-13: 978-3-659-42258-4).

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному руководителю к.б.н. Боярских Ульяне Александровне за профессиональное и ответственное руководство работой, передачу опыта, внимание и поддержку, коллективу Лаборатории фармакогеномики и лично к.б.н. Ворониной Елене Николаевне за сотрудничество, ценные советы и помощь, к.б.н. Филипенко Максиму Леонидовичу за важные рекомендации и помощь в решении всех организационных вопросов и д.б.н Рыковой Елене Юрьевне за внимательное прочтение диссертации и полезные замечания. Автор также выражает глубокую благодарность д.м.н Лазареву Александру Федоровичу, д.м.н. Петровой Валентине Дмитриевне, к.м.н. Селезнёвой Инне Анатольевне, к.м.н. Синкиной Татьяне Владимировне, к.б.н. Гордеевой Людмиле Александровне, д.м.н. Шабалднну Андрею Владимировичу, д.м.н. Поспеловой Татьяне Ивановне, к.м.н. Березиной Ольге Валерьевне, к.м.н. Воропаевой Елене Николаевне, Тупикину Алексею Евгеньевичу, к.б.н. Морозову Игорю Владимировичу и Корольковой Ольге Александровне за предоставление образцов крови и ДНК для работы и помощь в описании сформированных выборок.

Подписано в печать 13.11.2013 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2 Тираж 120 экз. Заказ № 191

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383)217-43-46, 8-913-922-19-07

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шадрина, Александра Сергеевна, Новосибирск

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук

04201452137 На правах рукописи

Шадрина Александра Сергеевна

Ассоциация полиморфных вариантов генов фолатного цикла с предрасположенностью к развитию онкологических заболеваний и репродуктивных патологий у жителей Западно-Сибирского

региона России

03.01.03 — молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -к.б.н. У. А. Боярских.

Новосибирск - 2013

Оглавление

Введение..................................................................................................................................................4

I. Фолатный цикл в метаболизме клетки и его роль в патогенезе заболеваний человека............13

1. Фолатный цикл в организме человека.......................................................................................13

1.1. Всасывание и транспорт фолатов........................................................................................15

1.2. Метаболизм фолатов и его роль в функционировании клетки.........................................21

2. Функциональные последствия нарушений метаболизма фолатов..........................................45

2.1. Дефицит компонентов фолатного цикла: влияние на стабильность генома, уровень гомоцистеина и метилирование ДНК.........................................................................................45

2.2. Фолат и онкологические заболевания.................................................................................49

2.3. Фолат и врожденные пороки развития................................................................................53

2.4. Фолат и мужское бесплодие.................................................................................................59

2.5. Полиморфизм генов фолатного цикла, риск онкологических заболеваний, врожденных

пороков развития плода и мужского бесплодия.......................................................................62

Заключение...................................................................................................................................75

II. Материалы и методы.......................................................................................................................76

1. Характеристики выборок.............................................................................................................76

1.1. Рак молочной железы............................................................................................................76

1.2. Неходжкинские злокачественные лимфомы......................................................................78

1.3. Врожденные пороки развития..............................................................................................78

1.4. Идиопатическое мужское бесплодие..................................................................................80

2. Определение генотипов...............................................................................................................81

2.1. ПЦР-ПДРФ анализ................................................................................................................82

2.2. Анализ с помощью TaqMan-зoндoв....................................................................................85

2.3. Анализ с помощью аллель-специфичной ПЦР..................................................................86

2.4. Выбор БЫР и разработка систем генотипирования...........................................................87

3. Определение уровня метилирования ДНК................................................................................89

3.1 Анализируемые группы.........................................................................................................89

3.2. Определение концентрации ДНК в образцах.....................................................................91

3.3. Анализ уровня метилирования генома................................................................................93

4. Статистическая обработка...........................................................................................................94

5. Мета-анализ..................................................................................................................................95

III. Результаты.......................................................................................................................................96

1. Сравнение частот встречаемости аллелей у жителей Западной Сибири с частотами в популяциях европеоидов и монголоидов......................................................................................96

2. Исследование ассоциации полиморфизма генов фолатного цикла с риском развития рака молочной железы.............................................................................................................................99

3. Исследование ассоциации полиморфизма генов фолатного цикла с риском развития неходжкинских злокачественных лимфом..................................................................................106

4. Исследование ассоциации полиморфизма генов фолатного цикла с риском врожденных пороков развития............................................................................................................................116

5. Исследование ассоциации полиморфизма генов фолатного цикла с идиопатическим мужским беплодием.......................................................................................................................122

6. Анализ влияния локусов МТЯ А2756С и МТНРК С677Т на уровень метилирования генома. ..........................................................................................................................................................130

IV. Обсуждение результатов.............................................................................................................132

1. Ассоциативные исследования...................................................................................................132

1.1. Анализ влияния полиморфизма генов фолатного цикла на риск развития рака

молочной железы.......................................................................................................................132

1. 2. Анализ влияния полиморфизма генов фолатного цикла на риск развития неходжкинских злокачественных лимфом..............................................................................137

1.3. Анализ влияния полиморфизма генов фолатного цикла на риск врожденных пороков

развития.......................................................................................................................................144

1.4. Анализ влияния полиморфизма генов фолатного цикла на риск идиопатического мужского бесплодия..................................................................................................................151

1.5. Подведение итогов ассоциативных исследований..........................................................155

2. Функциональные исследования................................................................................................159

Заключение.........................................................................................................................................163

Выводы................................................................................................................................................164

Список сокращений и условных обозначений................................................................................165

Введение

Актуальность работы

Фолатный цикл является важнейшим звеном метаболизма клетки, функция

которого заключается в переносе одноуглеродных фрагментов от одних биологических соединений к другим. Это обуславливает его участие в ряде клеточных процессов, которые затрагивают самые разнообразные стороны жизнедеятельности клетки: синтез нуклеотидов, некоторых липидов и аминокислот, креатина и нейромедиаторов, конверсию гомоцистеина в метионин, детоксикацию ксенобиотиков, метилирование хроматина и т. д. [1-3]. Последнее играет важную роль в поддержании структуры и целостности генома и в эпигенетической регуляции экспрессии генов.

Нарушения в системе метаболизма фолатов приводят к появлению разрывов в ДНК [4-7], встройке в ДНК урацила [8-10], снижению эффективности репарации [8, 9, 11, 12], повышению уровня гомоцистеина [10, 13-15] и аномальному метилированию ДНК [10, 16]. Последствиями таких нарушений могут являться повреждения генов, ответственных за контроль клеточного цикла, дифференцировку, апоптоз, миграцию и др., в том числе ткане- и стадиоспецифичных генов, или их аномальная экспрессия; снижение пролиферативной способности клеток; нарушение правильного расхождения хромосом, а также эффекты, связанные с токсическим действием гомоцистеина (модификация белков и нарушение их функциональных свойств и фолдинга, индукция оксидативного стресса и апоптоза) [17-19]. Всё это может лежать в основе развития ряда заболеваний, в том числе онкологических заболеваний и патологий репродукции, таких как мужское бесплодие и врождённые пороки развития плода.

Во многих работах было показано, что потребление фолата снижает риск различных видов неоплазий [20-28] и врожденных аномалий развития [29-34], а также улучшает показатели спермограммы у мужчин [35-37]. Таким образом, фолатный цикл, по всей видимости, имеет важное значение в этиологии данных заболеваний. В связи с этим, представляет интерес анализ влияния генетического

полиморфизма ферментов фолатного обмена на риск их развития у пациента. Носительство аллелей этих генов, изменяющих функциональные характеристики, стабильность или количество соответствующих ферментов, может нарушать баланс в метаболизме одноуглеродных групп и лежать в основе генетической предрасположенности к данным патологиям.

На сегодняшний день идентифицирован ряд полиморфных локусов (нуклеотидных замен, небольших делеций или инсерций) в генах фолатного цикла, которые могут иметь функциональный эффект [1, 38, 39]. Для некоторых из них этот эффект был продемонстрирован в экспериментах in vitro и in vivo [3944]. Тем не менее, при исследовании их ассоциации с риском вышеуказанных заболеваний в разных этнических группах полученные результаты часто противоречили друг другу и не позволяли однозначно определить их роль в этиологии изучаемых болезней. Предствляется весьма вероятным, что эффекты генетических локусов варьируют от популяции к популяции. Причинами этого могут быть как различия в действии факторов окружающей среды и образа жизни, специфичные для разных этнических групп, так и разница в частотах аллельных вариантов и сцепление с разными функционально значимыми генетическими локусами. В России на настоящий момент уже проведено несколько исследований, посвященных анализу влияния ряда полиморфных локусов в генах фолатного цикла на риск рака молочной железы, лейкемии и лимфомы и врожденных аномалий развития (исследования Назаренко М. С. с соавт. [45], Перельмутер с соавт. [46], Gra et al. [47], Панковой Е. Е. с соавт. [48], Коваль М. М. с соавт. [49]). Представляется целесообразным подтвердить полученные результаты на независимой выборке, а также исследовать ассоцацию ранее неизученных полиморфных локусов в генах данной системы.

Кроме того, для ряда полиморфных локусов остаются значительные пробелы в понимании их функциональных последствий (таких, как влияние на уровень гомоцистеина и других метаболитов и степень метилирования ДНК). В частности, для нуклеотидной замены A2756G (rsl805087) в гене MTR, кодирующем фермент

метионин-синтазу, была обнаружена связь с уровнем гомоцистеина в ряде работ [50-54], но не исследовано влияние на уровень метилирования генома.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось изучение ассоциации

полиморфных локусов в генах фолатного цикла с риском онкологических заболеваний и патологий репродукции у жителей Западной Сибири, а также анализ влияния полиморфизма генов фолатного цикла на уровень метилирования ДНК.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать и оптимизовать системы определения генотипов полиморфных локусов в генах фолатного цикла;

2. Выполнить анализ ассоциации аллелей и генотипов полиморфных локусов в генах фолатного цикла с раком молочной железы, неходжкинскими злокачественными лимфомами, врожденными пороками развития плода и идиопатическим мужским бесплодием.

3. Сравнить частоты аллелей изучаемых локусов у жителей Западной Сибири с частотами в популяциях европеоидного и монголоидного происхождения;

4. Выполнить мета-анализ, объединив результаты настоящего исследования с результатами ранее опубликованных работ;

5. Провести анализ влияния генотипов изучаемых полиморфных локусов в генах фолатного цикла на уровень метилирования генома.

Научная новизна

Впервые в мире была исследована ассоциация локуса CBS 844ins68 с риском рака молочной железы, локуса MTHFD1 G1958А - с риском неходжкинских злокачественных лимфом и локусов ВНМТ1 rsl6876512, CUBN rsl907362 и ALDH1L1 rs4646750 - с риском врожденных пороков развития плода. Впервые в популяции русского этнического происхождения была проанализирована ассоциация локусов MTRR A66G, SHMT1 С1420Т и CBS 844ins68 с риском рака молочной железы; локусов MTR A2756G, SHMT1 С1420Т, CBS 844ins68, MTHFD1

G1958А - с риском неходжкинских злокачественных лимфом; локусов SHMT1 С1420Т, CBS 844ins68, MTHFD1 G1958A, ВНМГ1 G742A, ВНМТ1 rsl6876512, CUBN vs 1907362 и ALDH1L1 rs4646750 - с риском врожденных пороков развития плода и локусов MTHFR С677Т, MTHFR А1298С, SHMT1 С1420Т, MTR A2756G, MTRR A66G, CBS 844ins68 и MTHFD1 G1958A - с риском идиопатического мужского бесплодия.

Впервые было показано влияние локуса MTR A2756G на степень метилирования ДНК. Кроме того, была подтверждена ассоциация локуса MTHFR С677Т со снижением уровня метилирования генома, выявленная в четырех ранее опубликованных исследованиях [55-58].

Теоретическая и практическая значимость

Настоящая работа вносит вклад в изучение функциональной значимости

полиморфизма генов фолатного цикла, а также в понимание молекулярно-генетических основ развития рака молочной железы, неходжкинских злокачественных лимфом, врожденных аномалий развития плода и нарушений сперматогенеза у мужчин.

В перспективе, установление роли генетического полиморфизма ферментов фолатного цикла в этиологии этих заболеваний будет способствовать внедрению персонализированного подхода к их профилактике и лечению.

Данные о частотах аллелей и генотипов полиморфных локусов в генах фолатного цикла у жителей Западной Сибири, полученные в настоящем исследовании, вносят вклад в изучение генетических особенностей жителей данного региона.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработаны и оптимизованы системы определения генотипов полиморфных локусов MTHFR С677Т, MTHFR А1298С, MTR A2756G, MTRR A66G, SHMT1 C1420T, CBS 844ins68, MTHFD1 G1958A, BHMT1 G742A, CUBN rs 1907362 и ALDH1L1 rs4646750.

2. Частоты аллелей локусов MTHFR А1298С, MTR A2756G, MTRR A66G, SHMT1 С1420Т, MTHFD1 G1958A и ВНМТ1 rsl6876512 у жителей Западной Сибири статистически значимо отличаются от частот в популяциях монголоидного происхождения и не отличаются значимо от частот в популяциях европеоидного происхождения. Частоты аллелей локусов MTHFR С677Т и CBS 844ins68 значимо отличаются от частот как в популяциях монголоидного происхождения, так и в популяциях европеоидного происхождения. Частоты аллелей локусов ВНМТ1 G742A и ALDH1L1 rs4646750 не отличаются значимо от таковых в популяциях монголоидного и европеоидного происхождения.

3. Показано влияние локусов MTHFD1 G1958А и MTRR A66G на риск неходжкинских злокачественных лимфом, локусов MTHFR С677Т, MTR A2756G и MTHFR А1298С - на риск врожденных пороков развития плода и локусов MTHFD1 G1958A и MTR A2756G - на риск нарушений сперматогенеза у жителей Западно-Сибирского региона России.

4. Показана ассоциация локуса MTR A2756G со снижением риска неходжкинских злокачественных лимфом и локуса MTHFR С677Т с риском азооспермии в мета-анализе, включающем результаты настоящего исследования и ранее опубликованных работ. Для остальных проанализированных локусов мета-анализ не показал ассоциации с риском рака молочной железы, неходжкинских злокачественных лимфом и идиопатического мужского бесплодия.

5. Нуклеотидная замена MTR A2756G приводит к увеличению уровня метилирования генома. Замена MTHFR С677Т ассоциируется со снижением уровня метилирования ДНК.

Апробация результатов

По материалам диссертации опубликовано 13 статей в журналах, входящих в

Перечень ведущих рецензируемых научных изданий и журналов, рекомендуемых

Высшей аттестационной комиссией для публикации основных научных

результатов диссертаций:

1. Вайнер, А. С., Боярских, У. А., Воронина Е. Н., Селезнёва, И. А., Синкина, Т. В., Лазарев. А. Ф., Петрова, В. Д., Филипенко, М. Д.. Не выявлено ассоциаций полиморфных локусов генов фолатного цикла (С677Т и А1298С MTHFR, С1420Т SHMT1 и G1958A MTHFD) с риском развития рака молочной железы в Западно-Сибирском регионе России. // Молекулярная биология. - 2010. -Vol. 44.-N. 5.-Р. 816-823.

2. Weiner, A. S., Boyarskih, U. A., Voronina, Е. N., Selezneva, I. A., Sinkina, Т. V., Lazarev, A. F., Petrova, V. D., Filipenko, М. L. Polymorphisms in the folate-metabolizing genes MTR, MTRR, and CBS and breast cancer risk. // Cancer Epidemiology. - 2012. - Vol. 36. - N. 2.- P. e95-el00.

3. Weiner, A. S., Beresina, О. V., Voronina, E. N., Voropaeva, E. N., Boyarskih, U. A., Pospelova, Т. I., Filipenko, M. L. Polymorphisms in folate-metabolizing genes and risk of non-Hodgkin's lymphoma. // Leukemia Research. - 2011. - Vol. 35. -N. 4.-P. 508-515.

4. Weiner, A. S., Gordeeva, L. A., Voronina, E. N., Boyarskih, U. A., Shabaldin, A. V., Filipenko, M. L. Polymorphisms in folate-metabolizing genes and risk of having an offspring with congenital anomalies in West Siberian region of Russia: a case-control study. // Prenatal Diagnosis. - 2012. - Vol. 32. -N. 11.- P. 1041-1048.

5. Weiner, A. S., Boyarskikh, U. A., Voronina, E. N., Tupikin, A. E., Korolkova, O. V., Morozov, I. V., Filipenko, M. L. Polymorphisms in folate-metabolizing genes and risk of idiopathic male infertility: a study on a Russian population and a metaanalysis. // Fertility and Sterility. - 2013. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.09.014.

6. Weiner, A. S., Boyarskikh, U. A., Voronina, E. N., Mishukova, O.V., Filipenko, M. L. Methylenetetrahydrofolate reductase C677T and methionine synthase A2756G polymorphisms influence on leukocyte genomic DNA methylation level. // Gene. -2014.-Vol. 533.-N. l.-P. 168-172.

7. Вайнер, А. С., Жечев, Д. А., Кечин, А. А., Кудрявцева, E. А., Гордеева, Л.А., Воронина, E. H., Шабалдин, А. В., Филипенко, M. Л. Метаболизм фолатов и врожденные аномалии развития. // Мать и дитя в Кузбассе. - 2011. - N. 2 - Р. 3-10.

8. Вайнер, А. С., Кудрявцева, Е. А., Жечев, Д. А., Кечин, А. А., Гордеева, JL А., Воронина, Е. Н., Боярских, У. А., Шабалдин, А. В., Филипенко, М. JI. Исследование ассоциации полиморфизма генов фолатного обмена с риском врожденных аномалий развития. // Мать и дитя в Кузбассе. — 2011. - N. 3 - Р. 10-16.

9. Вайнер, А. С., Жечев, Д. А., Ширшова, А. Н., Кудрявцева, Е. А., Кечин, А. А., Гордеева, J1. А., Воронина, Е. Н., Шабалдин, А. В., Филипенко, М. JI. Система фолатного обмена и врожденные пороки развития: эффект материнского генотипа. // Мать и дитя в Кузбассе. - 2012 - N. 4 — Р. 7-12.

10. Вайнер, А. С., Воронина, Е. Н., Кострыкина, Н. А., Филипенко, М. JI. Полиморфные варианты генов фолатного цикла в популяции жителей г.