Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли генов-кандидатов фолатного обмена в формировании преэклампсии

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли генов-кандидатов фолатного обмена в формировании преэклампсии"

На правах рукописи

ТВЕРСКАЯ Анастасия Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ ФОЛАТНОГО ОБМЕНА В ФОРМИРОВАНИИ ПРЕЭКЛАМПСИИ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005558324

Белгород-2014

005558324

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации

Научный руководитель:

Чурносов Михаил Иванович, доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты:

Петрин Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор, заведующий лабораторией медицинских генетических технологий

Викторова Татьяна Викторовна, доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой биологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медико-генетический научный центр» РАМН

Защита диссертации состоится «¿Ь » О 2015 года в « /О " » часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Автореферат разослан «/3 » (Р / 2015 г.

и.о. Ученого секретаря совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13

доктор медицинских наук Пахомов С.П.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

До настоящего времени преэклампсия (ПЭ) остается тяжёлым специфическим осложнением беременности и одной из актуальных нерешенных научно-практических проблем в мировом акушерстве. Преэклампсия — это осложнение беременности, возникающее во второй ее половине и характеризующееся появлением . отеков, протеинурии, артериальной гипертензии, а также глубокими расстройствами функции сосудистой системы, гемостаза, иммунитета, гемодинамики и микроциркуляции, развитием фетоплацентарной недостаточности, нарушений функции почек, печени, легких [Mitanchez D., 2010; Williams P.J. et al, 2011; Айламазян Э.К. и др., 2010; Савельева И.В. и др., 2010; Фролова О.Г., 2011; Радзинский В.Е. и др.,2012]. Частота ПЭ составляет 8-20% среди всех беременных [Сухих Г.Т. и др., 2010]. В стационарах высокого риска она равна 30% и более [Сидельникова, В.М., 2010]. В течение последнего десятилетия преэклампсия является одним из основных факторов перинатальной заболеваемости в мире и стабильно занимает 3-4 место в структуре причин материнской заболеваемости и смертности [Zhang Y.P. et al, 2012; Wahabi H.A., 2012; Alves J.G. et al, 2014; Айламазян Э, К., 2010].

Анализ современной литературы свидетельствует, что ПЭ является мультифакторным заболеванием. Генетическая компонента развития ПЭ, может составлять до 50% всех факторов риска [Баранов B.C. и др., 2009]. К настоящему времени выявлены ассоциации около 100 различных генетических полиморфизмов с преэклампсией [Kjellberg U. et al., 2010; Harmon Q.E. et al., 2014; Long W. et al., 2014; Kaartokallio T., 2014 ; Silva V.R., 2014; Баранов B.C. и др., 2009; Павлова К.К., 2011; Ворожинцева А.Ю., 2014].

Важная роль в этиологии и патогенезе преэклампсии принадлежит генам-кандидатам фолатного обмена [Макацария А.Д., 2011]., Мутации в генах фолатного обмена, обусловливающие снижение активности ферментов метилтетрагидрофолатредуктазы и метионин-синтазы редуктазы, приводят к избыточному накоплению гомоцистеина в крови и, как следствие, нарушению процессов метилирования в клетках [Гречанина ЕЛ. и др., 2010]. Дефицит фолиевой кислоты обуславливает формирование артериальной гипертензии у беременных, развитие тотальной ангиопатии, микротромбозов, нарастание инсулинорезистентности. Следует отметить, что роль генов-кандидатов фолатного обмена в формировании ПЭ активно изучается, однако данные исследования проводятся в основном зарубежными учеными [Kupfermine M.J. et al., 2009; Simchen M. J. et al., 2010; Zdoukopoulos N. et al., 2011; Kosar A. et al., 2011; Wang J„ 2011; Kulkarni A., 2011; Obolens'ka MIu., 2011; Williams P. J. et al., 2012; Dhobale M., 2012; Reilly R. et al., 2014; Pérez-Sepûlveda A. et al., 2014], в Российской Федерации эти работы единичные [Макацария А.Д., 2004; Павлова К.К., 2011; Ворожинцева А.Ю., 2014]. При этом полученные результаты о вовлеченности генетических полиморфизмов

генов фолатного обмена в формирование ПЭ в разных популяциях неоднозначны. Это определяет актуальность проведенного исследования.

Диссертационное исследование выполнено в рамках государственного задания Министерства образования и науки РФ «Изучение генетических факторов риска развития мультифакториальных заболеваний человека» (№511/2014).

Цель и задачи исследования: изучить вовлеченность генетических вариантов ферментов фолатного цикла в подверженность к преэклампсии.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать роль полиморфных вариантов генов фолатного обмена (MTHFR +6770Т, MTHFR +1298А>С, TYMS -10530Т, TYMS IVS6-68С>Т, TYMS -1122A>G, SHMT1 +14200Т, MTR +2756A>G, MTRR +66A>G) в формировании преэклампсии у населения Центрального Черноземья России.

2. Проанализировать вклад комбинаций генетических полиморфизмов в предрасположенность к развитию преэклампсии.

3. Оценить роль наследственной отягощенности в характере ассоциаций молекулярно-генетических маркеров с развитием ПЭ.

4. Выявить ассоциации генов-кандидатов со степенью тяжести преэклампсии.

5. Разработать модель индивидуального прогнозирования риска развития ПЭ тяжелой степени с учетом генетических данных.

Научная новизна.

Впервые установлено важное клиническое значение генетических полиморфизмов фолатного цикла при ПЭ у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья РФ. Определены молекулярно-генетические факторы риска развития преэклампсии и степени ее тяжести. Показаны особенности ассоциации полиморфных маркеров с развитием ПЭ у женщин в зависимости от наличия отягощенного семейного анамнеза. Разработана модель индивидуального прогнозирования риска развития ПЭ тяжелого течения.

Научно-практическое значение. Результаты проведенного исследования расширяют представления о молекулярно-генетических основах развития преэклампсии. Полученная модель индивидуального прогнозирования риска развития ПЭ может использоваться в практическом акушерстве для выявления в период прегравидарной подготовки и на ранних сроках беременности женщин с высоким риском развития ПЭ тяжелого течения. Результаты настоящего исследования используются в учебном процессе в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», в работе врачей акушеров-гинекологов перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа, женской консультации МБУЗ «Городская поликлиника № 2».

Положения, выносимые на защиту:

1. Генетические варианты ферментов фолатного цикла вовлечены в подверженность к развитию ПЭ у населения Центрального Черноземья России.

2. Вклад генов-кандидатов в предрасположенность к ПЭ различается у женщин с отягощенным семейным анамнезом и без отягощенной наследственности.

3. Девять комбинаций полиморфных вариантов ферментов фолатного обмена оказывают протективное влияние на развитие ПЭ тяжелой степени.

4. Генетический полиморфизм MTRR +66A>G, возраст женщины, наличие в анамнезе инфекций, передаваемых половым путем, патологии сердечно-сосудистой системы, уровень систолического артериального давления до беременности, содержание фибриногена в крови являются прогностически значимыми факторами при оценке индивидуального риска развития ПЭ тяжелого течения.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: VI региональном научном форуме «Мать и Дитя» (Ростов-на-Дону, 2012), 77-й Российской научной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 80-летию Башкирского государственного медицинского университета «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2012), ХШ-ой научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке», посвященной 25-летию Кировской государственной медицинской академии (Киров, 2012), 3-й Московской международной конференции «Молекулярная филогенетика MolPhy-3» (Москва, 2012), международном конгрессе «Новые технологии в акушерстве, гинекологии, перинатологии и репродуктивной медицине» (Новосибирск, 2013), VI межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Здоровье женщины — здоровье нации» (Белгород, 2013), VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2013), IX Международной (XVIII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2014).

Личное участие автора. Личный вклад автора заключался во включенном участии в выполнение всех этапов исследования: формирование клинических групп для исследования, анализ индивидуальных карт беременных и историй родов, выполнение молекулярно-генетических исследований. Автор лично проводил обработку и обобщение полученных результатов, подготовку основных публикаций по выполненной работе, написание и оформление рукописи.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 в журналах из перечня ВАК Минобрнауки РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы, практические рекомендации и список литературы. Материалы диссертации изложены на 137 страницах машинописного текста и содержат 14 таблиц и 27 рисунков. Библиографический указатель содержит 218 наименований, из которых 108 иностранных.

Материалы и методы исследования Характеристика исследованных групп

Согласно поставленным целям и задачам исследования проведено изучение 501 женщины: 322 беременных с диагнозом преэклампсия и 179 женщин с нормальным течением беременности (контрольная группа). В настоящее исследование вошли лица русской национальности, не имеющие между собой родства, являющиеся уроженками ЦентральноЧерноземного региона России. Клинико-лабораторное обследование женщин основной и контрольной группы проводилось на сроке родоразрешения в Перинатальном центре Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. В основную группу включены беременные с диагнозом преэклампсия. Диагноз преэклампсии ставился на основании генерализованных отеков, артериальной гипертензии и протеинурии [Савельева Г.М., 2000]. Средний возраст женщин с ПЭ составил 27,19± 6,4 лет (варьировал от 18 до 44 лет). В контрольную группу вошли беременные без диагноза преэклампсия в возрасте от 19 до 41 года (средний возраст женщин составил - 26,71±6,36 лет) (р>0,05). Таким образом, контрольная группа беременных не отличалась от основной группы по полу, месту рождения, возрасту и национальности.

Критериями исключения при формировании выборки явились: наличие среди пациенток патологии матки (фибромиома матки, аномалии развития внутренних половых органов), патология беременности (аномалии прикрепления и расположения плаценты, резус-конфликт), патология плода (врожденные аномалии развития), наличие многоплодной беременности.

Среди пациенток, беременность которых осложнилась ПЭ 148 человек было с преэклампсией легкой степени тяжести, 97 беременных - с преэклампсией средней степени тяжести, 60 индивидуумов - с тяжелой преэклампсией. Степень тяжести ПЭ оценивалась по шкале Goecke в модификации Г.М. Савельевой [Савельева Г.М., 2000]. Все клинические исследования проводились согласно протоколам этического комитета Российской Федерации, с информированного согласия пациенток.

Молекулярно-генетические методы На базе научно-исследовательской лаборатории "Молекулярной генетики человека" Белгородского государственного национального исследовательского университета проводилось типирование молекулярно-генетических маркеров ферментов фолатного цикла. Материалом для

исследования послужила венозная кровь, полученная в объеме 8-9 мл из локтевой вены беременных женщин. Анализ всех полиморфных вариантов ферментов фолатного цикла проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК в режиме реального времени (Real-time-PCR). Для ПЦР использовали полимеразу Thermus aquaticus («Силекс-М»), олигонуклеотидные праймеры и зонды («Синтол»), ПЦР выполняли на амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad) с програмным обеспечением CFX Manager™.

Статистические методы

Формирование базы данных и статистические расчеты проводились с использованием программы «STATISTICA 6.0». Генные и фенотипические частоты рассчитывались стандартными методами [Животовский, 1983]. Оценка соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, выполнялась с использованием критерия х2 [Вейр, 1995]. Ассоциации аллелей и генотипов изученных полиморфных вариантов с формированием преэклампсии и ее качественными признаками (степень тяжести ПЭ и др.) оценивали с помощью таблиц сопряженности 2><2 с расчетом критерия %2 с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительным интервалом [Schlesselman J., 1982]. С помощью програмного обеспечения APSampler, использующего метод Монте-Карло марковскими цепями и байесовскую непараметрическую статистику [Favorov А. V., et al., 2005] проведено изучение роли комбинаций генетических вариантов генов фолатного цикла в развитии ПЭ (http://sources.redhat.com/cygwin/). С целью минимизации ошибок первого рода (ложноположительные результаты) при проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони и пермутационный тест.

Изучение связей полиморфных вариантов с патогенетически значимыми количественными признаками ПЭ (уровень АД, уровень фибриногена, ПТИ и др.) проводили с помощью методов непараметрической статистики [Реброва О.Ю., 2006]. С целью прогнозирования риска развития преэклампсии использовали логистический регрессионный анализ.

Результаты исследования и их обсуждение 1. Сравнительный анализ распределения полиморфных генетических маркеров у беременных с преэкламисией и в контрольной группе

При сравнительном анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров ферментов фолатного цикла в группах беременных с ПЭ и беременных с нормальным течением гестации установлена более высокая частота (практически в 2 раза) генетического варианта IVS6-68 TT TYMS (8,36%) у женщин с ПЭ по сравнению с беременными контрольной группы (4,24%; х2=8,73; р=0,004; Pbonf=0,012; OR=3,65; 95%С1 1,47-9,48).

С помощью биоинформатического анализа выявлено, что фактором риска развития ПЭ является сочетание генетических вариантов MTHFR +1298СС и MTHFR +677Т, которое встречается у 7,19% пациенток с ПЭ и у 1,18% беременных контрольной группы (р=0,002, pperm=0,02, OR=6,47, 95%С1 1,49-28,05). Наоборот, у беременных с преэклампсией сочетание аллелей 5ЯМ77+1420С, MTHFR +1298А, TYMS -1053С выявлено в 61,05%, тогда как в контрольной группе оно наблюдается у 76,10% (р=0,0009, ррегт=0,009). Данная комбинация полиморфных вариантов является протективным фактором развития преэклампсии (OR=û,49, 95%С1 0,32-0,76). Другим протективным фактором развития преэклампсии является сочетание аллелей SHMT1+1420С, MTHFR +1298А, TYMS IVS6-68C, которое встречается у 61,60% пациенток с ПЭ и у 75,82% беременных контрольной группы (р=0,002, Ррегш=0,01, OR=0,51, 95%С1 0,33-0,80). Комбинация аллелей SHMT1+1420C, MTHFR +1298А, MTR +2756А, зарегистрированная у 63,50% беременных с ПЭ и у 76,62% контрольной группы, также является протективным фактором развития ПЭ (р=0,003, pperm=0,04, OR=û,53, 95%С1 0,34-0,83). Сочетание аллелей MTHFR +1298А, TYMS IVS6-68C, TYMS -1122А, MTR +2756A среди беременных с преэклампсией встречается в 68,46% тогда как в контроле этот показатель равен 81,38% (р=0,003, Ррепч=0,04, OR=0,50, 95%С1 0,30-0,82). Распространенность сочетания аллелей MTHFR +1298А, TYMS IVS6-68C, MTR +2756А в группе беременных с физиологическим течением гестации составляет 69,56%, что выше, чем у беременных с ПЭ (81,88%, р=0,004, ррепп=0,04, C)R=0,50, 95%С1 0,31-0,83). Частота комбинации аллелей S#A/77+1420C, MTHFR +1298А среди пациенток с преэклампсией составила 67,39%, тогда как в контрольной группе этот показатель равен 79,27% (р=0,005, pperm=0,04, OR=0,54, 95%CI 0,34-0,85).

Таким образом, в результате проведенного исследования установлены генетические варианты ферментов фолатного цикла, ассоциированные с развитием ПЭ. Повышает риск развития ПЭ генотип TYMS IVS6-68TT (OR=3,65) и комбинация генетических вариантов MTHFR +1298СС и MTHFR+611T (OR=6,47). Протективное значение при развитии ПЭ имеют шесть различных комбинаций шести генетических вариантов ферментов фолатного цикла MTHFR +1298А, SHMT1 +1420С, MTR +2756А, TYMS -1053С, TYMS IVS6-68C, 7YMS-1122A (OR=0,49-0,54) (рис. 1).

Полученные в нашем исследовании результаты согласуются с данными литературы, согласно которым, у индивидуумов, гомозиготных по полиморфным вариантам MTHFR +1298С и MTHFR +677Т, выявлено значительное снижение активности метилентетрагидрофолатредуктазы [Зайнулина М.С. и др., 2005]. Уменьшение активности MTHFR ведет к нарушению доставки и метаболизма фолиевой кислоты, накоплению гомоцистеина в плазме крови и развитию гипергомоцистеинемии [Суховольская М.А. и др., 2012]. Более высокий уровень гомоцистеина в

крови обуславливает угнетение синтеза тромбомодулина, понижение активности антитромбина III (AT-III) и эндогенного гепарина, увеличение выработки тромбоксана А2 [Макацария А.Д. и др., 2002]. В последующем эти изменения вызывают микротромбообразование и нарушения микроциркуляции, обуславливая развитие патологии спиральных артерий. Согласно данным литературы, эти патогенетические механизмы лежат в основе формирования преэклампсии [Макацария А.Д. и др., 2002; Сидорова И.С., 2003].

Рис. 1. Вовлеченность генов фолатного обмена в генетическую предрасположенность к преэклампсии

2. Изучение особенностей вовлеченности генетических вариантов ферментов фолатного цикла в подверженность к ПЭ у женщин в зависимости от наличия наследственной отягощенности

Данное исследование проводили в трех группах женщин: к первой группе были отнесены беременные с физиологическим течением гестации (174 человека), ко второй группе - беременные с ПЭ с наследственной отягощенностью (105 индивидуумов), к третьей - беременные с ПЭ без отягощенного семейного анамнеза (169 пациенток). У 48 пациенток информация о наследственной отягощенности по ПЭ не была получена.

Установлены различия в вовлеченности генов-кандидатов фолатного цикла в формирование подверженности к ПЭ у женщин с отягощенным семейным анамнезом и без наследственной отягощенности. С развитием ПЭ у женщин без отягощенного семейного анамнеза ассоциированы

генетические варианты MTR +2756G (OR=l,61), MTR +2756GG (OR=7,26), TYMS IVS6-68T (OR=l,49) и восемь комбинаций всех восьми изученных полиморфных маркеров (рис.2). Так, сочетание полиморфных вариантов MTHFR +1298A, TYMS IVS6-68C, TYMS-1122А, MTR +2756А у беременных с ПЭ без наследственной отягощенности встречалось в 65,74%, тогда как в контрольной группе данный показатель равнялся 82,07% (р=0,002, pPcrm=0,01, OR=0,40, 95% CI 0,22-0,72). Комбинация генетических маркеров SHMT1 +1420С, MTHFR +1298А, TYMS -1053С, MTR +2756А, которое наблюдалось у 53,39% беременных с ПЭ и у 72,79% контрольной группы, является протективным фактором в отношении риска развития преэклампсии (р=0,0008, рРегт=0,009, OR=0,43, 95% CI 0,26-0,71). Сочетание аллелей SHMT1+142ОС, MTHFR +1298А, TYMS -1053С зарегистрированное у 58,06% беременных с ПЭ и у 75,97% беременных контрольной группы также является протективным фактором развития преэклампсии (р=0,001, РРепп=0,009, СЖ=0,44, 95% CI 0,26-0,73).

Частота комбинации аллелей MTHFR +1298A, TYMS IVS6-68C, MTR +2756А среди беременных с преэклампсией без наследственной отягощенности составила 64,08%, тогда как в контрольной группе этот показатель равнялся 81,56% (р=0,002, Pperm=0,02, OR=0,42, 95% CI 0,23-0,75). Распространенность сочетания аллелей MTHFR +1298A, TYMS -1053С, MTR +2756А в группе беременных с ПЭ составляет 63,63%, что меньше чем у беременных контрольной группы (79,60%, р=0,002, Рр.^0,02, <Ж=0,45, 95% CI 0,26-0,77). Комбинация аллелей SHMT1 +1420С,MTHFR +1298А и TYMS IVS6-68C среди пациенток с ПЭ встречается у 59,46%, тогда как в контрольной группе этот показатель равен 75,67% (р=0,004, Рр^О.ОЗ, ÛR=0,47, 95% CI 0,28-0,80). Распространенность сочетания аллелей MTHFR +1298A, MTHFR +611 С, MTRR +66A, TYMS IVS6-68C, MTR +2756G в группе беременных с ПЭ (11,76%) достоверно меньше по сравнению с беременными контрольной группы (25,73%, р=0,005, Pperm~0,03, C)R=0,38, 95% CI 0,19-0,79).

Аналогичной направленности различия выявлены и для сочетания аллелей MTHFR +1298А и MTR +2756А (71,54% и 84,61%, соответственно, р=0,006, Pperm=0,05, OR=0,46, 95% CI 0,25-0,82).

В группе беременных с ПЭ с отягощенным семейным анамнезом сочетание генотипа MTHFR +1298СС и аллеля MTHFR +677Т является фактором риска развития ПЭ. У 9,28% беременных с ПЭ встречается это сочетание, тогда как в контрольной группе данный показатель составляет 1,22% (р=0,003, pPerai=0,01, OR=8,28, 95% CI 1,75-39,19). Комбинация генетических маркеров MTHFR +1298А и TYMS IVS6-68C которое наблюдается у 69,15% беременных с ПЭ и у 83,77% контрольной группы, является протективным фактором в отношении риска развития преэклампсии (р=0,006, Pperm=0,03, QR=0,43, 95% CI 0,23-0,80).

Рис. 2. Связь генов фолатного обмена с формированием преэклампсии у женщин без наследственной отягощенности

Таким образом, подверженность к формированию ПЭ у женщин без отягощенного семейного анамнеза связана с тремя «моноэффектами» генетических полиморфизмов и восемью комбинациями генетических вариантов всех восьми изученных ферментов фолатного цикла, тогда как развитие ПЭ у индивидуумов с отягощенной наследственностью связано с двумя сочетаниями трех полиморфных локусов. При этом следует отметить, что как в группе женщин с наследственной отягощенностью, так и среди индивидуумов без отягощенного семейного анамнеза в формирование ПЭ вовлечены генетические варианты двух локусов

метилентетрагидрофолатредуктазы МГНЕЯ +1298С и МТНРЯ +677Т. Факторами повышенного риска развития ПЭ являются генетические варианты, включающие аллели МГЯЯ? +1298С и МГНРК +677Т, а протективное значение имеют аллели МТНЕЯ +1298А и МГНРЯ +677С. Наши результаты согласуются с литературными данными по этому вопросу. Так, в работе Зайнулиной М.С. (2005) установлено, что гомозиготная форма

677ТТ по гену MTHFR в четыре раза чаще встречается в группе женщин с ПЭ, чем в контроле. Важное патогенетическое значение генетического полиморфизма С677Т гена MTHFR при ПЭ в русской этнической выборке Томской популяции выявлено и в работе Ворожищевой А.Ю. (2014). Наряду с этим, в якутской и бурятской этнических группах данный генетический полиморфизм не был связан с ПЭ. Следует отметить, что, наоборот, ранее в работе Павловой К.К. (2011) было показано, что гаплотип 677Т-1298С генетических полиморфизмов С677Т и А1298С гена MTHFR является предрасполагающим к развитию ПЭ в якутской популяции.

3. Ассоциации генов-кандидатов со степенью тяжести преэклампсии

Анализ ассоциации генов-кандидатов со степенью тяжести ПЭ позволил выявить особенности «генетической конституции беременных с ПЭ различных степеней тяжести.

Во-первых, с развитием ПЭ легкой степени ассоциированы генетические варианты MTR +2756А (OR=l,66), MTR +2756АА (OR=2,43), MTRR +66G (OR=l,52), TYMS -1053C (OR=l,57), TYMS -1053CC (OR=2,12), TYMS -1122A (OR=l,67), MTR +2756AG (C)R=0,30), MTHFR +1298AC (C>R=0,44), TYMS -1053CT (C)R=0,41) и восемь комбинаций генетических полиморфизмов MTHFR +1298А>С, MTRR +66A>G, MTR +2756A>G, SHMT1 +14200T, TYMS -1053C>T, TYMS IVS6-68OT, TYMS -1122A>G, причем две комбинации полиморфных вариантов TYMS IVS6-68TT, TYMS -1122А (OR=4,43) и MTHFR +1298C, MTR +2756GG, (OR=8,49) являются факторами риска развития ПЭ 1-ой степени тяжести, а восемь комбинаций MTRR +66АА, MTR +2756AG (OR=û,22), SHMT1 +1420C, MTHFR +1298A, TYMS -1053C (OR=û,49), SHMT1 +1420C, TYMS -1053C, MTR +2756A (OR=û,48), SHMT1 +1420C, TYMS -1053C (C)R=0,48), SHMT1 +1420C, MTHFR +1298A.7TMS IVS6-68C (OR=û,53), SHMT1 +1420C, MTR +2756A (OR=û,48), MTHFR +677C, MTRR +66AA, MTR +2756G (OR=0,30), TYMS IVS6-68C, MTR +2756A (OR=0,39) оказывают протективное влияние на формирование ПЭ 1-ой степени тяжести.

Во-вторых, выявлен ряд протективных комбинаций изучаемых генетических вариантов ферментов фолатного цикла, ассоциированных с развитием преэклампсии средней и тяжелой степеней (рис.3). Установлено, что сочетание аллелей MTHFR +1298А, TYMS IVS6-68C, TYMS -1122А, MTR +2756A среди беременных с ПЭ средней и тяжелой степеней встречается в 64,60%, а у индивидуумов с физиологическим течением гестации этот показатель составляет 81,38% (р=0,002, pperm=0,01, ÛR=0,42, 95% CI 0,24-0,74). Распространенность сочетания полиморфных вариантов SHMT1

+1420С, MTHFR +1298A, TYMS IVS6-68C, TYMS -1122A в группе пациенток с ПЭ 2-3 степеней тяжести равна 58,41%, тогда как у беременных контрольной группы - 75,00% (р=0,003, pperm=0,02, ÛR=0,47, 95% CI 0,28-0,79). Комбинация аллелей SHMT+1420С, MTHFR +1298А, MTR +2756А среди беременных с ПЭ 2-3 степеней тяжести наблюдается в 61,29%, тогда как у пациенток с физиологическим течением гестации - в 76,62% (р=0,004, Pperm=0,02, OR=0,48, 95% CI 0,29-0,81). Частота комбинации генетических вариантов MTHFR +1298А, MTRR +66А, MTR +2756А среди беременных с ПЭ 2-3 степеней тяжести составляет 44,09%, что достоверно ниже по сравнению с пациентками контрольной группы (60,53%, р=0,004, pperm=0,02, OR=û,51, 95% CI 0,32-0,83). Сочетание аллелей MTHFR +1298А, TYMS IVS6-68С, MTR +2756A среди индивидуумов, беременность которых осложнилась преэклампсией средней и тяжелой степеней, встречается в 67,23%, тогда как, у лиц контрольной группы это сочетание наблюдается у 81,88% (р=0,004, pPerm=0,02, OR=û,45, 95% CI 0,26-0,80). Выявлено, что комбинация генетических вариантов MTHFR +1298А, MTR +2756А среди пациенток с ПЭ 2-3 степеней тяжестей составляет 72,52%, а в группе беременных без ПЭ этот показатель равен 85,00% (р=0,007, pperm=0,03, OR=0,46, 95% CI 0,26-0,83). Сочетание аллелей MTHFR +1298А, TYMS IVS6-68C, TYMS -1122А, зарегистрированное у лиц с преэклампсией средней и тяжелой степеней тяжести в 69,75%, в контрольной группе женщин встречается у 83,12% (р=0,007, pperm=0,04, C)R=0,47, 95% CI 0,26-0,83). Установлено, что комбинация аллельных вариантов MTHFR +1298A, MTRR +66А, TYMS -1122А, TYMS -1053С среди пациенток, беременность которых осложнилась развитием ПЭ средней и тяжелой степеней наблюдается достоверно реже (41,46%) по сравнению с женщинами с физиологическим течением беременности (56,58%, р=0,009, pperm=0,04, OR=0,54, 95% CI 0,33-0,88). Распространенность сочетания генотипов SHMT +1420С, MTHFR +1298А в группе беременных с ПЭ 2-3 степеней тяжести составляет 66,41%, тогда как, у беременных контрольной группы - 79,27% (р=0,009, ррепп=0,04, OR=0,52, 95% CI 0,31-0,87). Обращает на себя внимание факт того, что, генетический вариант MTHFR +1298А вовлечен в формирование всех 9 значимых комбинаций, являющихся протективными факторами риска развития ПЭ тяжелой степени.

Рис. 3. Вклад генов фолатного обмена в генетическую предрасположенность к преэклампсии П-1П степени тяжести

4. Разработка модели прогнозирования риска развития преэклампсии тяжелого течения на основе генетических данных

В данном разделе работы проведена разработка модели прогнозирования риска развития ПЭ тяжелого течения с учетом индивидуальных особенностей генетических полиморфизмов фолатного цикла и ряда клинических и медико-биологических характеристик. Выборка для исследования составила 155 беременных с ПЭ 2-3-ей степеней тяжести и 95 беременных с ПЭ 1-ой степени тяжести. Для решения этой задачи нами использовался логистический регрессионный анализ [Реброва О.Ю., 2006].

Получена модель прогнозирования риска развития ПЭ II-III степени тяжести, включающая следующие факторы: возраст, наличие в анамнезе инфекций, передающихся половым путем, патология ССС, уровень САД до беременности, уровень фибриногена в крови, генетический вариант по локусу MTRR +66A>G (табл.1).

Таблица 1

Параметры логистической регрессионной модели прогнозирования риска

возникновения преэклампсии 2-3-ей степеней тяжести, разработанная на основе генотипирования полиморфизмов ферментов фолатного цикла

Анализируемые признаки (X]) и их градации Коэффициенты регрессии (Ь;) и уровень значимости (р)

Р

Константа -19,039 0,00000

Наличие в анамнезе инфекций, передающихся половым путем (да-0;нет-1) 0,843 0,02

САД до беременности, мм.рт. ст. 0,057 0,002

Возраст, лет 0,102 0,002

Наличие заболеваний сердечно-сосудистой системы (да-0;нет-1) 2,060 0,00003

Содержание фибриногена в крови, г/л 1,011 0,00004

Генетический вариант по локусу МТКЯ +66А>в ((АА+АО) -1; вв -0) 0,995 0,02

Уровень значимости модели: р=0,00000 (-¿2=65,69; с!£=6, 011=6,06); Процент правильной классификации: беременные с ПЭ тяжелой степени —80%, беременные с ПЭ легкой степени - 61%, в среднем — 72%

Показатель отношения шансов для полученной модели регрессии равен 6,06. Таким образом, при увеличении на единицу значения ¡-го признака, риск развития у беременных ПЭ тяжелой степени увеличивается более чем в 6 раз. Полученная логрессионная модель позволяет оценить риск развития ПЭ 2-3-ей степеней тяжести в 80% случаев ив 61% случаев правильно классифицирует беременных с ПЭ 1-ой степени тяжести.

Работоспособность модели проверена путем дополнительного включения в анализ двух пациенток. У 1-ой пациентки, беременной В., имеющую ПЭ легкой степени тяжести, определены следующие показатели: наличие в анамнезе инфекций, передающихся половым путем - нет, наличие патологии сердечно-сосудистой системы - нет, возраст пациентки - 26 лет,

САД до беременности - 110 мм.рт. ст., содержание фибриногена в крови -5,4 г/л., генетический вариант MTRR +66AG.

Для беременной А., также имеющую ПЭ легкой степени тяжести, были определены следующие показатели: наличие в анамнезе инфекций, передающихся половым путем - нет, наличие патологии сердечно-сосудистой системы- да, возраст пациентки - 23 лет, САД до беременности - 90 мм.рт. ст., содержание фибриногена в крови - 3,2 г/л., генетический вариант MTRR +66AG.

Подставляя значения в уравнение регрессии для беременной В. получили:

у=-19,039+0,843*1+0,057*110+0,102*26+2,060*1+1,011*5,4=-2,7, а

Р = 2,72"2'7/ (1+2,72"2'7) или (1/2,722,7) / 1+ (1/2,722'7) =0,06,

т.е. вероятность риска развития преэклампсии тяжелой степени у беременной В. незначительна и составила около 6%.

Для беременной А. уравнение регрессии имеет следующий вид:

у=-19,039+0,843*1+0,057*90+0,102*23+2,060*0+1,011*3,2=-7,5, соответственно Р = 2,7J7'5/ (1+2,72"7'5) или (1/2,727'5) / 1+ (1/2,727,5) =0,84, т.е. вероятность риска возникновения ПЭ 2-3-ей степеней тяжести у пациентки А. высока и составляет около 84%.

Выводы

1. Полиморфные варианты генов фолатного обмена MTHFR +677С>Т, MTHFR +1298А>С, TYMS -10530Т, TYMS IVS6-68C>T, TYMS -1122A>G, SHMT1 +14200Т, MTR+2156A>G, MTRR +66A>G вовлечены в подверженность к формированию преэклампсии у женщин Центрального Черноземья России.

2. Генотип TYMS IVS6-68TT (OR=3,65) и комбинации генетических вариантов MTHFR +1298СС, MTHFR +677Т (OR=6,47) повышают риск развития ПЭ. Шесть комбинаций аллелей MTHFR +1298А, SHMT1 +1420С, MTR+1166А, TYMS -1053С, TYMS IVS6-68C, TYMS -1122A оказывают протективное влияние на формирование ПЭ (OR=0,49 - 0,54).

3. Развитие ПЭ у женщин без отягощенного семейного анамнеза связано с генетическими вариантами MTR +2756G (OR=l,ll), MTR +2756GG (OR=7,26), TYMS IVS6-68T (OR=l,49) и восемью комбинациями генетических полиморфизмов ферментов фолатного обмена, имеющих протективную направленность (OR=û,38 - 0,47). Комбинация генетических вариантов MTHFR +1298СС и MTHFR +6111 (OR=8,28) определяет повышенный риск развития ПЭ, а сочетание аллелей MTHFR +1298А и TYMS IVS6-68C (OR=û,43) снижает риск формирования ПЭ у женщин с отягощенной наследственностью.

4. Предрасположенность к развитию преэклампсии тяжелой степени связана с девятью комбинациями полиморфных локусов MTHFR +1298А>С, MTRR +66A>G, MTR +2756A>G, TYMS -10530T, TYMS -U22A>G, TYMS IVS6-68TT, SHMT1 +14200T (QR=0,42 - 0,54).

5. Прогностически значимыми факторами при оценке индивидуального риска развития ПЭ тяжелой степени являются возраст женщины, наличие в анамнезе инфекций, передаваемых половым путем, патологии сердечнососудистой системы, уровень систолического артериального давления до беременности, содержание фибриногена в крови, генетический вариант по локусу MTRR +66A>G (OR=6,06).

Практические рекомендации

1. При прегравидарной подготовке женщин с целью формирования группы риска по развитию преэклампсии рекомендуется проводить молекулярно-генетическое тестирование локусов MTHFR +1298А>С, MTHFR +6770Т, SHMT1+14200T, MTR +2756A>G, TYMS -10530Т, TYMS IVS6-680Т, TYMS -1122А>С и MTRR +66A>G. Оценку риска развития ПЭ следует проводить на основе генетических данных с учетом наличия/отсутствия отягощенного семейного анамнеза женщин.

2. При оценке индивидуального риска развития ПЭ тяжелой степени рекомендуется учитывать возраст женщины, наличие в анамнезе инфекций, передаваемых половым путем, патологии сердечно-сосудистой системы, уровень систолического артериального давления до беременности, содержание фибриногена в крови, генетические варианты по локусу MTRR +66A>G.

Список сокращений

ПЭ - преэклампсия

АД - артериальное давление

САД — систолическое артериальное давление

ДАД - диастолическое артериальное давление

ССС - сердечно-сосудистые заболевания

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Изучение эпидемиологии мультифакториальной патологии среди населения Центрального Черноземья и оценка роли популяционно-генетических факторов в их распространении / Чурносов М.И., Сорокина И.Н., Лепендина И.Н., Полякова И.С., Верзилина A.B. (Тверская A.B.) // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина. Формация. - 2011. — № 10 (105) Выпуск 14. - С. 239-245.

2. Верзилина, A.B. (Тверская A.B.) Изучение роли наследственных, средовых и молекулярно генетических факторов в генезе развития преэклампсии /Верзилина A.B. // Материалы VI регионального научного форума «Мать и Дитя», Ростов-на-Дону, 2012. — С. 25.

3. Верзилина, A.B. (Тверская A.B.) Изучение клинических особенностей преэклампсии /Верзилина A.B. // Материалы 77-й Российской научной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 80-летию БГМУ «Вопросы теоретической и практической медицины», ТОМ 1. - Курск, 2012.-С. 115.

4. Верзилина, A.B. (Тверская, A.B.) Кпинико-генетическое исследование преэклампсии / Верзилина A.B., Лобач Л.И. // Сборник трудов XIII-ой научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке», посвященной 25-летию Кировской государственной медицинской академии, Киров, 2012.-С. 34.

5. Кокорина О.С. Изучение клинических особенностей преэкламсии в Центрально-Черноземном регионе / Кокорина О.С., Верзилина A.B. (Тверская A.B.) // Материалы 3-й Московской международной конференции «Молекулярная филогенетика MolPhy-3», Москва, 2012. - С. 7116.

6. Верзилина, A.B. (Тверская A.B.) Исследование роли генов-кандидатов в формировании преэклампсии / Верзилина A.B. (Тверская A.B.) // Вестник Российского государственного медицинского университета. -2013,-№2.-С. 189.

7. Кокорина, О.С. Изучение роли полиморфизма IVS6-68 С>Т гена тимидилат-синтазы в развитии патологии беременности / Кокорина О.С., Верзилина A.B. (Тверская A.B.) // Вестник Российского государственного медицинского университета, 2013. - № 1. - С. 18.

8. Тверская, A.B. Ассоциация полиморфных аллелей генов фолатного обмена с развитием преэклампсии / Тверская A.B. // Тезисы VI межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Здоровье женщины - здоровье нации», Белгород. - 2013. - С. 35.

9. Тверская, A.B. Изучение роли комбинаций генетических вариантов генов фолатного обмена в формировании преэклампсии различной степени тяжести / Тверская A.B. / Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2014, № 2. - С. 271.

10. Тверская, A.B. Влияние генетических вариантов +2756A/G MTR, +66A/G MTRR, -1053С/Т TYMS на формирование преэклампсии различной степени тяжести / Тверская A.B., Верзилина И.Н //Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2014, № 2. - С. 275.

Подписано в печать 26.12.2014. Формат 60x84/16 Гарнитура Times. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 358. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИД «Белгород» НИУ «БелГУ». 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85