Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск генов Schizosaccharomyces pombe, участующих в инициации анафазы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грищук, Екатерина Леонидовна, Б. м.

Диссертация представлена в аспирантуру Университета Колорадо

1997.

Оглавление_ 1

Глава 1. Вступление._ 5

Циклы всех клеток регулируются 5

Вступление в митоз 6

События начала анафазы 7

Контроль начала анафазы 8

Убиквитин-зависимый протеолиз 11

Резюме 14

Обзор будущей работы 14

S. pombe, как модельная система 18

Глава 2. Материалы и методы._■ _20

Методы работы с клетками S. pombe 20

Генетические методы 21

Получение диплоида 21

Трансформация клеток S.pombe 22

Молекулярные методы. Методы клонирования 24

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 26

Использование метода Southern blot для подтверждения гомологичной рекомбинации 28

Глава 3. Поиск мутантов Schizosacchfromyces pombe, дефектных в инициации анафазы, используя чувствительность к

ингибитору протеаз, ТРСК._30

Обсуждение 38

Глава 4. Генетический скрининг на митозных мутантов Schizosacchfromyces pombe, дефектных в инициации анафазы.

Описание скрининга и его результатов._45

Характеризация фенотипа штамма tsml-512 52

В качестве модельной системы для изучения процессов, контролирующих анафазу, я использую одноклеточные дрожжи S. pombe. Так как для правильного выхода из митоза требуется деградация специальных белков, то мною был предложен поиск новых мутантов S. pombe, дефектных в инициации анафазы, по их чувствительности к ингибитору протеаз ТРСК (N-Tosyl-L-Phenylalanine Chloromethyl Ketone). Для экспериментальной проверки данного подхода я протестировала 30 митозных мутантов на чувствительность к ТРСК при разрешающих температурах. Чувствительность была обнаружена у 4-х мутантов: cutl-206, cut6-81, cdcl5-136, пис2-663. Белковые продукты трех из них: Cutlp, Cdcl5, Nuc2p, по-видимому, участвуют в анафазном протеолитическом пути. Например, пис2+ кодирует предполагаемый компонент Комплекса Инициации Анафазу (АРС), который необходим для убиквитин-зависимого протеолиза циклина В.

На основе этих данных я провела новый скрининг, направленный на поиск температурочувствительных митозных мутантов, которые также чувствительность к ТРСК. Было обнаружено три таких мутанта, названных tsm, два из которых оказались аллельны к cuti. Один из них, cutl-tsm2, а также новый митозный мутант tsml-512, генетически взаимодействует с пис2-663, подтверждая возможную роль Cutlp и Tsmlp в инициации анафазы.

Для изучения золи Tsmlp я изучила фенотип мутации tsml-512

при рестриктивных температурах. При 36°С клетки временно

приостанавливаются во втором митозе, но затем выходят из митоза,

судя по удлинению веретена. Однако хромосомы часто сегрегирует

неправильно. При попытке клонирования гена tsml+, мною был

выделен экзогенный супрессор - Stolp. Делеция stol+ приводит к

митозному аресту при отсутствии веретена. Предсказанная белковая

3

ГЛАВА 1.

ВСТУПЛЕНИЕ.

Циклы всех клеток регулируются.

Циклы роста и деления присущи клеткам всех животных, растений и одноклеточных организмов. Регуляция этих циклов строго регламентирована, чтобы гарантировать надлежащий органу морфогенез и здоровье во взрослом состоянии. Сбой в контроле клеточного цикла может привести либо к клеточной смерти, либо к раку, таким образом глубокое понимание соответствующих регуляторных путей является важным. Традиционно считают, что клеточный цикл состоит из четырех фаз: период репликации ДНК (S-фаза), фаза расхождения хромосом и клеточного деления (М-фаза) и две вклинивающиеся фазы (интерфазы) или "промежутки" - Gj и G2-Прохождение через клеточный цикл требует последовательной активации различными циклинзависимыми протеинкиназами (CDKs) (Nigg, 1995). Эти ферменты контролируются временной ассоциацией с регуляторными субъединицами: циклинами, которые нужны для их активации, и ингибиторными полипептидами, которые супрессируют их (Morgan, 1995). Существуют также обратимые реакции фосфорилирования, которые либо ингибируют, либо увеличивают активность каталитических субъединиц. Клетки отвечают на активацию данных протеинкиназ в зависимости от состояния или присутствия.отсутствия их субстратов (Nasmyth, 1996). Прохождение через клеточный цикл находится под воздействием по крайней мере двух типов контроля. Внеклеточные сигналы, такие как концентрация ростовых факторов или питательных веществ, гарантируют, что норма клеточной пролиферации координируется с нормой клеточного роста. Другой контроль, называемый checkpoint, происходит из внутренней части; этот контроль направлен на то, чтобы координировать

различные события клеточных циклов в пространстве и времени (Murray, 1991; Murray, 1992).

Вступление в митоз.

Ключевой составляющей путей контроля митоза является серин-треонин киназа р34с^ и ее положительная регуляторная субъединица - циклин В. Вместе они образуют М-стимулирующий фактор (MPF), универсальный индуктор митоза (Maller, 1990; King et al., 1994). Активация этой киназы нуждается в адекватных питательных веществах, а также в удачном завершении S-фазы. В G2/M переходе общее количество внутриклеточных белок-связанных фосфотаз увеличивается сильно, показывая, что фосфорилирование составляет главный механизм, вызывающий глубокую структурную реорганизацию, которая сопровождает вступление в митоз.

У позвоночных типичные события митоза включают конденсацию хромосом, разрушение ядерной оболочки, разборку цитоплазматического цитоскелета и образование митотического веретена (Mcintosh & Hering, 1991; Gorbsky, 1992; Koshland, 1994). Сравнительно мало известно о физиологических субстратах для MPF, которые вызывают эти сильные (кординальные) перестройки (Nigg, 1995). Возможно лучше всего понятен процесс разборки ламин, который сопровождает разрушение ядерной оболочки. По-видимому, это является результатом прямого фосфорилирования ламина с помощью сс1с2/циклин В киназы (Nigg, 1992). Есть также данные, что MPF и другие киназы контролируют сборку веретена и динамику микротрубочек (Lamb et al., 1990; Verde et al., 1990), однако не много известно о сборке других структур, необходимых для расхождения хромосом, к примеру о созревании кинетохора.

Предполагается, что сборка кинетохора имеет место в результате сборки белковых факторов на специфических последовательностях ДНК на определенном хромосомном локусе (Earnshaw & Tomkiel,

1992). Под электронным микроскопом кинетохоры прометафазных хромосом выглядят триламинарными структурами, имеющими дискообразную форму. Их точный молекулярный состав еще неизвестен, но было показано, что ряд белков, включая микротрубочко-зависимые двигатели, располагаются на кинетохорах (например, Нушап & МйсЫбоп, 1991). Эти моторы и, вероятно, некоторые до сих пор не идентифицированные белки придают кинетохорам способность захватывать микротрубочки и двигаться вдоль них. Микротрубочки образуют ядро таким образом, что их минус концы находятся около центросом и их плюс концы являются свободными для взаимодействий с кинетохором. В начале митоза число и лабильность микротрубочек, которые растут из центросом, увеличивается, в то время как средняя длина микротрубочек уменьшается. Зрелые веретена возникают, когда две центросомы расходятся и становятся полюсами веретена. Некоторый набор микротрубочек, вырастающих из каждого из этих полюсов, взаимодействует с их аналогами с противоположных полюсов. В это время фосфорилирующие участки, которые узнаются различными антителами, присутствуют на обеих центросомах и кинетохорах, но киназы, ответственные за эти участки, так же как и их субстраты, неизвестны (Уапёге & Вопзу, 1989; ОогЬвку & Ri.cket.ts, 1993; \¥ез1епс1ой' et а1, 1994; Таа§ерега et а1., 1995). В результате взаимодействия между микротрубочками, кинетохорами и центросомами хромосомы достигают биполярного прикрепления и выстраиваются в линию на экваторе веретена.

События начала анафазы

Переход в новую митотическую стадию, которая называется анафаза, отмечает необратимое намерение выйти из митоза и войти в следующую фазу роста. Не только центросомы расходятся и хромосомы расходятся, но также события, которые готовят клетку к

делению, постепенно обращаютс на противоположные. Многие из веретен микротрубочек, включая те, которые соединены с кинетохорами, укорачиваются в результате деполимеризации их плюс концов (анафаза А). В то же время и полюсные микротрубочки веретена и астральные микротрубочки удлиняются, приводя к дальнейшему расхождению центросом (анафаза В). Центросомы изменяют свою степень фосфорилирования (Vandre & Borisy, 1989) и теряют свою способность инициировать новые трубочки (Snyder et al., 1982). Вскоре после этого ядерная оболочка восстанавливается, хромосомы деконденсируются и происходит физическое разделение клетки на две дочерние (цитокинез).

Контроль начала анафазы

Начало анафазы представляет собой один из тех ключевых переходов в клеточном цикле, успех которого является жизненно важным для выживания организма. К примеру, удлинение веретен никогда не должно встречаться раньше выравнивания хромосом на экваторе веретена, в то же время цитокинез никогда не должен предшествовать удлинению веретена. Поэтому обязательно, чтобы все события анафазы были упорядочены во времени. Имеет место

значительное уменьшение степени фосфорилирования белка,

>

сопутствующего митотическому выходу, таким образом возвращение к стадии интерфазы может просто отражать синхронное возвращение событий фосфорилирования, которое имело место в G2/M переходе. Эта точка зрения в значительной мере подтверждается способностью ингибиторов протеин-фосфатаз вмешиваться в митотический выход (Vandre & Wills, 1992; Wolniak & Larsen, 1992). Более того, мутация генов протеинфосфатазы или их регуляторных субъединиц делает дрожжевые клетки неспособными закончить митоз должным образом (Kinoshita et al., 1990; Kinoshita et al, 1991; Ohkura & Yanagida, 1991). Точно также как активация MPF ответственна за реакции

В

фосфорилирования начала митоза, реакции дефосфорилирования, которые имеют место в анафазе, кажется, происходят из потери активности MPF. Из-за совпадения этих событий, связанных с де-фосфорилированием белков в основные этапы анафазы, было предположено, что координация разных событий анафазы достигается через инактивацию MPF в начале анафазы. Известно, что инактивация MPF происходит из-за деградации ее регуляторной субъединицы циклина В, таким образом было предположено, что протеолиз циклина В запускает начало анафазы (Hunt, 1991).

Идея, что деградация циклина В является первичным событием, которое запускает анафазу, согласуется с экспериментами в клетках HeLa, в которых экспрессия недеградированных циклинов вызвало задержку клеточного цикла с конденсированными хромосомами (Gallant & Nigg, 1992). В то время это было интерпретировано как метафазная задержка, хотя хромосомы не выстраивались в линию на метафазной плоскости, и наблюдались эктопические микротубулярные центры. Данные в пользу важности деградации циклина в начале анафазы, казалось, следуют из экспериментов, с ингибиторами протеаз. Shoji-Kasai с соавторами (Shoji-Kasai et al., 1988) применили к клеточной линии карциномы человека ингибитор цистеиновых протеазы Е-64, который может необратимо связываться с остатками цистеина, образуя тиоэфир. Они наблюдали, что многие клетки в культуре остались приостановленными в метафазе по крайней мере на пять часов, что значительно больше, чем период метафазы в необработанных клетках. Было обнаружено, что другой ингибитор цистеин протеазы, ALLN, тормозит некоторые переходы клеточных циклов в клетках СНО - Gj/S и переход метафаза-анафаза (Sherwood et al., 1993). Последняя остановка коррелирует с торможением деградациии циклина В и продолжительной активацией активности киназы HI.

Развитие оплодотворенных яиц морского ежа может быть задержано между метафазой и анафазой действием TLCK,

алкилирующего агента, который тормозит действие трипсинподобной протеиназы (Репп et а1, 1976). Это также полностью блокирует нормальное митотическое деление в эмбрионах лягушки (Б. Ьиса, личное сообщение). Подобное исследование ингибиторов было также проведено в бесклеточной системе эмбрионов двухстворчатых моллюсков, где деградация циклинов могла быть прослежена биохимически (Ьиса & Киёегшап, 1989). Возможно и не удивительно, что ряд ингибиторов, включая ингибиторы протеаз и киназ, могли полностью блокировать деградацию циклина. ТЬСК и сходное соединение с ТРСК были самыми сильными среди них, в то время как Е-64 не действовал. Эти исследования подчеркнули важности деградации белков для начала анафазы и хорошо согласуются с гипотезой, что циклин В был решающим субстратом.

Многие последние исследования показывают, однако, что начало анафазы может произойти в экспериментальных условиях, где активность сс1с2: циклин В киназы остается высокой. Отсюда следует, что инактивация МРБ и отделение сестринских хроматид с последующей элонгацией веретена деления, являются независимыми событиями. Бигапа и др. обнаружили, что сверхпроизводство митотического циклина В-типа в почкующихся дрожжах ведет к остановке цикла после анафазы с разъединенными хроматидами и элонгированным веретеном (этапа et а1., 1993). Точно так же в экстрактах яиц лягушек добавление недеградированной формы циклина В предотвращает инактивацию МРБ, но не блокирует отделение сестринских хроматид (Но11о\уау et а1, 1993). Эти результаты все еще согласовывались с той идеей, что МРБ играет главную роль в поздних событиях анафазы, таких как деконденсация хромосом, разборка веретена и реформация ядерной оболочки, но они показали, что деградация циклина В не может быть первичным сигналом для разъединения хроматид и элонгации веретена. Удивительно, однако, что как деградация циклина, так и инициация

анафазы кажется зависят от активации протеолитической системы, зависимой от убиквитина (см. ниже).

Убиквитин-зависимый протеолиз.

Регулируемый оборот белков, связанный с убиквитином, возникает как первичный механизм для регулирования перехода через клеточный цикл (Deshaies, 1995; Murray 1995; Hochstrasser, 1995; King et al., 1996). Деградация митотических циклинов во время анафазы, зависимая от убиквитина, была первой такой обнаруженной регуляцией клеточного цикла (Glotzer et al., 1991). Этот механизм включает прикрепление маленького протеина, убиквитина, через ковалентную связь между его -карбоксил-группой и лизин -аминогруппами акцепторных белков. Множественные остатки лизина циклина В функционируют как акцепторные сайты убиквитина, но нет никакого единственного остатка лизина, необходимого для его деградации (King et al., 1996).

Были предложены несколько eis сигналов, которые метят белок для убиквитинации (Hilt & Wolf, 1996). Митотические циклины содержат "деструктивный бокс». Другие субстраты, включающие некоторые циклины Gj из S. cerevisiae содержат "PEST" последовательности, состоящие из областей богатых пролином, аспартановой и глутаминовой кислотами, серином и треонином (Rechsteiner & Rogers, 1996). Убиквитинация осуществляется комплексной энзимной системой, состоящей из El (активирующих) энзимов, Е2 (конъюгирующих) энзимов и, в некоторых случаях, ЕЗ (лигирующих) энзимов (Hochstrasser, 1995). В реакции, зависимой от АТР, убиквитин сначала активируется El, с которым он становится связанным макроэргичной тиоловой связью. Этот комплекс затем реагирует с одним из многих различных энзимов Е2, переносящих связанный убиквитин от El к Е2. Энзим Е2, часто с дополнительным

фактором ЕЗ, катализирует образование изопептидного связывания между убиквитином и субстратом. Дополнительные молекулы убиквитина обычно добавляются к субстрату тем же самым энзимным каскадом с образованием цепи или цепей молекул убиквитина в изопептидной связи друг с другом. Кажется, энзимы Е1 не являются специальными, в то время как Е2 может переносить убиквитин или прямо к их мишеням in vitro, или только в присутствии ЕЗ. Высокая специфичность, предполагается, идет от энзимов ЕЗ, которые содержат сайты связывания как для конкретного Е2, так и для подходящей мишени протеина. Не взирая на пути убиквитинации, деградация таких мульти-убиквитинированных протеинов происходит на большом мультикаталитическом белковом комплексе, 26S протеосоме.

Некоторые открытия способствовали реализации того, что расхождение сестринских хроматид и удлинения веретена возможно зависит от убиквитин-зависимой деградаци какого-либо протеина помимо циклина В. Holloway с сотр. открыли, что присутствие многих копий N-терминального фрагмента циклина В, которые содержали циклин "destruction box" и, как считается, конкурирует с эндогенными субстратами из-за убиквитинации, ингибирует расхождением сестринских хроматид в экстрактах лягушачьих яиц (Holloway et al., 1993). Аналогичным образом, метилированный убиквитин, который ингибирует убиквитин-зависимый протеолиз путем препятствия формирования поли-убиквитиновых цепей, задерживает расхождение сестринских хроматид. Согласуясь с открытием того, что деградация циклина В не требуется для начала анафазы, как цитировалось выше, эти открытия позволяют предположить, что помимо митотических циклинов и другие белки должны быть деградированными, чтобы вызвать расхо�