Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная консервативность и взаимодействие основных компонентов ядерных РНК-полимераз I, II и III эукариот

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Шпаковский, Георгий Вячеславович, Москва

■ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи УДК 577.214.(337+622)

ШПАКОВСКИИ Георгий Вячеславович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ КОНСЕРВАТИВНОСТЬ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ ЯДЕРНЫХ РНК-ПОЛИМЕР A3 I, II И III ЭУКАРИОТ

03.00.03 - Молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

в виде научного доклада „ . III на соискание ученоистецеМ Доктора Оищшическ"

Президиум ВАК России

(решение от " №

присудил ученую степень ДОКТ$$А

In ЧЯ Л 7-.Т-ТХТТГ 17ТГГ!я/й

МОСКВА - 2002 Щук

-7 Я Л ЪТТЫГГ ЛПТПЯиб Л ату.тх.ет ТЭ A ТУ

наук

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного ЗнамениИнституте биоорганической химии им.М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук.

.РОССИЙСКАЯ ,

* ■■вибшидка

Официальные оппоненты: ~ ^Q £ ^ ^ ^ '

доктор химических наук, U

академик РАН, профессор ' Е.Д. Свердлов (Институт молекулярной генетики РАН)

доктор химических наук,

член-корреспондент РАН, профессор С.Н. Кочетков

(Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН)

доктор биологических наук, профессор ; А.А. Колесников

(биологический факультет МГУ ям. М.В. Ломоносова, кафедра молекулярной биологии)

Ведущая организация -? Институт биологии гена РАН (Москва).

Защита состоится "25" апреля 2002 года в 10 часов на заседании, специализированного совета Д 002.019.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова. РАН по адресу: 117997 ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Диссертация в виде научного доклада разослана "25" марта 2002 года.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук, профессор

I $

В.А. Несмеянов

Актуальность проблемы. Одним из универсальных молекулярно-биологических процессов является транскрипция, т.е. синтез молекул РНК на ДНК-матрицах. Будучи первой стадией экспрессии генетического материала клеткй^ транскрипция представляет собой важнейший этап регуляции всех последующих процессов развития и дифференцировки. По сравнению с прокариотами (эубактериями и археями) эукариотические организмы имеют гораздо более сложный аппарат транскрипции, включающий три ядерные ДНК-зависимые РНК-полимеразы и множество других белковых факторов, участвующих в различных этапах синтеза РНК, прежде всего в инициации. Индивидуальные функции и пространственная структура многих компонентов эукариотических РНК-полимеразных комплексов все еще неизвестны, что делает невозможным построение детальной картины функционирования транскрипционного аппарата эукариот. Вместе с тем, выяснение подробной схемы взаимодействия субъединиц ядерных РНК-полимераз между собой и понимание функциональной роли каждого отдельного компонента в составе этих ферментных комплексов дадут возможность подойти к направленной регуляции экспрессии генетического материала в живой клетке.

Хотя биохимические исследования РНК-полимераз эукариот были начаты еще в 60-ые гг, к середине 90-х гг хорошо изученными с точки зрения биохимии (выделение, субъединичный состав, стехиометрия) и молекулярной генетики (клонирование и секвенирование генов различных субъединиц, картирование на хромосомах, получение условных и нокаут-мутантов) были только ядерные РНК-полимеразы I-Ш пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae, причем даже в этом случае получение условно дефектных мутаций по функциям отдельных субъединиц методами классической генетики было не очень успешным. Ограниченность нашего знания о механизмах сборки и функционирования РНК-полимераз эукариот частично объясняется чрезвычайной сложностью этих ферментов, в состав которых входит большое число субъединиц: 12-14 - в РНК-полимеразе I, 12 - в РЖ-полимеразе П и 17 - в тт1----------I субъединиц варьирует от

альной консервативности КНИГА ИМЕЕТ ' жот> разработка новых

Цель и задачи исследования. Основной целью работы явилось изучение структурной и функциональной консервативности различных компонентов базового аппарата транскрипции эукариотической клетки. Для этого к изучению ядерных РНК-полимераз 1-Ш планировалось впервые применить метод межвидовой комплементации и систематически использовать его для детальной характеристики аппарата транскрипции делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe, а также субъединиц РНК-полимеразы П человека. В ходе выполнения работы решались следующие основные задачи:

1. Молекулярное клонирование и структурно-функциональная характеристика кДНК и генов всех основных субъединиц ядерных РНК-полимераз Sch. pombe, прежде всего генов семи общих субъединиц (Rpb5, Rpb6, Rpb8, RpblO, RpclO, Rpc40 и Rpcl9).

2. Систематическое исследование способности всех субъединиц РНК-полимераз 1-Ш делящихся дрожжей Sch. pombe и РНК-полимеразы П человека (Homo sapiens) замещать in vivo гомологичные субъединицы пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae и выполнять соответствующую функцию в составе мозаичных РНК-полимеразных комплексов.

3. Получение (с помощью межвидовой комплементации in vivo и мутагенеза in vitro) условных мутантов дрожжей S. cerevisiae, дефектных по функциям некоторых субъединиц РНК-полимераз 1-Ш и поиск генетических супрессоров этих мутационных изменений.

4. Локализация на примере отдельных субъединиц основных структурно-функциональных участков (доменов) и аминокислотных остатков, строго необходимых для функции этих белков.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые продемонстрирована взаимозаменяемость отдельных субъединиц ядерных ДНК-зависимых РНК-полимераз между эволюционно далёкими видами эукариот, и тем самым положено начало новому направлению структурно-функциональных исследований этих многосубъединичных ферментов (Shpakovski, 1994, Gene, 147, 63-69; Shpakovski et al., 1995, Mol. Cell. Biol., 15, 4702-4710). Впервые путём прямой межвидовой комплементации клонирована кДНК незаменимого компонента РНК-полимераз эукариот, общей субъединицы RpblO. Использованный подход оказался также эффективным в генерировании условных мутантов дрожжей по специфическим функциям отдельных субьединиц: получены термочувствительные мутанты S. cerevisiae по субъединицам Rpal2, Rpb8, RpblO, Rpbll, Rpb3 и Rpc40 (Shpakovski et al., 1995, Mol. Cell. Biol., 15, 4702-4710; Шпаковский,

Лебеденко, Тюрьо, 1997, Биоорган, химия, 23, 110-117; Shpakovski, Shematorova, 1999, Curr. Genet., 36,208-214, Shpakovski et al., 2000, J. Mol. Biol., 295,1119-1127).

На примере субъединиц N (RpoN) и RpblO впервые показано функциональное родство малых субьединиц РНК-полимераз архей (надцарство Archaea, субъединица N) и эукариот (Eucarya, субъединица RpblO). В составе этого семейства субъединиц выявлены структурно-функциональные домены, специфичные для эукариот, и для одного из них установлена важная роль в процессах сборки и функционирования РНК-полимеразы I (Шпаковский, Лебеденко, Тюрьо, 1997, Биоорган, химия, 23, 110-117; Gadal, Shpakovski, Thuriaux, 1999, J. Mol. Biol., 274, 8421-8427).

Проведено первое систематическое исследование межвидовой комплементации в клетках дрожжей S. cerevisiae всех субъединиц РНК-полимеразы П Sch. pombe и Н. sapiens и всех субъединиц РНК-полимеразы I Sch. pombe. В результате выявлены новые функционально важные домены в субъединицах RpblO и Rpbll.

Проведен анализ генетических супрессоров по функциям субъединиц Rpb8, RpblO, Rpb3 и Rpbll, в результате которого найдены новые генетические партнеры этих субъединиц: RPB6, RPC160 [RPC1], UBI2 и SSD1 для субъединицы Rpb8 (Шпаковский, Лебеденко, 1997, Цитология, 39, 122-123); Fet5 и SRP40 для субъединицы RpblO; RPB11 и RPB10 для субъединицы Rpb3 (Shpakovski et al., 2000, J. Mol. Biol., 295, 1119-1127). Гетерологичный супрессор генетического дефекта субъединицы RpblO РНК-полимераз I-Ш, Fet5 из Sch. pombe, стал прототипом нового семейства GTP/ATP-связывающих белков (Шпаковский, Лебеденко 1997, Биоорган, химия, 23,234-237).

Выявлены основные структурно-функциональные домены общих субъединиц РНК-полимераз I-Ш эукариот RpblO и Rpb8. С помощью сайт-направленного мутагенеза консервативных позиций определены аминокислотные остатки, необходимые для функционирования этих субъединиц.

Практическая ценность работы заключается в получении условных (термочувствительных) мутантов, дефектных по функциям отдельных субъединиц эукариотических РНК-полимераз (RpblO, Rpb8, Rpal2, Rpb3, Rpbll, Rpc40, Rpc25). Эти мутанты, а также штаммы S. cerevisiae с мозаичными РНК-полимеразами, содержащими в своем составе субъединицы Rpb5, Rpb6, RpclO, Rpb4, Rpb7, Rpcl9, Rpc40, Rpa49 и Rpal2 Sch. pombe или hRPB4, hRPB6, hRPB8, hRPBlOp, hRPBlOa, hRPBllba человека, могут быть использованы для дальнейшего исследования взаимодействий и изучения роли отдельных субъединиц в составе РНК-полимераз I, П и Ш. Практическая значимость работы подтверждается тем, что впервые примененный нами к изучению ядерных РНК-полимераз

эукариот генетический метод межвидовой комплементации в настоящее время активно применяется для анализа функций отдельных субъединиц рядом других лабораторий (см. Khazak et al., 1995; McKune et al., 1995; Chedin et. al, 1998; Voutsina et al., 1999; Imai et al., 1999).

Результаты работы сыграли значительную роль в завершении секвенирования и в аннотировании генома Sch. pombe международным консорциумом. Секвенирование (в рамках совместной работы с Сэнгеровским Центром, Хинкстон, Великобритания) геномных клонов pYUK71, pYUL23 и pYUG7, полученных в этой работе, позволило ликвидировать три пробела на карте хромосомы I делящихся дрожжей (http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_pombe/cioneres.shtml). В процессе анализа и аннотирования генома Sch. pombe предложены унифицированные, обобщающие номенклатуры генов цитоплазматических рибосомных белков и субъединиц РНК-полимераз 1-Ш, а также составлены первые полные реестры факторов транскрипции и субъединиц медиаторного комплекса РНК-полимеразы П Sch. pombe (Шпаковский и др., 1999, Биоорган, химия, 25,450-463; Wood et al., 2002, Nature, 415, 871-880).

Апробация полученных результатов. Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: 16-й Международной конференции "Генетика и молекулярная биология дрожжей" (Вена, 1992); Международных совещаниях по транскрипции (Париж, 1994; Гейдельберг, 1995); Конференции по раковым клеткам "Механизмы эукариотической транскрипции" (Колд Спринг Харбор, 1995); ХП и ХШ Всероссийских симпозиумах "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 1996 и 1999); П-IV съездах Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1996, 1998 и 2000); Ш-V чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 1996, 1998 и 2000); XL и XLI научных конференциях Московского физико-технического института "Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук" (Долгопрудный, 1997 и 1998); Европейском конгрессе по молекулярной биологии клетки ВСВО'97 (Брайтон, 1997); Втором съезде Биохимического общества Российской академии наук (Москва, 1997); III, IV и V Международных Энгельгардтовских конференциях по молекулярной биологии (Москва-Ярославль-Москва, 1997, Москва-Углич-Кижи-Валаам-Санкт-Петербург, 1999 и Москва-Горицы-Москва, 2001); Конференция, посвященной 30-летию журнала "Молекулярная биология" (Москва, 1997); Международной конференции "Молекулярная генетика и биотехнология" (Минск, 1998); 25-м Юбилейном съезде Федерации Европейских Биохимических обществ (Копенгаген, 1998); 3-й и 4-й

конференциях по транскрипции Европейской молекулярно-биологической лаборатории /EMBL/ (Гейдельберг, 1998 и 2000); Международной конференции "Проблемы микробиологии и биотехнологии" (Минск, 1998); Первой международной конференции по делящимся дрожжам (Эдинбург, 1999); Международной конференции "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология" (Москва-Минск, 2001), Международных генетических конференциях, посвящённых 100-летию Н.В. Тимофеева-Ресовского (Минск, 2000) и 100-летию А.Р. Жебрака (Москва, 2002).

Циклы работ по изучению аппарата транскрипции эукариот, в которых были представлены отдельные этапы этого исследования, получили премию I степени журнала «Биоорганическая химия» за 1997 г. и Главную премию МАИК «Наука/Интерпериодика» за 1998 г. по группе биологических наук.

Основные результаты работы и выводы изложены в обобщенном виде в настоящем докладе. Работа выполнена в 1992-2001 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 55 работ (29 статей). Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке и проверке предложенных в настоящей работе экспериментальных подходов, обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в непосредственном участии во всех этапах исследования - от постановки задачи, проведения экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. ИССЛЕДОВАНИЯ БАЗОВОГО АППАРАТА ТРАНСКРИПЦИИ ДЕЛЯЩИХСЯ ДРОЖЖЕЙ Schizosaccharomyces pombe

Делящиеся дрожжи Schizosaccharomyces pombe - это одноклеточные организмы, которые представляют собой рано отделившуюся ветвь аскомицетов (класс Archiascomycetes) и эволюционно далеки как от млекопитающих, так и от почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Sipiczki, 1995). Будучи с генетической и биохимической точек зрения почти таким же удобным объектом, как 5. cerevisiae, делящиеся дрожжи во многих аспектах (клеточный цикл и механизм деления, строение центромер, морфология аппарата Гольджи, котрансляционный транспорт белков через мембрану эндоплазматического ретикулума, молекулярный механизм подвижности митохондрий,

организация системы сплайсинга мРНК и, что наиболее важно в контексте данной работы, механизм определения точки начала транскрипции в случае РНК-полимеразы П) гораздо более схожи с клетками животных, и сходство какого-либо процесса у S. cerevisiae и Sch. pombe практически означает универсальность его механизмов для всех эукариот.

1. Общие субъединицы ядерных РНК-полимераз I, II в III

К началу данной работы наименее изученными компонентами ядерных РНК полимераз эукариот были общие субъединицы. Прежде всего это относилось к пяти незаменимым субъединицам, которые входят в состав всех трёх РНК-полимераз и не имеют гомологов среди компонентов эубактериального фермента. Работа была начата с клонирования кДНК и генов пяти общих субъединиц ядерных РНК-полимераз I-Ш Sch. pombe. Дня обнаружения нужных нуклеотидных последовательностей были использованы четыре основных подхода: амплификация с помощью ПЦР и вырожденных олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе информации о структуре консервативных районов гомологичных субъединиц РНК-полимераз из разных организмов; поиск в базах данных участков ДНК, возможно представляющих собой фрагменты генов субъединиц и их последующая амплификация с помощью ПЦР на специфических затравках; просеивание клонотек с помощью ПЦР или гибридизации колоний на фильтрах со специфическими олигонуклеотидами; поиск нужных кДНК в экспрессирующей кДНК-клонотеке с помощью генетического метода межвидовой комплементации.

1.1. Клонирование и структурно-функциональный анализ генов, кодирующих субъединицы ЯрЬб и Rpb8

Две пары вырожденных олигонуклеотидных праймеров

5'-YTVYWRGGTACCKTBDKIAAYTG и 5'-GCTCTAGAVRTGTCTTATTTTGTG (для гена грЪ6+) и 5'-CGGGATCCTACAAAATGKSKGRRWSYSTNYT И 5'-GCGGAATTCTTAYCTYCTWARWMRWARRTA (для грЬ8+) были сконструированы (с учетом частоты встречаемости кодонов у Sch. pombe) к консервативным областям соответствующих генов, выявленным при сравнении гомологичных нуклеотидных последовательностей S. cerevisiae и Homo sapiens. Амплификация ДНК экспрессирующей кДНК-клонотеки Sch. pombe штамма 972h" (Becker et al., 1991) с помощью ПЦР и каждой из этих пар праймеров позволила получить и секвенировать фрагменты кДНК грЬ6+ и rpb8* Sch. pombe длиной около 400 п.о. На основании полученной структурной информации были сконструированы две пары уникальных (специфических для каждого гена) праймеров, которые были использованы для

просеивания геномной и кДНК-клонотек делящихся дрожжей по методу последовательных разведений (Shpakovski G.V., Gene, 1994).

Секвенирование геномной и кДНК-вставок в найденных клонах позволило определить интрон-экзонную структуру генов грЬ(Г и rpb8+ Sch. pombe, а также вывести аминокислотную последовательность субьединиц Rpb6 и Rpb8 и рассчитать их молекулярную массу (табл. 1).

Высококонсервативная у Sch. pombe и S. cerevisiae С-концевая половина белка Rpb6 (более 90% идентичности), по-видимому, представляет собой наиболее важный функциональный домен, а N-концевая часть субъединицы обусловливает её высокую кислотность (значения р/ соответственно 4.1 и 5.1) и аномальную электрофоретическую подвижность (рис. 1). С помощью гибридизации по Саузерну иммобилизованной геномной ДНК Sch. pombe со специфическими олигонуклеотидами было определено, что ген rpbS* представлен в геноме делящихся дрожжей единичной копией. Рядом с геном грЬ6*~ в геноме Sch. pombe расположен транскрибируемый в противоположном направлении нолноразмерный ретротранспозон Tf2 делящихся дрожжей (Shpakovski G.V., Gene, 1994), секвенирование которого позволило впервые детально сравнить строение двух семейств ретроэлементов Sch. pombe, Tfl и ТС. Именно в ходе этой работы была с�