Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная и функциональная характеристика генов, кодирующих субъединицы РНК-полимеразы I делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шематорова, Елена Константиновна

Список сокращений.

Введение

1. Структура и функции ядерной ДНК-зависимой РНК-полимеразы I эукариот (обзор литературы).б

1.1. Биологические особенности биосинтеза рибосомных РНК.

1.2. Промотор и базовые факторы транскрипции РНК-полимеразы I эукариот.

1.3. Энхансерные элементы и промоторы межгенных участков рибосомных генов.

1.4. Структурные элементы ДНК и белки, участвующие в терминации транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой 1.

1.5. Субъединичный состав ядерной РНК-полимеразы I эукариот.

1.6. Клонирование генов, кодируЕры^йх субъединицы РНК-полимеразы 1.

1.7. Большие субъединицы ядерной РНК-полимеразы I эукариот.

1.8. Общие субъединицы РНК-полимераз I и III.

1.9. Общие субъединицы ядерных РНК-полимераз I, II и III.

1.10. Малые специфические субъединицы РНК-полимеразы 1.

1.11. Функциональная консервативность субъединиц РНК-полимеразы I эукариот.

1.12. Роль ионов цинка в ферментном комплексе РНК-полимеразы 1.

1.13. Фосфорилирование субъединиц РНК-полимеразы 1.

1.14. Организация ферментного комплекса РНК-полимеразы I эукариот.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурная и функциональная характеристика генов, кодирующих субъединицы РНК-полимеразы I делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe"

Ключевым этапом в реализации генетической информации в живой клетке является транскрипция - матричный синтез молекул РНК на ДНК-матрице. Три вида ДНК-зависимых РНК-полимераз (I, II и III) обнаружены в ядрах всех эукариотических клеток. Эти ферменты являются сложными мультисубъединичными белковыми комплексами, в состав которых входит от 12 до 17 субъединиц. Специфичность эукариотических ДНК-зависимых РНК-полимераз по отношению к матрице, сложность их строения, а также существование множества регуляторных белковых факторов, контролирующих работу этих ферментов, отражают необходимость тщательного, многостадийного контроля процесса транскрипции.

Основная часть полимеразной активности клетки приходится на долю ядерной РНК-полимеразы I. Этот фермент обеспечивает клетку важнейшим структурно-функциональным компонентом рибосом (большими рибосомными РНК) и, следовательно, является необходимым звеном в сложном процессе биосинтеза белка. К настоящему времени в наибольшей степени изучена РНК-полимеразы I почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae: клонированы и секвенированы гены, кодирующие все 14 субъединиц этого ферментного комплекса.

Настоящая работа посвящена клонированию и структурно-функциональному анализу кДНК и генов, кодирующих субъединицы РНК-полимеразы I другого, эволюционно далекого вида дрожжей, Schizosaccharomyces pombe. Сравнение базовых аппаратов синтеза больших рибосомных РНК двух эволюционно далеких эукариотических организмов дает возможность выявить общие закономерности и специфические особенности строения и функционирования этих молекулярных машин. Работа является частью исследований, проводимых в лаборатории механизмов генной экспрессии ИБХ РАН, по изучению структурно-функциональной консервативности аппарата транскрипции эукариотических организмов.

1. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ЯДЕРНОЙ ДНК-ЗАВИСИМОЙ РНК-НОЛИМЕРАЗЫ1 ЭУКАРИ ОТ обзор литературы)

Экспрессия генетического материала в клетках эукариот начинается с матричного синтеза различных РНК, осуществляемого тремя ядерными ДНК-зависимыми РНК-полимеразами (I, II и III), каждая из которых является сложным многосубъединичным белковым комплексом. Данный обзор посвящен РНК-полимеразе I, наиболее специализированной из трех родственных ядерных РНК-полимераз. Этот фермент осуществляет синтез высокомолекулярного предшественника больших рибосомных РНК, в то время как РНК-полимераза II ответственна за синтез всех матричных РНК, а продуктами генов, транскрибируемых РНК-полимеразой III, являются низкомолекулярные РНК, которые участвуют в синтезе белков (тРНК и 5S рРНК), их внутриклеточном транспорте (7SL РНК), а также в посттранскрипционном процессинге мРНК (U6 РНК).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шематорова, Елена Константиновна

118 ВЫВОДЫ

1. Клонированы и секвенированы семь кДНК, кодирующих субъединицы Rpcl9, Rpc40, Rpa43, Rpa49, Rpal2, Rpa2 РНК-полимеразы I Sch. pombe и субъединицу hRPA12 РНК-полимеразы I Homo sapiens.

2. Функциональное тестирование всех клонированных кДНК в клетках почкующихся дрожжей S. cerevisiae показало, что четыре субъединицы Sch. pombe (Rpcl9, Rpc40, Rpa49 и Rpal2) способны заменять in vivo ортологичные субъединицы S. cerevisiae с образованием мозаичных ферментных комплексов РНК-полимеразы I.

3. Установлена экзон-интронная структура гена грс!9+ и безынтронное строение гена rpc40+ Sch. pombe, а также хромосомная локализация этих генов.

4. Показано, что точечная замена аргинина-106 на глицин в составе субъединицы Rpc40 Sch. pombe приводит к утрате способности РНК-полимеразы I S. cerevisiae функционировать при повышенной температуре (37°С).

5. С помощью мутагенеза субъединицы Rpal2 Sch. pombe показано, что целостность N-концевого цинксвязывающего мотива необходима для функционирования этой субъединицы в составе РНК-полимеразы I, в то время как замена ряда консервативных аминокислотных остатков в С-концевом районе не приводит к потере функции Rpal 2 in vivo.

6. В результате супрессорного анализа термочувствительного аллеля rpal2-29 (C27Y) Sch. pombe обнаружено, что генетическим парнером субъединицы Rpal 2 является общая субъединица РНК-полимераз I-III Rpb6.

7. С помощью гель-электрофореза и TOF-MALDI масс-спектрометрии в составе РНК-полимеразы I Sch. pombe обнаружено 12 субъединиц, присутствие восьми из которых подтверждено с помощью микросеквенирования соответствующих белков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шематорова, Елена Константиновна, Москва

1. Reeder R.H., Roeder R.G. Ribosomal RNA synthesis in isolated nuclei. J. Mol. Biol. 1972, 67, 433-441.

2. Scheer U., Weisenberger D. The nucleolus. Curr Opin.Cell.Biol. 1994,6,354-359.

3. Shaw P.J., Highett M.I., Beven A.F., Jordan E.G. The nucleolar architecture of polymerase I transcription and processing. EMBO J. 1995,14,2896-2906.

4. Lazdins I.B., Delannoy M., Sollner-Webb B. Analysis of nucleolar transcription and processing domains and pre-rRNA movements by in situ hybridization. Chromosoma. 1997,105,481-495.

5. Long E.O., Dawid B.I. Repeated genes in eukaryotes. Annu. Rev. Biochem. 1980, 49, 727-724.

6. Албертс Б, Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки.: Мир, Москва, 1986, т. 2,251.

7. Christman M.F., Dirtrich F.S., Fink G.R. Mitotic recombination in the rDNA of S. cerevisiae is suppressed by the combined action of DNA topoisomerases I and II. Cell. 1988, 55,413-425.

8. Nierras C.R., Liebman S.W., Warner J.R. Does Saccharomyces need an organized nucleolus? Chromosoma. 1997,105, 444-451.

9. Reeder R.H. in "Ribosoms" (P. Lengyel, M. Nomura and A.Tissteres, eds.), 489-518. Cold Spring Harbor, New York, 1974.

10. Conconi A., Widmer R.M., Koller Т., Sogo J.M. Two different chromatin structures coexist in ribosomal RNA genes throughout the cell cycle. Cell. 1989,57, 753-761.

11. Dammann R., Lucchini R., Koller Т., Sogo J.M. Chromatin structures and transcription of rDNA in yeast Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 1993,21,2331-2338.

12. Scheer U., Trendelenburg M.F., Franke W.W. Transcription of ribosomal RNA cistrons. Correlation of morphological and biochemical data. Exp. Cell Res. 1973, 80,175-190.

13. Grummt I., Roth E., Paule M.R. Ribosomal RNA transcription in vitro is species specific. Nature. 1982, 296,173-174.

14. Bell S.P., Jantzen H.M., Tjian R. Assembly of alternative multiprotein complexes directs rRNA promoter selectivity. Genes Dev. 1990. 4,943-954.

15. Haltiner M.M., Smale S.T., Tjian R. Two distinct promoter elements in the human rRNA gene identified by linker scanning mutagenesis. Mol. Cell. Biol. 1986,6,227-235.

16. Miller K.G., Tower J., Sollner-Webb B. A complex control region of the mouse rRNA gene directs accurate initiation by RNA polymerase I. Mol. Cell. Biol. 1985, 5, 554-562.

17. Kulkens Т., Riggs D.L., Heck J.D., Planta R.J., Nomura M. The yeast RNA polymerase I promoter: ribosomal DNA sequences involved in transcription initiation and complex formation in vitro. Nucleic Acids Res. 1991,19, 5363-5370.

18. Lalo D., Steffan J.S., Dodd J.A., Nomura M. RRN11 encodes the third submit of the complex containing Rrn6p and Rrn7p that is essential for the initiation of rDNA transcription by yeast RNA polymerase I. J. Biol. Chem. 1996,271,21062-21067.

19. Keener J., Dodd J.A., Lalo D., Nomura M. Histones H3 and H4 are components of upstream activation factor required for the high-level transcription of yeast rDNA by RNA polymerase I. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, 94,13458-13462.

20. Keener J., Josaitis C.A., Dodd J.A., Nomura M. Reconstitution of yeast RNA polymerase I transcription in vitro from purified components. TATA-binding protein is not required for basal transcription. J. Biol. Chem. 1998,273,33795-33802.

21. Learned R.M., Cordes S., Tjian R. Purification and characterization of a transcription factor that confers promoter specificity to human RNA polymerase I. Mol. Cell. Biol. 1985, 5, 1385-1369.

22. Schnapp A., Isolation and functional characterization of TIF-IB, a factor that confers promoter specificity to mouse RNA polymerase I. Nucleic Acids Res. 1990, 18, 1385-1393.

23. Bell S.P., Learned R.M, Jantzen H.-M. Tjian R. Functional cooperativity between transcription factors UBF1 and SL1 mediates human ribosomal RNA synthesis. Science. 1988, 241, 1192-1197.

24. Pikaard C.S., McStay В., Schultz M.C., Bell S.P., Reeder R.H. The Xenopus ribosomal gene enhancers bind an essential polymerase transcription factor, xUBF. Genes Dev. 1989,11, 1779-1788.

25. O'Mahony D.J. and Rothblum L.I. Identification of two forms of the RNA polymerase I transcription factor UBF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991,88, 3180-3184.

26. Jantzen H.M., Admon A., Bell S.P., Tjian R. Nucleolar transcription factor hUBF contains a DNA-binding motif with homology to HMG proteins. Nature. 1990, 344, 830-836.

27. Jantzen H.M., Chow A.M., King D.S., Tjian R. Multiple domains of the RNA polymerase I activator hUBF interact with the TATA-binding protein complex hSLl to mediate transcription. Genes Dev. 1992, 6,1950-1963.34.