Характеристика новых генов Schizosaccharomyces pombe dds20+ и rlp1+, участвующих в клеточном ответе на повреждения ДНК

Салахова, Альбина Фаатовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика новых генов Schizosaccharomyces pombe dds20+ и rlp1+, участвующих в клеточном ответе на повреждения ДНК
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика новых генов Schizosaccharomyces pombe dds20+ и rlp1+, участвующих в клеточном ответе на повреждения ДНК"

На правах рукописи УДК 575.1:579.852.11

Салахова Альбина Фаатовна

Характеристика новых генов ЗсЫгоъассЪаготусех ротЬе <Ш20+ г1р1+, участвующих в клеточном ответе на повреждения ДНК.

специальность 03.00.26 - «молекулярная генетика»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики репарации ДНК Института биологии гена РАН

Научные руководители: доктор биологических наук В.И. Башкиров кандидат биологических наук Ф.К. Хасанов

Официальные оппоненты: чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Н.В. Томилин

доктор биологических наук, профессор Г.В. Шпаковский

Ведущая организация:

Государственный НИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов

диссертационного совета Д 002.037.01 в Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова д.32.

Защита диссертации состоится «.

.» мая 2005 года, в «.

» часов на заседании

Автореферат разослан:«.

хч-

.» апреля 2005 года.

Учёный секретарь Диссертационного совета Кандидат фармацевтических наук

Грабовская Л. С.

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы.

Целостность генетической информации клетки постоянно подвергается воздействию экзогенных химических и физических факторов, которые могут вызывать широкий спектр повреждений ДНК. Кроме того, спонтанные повреждения ДНК возникают и в процессе нормального клеточного метаболизма. Двуцепочечные разрывы ДНК, возникающие

спонтанно или при действии ряда физических и химических факторов, например, таких как ионизирующая радиация и алкилирующий агент метилметансульфонат, являются наиболее тяжелыми повреждениями ДНК, препятствующими процессам транскрипции и репликации ДНК Не репарирочанные или неправильно репарированные двуцепочечные разрывы ДНК могут приводить к хромосомным перестройкам, мутагенезу, канцерогенезу и клеточной смерти. Существенной потребностью всех организмов является поддержание целостности генома и противодействие накоплению повреждений ДНК Живые организмы выработали специальные системы для исправления таких повреждений ДНК, среди которых наиболее существенными являются фотореактивация УФ повреждений, эксцизионная репарация нуклеотидов и оснований ДНК, и рекомбинационная репарация ДНК Двуцепочечные разрывы ДНК репарируются в клетках дрожжей преимущественно с помощью системы рскомбинационной репарации. Рекомбинационная репарация представляет собой безошибочный способ исправления ошибок ДНК, поскольку она использует информацию другого гомолога или сестринской хроматиды для репарации повреждения ДНК В клетках существуют также и другие механизмы репарации двуцепочечных разрывов ДНК, основанные на отжиге одно-цепочечных участков или негомологичном соединении концов ДНК в месте разрыва. Однако в отличие от рекомбинационной репарации два последних механизма репарации двуцепочечных разрывов ДНК являются потенциально мутагенными, поскольку они сопровождаются делениями ДНК в местах разрывов.

В ответ на повреждение ДНК происходит остановка клеточного цикла, индуцируется транскрипция репарационных генов, и включаются различные пути репарации ДНК. Эти процессы контролируются механизмами контроля клеточного цикла, которые предотвращают вхождение клетки в 8-фазу или митоз, до тех пор, пока повреждение ДНК не будет репарировано. Механизмы контроля клеточного цикла

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С-Петербург

2МСРК

являются важнейшей частью клеточного ответа на повреждения ДНК, и обеспечивают выживание клетки и стабильность ее генома.

Так как ионизирующая радиация широко используется в качестве инструмента в медицинских диагностических целях и при терапии рака, необходимо более полное понимание клеточных ответов на возможные повреждения ДНК. Более того, радиационная устойчивость раковых клеток создает ряд проблем с противораковой терапией. Как следствие, радиационная устойчивость может вызываться повышенной репарационной способностью раковых клеток. Высокий уровень рекомбинации, наблюдаемый у людей с такими синдромами предрасположенности к раку как синдромы Блюма или Вернера, вызывают геномную нестабильность в клетках пациентов. Наличие прямой связи между предрасположенностью к раковым заболеваниям молочной железы и яичников и репарационными процессами было недавно продемонстрировано обйаружением взаимодействия белков Вгса1 и Вгса2 с ключевым рекомбинационным белком 11ас151. Рекомбинационная репарация является эволюционно консервативным механизмом и играет определяющую роль в сохранении целостности генома и выживания клеток, как бактерий, так и человека.

Таким образом, изучение молекулярных механизмов репарации двуцепочечных разрывов ДНК является актуальной проблемой молекулярной генетики и биологии. Изучение и открытие новых генов, вовлеченных в механизмы репарации и рекомбинации ДНК, позволяет не только глубже понять эти процессы, но имеет и практическое значение для онкологии и генотерапии.

Цель работы и задачи исследования.

Основной целью диссертационной работы является выяснение молекулярных механизмов рекомбинационной репарации ДНК в эукариотах, используя делящиеся дрожжи БскцовассНаготусе! ротЪе в качестве модельной системы. В задачи исследования входит изучение двух открытых нами новых генов, (МбЮ* и Нр1*, и кодируемых ими белков генетическими и молекулярно биологическими методами.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Были идентифицированы и изучены 2 новых гена <№20* и НрГ, участвующих в рекомбинационной репарации ДНК в делящихся дрожжах. Ген ¡ШЮ* является высококопийным супрессором чувствительности к метилметансульфонату, у и УФ лучам,

клеток с делециями в генах rhp55* и rhp57гомологов S. cerevisiae, RAD55 и RAD57. Было показано, что ген dds20* функционирует в rhp51*- зависимом механизме репарации ДНК параллельно rhpS]+-зависимому пути, контролируемому Rad51 паралогами, Rhp55 и Rhp57. Белок Dds20 взаимодействует с ключевым рекомбинационным белком делящихся дрожжей Rhp51, образующим нуклеопротеиновый филамент способный к поиску гомологичной ДНК и образованию гетеродуплексной ДНК. Мутант dds20A проявляет холодочувствительность в репарации УФ и ММС - индуцированных повреждений ДНК. предполагая, что он участвует в сборке или стабилизации мультипротеинового комплекса Эпистатический анализ показывает, что белок Dds20 функционирует в Cdsl-независимом пути толерантности к повреждениям ДНК, вызванным действием УФ света. Обнаружен новый тип белковых повторов (повторы PDA), который предположительно является структурным модулем, опосредующим взаимодействие между белками Dds20 и Rhp51 Показано, что введение замен консервативных аминокислотных остатков PDA повторов с помощью сайт-направленного мутагенеза нарушает репарационную функцию белка Dds20 Таким образом, впервые обнаружен новый функциональный модуль в белке, участвующий в репарации двуцепочечных разрывов ДНК.

Новый репарационный ген S. pombe rlpl* принадлежит к семейству RecA подобных генов Эпистатический анализ показывает, что rlpl*, вместе с генами rhp5I*, rhp54* и rhp55* является членом одной и той же группы генов, контролирующих механизм рекомбинационной репарации. Кодируемый геном rlpl* белок Rlpl показывает высокую степень гомологии с белками Е. coli RecA, S. pombe Rhp51, а также с белком человека Хгсс2. Rlpl является новым Rad51 паралогом делящихся дрожжей наряду с Rhp55 и Rhp57 и выполняет, по-видимому, специализированную функцию в полимеризации белка Rhp51 на ДНК. Обнаружение гена rlpl*, гомолога гена человека XRCC2 в S. pombe, и его изучение продемонстрировало функциональное разнообразие и специализацию RecA-подобных белков в ряду от почкующихся дрожжей до позвоночных

Представленная работа направлена на решение фундаментальной задачи -понимание механизмов рекомбинационной репарации в эукариотических организмах Проведенные исследования могут также послужить основой для изучения этих механизмов в клетках человека с выходом на заболевания, связанные с нарушением стабильности генома, в частности рака. Они также важны и для понимания процессов гомологичной рекомбинации при генных манипуляциях с клетками высших организмов (трансгенезис и генотерапия).

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на конференциях "Molecular Genetics of Eeukaryotes" (Москва, 4.02.-7.02. 2003), "FASEB Meeting. Genetic Recombination & Genome Rearrangement" (Snowmass Village, Snowmass, Colorado, USA, 26.07-31.07, 2004), "Scientific Meetings of HHMI Research Scholars" (20.06-23.06, 2001, Vancouver, Canada; 23.06-26.06, 2004, Tallinn, Estonia)

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста и содержит 12 таблиц и 21 рисунок. Библиография включает 129 источников

Содержание работы

Dds20 - высоко-копийный супрессор нарушения репарации клеток, лишенных S. pombe Rad51 паралогов, Rhp55 и Rhp57.

Для того чтобы идентифицировать новые гены, участвующие в рекомбинационной репарации, мы провели скрининг геномной библиотеки S. pombe на плазмиде pUR19 на предмет обнаружения высококопийных супрсссоров ММС-чувствительности клеток с делецией гена S. pombe rhp55*. В результате скрининга были выявлены несколько фрагментов геномной ДНК, супрессирующих ММС чувствительный фенотип муташных клеток rhpSS. Среди них наиболее сильной супрессорной активностью обладала вставка ДНК размером 3.4 т.п.н. Рестрикционный анализ позволил идентифицировать минимальный участок ДНК (Kpnl фрагмент ДНК размером 1475 п.н), обладающий супрессорной активностью Секвенирование Kpnl фрагмента ДНК выявило потенциальную рамку считывания, кодирующую белок размером 299 аминокислот. Новый ген был назван ddslO* (DNA damage sensitive isolate 20). Клонирование и секвенирование кДНК dds20* подтвердило, что ген не имеет нитронов (номер поступления в GenBank: AY275538). Клонирование кДНК привело также к обнаружению антисмысловой РНК, транскрибируемой в противоположном направлении и перекрывающейся с мРНК dds20+. Эта РНК (номер поступления в GenBank AY738531) имеет два интрона. Для того чтобы убедиться, что за супрессорную активность отвечает рамка считывания гена dds20*, а не

противоположно транскрибируемая РНК, мы ввели мутацию сдвига рамки считывания в dds20*, разрезав вставку с помощью Xhol и заполнив липкие концы с помощью фрагмента Кленова перед лигированием. Эта мутация полностью убирала эффект супрессии Kpnl фрагмента ДНК (Рис. 1).

Поиск с помощью программы BLAST не выявил значимых гомологов Dds20 в открытых базах данных за исключением С-концевой части S. pombe Swi2, участвующего в переключении типа спаривания и белка CNBF2390 Cryptococcus neoformans неизвестной функции С-концевые части белков Dds20 и Swi2 имеют 24% идентичности аминокислотной последовательности. Анализ аминокислотной последовательности Dds20 выявил наличие сверхспирального домена (аминокислоты 178-236), предсказанного с большой долей вероятности программой COILS. Не было обнаружено никаких других известных мотивов в Dds20 при использовании баз данных белковых мотивов и доменов

Неизвестная РНК

s -

о + «

о. + & -

I-

dds20*

xhol

Kpnl Dds20p И

Kpnl

1 46

Ш.

299

Swi2p

490 719

Рис l Клонирование гена dds20+ и предполагаемая его белковая структура (А) Схема лелеционного анализа клонированного геномного фрагмента ДНК с целью определения минимальной области ДНК, отвечающей за супрессорный эффект Идентификация открытой рамки считывания dds20+ как одного из двух противоположно направленных транскриптов (объяснение в тексте). (Б). Структура домена белка Dds20 и его свячь с белком S pombe Swi2 Серым цветом помечена область гомологии между двумя белками. Черным цветом - coiled-coil домен (СС) Стрелками помечены PDA повторы.

Kpnl фрагмент геномной ДНК с dds20* на высококоиийном векторе pUR19 частично

супрессировал чувствительность мутанта rhpSSA к ММС и у лучам (Рис.2А, Б), но не

наоборот Ген rhp55+ не был способен супрессировать чувствительность клеток dds20A к

ММС (Рис.ЗД). Однако высококопийность dds20* не могла супрессировать репарационные

дефекты делений гкр51* и гкр54+, других ключевых игроков рекомбинационной репарации (Рис.2В). Так как белок ЯЬр55 образует стабильный гетеродимер с Шф57, была также проверена супрессия мутанта гкр57А. Как и ожидалось, чувствительность мутанта гИр57А к ММС супрессировалась многокопийностью <1(1520*. Основываясь на этих данных, был сделан вывод, что (1с!х20* специфически супрессирует нарушения репарации ДНК у клеток, в которых отсутствуют Яас151 паралоги.

|0, 3 0.01

w.t + pUR19

101

"-«.rftpSSA + pUR1g

rftpSSA + pUR19

0 15 30 46 80

время в ММС (мин )

rhpssa+pURí э:Ай2(Г

]w.t.+ p } rhpSBA + p '} rhpS4A + p \rhp51A + p } rhpSSá + p:dds2CT I rhp34A + p:dds2tr i\rhp5lA + p:tHts20*

С 003% ММС Вез ММС

rfip5aa+pURi9

200 400 600

дозы у ray (Gy)

Рис 2 dds20* является высоко-копийным супрессором репарационного дефекта делсции гена rhp55+, кодирующего структурный гомолог S. pombe Rad51 (А) Высоко-копийный dds20* частично супрессирует чувствительность Arhp55 к мешлметансульфонату (ММС) (Б) Спасение высоко-копийным dd\20+ чувствительности Arhp55 к у-лучам, (В) Повышенная когшйность ddi20+ специфично супрессирует чувствительность Arhp55 к метилметансульфонату

Чувствительность мутантных клеток dds20A к генотоксическому стрессу.

Наши эксперименты показали, что деления гена dds2Cf приводит к чувствительности клеток к алкилирующему агенту ММС (Рис.ЗА, Б, В и Г). Более ранние исследования показали, что в S. pombe гомологи генов RAD52 группы S. cerevisiae, rhp50 rhp51+, rhp54rhp55*, г hp 5 7*, rad22+ и rlpl*, представляют собой одну эпистатическую группу, участвующую в рекомбинационной репарации ДНК. Для выяснения роли белка Dds20 в репарации ДНК мы провели анализ эпистатических взаимодействий dds20A с представителями RAD52 группы (Рис.3 и 4). Мы обнаружили, что мутнт dcü20A показывает синергизм и аддитивность при репарации повреждений, индуцируемых ММС и

у - чучами, с мутантами гкр55А и г1р!А, соответственно, так как двойные мутанты были более чувствительны, чем наиболее чувствительный одиночный мусант. Синергизм а увеличении чувствительности двойных мутантов свидетельствует, что гены работают в разных путях. Таким образом, ген сЫ$20* участвует в другом пути репарации, чем К.ас151 паралоги, гИр55* и Нр1+ Однако, 1 показал эпистаз с мутантами гЬ.р51А и гкр54А -двойные мутанты были так же чувствительны к ММС (Рис.ЗГ) и у лучам (Рис 4Ь) как наиболее чувствительные одиночные мутанты (гкр51А и гкр54А). Более того, двойной мутант сШ$20АгНр55А оказался так же чувствителен к ММС, как и одиночный мутанг гИр51А (Рис.ЗБ). Эти данные указывают на то, что Ос^О является новым белковым фактором, вовлеченным в КЬр51/КИр54-зависимый путь репарации ДНК.

30° 1009

22°

30° 10

22*

30° 1'

22° 0.1]

0.01

¿«20 гЬр53

0 20 40 60 80

экспозиция ММС (мин)

(¡<¡$20

О 15 30 45 60 75

экспозиция ММС (мин.)

0.01

сШ20 гЬр54 0 01| гьр51

fl.no 11

О 5 10 15 20 25

Экспозиция в 0.1% ММС (мин.)

О 15 30 45 60 75

экспозиция ММС (мин.)

УЛ + р1Ж19 с№?20 + ритэ Мз20+риЯ19+гЬр55*

Ш20*риМ9+гЬр5Г

0.005% ММС без ММС

Рис 3 Холодо-чувствительность и эпистатический анализ мутанта в репарации

индуцированных ММС повреждений ДНК (А) Мутант сШ$20 показал повышенную чувствительность к ММС при пониженной 1емпературе (Б) обнаружен синергизм между (/Л20 и ¡Ир55 в репарации повреждений ДНК, индуцированных ММС (В) ¿Л20 и >/р! дополнительно повышают чувс!ви1ельность клеток к ММС (Г) (1с1з20 эпистатичен г1гр51 и гкр54 (Д) гИр51* является высоко коиийным супрессором чувствительности 4с1<1520 к ММС

1 1

я 1

I 0.1

v ^

dtfs20 rt

rhp55

\<MS20 dds20 rlp1

150 300 450

дозы у лучей (Gy)

(s20

■ rhp54 о Ods20 rhp51 • rhp51 □ das20 rhpS4

дозы у лучей (Gy)

Рис.4. Эпистатический анализ на чувствительность к ионизирующей радиации. (А) Эпистатический анализ с мутантами dds20, rhp5S и rlpl\ (Б) Выживаемость двойных мутантов rhp5!dds20 и rhp54dds20 при облучении клеток разными дозами лучей.

Wt + pUR19

№<¿60 *-dds2Q*

\ гаОбО * pUR19

О 10 20 30 40 50

дозы у -лучей (Gy)

0.0025 0.005

ММС (%)

Штамм Эффективность высева кпеток(%)

дикий тип 100

PUR19

ratSbO-1 7.5

PUR19

гаМв-1 36.2

Рис 5. dds20 эпистатичен гайбО и гси118 в экспериментах по клеточной выживаемости при воздействии у - лучей и ММС, а также супрессирует мутацию гас!60-1 в опытах но высеву клеток (А) Кривые выживаемости при обработке у - лучами одиночных и двойных мутантов (Шь20А гаЛ60-1, гаё18-па74. (Б) Повышенная копийность ёс1$20* частично супрессирует ММС чувствительность мутанта гси1б0-1. (В) Повышенная экспрессия частично

супрессировала пониженную выживаемость гипоморфного мутанта гаёбО

Так как (Шз20* эпистатичен гкр51+ и гИр54*, но не гкр55* и г1р1\ эти результаты могут быть наиболее просто интерпретированы, если принять, что белок 0(к20 действует в Иф51 -зависимом пути параллельном пути, контролируемым ЯасШ паралогами, белками

Rhp55, Rhp57 и Rlpl Таким образом, Dds20 является новым белком, который участвует в механизме рекомбинационной репарации ДНК, и функционирует параллельно Rad51 паралогам, Rhp55, Rhp57 и Rlpl (Рис.6).

dds20 эпистатичен radl8 и radöO и является высококопийным супрессором репликационных и репарационных дефектов мутанта radöO.

В клеточном ответе на облучение ионизирующей радиацией SMC белок S. pom.be Rad 18 и белок Rad60 функционируют в том же репарационном пути, чш и Rhp5i Гены radl8* и radöO* являются существенными генами, и, как было показано, участвуют в репарации двуцепочечных разрывов ДНК, возникающих при репликации. Мы проанализировали эпистатические взаимодействия между генами dds20+, rad60+ и radlü* в репарации повреждений, вызванных действием гамма лучей (Рис.5 А). Для проведения этого анализа предварительно были сконструированы двойные мутанты dds20Arad60-1 и ddb20Arad!8-па74 Двойные мутанты dds20Aradl8-na74 и dds20Arad60-1 оказались не чувствительнее одиночного мутанта dds20A. Таким образом, все три гена {dds2(f, rad60+ и radlS+), принадлежат к одной эпистатической группе и функционируют одном и том же пути репарации двуцепочечных разрывов ДНК. Была проверена и возможность супрессии репарационного дефекта мутантов rad60-l и radl8-na74 при сверхэкспрессии Dds20 Оказалось, что dds20* в большом числе копий частично супрессирует шперчувствительность мутанта rcul60-1 к ММС (Рис. 5Б), также как и ею низк>ю эффективность высева при 30° (Рис. 5В). Однако не наблюдалось супрессии гиперчувствительности к ММС у мутанта radl8-na74 (данные не показаны). Поскольку белки Rad60 и Rad 18 взаимодействуют между собой и имеют частично перекрывающиеся функции в репарации двуцепочечных разрывов ДНК, то, по-видимому, повышенная экспрессия белка Dds20 супрессирует Rad 18-независимую функцию белка Rad60.

Dds20 участвует в Cdsl-независимом механизме толерантности УФ повреждений ДНК.

Пиримидиновые димеры и пиримидин 6-4 фотопродукты являются основными повреждениями ДНК, возникающими при действии УФ света, и потенциально могут приводить к остановке движения репликационных вилок. В клетках S. pombe используются два механизма репарации УФ повреждений: нуклеотидная эксцизионная репарация (НЭР)

и эксцизионная репарация УФ повреждений (UVDE).

1*3(150

НасЮгД } Ехо1

ЫЬв1

КЬр55Г57

/ ^ Бс1820 Рас151

? паралогй Р1р1

\ / ~ Rad51sP

РИр54, Ми$81/Ете1

Рис.6. Путь рекомбинационной репарации в 5. ротЬе. После формирования двуцепочечных разрывов концы ДНК процессируются нуклеазами, комплексом Яаё50/Яай32/КЬь 1 или Ехо1. Яас1515р нуклеопротеиновый филамент образуется на 3'-выступающих концах одно -цепочечной ДНК при замещении конкурирующего белка ЯРА через использование двух параллельных механизмов, с участием 11ас151 паралогов и участием белка 0(1520 Инвазия цепи инициируется филаментом и продолжается с участием ЯЬр54 и Мш81 /Етс 1, завершая процесс репарации двуцепочечных разрывов ДНК.

Гены рекомбинационной репарации важны как для клеточной выживаемости при УФ повреждениях ДНК (механизм и\ФЕ), так и для механизма толерашности к УФ повреждениям ДНК, контролируемого чекпойш киназой С<к1. Механизм толерашности к УФ повреждениям ДНК, по-видимому, восстанавливает движение репликационной вилки с помощью рекомбинационного механизма. Мутанты 5. ротЬе по генам репарации ДИК показывают значительную гиперчувствительность к УФ свету Мы обнаружили, что мугант ¿¿¡20 является 1 инерчувствительным к УФ, и его чувствительность повышается при снижении температуры инкубации клеток (Рис.7 А). Сходная картина наблюдалась и ири использовании ММС (Рис.ЗА). Это предполагает, что 0ск20 возможно являемся фактором нуклеации или стабилизации мультипротеинового комплекса, участвующего в клеточном ответе на повреждения ДНК, вызванные УФ светом. Эпистатический анализ показывает, что <1ск20* не вовлечен ни в НЭР, ни в 11УОЕ репарацию, поскольку двойные мутанты г/<&20га<^/:? и (1(1$20те1 более чувствительны, чем одиночные (Рис.7Б). Ген гас113* кодирует в клетках 5. ротЬе гомолог эндонуклеазы ХРО человека, а ген иуе1+ кодирует УФ эндонуклеазу Как и при использовании ММС, двойной мутант ¿Мз2(М/;55 показал

синергизм при сравнении с чувствительностью одиночных мутантов (Рис.7Б). Однако чувствительность двойных мутантов ¿¿¡20гкр51 и <Ш20гкр54 указывает, что эти гены являются эпистатичными по отношению друг к другу (Рис.7В).

3 ш

0.001

Ч. >8 О®- «Л \

- гЬр55 \ Ор - АЁ20 *

0 25 50 75 100 ДОЗЫ УФ (ч№п?)

100 10 1

0.1 й

0 01

0.0014 0.00011

МЛ

А ^

"■V

<Ш*20 иуе1

<Ш*20ше1

0 20 40 60 80 100 дозы УФ у/т2)

0.000

О 90 10« 160

дозы УФ (Лтг)

С<Ь1

0(1520

0 4 8 12 16 дозы УФ (Лт2)

20 40 60 80 100 дозы УФ (Лт*)

Рис 7 Анализ ответа клеток мутанта ¿¿з20А на повреждения ДНК, вызванные действием УФ лучей. (А) Холодочувствительность мутанта МьЮй к УФ свету. (Б) и (Г) Эпистатический анализ между сШ520А и делеционными мутантами по генам .V ротЬе, участвующими в нуклеотидной эксцизионной репарации и иУЕЯ репарации повреждений, вызванных действием УФ лучей. (В) Эпистатический анализ между (1с1я20А и делециями генов рекомбинационной репарации, гИр51* и гкр54* (Д) Эпистатический анализ между (1с1.',20А и делецией геиа ссЬ /. Все кривые выживаемости были определенны при 30°С, м исключением (А), где были использовали температуры 22°С и 30°С.

Это предполагает, что, как и в случае с ответом на повреждения ДНК, индуцированные ММС и у лучами, 0с1820 оперирует в Яас151 -зависимом механизме репарации УФ повреждений, параллельном пути, контролируемом белком Ш1р55. В случае, когда оба механизма репарации (НЭР и и\ТЗЕ) были инактивированны в мутанте гас!13иуе1, добавление мутации с!(1з20А значительно повышало чувствительность к УФ свету клеток гай13те1 (Рис.7Г)- Это указывает на то, что 4(1.420* участвует в механизме толерантное ш к УФ повреждениям ДНК, позволяющем поврежденной ДНК реплицироваться в отсутствии НЭР и ЦУОЕ. Ранее было установлено существование механизма

толерантности к УФ повреждениям ДНК, который включает ряд генов группы рекомбинационной репарации (rhp5/+, rhp54musSl* и rad!8*) и контролируется киназой Cdsl, играющей роль в чекпойнте S фазы. Так как dds20* является эпистатичным генам rhp51* и rhp54мы проверили, показывают ли dds20 и cdsl эпистаз по отношению друг к другу. Как показано на Рис.7Д, двойной мутант dds20cdsl был более чувствительным, чем любой из одиночных мутантов по этим генам. Таким образом, dds20+ действует в чекпойнт - независимом рекомбинационном механизме толерантности к УФ повреждениям ДНК Этот вывод дополнительно подтверждается фактом существования двух субнутсй рекомбинационной репарации повреждений ДНК, вызываемых ионизирующей радиацией и ММС, так и обнаружением нами синергизмом между dds20+ и chkl* или rad3*, другими ключевыми генами, кодирующими чекпойнт киназы (данные не приводят ся)

Уровень потери хромосомы и митотической рекомбинации не изменен в мутанте dds20.

Репарационные мутанты rhp5I и rhp54 обладаю! повышенной частотой потери минихромосом Поэтому мы определили частоты потери хромосомы и гомологичной рекомбинации у мутанта dds20, в сравнении с клетками дикого типа и мутанта rhp55 Как показано в Табл 1 у мутанта dds20 мы наблюдали частоту потери хромосом на уровне клеток дикого типа, тогда как у мутанта rhp55 потеря хромосомы в течение каждого клеточного деления была приблизительно в 2000 раз чаще, чем у клеток дикого типа Мы не обнаружили дефекта в митотическом кроссинговерс в клетках dd%20: небольшое уменьшение по сравнению клетками дикого типа было статистически не значимым (Табл 2) Клетки мутанта rhp55 показали гипер-рекомбинационный фенотип проявляющийся в 11-кратном повышении уровня митотического кроссинговера. Чтобы измерить частоту рекомбинации между сестринскими хроматидами в мутанте dds20 мы использовали гаплоидный штамм с маркером ига*, фланкированным прямыми повторами гетероаллелей ade6 (adeö-469 и ade6-M375). Образование ade* рекомбинантов является результатом гомологичной рекомбинации между ade аллелями одной хроматиды (внутри-хроматидная рекомбинация) или между аллелями сестринских хроматид (рекомбинация сестринских хроматид). Мы обнаружили, что частота рекомбинации сестринских хроматид на 1 х 106 высеянных клеток увеличивалась в 1.2-раза в мутанте dds20 при сравнении со штаммом дикого типа (Табл.3), что соответствует 1.2-кратному увеличению частоты рекомбинации при вычислении методом медианы Ли-Коулсон (Lea-Coulson). Однако

статистический анализ с использованием U-теста Манна-Уитни (Mann-Whitney) показал, что это увеличение является статистически не значимым. И, наоборот, у мутанта rhp55 частота рекомбинации между сестринскими хроматидами была увеличена в 4.1-раза, что соответствовало 3.2-кратному увеличению степени рекомбинации. Полученные данные показывают, что dds2(f не имеет видимой роли в гомологичной рекомбинации

сестринских хроматид в вегетативных клетках.

Таблица 1. Частота потери 3-й хромосомы в динлоидах Мь20А и гкр55Д

Среднее кол-во iаплоидов на 1 х 106 высеянных клеток11 Частота iанлоидизации на делениеь

Дикий тип dds20A rhp55A Дикий тип dds20A rhp55A

0 27 х 102 0.3 х 102 (1.1*) P>=0.05d 1.1 х 105 (4140xl) P<0.001d 4.34 xlO"6 4.9 xlO"6 1.0x102 (l.lx1) (2300xL)

Таблица 2. Частота кроссинговера между гомологами (между центромерой и локусом ига4 на 3-й хромосоме в диплоидах dds20A и rhp55A)

Среднее кол-во рекомбинангов на 1 х 106 высеянных клеток" Частота рекомбинации между гомологами на деленись

Дикий тип dds20A rhp55A Дикий тип dds20A rhp55A

0.8 х 103 0.6 xlO1 (0 75хс) P>=0.05d 1.4 XlO4 (17xc) P<0.001d 7.95 xlO"5 6.15 х 10'5 8.68 xlO"4 (0.77xl) (llx1)

Таблица 3. Частота рекомбинации между сестринскими хроматидами ] дикого типа, ¿¿$20А и гНр55А

Среднее кол-во ade* рекомбинангов на 1 х 106 высеянных клеток" Частота меж/внутри-сестринской рекомбинации на делениеь

Дикий тип dds20A rhp55A Дикий тип dds20A rhp55A

4.4x104 5.4 х104 (1.2хс) P>=0.05d 18.2 x 104 (4. lxc) P<0.001d 3.25 xlO"3 3.86 xlO3 10.5 xlO3 (1.2xc) (3.2xc)

"Вычислено на основе 20 независимых экспериментов ''Вычислено с помощью метода медианы Ли-Коулсона

'Коэффициент увеличения в сравнении с диким типом ""Вероятность, вычисленная с помощью U-теста Манн-Уитни

Мейотичеекая рекомбинация снижена в мутанте dds20A

Делеции в генах rhp51*, rhp54rhp55* и rad22+, принадлежащих к группе 5. pom.be RAD52, приводят к нарушениям различной степени в мейозе и мейотической рекомбинации Мы проверили мутант dds20A на мейоз - специфичные фенотипы Оказалось, что жизнеспособность спор при скрещивании штаммов dds20A была сравнимой со скрещиванием клеток штаммов дикого типа, 88% и 92%, соответственно Мы также наблюдали небольшое различие в эффективности споруляции- 32% в диком типе и 25% в мутанте dds20. Чтобы определить в какой степени мутация dds20A влияет на рекомбинацию, мы определили частоту мейотической внутри- и межгенной рекомбинации (см Таблицы 4 и 5) Наблюдалось 5-20 кратное уменьшение частош внутригенной рекомбинации в зависимости от тестированных интервалов (Табл.4) Межгенную рекомбинацию (Табл.5) анализировали в двух интервалах: hisl-lys7 (хромосома I) и adel-Iys4 (хромосома II), и было обнаружено, что она уменьшалась в клетках мутанта приблизительно в 11 и 13-раз, соответственно. Полученные результаты позволяют заключить, что функция белка Ddb20 необходима для мейотической рекомбинации в делящихся дрожжах.

Мы обнаружили, что повышенная экспрессия dds20+ на плазмидном векторе pUR19 почти полностью супрессирует снижение эффективности споруляции и частично в жизнеспособности спор мутанта г hp 55 При этом снижение внутригенной (в скрещиваниях ade7-50 х ade7-152 и ade6-469 х ade6-M375) и межгенной (в интервале lys4-adel) рекомбинации у мутанта rhp55A не восстанавливается. Основываясь на этих данных можно предположить, что rhp55* и dds2Cf обладают уникальными функциями в мейотической рекомбинации Снижение жизнеспособности спор штамма с мутацией rhp55A вызвано ее влиянием на предмейотическую (проблемы с репликацией ДНК, выраженные элонгацией клеток и ядерными аберрациями) и мейотическую (рекомбинационная и хромосомная сегрегация) стадии. Вероятно, способность гена dds20* при повышенной экспрессии частично супрессировать жизнеспособность спор клеток с мутацией rhp55A, обусловлена супрессией лишь их митотического дефекта В действительности, и оказалось, что повышенная экспрессия dds20* частично супрессирует

фенотип клеточной элонгации штамма гкр55Л в вегетативно делящихся клетках (данные не показаны).

Таблица 4. Мейотическая внутригенная рекомбинация в мутантах dds20

Прототрофы/106 жизнеспособных спор

Хромосомы и аллели Коэффициент Дикий тип dds20A уменьшения

II L ade7-J50xade7-152 IHR adeö-469 х ade6-M375 III R adeö-469 x ade6-M26 420 ±85 21 ± 5 20 0 635 ± 17 68 ± 7 9.3 10852 ±42 2080 + 389 5 2

Таблица 5. Мейотическая межгенная рекомбинация в мутантах ¿№20

Рекомбинанты (%) Коэффициент Хромосома и интервал Дикий тип dds20A уменьшения

IR hisl-lys7 26.7 ±2.4 HR adel-lys4 28 7 ±1.7 2.4 ±0.3 11.1 2 2 ±0.2 12 9

Р<^20 является ядерным белком, взаимодействующим с Юф51 (Rad51).

Чтобы изучить клеточную локализацию белка 0(1820, мы сконструировали слитой ген dds20* с Мус 13. Был использован метод иммунофлуоресценциии на митотических делящихся клетках с применением антител к Мус. Следует отметить, что клетки dd<;20* -Мус13 экспрессировали функциональный белок, поскольку устойчивость таких клеток к ММС и УФ была одинаковой со штаммом дикого типа Флуоресцентный сигнал был обнаружен в клеточном ядре и локализовался на ПАР1 окрашенной хромосомной ДНК Анализ видео изображений показал, что примерно 30-50 фокусов белка 0<Н20-Мус13 приходилось на одно ядро. Эти результаты указывают, что 0ск20 является ядерным белком с дискретной локализацией. Известно, что некоторые эукариотические белки участвующие в репарации ДЦР, формируют ядерные фокусы, особенно после обработки ДНК повреждающими агентами.

Так как Шя20 функционирует в ЯЪр51-зависимом пути репарации ДЦР ДНК, мы провели дрожжевой количественный двугибридный анализ на предмет того, взаимодействует ли Эс^О с другими белками рекомбинационной репарации Эти результаты, представленные в Таблице 8, показывают, что 0ёв20 сильно взаимодействует с полноразмерным белком ЯЬр51.

DBD AD p-Gal активность Коэф. увеличения

Dds20 - 4.8 1.0

Rhp51 2143.7 448.5

Rhp51 - 2.9 1.0

Dds20 3.8 1.3

Не было обнаружено сколько-либо существенных взаимодействий с другими членами RAD52 группы, Rhp54, Rhp55, Rhp57 и Rad22, а также с мейотическим юмологом Rhp51, белком Dmcl.

Для подтверждения нангих данных по взаимодействию Dds20 и Rhp51 в дрожжевом двугибридном анализе, мы провели эксперименты по иммунопрсципитации этих белков Плазмнда сверхэкспрессирующая слитой белок GST-Rhp51 под контролем nmt промотора, была введена в штаммы dds20+-mycl3 и dds20. Белок Dds20-MycI3 иммунопреципитировали с помощью антител против Мус и белок G Сефарозы Как показано на Рис.8 (дорожка 2) белок GST-Rhp51 преципитировался вместе с Мус 13-слитым Dds20 Контроли в иммунопреципитационных экспериментах показали специфичность использованных антител (дорожка 3) и что белок GST-Rhp51 не связывался не специфически с шариками протеин G сефарозы (дорожка 1). Таким образом, наши данные указывают на взаимодействие между белками Dds20 и Rhp51 in viva.

IP: a-Мус

dds2(T-Myc13. -pGST-rhp51+: + IB:a -GST

IB: a-Myc

Рис.8. Белок Dds20 взаимодействует с Rhp51 in vivo.

Повторы PDA необходимы для функции белка Dds20.

Присутствие PDA повторов в белке Dds20 предполагает, что они могут иметь функциональное значение. Чтобы выяснить это, мы проверили, может ли повышенная

экспрессия PDA повторов вызывать доминантно негативный эффект на клеточную выживаемость в условиях генотоксического стресса. Мы экспрессировали часть белка Dds20 (остатки аминокислот 71-176), содержащую повторы PDA1 и PDA2, в япамме дикого типа и провели «капля-гест» на среде с ММС и без него. Как показано на Рис 9А, повышенная экспрессия PDA повторов (- thi) вызывает умеренно негативный эффект на клеточную выживаемость (ряд 1 и 3) Это особенно было заметно на чашках с ММС в сравнении с клетками, у которых экспрессия белка была репрессирована (ряд 2 и 4), или с клетками, содержащими пустой вектор (ряд 5, 6, 7, и 8). Это может предполагав, что PDA повторы являются модулями, определяющими взаимодействие между белками, и ко!да они экспрессируются в большем числе копий, то могут оттитровать белок, с которым взаимодействует Dds20 в клетке и /или приводить к сгохиометрическому дисбалансу компонентов мультипротеинового комплекса. Так как белок Dds20 взаимодействуе i с белком Rhp51, мы задались вопросом является ли негативный эффект повышенной экспрессии PDA повторов зависимым от присутствия в клетке белка Rhp51 Тот же эксперимент был выполнен на клетках не имеющих белка Rhp51 (штамм rhp51A), и было обнаружено, что негативный эффект повышенной экспрессии PDA повшров исчезал в отсутствии белка Rhp51 (сравните ряды 1 и 3 с 2 и 4) (Рис.9А). Это предполагает, что PDA повторы могут быть вовлечены во взаимодействие белков Dds20 и Rhp51 Чтобы выяснить функцию PDA повторов, мы ввели с помощью сайт - направленною мутагенеза аминокислотные замены в повторы PDA1 и PDA2, приводящие к изменению аминокислотного заряда на противоположный. Если PDA повторы являются модулями, определяющими взаимодействие между белками, то замена заряда на ем\ противоположный потенциально может приводить к потере функции повторов Так, с помощью сайт - направленного мутагенеза были внесены аминокислотные замещения лизина на глутамат в положениях К108Е (в повторе PDA1) и К164Е (в повторе PDA2) Как показано на Рис 9Б, одиночная мутация в любом из повторов не приводит к чувствительности клеток к высоким дозам камптотецина (ингибитор топоизомеразы I), и только немного повышает чувствительность к ММС, тогда как делеционный мутант dds20A является очень чувствительным к этим дозам агента. Однако когда две мутации в обоих повторах были скомбинированы вместе (dds20KI08E, К164Е), клетки становились значительно чувствительнее как к ММС, так и к камптотецину, хотя и не достигали чувствительности делеционного мутанта dds20A (Рис.9Б).

дикий тип

rhpSiA

пустой вектор

• • »

в •-.

• * Ь-

• » •

• ® »

• # -г- ■

• • «

без ММС 0.0075%ММС без ММС

О 0004%ММС

dds20-K164E MS20-K108E ätis20-K10BE, К164Е dds20A ДИКИЙ ТИП

В ^

# #

J> J* J* Ж

12 3 4

без ММС 0.0075% ММС 20 ^М СРТ

Рис.9 PDA повторы являются функциональными доменами белка Dds20. (А) Эффект повышенной экспрессии повторов PDA1 и PDA2 на чувствительность клеток штаммов дикого типа и rhpSlЛ к ММС. (В) Капля-тест штаммов с мутациями в PDA повторах на чувствительность к ММС и камптотецину (СРТ). (С) ,-LexA Стабильность мутантных белков.

Мутантные PDA повторы и дикого типа Dds20 были сверхэкспрессированны как Lex А слитые белки и определены визуально в белковых экстрактах с помощью иммуноблотинга с использованием антител к LexA.

Потеря функции белка Dds20 в репарации повреждений ДНК после введения мутаций в

PDA повторы не была обусловлена дестабилизацией белковой структуры, поскольку

уровни белка в клеточных экстрактах, приготовленных из всех тестируемых штаммов,

были схожими (Рис.9В). Эти данные свидетельствуют о важной роли PDA повторов в ДНК репарационной функции белка Dds20.

Ген rlpl* кодирует новый RecA-подобный белок S. ротЪе с высокой гомологией к белку человека Хгсс2.

Ранее в клетках делящихся дрожжей S.pombe были обнаружены четыре RecA-подобных белка Dmcl, Rhp51, Rhp55 и Rhp57. Мы проанализировали базу данных 5. pombe с помощью программы TBLASTN 14.11, используя последовательность белка Rhp55 в качестве пробы. Это позволило нам идентифицировать открытую рамку считывания SPBC1685.il на космидс SPBC1685 (картированную на второй хромосоме), потенциально способную кодировать полипептид со значительной гомолошей к белкам, принадлежащим к семейству белков Rad51/RecA. Ген был назван rip Г (for RecA-hke protem 1} Открытая рамка считывания rlpl* включает в себя 1094 пар оснований, которая может быть транслирована в белок с 363 аминокислотами с молекулярной массой 41,700 Белок Rlpl имеет наибольшую степень гомологии к Rad51 паралогу человека, белку Хгсс2. Наиболее высокая гомология была характерна для N-терминальной части белков Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей показал, что Rlpl имеет 28% идентичность и 44% сходность с белком человека Хгсс2, в то время как наименьшую гомологию среди RecA подобных белков он имел с белком S. pombe Rhp51 (22% идентичность и 38% сходность) и с белком Rhp55 (20% идентичность и 34% сходность) Таким образом, Rlpl вероятно представляет собой третий паралог S pombe Rad51 Молекулярный филогенетический анализ с использованием программы ClustalX (version 1.81) также показал близкое сходство двух белков, Rlpl и Хгсс2. Все члены семейства RecA-подобных белков имеют два NTP связывающих домена: Walker А домен (GxxxxGKT/S) и Walker В домен с харакч ерным гидрофобным профилем Мы обнаружили у Rlpl лишь характерный Walker А домен. В целом гомология белка Rlpl с RecA-подобными белками предполагает его участие в рекомбинационной репарации повреждений ДНК.

rlpl* является ДНК репарационным геном, действующим в одном пути репарации с rhp51rhp54* и rhp55*.

Чтобы проверить наше предположение обладает ли ген rlpl* функцией в репарации повреждений ДНК, мы использовали нуль аллель гена, который был сконструирован замещением полной рамки считывания гена на маркер КапМХ, придающий клеткам

устойчивость к генегицину. Делеционные мутанты RecA-подобных генов, вовлеченных в рекомбинационную репарацию двуцепочечных разрывов ДНК в делящихся дрожжах, являются чувствительными к алкилирующему агенту ММС. Среди них мутанты по генам паралогов Rad51, rhp55* и rhp57*, показывают необычный фенотип: повышенную чувствительность к ДНК - повреждающим агентам при низких температурах Мы проверили чувствительность штамма rlplA::KanMX к метилметансульфопату при 30°С и 23°С в эксперименте «капля-тест». Как показано на рис 10А, мутант rlpl показал чувствительность к 0.005% и 0.0075% ММС при 30°, и его чувствительность не увеличивалась при понижении температуры до 23°С. Как известно, действие ММС приводит к задержке репликации ДНК, что может сказаться на результатах, нолученных в эксперименте «капля-тест» ("замедленный рост клеток может маскировать смерть клеток) Поэтому мы провели опыты по острой инкубации клеток с ММС, которые показали, что мутант rlpl действительно обладает сниженной жизнеспособностью при воздействии ММС на клетки (Рис.ЮБ). Однако в целом выживаемость клеток rlpl и в этом случае была выше, чем у мутанта rhp55 В клетках S. pombe гены rhp51+, rhp54+, rhp55* и rad22* были определены, используя генетический анализ, в одну эпистатическую группу рекомбинационной репарации. Так как белок Rlpl показывает гомологию с RecA-подобными белками, правомерным являлось предположение, что Rlpl функционирует в том же пути репарации ДНК Чтобы проверить это предположение мы провели эпистатический анализ гена rlpl+ Двойные мутанты rlplrhp51, rlplrhp55 и rlplrad22 и одиночные мутанты по этим генам были тестированы на чувствительность к ММС (Рис.11). Мутанты rhp51, rhp55 и rad.22 оказались значительно чувствительнее к низким дозам ММС, чем мутант rlpl, что свидетельствует о наименее важной роли белка Rlpl в репарации повреждений ДНК вызванных действием ММС Двойные мутанты rlplrhpSl, rlplrhp55 и rlplrad22 были чувствительными к ММС в той же степени, что и одиночные мутанты rhp51, rhp55 и rad.22, указывая на то, что rlpl+ является эпистатичным по отношению к этим генам, а значит, работает вместе с ними при репарации повреждений ДНК вызываемых ММС. Известно, что спектр повреждений, возникающих при обработке клеток ММС, довольно широк и двуцепочечные разрывы ДНК составляют только час!ь повреждений, вызываемых действием этого вещества. Поэтому мы расширили наш эпистатический анализ гена rlpl+ использованием ионизирующей радиации, вызывающей главным образом двуцепочечные разрывы ДНК.

Дикий тип

без ММС

О 005% ММС

О 0075% ММС

Л О 1

со

гИрЗ!

«И

Дикий тип

Без 50 |щ/ц1

митомицинз С митомицина С

О 16 30 45 во 76

Время 0 5 ММС (мин)

Рис. 10. Чувствительность к ММС и эпистатический анализ гена г1р!+. (А) Тест ММС выживаемости мутанта г1р1 при двух различных температурах - при 30°С и при 23°С (Б) Выживаемость мутанта Нр1 при временной экспозиции ММС. (В) Тест на чувствительность к митомицину С.

Рис.12 показывает, что мутант т1р1 проявляет чувствительность к у лучам, хотя и значительно меньшую но сравнению с мутантами гНр51 и гкр55. Эти данные подтверждают наши результаты по чувствительности мутанта г1р1 к ММС и указывают, что белок Юр1 имеет функцию в репарации двуцепочечных разрывов ДНК, хотя его роль и не является такой критической как у белков ИЬр51 и Ш1р55. Двойные мутанты г1р1гЬ.р51 и г1р1гНр55 показали ту же чувствительность к у лучам, что и одиночные муганты гкр51 и гкр55. Вместе взятые, результаты, полученные в экспериментах с ММС и у лучами, показывают, что Нр1 является эпистатичным к генам гкр51+ и гкр55+ и функционирует в том же пути репарации ДНК, а именно в механизме рекомбинационной репарации двуцепочечных разрывов ДНК. Таким образом, Шр1 - новый ЯесА-подобный белок рекомбинационной репарации.

г1р1 не играет существенной роли в репарации повреждений ДНК, вызванных действием УФ света и в клеточном ответе при повреждениях репликационных вилок.

УФ повреждения ДНК вызывают образование пиримидиновых димеров и пиримидин 6-4 фотопродуктов, которые являются препятствием для движущихся репликационных вилок. Гены рекомбинационной репарации играют важную роль в клеточной выживаемости при УФ повреждениях ДНК, участвуя в и\Т)Е пути репарации и в механизме толерантности к УФ повреждениям ДНК. Мутанты 5 ротЪе по генам рекомбинационной репарации ДНК показывают значительную гиперчувствительность к УФ свету. Кроме того, эти мутанты также чувствительны к камптотецину, ингибитору ДНК топоизомеразы I, который вводит одно-цепочечные надрезы в ДНК, приводящие к коллапсу репликационных вилок. Поскольку ген Нр1+ принадлежит к эпистатической группе рекомбинационной репарации, мы проверили, является ли мутант г1р1 чувствительным к УФ свету и камтотецину. Тогда как мутант гкр55 показал ожидаемую нами значительную чувствительность к УФ свету, мутант г\р1 оказался устойчивым к УФ повреждениям ДНК, как и штамм дикого типа. Кроме того, делеция гена Нр1* не приводила к чувствительности к камптотецину, в то время как мутанты гкр51 и гкр55 показали высокую чувствительность к антибиотику (Рис. 12В) Отсутствие УФ и камптотецин - чувствительного фенотипа отличает г1р! А от других мутантов по генам рекомбинационной репарации.

rlpl rad22[ I ra422 [Е rlpl rhpSS t| rlpl rhp51 Г rhpSS | rhp5T[| rlpl Дикии тип[

без MMC 0.0002% 0.001% 0.0075%

Рис 11 Эпистатический анализ гена rip]+ в репарации ММС индуцированных повреждений ДНК.

Рис 12. (А) Эпистатический анализ гена rlpl* в репарации повреждений, вызванных действием у лучей (Б) Тест на чувствительность мутанта rip J к агенту, затрудняющему репликацию Для определения чувствительности клеток к 10 ДМ камптотецина (СРТ) были использованы клетки в пятикратных разведениях.

rlpl

Ир1 thpSbyripj rtq/SS rlq>55

ZOO 400 600 800 дозы y лучей(Су)

дикии тип

без СРТ

Ю^МСРТ

Мейоз и переключение типа спаривания в мутанте rlpl.

Мутанты S pombe rhpSl, rhp55 и rad22 характеризуются такими мейотическими дефектами как сниженные эффективность споруляции и жизнеспособность спор. В связи с этим мы проверили споруляционные фенотипы мутанта rlpl Для этого мы провели скрещивания штаммов дикого типа и мутанта rlplA.. Эффективность споруляции и жизнеспособность спор в скрещивании дикого типа были на уровне 33% и 95%, соответственно, тогда как в скрещивании клеток rlpl эффективность споруляции была уменьшена в 2.3-раза (14.3%), а жизнеспособность спор оказалась на уровне (95%) скрещивания клеток дикого типа.

Переключение типа спаривания в клетках S. pombe инициируется повреждением ДНК (вероятно одно- цепочечным надрезом или другими модификациями ДНК) в кассете matl, который, по-видимому, конвертируется репликацией ДНК в двуцепочечный разрыв ДНК Впоследствии этот двуцепочечный разрыв ДНК репарируется рекомбинационным механизмом. Нарушения рекомбинационной репарации двуцепочечных разрывов ДНК может приводить к дефекту переключения типа спаривания. Действительно, мутанты по репарации двуцепочечных разрывов ДНК, rad22, rhp51 и rhp55, являются дефектными в переключении типа спаривания. Мы скрестили штамм h* rlpl А со штаммом h90 rlpl А, чтобы получить гомоталический штамм h90rlplA, и проанализировали с помощью микроманипулятора потомство образующихся тсгград. В общей сложное i и двадц<иь жизнеспособных тетрад были проанализированы на генотип содержащихся в них индивидуальных спор Среди них мы обнаружили 4 тетрады с не родительским дитипом, включающие в себя две h90rlpl А (йод - позитивные) и две К*г1рГ{йод - негативные) споры Выделенные споровые клоны h90rlpl при высеве на споруляционную среду положительно окрашивались парами йода, как и родительские штаммы h90 дикого типа, показывая нормальную способность к переключению типа спаривания и образованию спор у мутанха h90 rlpl. Более того, штамм h90rlpl не сегрегировал на йод - негативные (не переключающиеся) гетероталичные колонии, как это наблюдали в ряде муташных клеток с дефектом в переключении типа спаривании Таким образом, наши данные указывают, что мутант rlpl не имеет дефекта в переключении типа спаривания.

Двугибридный анализ взаимодействия Rlpl с другими белками рекомбинационной репарации.

Ранее были идентифицированы множественные взаимодействия между белками рекомбинационной репарации в S. pombe. Среди них два Rad51 napanoi а 5. pombe , Rhp55 и Rhp57, образуют гетеродимер, который взаимодействует с N-терминальной частью Rhp51 через Rhp57 субъединицу. Поскольку наши данные предполагают, что Rlpl является третьим паралогом белка Rad51 в 5. pombe, и принадлежит к группе белков рекомбинационного пути репарации двуцспочечных разрывов ДНК, мы провели систематический анализ взаимодействий между Rlpl и другими членами группы рекомбинационной репарации в 5 pombe, используя дрожжевую двугибридную систему Были сконструированы N-терминальные слияния полно размерного белка Rlpl с DBD и AD соответствующих векторов и количественно оценены по парные взаимодействия Rlpl с другими белками RAD52 группы Взаимодействия между белками Rlpl и Rhp51, и Rlpl и Rhp55 не обнаружены. Мы расширили наш анализ по взаимодействию Rlpl и Rhp51 использованием более стабильных делеционных версий белка Rhp51, Rhp51 АС (аа 1 -117) и RhpSlAN (аа 114-365). Наши данные показывают, что и делеционные формы белка Rhp51 не взаимодействуют с белком Rlpl. В результате мы заключили, что Rlpl не взаимодействует с Rhp51 Нами не были также выявлены взаимодействия Rlpl с другим RecA - подобным белком Rhp55, а также с белками Rhp54 и Rad22. Однако мы постоянно наблюдали почти 6-кратнос увеличение ß-галактозидазной активности, указывающей на взаимодействие между белками Rlpl и Rhp57. Наши данные предполагают, что Rlpl, подобно S pombe Rhp55, вероятно не напрямую ассоциирован с рекомбиназой Rhp51, а образует временный комплекс с субъединицей Rhp57 гетеродимера Rhp55/Rhp57, взаимодействующего непосредственно с Rhp51.

Выводы.

1 Идентифицированы два новых гена делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe-dds20* и rlpl*, участвующие в механизме репарации двуцепочечных разрывов ДНК

2 Показано, что ген dds20* является высококопийным супрессором чувствительности к у лучам, метилметансульфонату и УФ лучам мутаншых клеток с делениями в генах rhp55* и rhpST, кодирующих паралоги ключевого белка рекомбинационной репарации Rad51.

3. Установлено, что мутант dds20A проявляет уникальный фенотип холодочувствительность в репарации УФ и ММС-индуцированных повреждений ДНК, свидетельствующий о вероятной роли белка Dds20 в образовании и/или стабилизации

мультипротеинового комплекса, участвующего в механизме рекомбинационной репарации.

4. Обнаружен новый Rhp51-зависимый механизм рекомбинационной репарации, контролируемый белком Dds20 и действующий параллельно пути контролируемом Rad51 паралогами.

5. Установлено, что Dds20 взаимодействует in vivo с белком Rhp51, образующим Rhp51-ДНК нуклеопротеиновый филамент.

6. Показано, что белок Dds20 функционирует в новом Cdslp-независимом пути толерантности к повреждениям ДНК, вызванным действием УФ света.

7. Обнаружен новый тип белковых повторов (повторы PDA), который может представлять собой структурный модуль, опосредующий взаимодействие между белками Нарушение репарационной способности белка Dds20 введением мутаций в PDA повторы с помощью сайт-направленного мутагенеза показывает, что PDA повторы являются важной функциональной частью белка Dds20.

8. Выдвинута гипотеза о медиаторной роли белка Dds20 в сборке Rhp5) нуклеопротеинового филамента вне S-фазы клеточного цикла.

9. Обнаружен новый RecA-подобный ген rip]кодирующий третий Rad51 паралог Schizosaccharomyces pombe. С помощью эпистатического анализа установлено, чго rlpl* принадлежит к RAD52 группе генов рекомбинационной репарации ДНК. Делсция гена rlpl* приводит к чувствительности клеток к метилметансульфонату и у лучам.

10.Rlpl не играет существенной роли в репарации повреждений ДНК, вызванных действием УФ света и в клеточном ответе при повреждениях репликационных вилок. Не обнаружено существенной роли Rlpl в переключении типа спаривания и мейозе.

11.Показано, что Rlpl имеет высокую степень гомологии с RadSl паралогом человека, белком Хгсс2. Однако отсутствие чувствительности rlpl мутанта к митомицину С не позволяет считать его непосредственным функциональным гомологом Хгсс2 Идентификация Rlpl и анализ свойств делеционного мутанта демонегрируег функциональное разнообразие и специализацию RecA-подобных белков в ряду от дрожжей до позвоночных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1) Khasanov FK., Salakhova A.F., Chepurnaja О. V., Korolev V.G., Bashkirov VI Identification and characterization of the rlplthe novel Rad51 paralog in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. DNA Repair. 2004. 3:1363-1374

2) Салахова А.Ф, Савченко Г.В., Хасанов Ф.К., Чепурная О.В., Королев В.Г, Башкиров В.И. Ген dds20* контролирует новый Rad51Sp -зависимый путь рекомбинационной репарации в Schizosaccharomyces pombe. Генетика. 2005. 41 • 1-10

3) Khasanov F.K., Savchenko G.V., Salakhova A.F., Vagin D.A., Bashkirov V I. Fission yeast dds20+ defines a novel pathway of DNA damage tolerance. Meeting of International Reseaich Scholars of Howard Hughes Mcdical Institute. June 20-23 2001, Vancouver, Canada

4) Khasanov F K„ Salakhova A.F , Hartsuiker E., Savchenko G V , Korolev V G., Kohli J , Carr AM, Bashkirov VI Novel Rad5Independent pathway of recombination/repair in Sihizosaccharomyces pombe mediated by Dds20 protein Genetic Recombination & Genome Rearrangements. FASEB Meeting July 26-31 2004 Snowmass Village, Snowmass, Colorado, USA.

5) Khasanov F.K., Salakhova A.F., Savchenko G.V., Hartsuiker E., Korolev V.G., Carr A M„ Bashkirov V.I Novel Rad5 ISp-dependent pathway of recombination/repair in Schizosaccharomyces pombe mediated by Dds20 protein. Meeting of International Reseaich Scholars of Howard Hughes Medical Institute, Tallinn, Estonia, June 23-"'

* 'i

Принято к исполнению 27/04/2005 Исполнено 27/04/2005

Заказ № 798 Тираж' 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www autoreferat ru

РНБ Русский фонд

2005-4 45441

М^?005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Салахова, Альбина Фаатовна

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Делящиеся дрожжи Schizosaccharomyces pombe как модельный объект в молекулярно- генетических исследованиях.

2.2. Рекомбинационная репарация как основной механизм исправления двуцепочечных разрывов ДНК в эукариотических клетках.

2.3. Характеристика генов, участвующих в механизме рекомбинационной репарации.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Штаммы, использованные в работе.

3.2. Ростовые среды.

3.3. Генетические скрещивания.

3.4. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli.

3.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.6. Трансформация клеток штамма E.coli DH5a.

3.7. Трансформация клеток S. pombe.

3.8. Выделение ДНК из агарозного геля.

3.9. Тесты на клеточный ответ на генотоксический стресс.

3.10. Полимеразная цепная реакция.

3.11. Конструирование делеционного мутанта dds20::arg3+.

3.12. Выделение белка Dds20 из клеток S.pombe.

3.13. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

3.14. Тест на эффективность мейотической внутригенной рекомбинации.

3.15. Тест на эффективность мейотической межгенной рекомбинации.

3.16. Определение выживаемости спор.

3.17. Определение эффективности споруляции.

3.18. Тесты на белок-белковые взаимодействия.

3.19. Манипуляции с ДНК.

3.20. Иммунофлуоресцентная микроскопия.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Dds20 - высококопийный супрессор нарушения репарации клеток, лишенных

S. pombe Rad51 паралогов Rhp55 (Rad55Sp) и Rhp57 (Rad57Sp).

4.2. Конструирование делеционного мутанта dds20::arg3+.

4.3. Чувствительность мутантных клеток dds20A к генотоксическому стрессу.

4.4. dds20+ эпистатичен radl8 и rad60, и является высококопийным супрессором репликационных и репарационных дефектов мутанта rad60.

4.5. Dds20 не играет существенной роли в возобновлении остановленной репликации и в переключении типа спаривания.

4.6. Dds20 участвует в Cdsl-независимом механизме толерантности УФ повреждений ДНК.

4.7. Уровень потери хромосомы и митотической рекомбинации не изменен в мутанте dds2 0.

4.8. Мейотическая рекомбинация снижена в мутанте dds20A.

4.9. Dds20 является ядерным белком, взаимодействующим с Rhp51 (Rad51Sp).

4.10. Повторы PDA необходимы для функции белка Dds20.

4.11. Ген rlpl+ кодирует новый RecA-подобный белок S. pombe с высокой гомологией к белку человека XRCC2.

4.12. Конструирование делеционного штамма rlpl.

4ЛЗ. rlpl+ является ДНК репарационным геном, действующим в одном пути репарации с rhp51+, rhp54+ и rhp55+.

4.14. Rlplp не играет существенной роли в репарации повреждений ДНК, вызванных действием УФ света и в клеточном ответе при повреждениях репликационных вилок.

4.15. Спонтанная митотическая внутрихромосомная рекомбинация в мутанте rlpl.

4.16. Мейоз и переключение типа спаривания в мутанте rlpl.

4.17. Дрожжевой двугибридный анализ взаимодействия Rlpl с другими белками рекомбинационной репарации.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. Rad51 -зависимые механизмы рекомбинационной репарации.

5.2. Dds20 и толерантность к повреждений ДНК, вызванных действием УФ света.

5.3. Повторы PDA и возможная роль белка Dds20 в репарации двуцепочечных разрывов ДНК.

5.4. Rlpl является новым паралогом Rad51 в делящихся дрожжах.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика новых генов Schizosaccharomyces pombe dds20+ и rlp1+, участвующих в клеточном ответе на повреждения ДНК"

Целостность генетической информации клетки постоянно подвергается воздействию экзогенных химических и физических факторов, которые могут вызывать широкий спектр повреждении ДНК. В дополнение к индуцированным повреждениям значительный уровень спонтанных повреждений ДНК может возникать в результате клеточного метаболизма [Friedberg, 1995]. Двуцепочечные разрывы ДНК, возникающие спонтанно пли при действии ряда химических и физических факторов, например, таких как алкнлирующий агент метилметансульфонат и ионизирующая радиация, являются наиболее тяжелыми повреждениями ДНК, препятствующими процессам транскрипции и репликации ДНК. Не репарированпые или неправильно репарированные двуцепочечные разрывы ДНК могут приводить к хромосомным перестройкам, мутагенезу, канцерогенезу и клеточной смерти. Существенной потребностью для всех организмов является поддержание целостности генома н противодействие накоплению повреждений ДНК. Живые организмы выработали специальные системы для исправления таких повреждений ДНК [Detloff et.al., 1991] среди которых наиболее существенньши механизмами исправления повреждений ДНК являются фотореактивация УФ повреждений, эксцизионная нуклеотидная и рекомбинационная репарации. Двуцепочечные разрывы ДНК репарируются в клетках дрожжей преимущественно с помощью системы рекомбипационной репарации. Рекомбинационная репарация представляет собой безошибочный способ исправления ошибок ДНК, поскольку она использует информацию другого гомолога или сестринской хроматиды для репарации повреждения ДНК. Клетками используются также другие механизмы репарации двуцепочечных разрывов ДНК, основанные на отжиге одноцепочечных участков или негомологичном соединении концов ДНК в месте разрыва [Paques and Haber, 1999]. Однако в отличие от рекомбипационной репарации два последних механизма репарацщ! двуцепочечных разрывов ДНК являются потенциально мутагенными, поскольку они сопровождаются делениями ДНК в местах разрывов.В ответ на повреждение ДНК происходит остановка клеточного цикла, индуцируется транскрипция репарационных генов, и включаются различные пут репарации ДНК. Эти процессы контролируются механизмами контроля клеточного цикла, предотвращая вхождение клетки в S-фазу или митоз, до тех пор, пока повреждение ДНК не будет репарировано. Механизмы контроля клеточного цикла являются одной из составляющих клеточного ответа на повреждения ДНК, и они обеспечивают выживание клетки и стабильность ее генома.Так как ионизирующая радиация может использоваться в качестве игютрумента в медицинских диагностических целях и терапии рака, необходимо более полное понимание клеточных ответов на возможные повреждения ДНК. Более того, радиационная устойчивость раковых клеток создает ряд проблем с противораковой терапией. Как следствие, радиационная устойчивость может вызывать повышенную репарационную способность раковых клеток [Lavin and Shiloh, 1997]. Повышенные уровни рекомбинации, наблюдаемые у людей с такими синдромами с предрасположешюстью к раку как синдромы Блюма или Вернера, первично вызывают геномную нестабильность в клетках пациентов [Ellis and Geiger, 1995; Scully, 1997].Наличие прямой связи между предрасположенностью к раковым заболеваниям груди и яичника и репарационными процессами было недавно проде\юнстрировано обнаружением взаимодействия между белками Brcal и Вгса2 с ключевым белком рекомбннационной репарации RadSl [Sharan et.al., 1997; George et.al., 1975]. Таким образом, понимание и изучение молекулярных механизмов эукариотнческой реко.мбинационной репарации является важным с точки зрения молекулярной патологии болезней человека и их медицинской терапии.Эволюционно консервативный механизм рекомбинационной репарации в ряду от низшей организации генома к организмам более высоко организованным играет определяющую роль в выживаемости клеток и сохранении целостности генома. Однако механизм рекомбинационной репарации остается не достаточно изученным. Этот процесс наиболее хорошо исследован у бактерий, недостаточно полно у дрожжей и мало изучен у млекопитающих и человека.Представленная работа направлена на решение фундаментальной задачи нониманне механизмов рекомбинационной репарации в эукариотическнх организмах.Проведенные исследования могут послужить основой для изучения этих механизмов в клетках человека с выходом на генетические заболевания. Они также важны и для понимания процессов гомологичной рекомбинации при генных манипуляциях с клетками высших организлюв (трансгенезис и генотерапия).Основной целью диссертационной работы является выяснение молекулярных механизмов рекомбинационной репарации ДНК в эукариотах, используя делящиеся дрожжи Schizosaccharomyces pombe в качестве модельной системы, через изучение двух открытых налш новых генов, dds20* и г/р/" ,^ и кодируемых ими белков генетическилп!, молекулярно биологическими и биохимическими методами.В настоящем исследовании бьши поставлены следующие задачи: 1. Поиск новых генов, участвующих в рекомбинационной репарации делящихся дрожжей, методами: а) скрининга геномной библиотеки S. pombe для выявления супрессоров метилметансульфонат - чувствительного фенотипа клеток с делецией S. pombe, гена rhp55'^, б) компьютерного поиска в базе данных S. pombe новых RecAподобных белков с использованием TBLASTN 1.4.11 [Altschul et.al., 1990].2. Обнаружение генетических взаимодействий открытых нами новых генов S. pombe dds20^ и rlpl*, а также анализ фенотипов мутантов по этим генам. Стратегия экспериментов включала конструирование од1нючных, двойных и тройных мутантов, а также эпистатическии анализ по клеточной выживаемости мутаптных клеток при действии у- лучей, метилметансульфоната и УФ света.3. Изучение возможных взаимодействий белков Dds20 и Rlpl с другими белками рекомбинационной репарации, с использованием методов двугнбридпого анализа в дрожжевой системе S. cerevisiae и иммунопреципитации белков.4. Изучение потенциальных мейотических дефектов в мутантах S. ротЬе dds20 и rlpl с использованием количественной оценки эффективности споруляции, жизнеспособности спор и частоты менотической внутригеиной и межгенной рекомбинации.5. Определение роли S. ротЬе dds20^ и rlpl"^ в митотической рекомбинации при измерении частоты потери хромосомы S. ротЬе и рекомбинации между голюлогичнымн хромосомами с помощью флуктуационного теста [Hartsuiker et.al., 2001], а также частоты рекомбинации сестринских хроматид в мутаитных клетках dds20 и rlpl [Schuchert et. al., 1988].В результате проделанной работы мы показали, что dds20^ является новым геном рекомбинациоппой репарации. Наши данные свидетельствуют, что в делящихся дрожжах действуют два различных RadSl-зависимых пути репарации двуцепочечных разрывов ДНК. Мы обнаружили, что ген dds20^ определяет новый путь сборки Кас151-ДНК филамента в делящихся дрожжах, функционирующий параллельно пути, опосредованному Rad51 паралогами, белка\«1 Rhp55 и Rhp57. В настоящее время нет свидетельств наличия такого пути репарации в почкующихся дрожжах, что не исключает его существования в других эукариотических организмах. В подтверждение генетических данных о наличии второго Rad51-зависимого пути у S. ротЬе мы показали, что белок Dds20 непосредственно взаимодействует с RadSl^''. Это позволяет предположить, что Dds20 может играть медиаторную роль в образовании Rad51-ДHK филамента, параллельную роли Rad51 паралогов.Так же в этой работе мы охарактеризовали другой ген rlpl^, идентифицированный в делящихся дрожжах. Этот ген кодирует белок структурно схожий белкам RecA семейства, и таким образом, он является третьим паралогом Rad51 в S. ротЬе, помимо белков Rhp55 и Rhp57.Настоящая работа выполнена в лаборатории Молекулярной генетики репарации ДНК Института биологии гена РАН. Автор выражает благодарность своим научным руководителям Башкирову Владимиру Ивановичу и Хасанову Фуату Каримовичу за профессиональное руководство, Паршенковой Ольге Анатольевне за техническую помощь и всем сотрудникам лаборатории Молекулярной генетики репарации ДНК за помощь в выполнении этой работы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Салахова, Альбина Фаатовна

выводы

1. Идентифицированы два новых гена делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe: dds20* и rlpl*, участвующие в механизме репарации двуцепочечных разрывов ДНК.

2. Показано, что ген dds20* является высококопийным супрессором чувствительности к у лучам, метилметансульфонату и УФ лучам мутантных клеток с делениями в генах rhp55* и г hp 57*, кодирующих паралоги ключевого белка рекомбинационной репарации Rad51.

3. Установлено, что мутант dds20A проявляет уникальный фенотип -холодочувствительность в репарации УФ и ММС-индуцированных повреждений ДНК, свидетельствующий о вероятной роли белка Dds20 в образовании и/или стабилизации мультипротеинового комплекса, участвующего в механизме рекомбинационной репарации.

4. Обнаружен новый Rhp51 -зависимый механизм рекомбинационной репарации, контролируемый белком Dds20 и действующий параллельно пути контролируемом Rad51 паралогами.

5. Установлено, что Dds20 взаимодействует in vivo с белком Rhp51, образующим Rhp51 -ДНК нуклеопротеиновый филамент.

7. Обнаружен новый тип белковых повторов (повторы PDA), который может представлять собой структурный модуль, опосредующий взаимодействие между белками. Нарушение репарационной способности белка Dds20 введением мутаций в PDA повторы с помощью сайт-направленного мутагенеза показывает, что PDA повторы являются важной функциональной частью белка Dds20.

8. Выдвинута гипотеза о медиаторной роли белка Dds20 в сборке Rhp51 нуклеопротеинового филамента вне S-фазы клеточного цикла.

9. Обнаружен новый RecA-подобный ген rlpl+, кодирующий третий Rad51 паралог Schizosaccharomyces pombe. С помощью эпистатического анализа установлено, что rlpl+ принадлежит к RAD52 группе генов рекомбинационной репарации ДНК. Делеция гена rlpl* приводит к чувствительности клеток к метилметансульфонату и у лучам.

10. Rlpl не играет существенной роли в репарации повреждений ДНК, вызванных действием УФ света и в клеточном ответе при повреждениях репликационных вилок. Не обнаружено существенной роли Rlpl в переключении типа спаривания и мейозе.

11. Показано, что Rlpl имеет высокую степень гомологии с Rad51 паралогом человека, белком Хгсс2. Однако отсутствие чувствительности rlpl мутанта к митомицину С не позволяет считать его непосредственным функциональным гомологом Хгсс2. Идентификация Rlpl и анализ свойств делеционного мутанта демонстрирует функциональное разнообразие и специализацию RecA-подобных белков в ряду от дрожжей до позвоночных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Салахова, Альбина Фаатовна, Москва

1. Хасанов Ф.К., Башкиров В.И. Рекомбинационная репарация в Schizosaccharomyces pombe: Роль в поддержании целостности генома. 35 (2001) 1-14.

2. Abe Н., Wada М., Kohno К., Kuwano М. 1994. Altered drug sensitivities to anticancer agents in radiation-sensitive DNA repair deficient yeast mutants. Anticancer Res. 14:1807-1810.

3. Ajimura M., Leem S.H., Ogawa H. 1992. Identification of new genes required for meiotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 133:51-66.

4. Akamatsu Y., Dziadkowiec D., Ikeguchi M., Shinagawa H., Iwasaki H. 2003. Two different Swi5-containing protein complexes are involved in mating-type switching and recombination repair in fission yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:15770-15775.

5. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.

6. Arcangioli B. 1998. A site- and strand-specific DNA breaks confers asymmetric switching potential in fission yeast. EMBO J. 17:4503-4510.

7. Arcangioli В., de Lahondes R. 2000. Fission yeast switches mating type by a replication-recombination coupled process, EMBO J. 19:1389-1396.

8. Auble D.T., Wang D., Post K.W., Hahn S. 1997. Molecular analysis of the SNF2/SWI2 protein family member MOT 1, an ATP-driven enzyme that dissociates TATA-binding protein from DNA. Mol. Cell. Biol. 17:4842-4851.

9. Baroni E., Viscardi V., Cartagena-Lorola H., Lucchini G., Pia Longhese M. 2004. The functions of budding yeast Sae2 in DNA damage response require Mecl- and Tell-dependent phosphorylation. Mol. Cell. Biol. 24:4151-4165.

10. Bashkirov V.I., King J.S., Bashkirova E.V., Schmuckli-Maurer J., Heyer W.D. 2000. DNA repair protein Rad55 is a terminal substrate of the DNA damage checkpoints. Mol. Cell. Biol., 20:4393-4404.

11. Beach D.H. 1983. Cell type switching by DNA transposition in fission yeast. Nature. 305:682687.

12. Benson F.E., Baumann P., West S.C. 1998. Synergistic actions of Rad51 and Rad52 in recombination and DNA repair. Nature. 391:401-404.

13. Bianco P.R., Tracy R.B., Kowalczykovski S.C. 1998. DNA strand exchange proteins: a biochemical and physical comparison. Bioessays. 3:1-56.

14. Boddy M. N., Lopez-Girona A., Shanahan P., Interthal H., Heyer W. D„ and Russell P. 2000. Damage tolerance protein Mus81 associates with the FHA1 domain of checkpoint kinase Cdsl. Mol. Cell. Biol. 20:8758-8766.

15. Braybrooke J.P., Spink K.G., Thacker J., Hickson I.D. 2000. The RAD51 family member, RAD51L3, is a DNA-stimulated ATPase that forms a complex with XRCC2. J. Biol. Chem. 275:29100-29106.

16. Cartwright R., Tambini C.E., Simpson P.J., Thacker J. 1998. The XRCC2 DNA repair gene from human and mouse encodes a novel member of the recA/RAD51 family. Nucleic Acids Res. 26:3084-3089.

17. Caspari Т., Murray J. M., Carr A. M. 2002. Cdc2-cyclin В kinase activity links Crb2 and Rqhl-topoisomerase 1П. Genes Dev. 16:1195-1208.

18. Cao Y., Kogoma T. 1995. The mechanism of recA polA lethality: Suppression by RecA-independent recombination repair activated by the lexA (Def) mutation in Escherichia coli. Genetics. 139:1483-1494.

19. Cervantes M.D., Farah J.A., Smith G.R. 2000. Meiotic DNA breaks associated with recombination in S. pombe. Mol. Cell. 5:883-888.

20. Chlebowiecz E., Jachymczyk W.J. 1979. Repair of MMS-induced DNA double-strand breaks in haploid cells of Saccharomyces cerevisiae, which requires the rpesence of a duplicate genome, Mol. Gen. Genet. 167:279-286.

21. Cromie G.A, Leach DR 2001. Recombinational repair of chromosomal DNA double-strand breaks generated by a restriction endonuclease. Mol Biol. Cell. 41:873-883.

22. Detloff P., Sieber J., Petes T.D. 1991. Repair of specific base pair mismatches formed during meiotic recombination in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol.l 1:737-45.

23. Doe C.L., Ahn J.S., Dixon J., Whitby M.C. 2002. Mus81-Emel and Rqhl involvement in processing stalled and collapsed forks. J. Biol. Chem. 277:32753-32759.

24. Doe CL, Osman F, Dixon J, Whitby MC. 2004. DNA repair by a Rad22-Mus81 -dependent pathway that is independent of Rhp51. Nucleic Acids Res. 32:5570-81.

25. Dong Z., Zhong Q., Chen P.L. 1999. The Nijmegen breakage syndrome protein is essential for Mrel 1 phosphorylation upon DNA damage. J. Biol. Chem. 274:19513-19516.

26. Dronkert M.L.G., Kanaar R. 2001. Repair of DNA interstrand cross-links. DNA Repair 486:217247.

27. Dudas A, Chovanec M. 2004. DNA double-strand break repair by homologous recombination. MutatRes. 566:131-167.

28. Egel R., Beach D.H., Klar A.J. 1984. Genes required for initiation and resolution steps of mating-type switching in fission yeast. Proc Natl. Acad. Sci. USA 81:3481-3485.

29. Egel R. 1989. Mating-type genes, meiosis, and sporulation. In: A. Nasim, P. Young and B.F. Johnson (Eds.), Molecular biology of fission yeast, Academic Press, San Diego. 671-691.

30. Ellis J. Geiger K. 1995. Real-time description of parton-hadron conversion and confinement dynamics. Phys Rev D Part Fields 52:1500-1526.

31. Fleck O., Heim L., Gutz H. 1990. A mutated s\vi4 gene causes duplications in the mating-type region of Schizosaccharomyces pombe. Curr. Genet. 18:501-509.

32. Fousteri M. I., Lehmann A.R. 2000. A novel SMC protein complex in Schizosaccharomyces pombe contains the Radl8 DNA repair protein. EMBO J. 19:1691-1702.

33. French C.A., Masson J.Y., Griffin C.S., O'Regan P., West C.S., Thacker J. 2002. Role of mammalian RAD51L2 (RAD51C) in recombination and genetic stability. J. Biol. Chem. 277:19322-19330.

34. Friedberg E.C., Walker G.C., Siede W. 1995. DNA Repair and Mutagenesis, ASM Press, Washington, DC.

35. Fukushima K., Tanaka Y., Nabeshima K., Yoneki Т., Tougan Т., Tanaka S., Nojima H. 2000. Dmcl of Schizosaccharomyces pombe plays a role in meiotic recombination, Nucleic Acids Res. 28:2709-2716.

36. George J., Castellazzi M., Buttin G. 1975. Prophase induction and cell division in E.coli. III. Mutations sfiA and sfiB restore division in tif and Ion strains and permit the expression of mutator properties of tif. Mol.Gen.Genet. 140:309-332.

37. Grishchuk A.L, Kohli J. 2003. Five RecA-like proteins of Schizosaccharomyces pombe are involved in meiotic recombination. Genetics. 165:1031-43.

38. Gutz H., Heslot H., Leupold U., Loprieno N. 1974. Schizosaccharomyces pombe. In R. C. King (ed.), Handbook of genetics, vol. 1. Plenum Press, New York, NY. 395-446.

39. Gyuris J., Golemis E., Chertkov H., Brent R. 1993. Cdil, a human G1-phase and S-phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75:791-803.

40. Haber J.E. 1998. The many interfaces oSMrell. Cell 95:583-586.

41. Hagan I. M., Hyams J.S. 1988. The use of cell division cycle mutants to investigate the control of microtubule distribution in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J. Cell Sci. 89:343357.

42. Hays S.L., Firmenich A.A., Berg P. 1995. Complex formation in yeast double-strand break repair participation of Rad51, Rad52, Rad55, and Rad57 proteins. Proc Natl. Acad. Sci. USA. 92:6925-6929.

43. Johnson R.D., Symington L.S. 1995. Functional differences and interactions among the putative RecA homologs RAD51, RAD55, and RAD57. Mol. Cell. Biol. 15:4843-4850.

44. Jones N.J., Cox R., Thacker J. 1987. Isolation and cross-sensitivity of X-ray-sensitive mutants of V79-4 hamster cells. Mutation Res. 183:279-286.

45. Kai M, Wang TS. 2003. Checkpoint responses to replication stalling: inducing tolerance and preventing mutagenesis. Mutation Res. 222:59-73.

46. Kaykov A., Holmes A.M., Arcangioli B. 2004. Formation, maintenance and consequences of the imprint at the mating-type locus in fission yeast. EMBO J. 23:930-938.

47. Khasanov F.K., Savchenko G.V., Bashkirova E.V., Korolev V.G., Heyer W.-D., Bashkirov V.I. 1999. A new recombinational DNA repair gene from Schizosaccharomyces pombe with homology to E. coli RecA, Genetics 152:1557-1572.

48. Kojic M., Kostrub C.F., Buchman A.R., Holloman W.K. 2002. BRCA2 homolog required for proficiency in DNA repair, recombination, and genome stability in Ustilago maydis. Mol. Cell 10:683-691.

49. Kojic M., Yang H., Kostrub C.F., Pavletich N.P. 2003. The BRCA2-interacting protein DSS1 is vital for DNA repair, recombination, and genome stability in Ustilago maydis. Mol. Cell 12:1043-1049.

50. Maniatis T, Fritsch E.E., Sambrook J. Molecular cloning. 1982. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory.

51. Masson J.Y., Tarsounas M.C., Stasiak A.Z., Stasiak A., Shah R., Mcllwraith M.J. Benson F.E., West S.C. 2001. Identification and purification of two distinct complexes containing the five RAD51 paralogs. Genes Dev. 15:3296-3307.

52. Mata J., Lyne R., Burns G., Bahler J. 2002. The transcriptional program of meiosis and sporulation in fission yeast. Nat Genet. 32:143-7.

53. Mazin, A., Alexeev A., Kowalczykowski S. C. 2003. A novel presynaptic function of Rad54 protein: Stabilization of the Rad51 nucleoprotein filament. J. Biol. Chem. Опубликование online как M212779200

54. Mazin A.V., Bornarth C.J., Solinger J.A., Heyer W.D., Kowalczykowski S.C. 2000. Rad54 protein is targeted to pairing loci by the Rad51 nucleoprotein filament. Mol. Cell. 6:583-592.

55. Michel В., Ehrlich S.D., Uzest M. 1997. DNA double-strand breaks caused by replication arrest. EMBOJ. 16:430-438.

56. Muris D.F.R., Vreeken K., Carr A.M., Broughton B.C., Lehmann A.R., Lohman P.H.M., Pastink A. 1993. Cloning the RAD51 homologue of Schizosacchaomyces pombe. Nucleic Acids Res. 21:4586-4591.

57. Murray J. M., Lindsay H. D., Munday C. A., Carr A. M. 1997. Role of Schizosaccharomyces pombe RecQ homolog, recombination, and checkpoint genes in UV damage tolerance. Mol. Cell. Biol. 17:6868-6875.

58. New J.H., Sugiyama Т., Zaitseva E., Kowalczykowski S.C. 1998. Rad52 protein stimulates DNA strand exchange by Rad51 and replication protein A. Nature 391:407-410.

59. Ogawa T. Yu X, Shinohara A., Egelman E.H. 1993. Similarity of the yeast RAD51 filament to the bacterial RecA filament. Science 259:1896-1899.

60. O'Regan P., Wilson C„ Townsend S., Thacker J. 2001. XRCC2 is a nuclear RAD51-like protein required for damage-dependent RAD51 focus formation without the need for ATP binding, J. Biol. Chem. 276:22148-22153.

61. Osman F., Adriance M., McCready S., Curr. 2000. The genetic control of spontaneous and UV-induced mitotic intrachromosomal recombination in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Genet. 38:113-125.

62. Osman F., Bjoras M., Alseth I., Morland I., McCready S., Seeberg E., Tsaneva I. 2003. A new Schizosaccharomyces pombe base excision repair mutant, nthl, reveals overlapping pathways for repair of DNA base damage. Mol. Microbiol. 48:465-480.

63. Ostermann K., Lorentz A., Schmidt H. 1993. The fission yeast rad22 gene, having a function in mating-type switching and repair of DNA damages, encodes a protein homolog to Rad52 of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 21:5940-5944.

64. Paques F., Haber J.E. 1999. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol.Mol.Biol.Rev. 63:349-404.

65. Pastink A., Eeken J.C.J., Lohman P.H.M. 2001. Genomic integrity and the repair of double-strand DNA breaks. Mutation Research 480:37-50.

66. Pawson Т., Nash P. 2003. Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains. Science 300:445-452.

67. Pellegrini L., Yu D. S., Lo Т., Anand S., Lee M., Blundell T. L., Venkitaraman A. R. 2002. Insights into DNA recombination from the structure of a RAD51-BRCA2 complex. Nature 420:287-293.

68. Pellegrini L., Venkitaraman A. 2004. Emerging functions of BRCA2 in DNA recombination. Trends in Biochemical Sciences. 29:310-316.

69. Petukhova G., Stratton S., Sung P. 1998. Catalysis of homologous pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature. 393:91-94.

70. Petukhova G., Komen S.V., Vergano S., Klein H., Sung P. 1999. Yeast Rad54 Promotes Rad51-dependent Homologous DNA Pairing via ATP Hydrolysis-driven Change in DNA Double Helix conformation. J. Biol. Chem. 274:29453-29462.

71. Petukhova G., Sung P., Klein H. 2000. Promotion of Rad51-dependent D-loop formation by yeast recombination factor Rdh54/Tidl. Genes Dev. 14:2206-2215.

72. Pnnz S., Amon A., Klein F. 1997. Isolation of COM1, a new gene required to complete meiotic double-strand break-induced recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 146:781-795.

73. Scully C. 1997. Drug-induced oral mucosal hyperpigmentation. Prim Dent Care. 4:35-36.

74. Sharan S.K., Morimatsu M., Albrecht U., Lim D.S., Regel E., Dinh C., Sands A., Eichele G., Hasty P., Bradley A. 1997. Embryonic lethality and radiation hypersensitivity mediated by Rad51 in mice lacking Brca2. 386:804-10.

75. Sharpies G.J., Leach D.R. 1995. Structural and functional similarities between the SbcCD proteins of Escherichia coli and the RAD50 and MRE11 (RAD32) recombination and repair proteins of yeast. Mol. Microbiol. 17:1215-1217.

76. Shinohara A., Ogawa T. 1998. Stimulation by Rad52 of yeast Rad51-mediated recombination. Nature. 391:404-407.

77. Schuchert P., Kohli J. 1988. The ade6-M26 mutation of Schizosaccharomyces pombe increases the frequency of crossing over. Genetics. 119:507-515.

78. Shivji M. К. K., Venkitaraman A. R. 2004. DNA recombination, chromosomal stability and carcinogenesis: insights into the role of BRCA2. DNA Repair. 3:835-843.

79. Solinger J. A., Heyer W. D. 2001. Rad54 protein stimulates the postsynaptic phase of Rad51 protein-mediated DNA strand exchange. Proc. Natl. Acad. Scie. USA. 98:8447-8453.

80. Solinger J. A., Kiianitsa K., Heyer W. D. 2002. Rad54, a Swi2/Snf2-like recombinational repair protein, disassembles Rad51 :dsDNA filaments. Mol. Cell. 10:1175-1188.

81. Sugiyama Т., Zaitseva E.M., Kowalczykowski S.C. 1997. A single-stranded DNA-binding protein is needed for efficient presynaptic complex formation by the Saccharomyces cerevisiae Rad51 protein. J.Biol.Chem. 272:7940-7945.

82. Sung P. 1994. Catalysis of ATP-dependent homologous DNA pairing and strand exchange by yeast RAD51 protein. Science. 265:1241-1243.

83. Sung P. 1997. Yeast Rad55 and Rad57 proteins form a heterodimer that functions with replication protein A to promote DNA strand exchange by Rad51 recombinase. Genes Dev. 11:1111-1121.

84. Sung P., Robberson D.L 1995. DNA strand exchange mediated by a RAD51-ssDNA nucleoprotein filament with polarity opposite to that of Rec. Cell 82:453-461

85. Suto K., Nagata A., Murakami H., Okayama H. 1999. A Double-Strand Break Repair Component Is Essential for S Phase Completion in Fission Yeast Cell Cycling. Mol. Biol. Cell. 10:3331-3343.

86. Symington L.S. 1998. Homologous recombination is required for the viability of rad27 mutants. Nucleic Acids Res. 26:5589-5595.

87. Symington L. S. 2002. Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66:630-670.

88. TakataM., Sasaki M. S., Tachiiri S., Fukushima Т., Sonoda E., Schild D., Thompson L. H., Takeda S. 2001. Chromosome instability and defective recombinational repair in knockout mutants of the five Rad51 paralogs. Mol. Cell. Biol. 21:2858-2866.

89. Takata M., Tachiiri S., Fujimori A., Thompson L. H., Miki Y., Hiraoka M., Takeda S., Yamazoe M. 2002. Conserved domains in the chicken homologue of BRCA2. Oncogene 21:1130-1134.

90. Tarsounas M., Davies D., West S. C. 2003. BRCA2-dependent and independent formation of RAD51 nuclear foci. Oncogene 22:1115-1123.

91. Tavassoli M., Shayeghi M., Nasim A., Watts F.Z. 1995. Cloning and characterisation of the Schizosaccharomyces pombe rad32 gene: A gene required for repair of double strand breaks and recombination. Nucleic Acids Res. 23:383-388.

92. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. 1997. The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools, Nucleic Acids Res. 24:4876-4882.

93. Tsutsui Y., Khasanov F.K., Shinagawa H., Iwasaki H., Bashkirov V.I. 2001. Multiple interactions among the components of the recombinational DNA repair system in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 159:91 -105.

94. Ueno M., Nakazaki Т., Akamatsu Y., Watanabe K., Tomita K., Lindsay H.D., Shinagawa H., Iwasaki H. 2003. Molecular characterization of the Schizosaccharomyces pombe nbsl+ gene involved in DNA repair and telomere maintenance. Mol Cell. Biol. 23:6553-6563.

95. Usui Т., Ohta Т., Oshiumi H., Tomizawa J., Ogawa H., Ogawa T. 1998.Complex formation and functional versatility of Mrel 1 of budding yeast in recombination. Cell. 95:705-716.

96. Van Komen S., Petukhova G., Sigurdsson S., Stratton S., Sung P. 2000. Superhelicity-driven homologous DNA pairing by yeast recombination factors Rad51 and Rad54. Mol. Cell. 6:563572.

97. Verkade H. M., Bugg S. J., Lindsay H. D., Carr A. M., O'Connell M. J. 1999. Radl8 is required for DNA repair and checkpoint responses in fission yeast. Mol. Biol. Cell. 10:2905-18.

98. Warren M., Smith A., Partridge N., Masabanda J., Griffin D., Ashworth A. 2002. Structural analysis of the chicken BRCA2 gene facilitates identification of functional domains and disease causing mutations. Hum. Mol. Genet. 11:841-851.

99. Wilson S., Tavassoli M., Watts F.Z. 1998. Schizosaccharomyces pombe rad32 protein: a phosphoprotein with an essential phosphoesterase motif required for repair of DNA double strand breaks. Nucl. Acids Res. 26:5261-5269.

100. Wilson S., Warr N., Taylor D.L., Watts F.Z. 1999. The role of Schizosaccharomyces pombe Rad32, the Mrell homologue, and other DNA damage response proteins in non-homologous end joining and telomere length maintenance. Nucl. Acids Res. 27:2655- 2661.

101. Wold M.S. 1997. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu. Rev. Biochem. 66:61-92.

102. Yang H. J., Jeffrey P. D., Miller J., Kinnucan E., Sun Y. Т., Thoma N. H„ Zheng N. Chen P. L„ Lee W. H., Pavletich N. P. 2002. BRCA2 function in DNA binding and recombination from a BRCA2-DSS1 -ssDNA structure. Science. 297:1837-1848.

103. Yasui A., McCready S.J. 1998. Alternative repair pathways for UV-induced DNA damage. Bioessays. 20:291-297.

104. Xiao W., Chow B.L., Rathgeber L. 1996. The repair of DNA methylation damage in Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 30:461-468.

Информация о работе

Салахова, Альбина Фаатовна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.26

Диссертация

Характеристика новых генов Schizosaccharomyces pombe dds20+ и rlp1+, участвующих в клеточном ответе на повреждения ДНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы