Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функция повторов аминокислотной последовательности белка Sfr1 в рекомбинационной репарации Schizosaccharomyces pombe

ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Функция повторов аминокислотной последовательности белка Sfr1 в рекомбинационной репарации Schizosaccharomyces pombe"

На

Хасанова Ольга Сергеевна

Функция повторов аминокислотной последовательности белка 81г1 в рекомбинационной репарации БсИ 'цоъасскаготусеяротЬе

Специальность 03.01.07- «молекулярная генетика»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2010

-3 лек ?т

004616357

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

Северинов Константин Викторович Хасанов Фуат Каримович

Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Рысков Алексей Петрович Богданов Юрий Федорович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится » декабря 2010

года, в «

.» часов на заседании

диссертационного совета Д 002.037.01 в Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова д.32.

Автореферат разослан: « » ноября 2010 года.

Учёный секретарь диссертационного совета канд. фарм. наук

Грабовская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Двухцепочечные разрывы ДНК представляют собой серьезную опасность для клеточной жизнеспособности и стабильности генома. Двухцепочечные разрывы ДНК возникают при геномных перестройках, индуцированных нуклеазами, включая переключение типа спаривания у дрожжей, повреждение репликационных вилок, вызванных продуктами метаболизма клеточного дыхания, рекомбинации и в мейозе.

Двухцепочечные разрывы ДНК также образуются и при действии ДНК повреждающих факторов: ионизирующая радиация, некоторые химические вещества и УФ-излучение через образование алкилирующих аддуктов, пиримидиновых димеров и сшивок ДНК. Не репарированные или неправильно репарированные двухцепочечные разрывы ДНК могут приводить к потере гетсрозиготности, мутациям, геномным перестройкам и потере хромосомы.

два механизма: негомологичное соединение концов ДНК (NHEJ) и гомологичная рекомбинация. NHEJ является предпочтительным способом в фазе G1 клеточного цикла, тогда как гомологичная рекомбинация - в фазах S и G2. NHEJ привносит больший вклад в репарацию двухцепочечных разрывов ДНК в клетках высших эукариот, геном которых включает протяженные межгенные области и повторяющиеся последовательности, тогда как гомологичная рекомбинация предпочтительна для дрожжей и других эукариот с небольшими геномами и короткими межгенными районами. Рекомбинационная репарация представляет собой безошибочный способ исправления ошибок ДНК, поскольку использует информацию другого гомолога или сестринской хроматиды для репарации повреждения ДНК. Рекомбинационная репарация зависит от функции рекомбинационного белка Rad51 и включает образование Rad51 -нуклеопротеинового филамента на одноцепочечной ДНК и интермедиатную стадию репарации - инвазию одноцепочечной в гомологичную дуплексную ДНК. В ответ на повреждение ДНК происходит остановка клеточного цикла, индуцируется транскрипция репарационных генов и включаются различные пути репарации ДНК. Эти процессы контролируются механизмами контроля клеточного цикла, чекпойнтами повреждения ДНК, предотвращая вхождение клетки в S-фазу или митоз, до тех пор, пока повреждение ДНК не будет репарировано. Механизмы контроля клеточного цикла являются одной из составляющих клеточного ответа на повреждения ДНК, обеспечивая выживание клетки и стабильность ее генома.

Знание и изучение молекулярных механизмов эукариотической рекомбинационной репарации является важным с точки зрения молекулярной патол!

Для репарации двухцепочечных разрывов ДНК, главным образом, используются

болезней человека и их медицинской терапии. Поскольку ионизирующая радиация используется в качестве инструмента в медицинских диагностических целях и терапии рака, необходимо более полное понимание клеточных ответов на возможные повреждения ДНК. Более того, радиационная устойчивость раковых клеток создает ряд проблем для противораковой терапии, вызывая повышенную репарационную способность раковых клеток. Повышенные уровни рекомбинации, наблюдаемые у людей с синдромами Блюма или Вернера, первично вызывают геномную нестабильность в клетках больных людей и повышают их предрасположенность к опухолевым заболеваниям. Наличие прямой связи между предрасположенностью к раку груди, яичника и репарационными процессами было продемонстрировано обнаружением взаимодействия онкогенных белков ВЯСА1 и В11СА2 с ключевым белком рекомбинационной репарации Яас151.

Цели и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы является выяснение молекулярных механизмов рекомбинационной репарации ДНК в эукариотах на примере изучения молекулярной структуры белка БГг1, медиатора образования Яаё51-нуклеопротеинового филамента. Ген ротЬе ф1 был идентифицирован в нашей лаборатории как высококопийный супрессор репарационных дефектов клеток ротЬе г1гр55&, одного из медиаторов образования Иаё51 нуклеопротеинового филамента.

Представленная работа направлена на решение фундаментальной задачи -изучение механизмов рекомбинационной репарации в клетках эукариотических организмов. Проведенные исследования могут послужить основой для изучения этих механизмов в клетках человека с выходом на генетические заболевания. Они также важны и для понимания процессов гомологичной рекомбинации при генных манипуляциях с клетками высших организмов (трансгенезис и генотерапия).

В настоящем исследовании были поставлены следующие задачи:

1. Идентификация новых мотивов белка и их функций методами компьютерного анализа профиля белка.

2. Проведение аминокислотных замещений в 8Гг1 для определения участков важных для его функции в репарации ДНК и для взаимодействия с белком Яас151.

3. Изучение взаимодействий белка и его мутантных форм с Яаё51 методами двугибридного анализа в дрожжевой системе 5. сегеуЫае, иммунопреципитации белков и иммунофлуоресцентного анализа.

4. Изучение потенциальных мейотических дефектов в мутантных аллелях S. pombe sfrl с использованием количественной оценки частоты мейотической внутригенной и межгенной рекомбинации.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проделанной работы идентифицирован новый мотив (PSA, gombe Sfrl associated) в белке Sfrl, используемый в качестве модуля для ассоциации с Rad51, ключевым белком гомологичной рекомбинации. Нами исследован эффект точковых мутаций в пределах PSA мотивов на взаимодействие с Rad51, функцию Sfrl в мейотической рекомбинации и репарации ДНК в клетках S. pombe. Биоинформатический анализ позволил идентифицировать белки с потенциальными PSA повторами и в других эукариотических организмах, что предполагает консервативность этих мотивов у низших эукариот, в частности, у грибов. Проведенные исследования могут послужить основой для изучения этих механизмов в клетках человека с выходом на заболевания, связанные с нарушением стабильности генома и разработкой генно-терапевтических подходов.

Публикации и апробация работы. По результатам диссертационной работы опубликовано 2 статьи. Материалы диссертации были представлены на: 4th Int. Moscow Conference on Computational Molecular Biology MCCMB'09, Moscow, Russia, July 20-23, 2009. и International Symposium «Control of Gene Expression and Cancer», Moscow, Russia, June 21-25,2010.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Работа изложена на / страницах машинописного текста и содержит 5 таблиц и 21 рисунок. Библиография включает 157 источников.

Содержание работы

Белок Sfrl взаимодействует с RadSl

Репарация двухцепочечных разрывов ДНК является эволюционно консервативным Rad51-опосредованным механизмом. В дрожжах паралоги Rad51, Saccharomyces cerevisiae Rad55-Rad57 и Schizosaccharomyces pombe Rhp55-Rhp57, являются медиаторами образования нуклеопротеинового Rad51 филамента. Было показано, что в S.

ротЬе существует параллельный 11ас151 -зависимый путь сборки нуклеопротеинового филамента. Был идентифицирован новый ген з/г/, контролирующий этот путь. Так как Бй"! действует в 11а(151 -зависимом пути репарации двухцепочечных разрывов ДНК, мы проверили, используя количественный двугибридный анализ в дрожжах, взаимодействует ли 5Гг1 с Каё51. Результаты этого анализа, представленные на Рис. 1А, показывают, что ЗМ строго взаимодействует с белком Яаё51. Взаимодействие с мейотическим гомологом белка 5. ротЬе 11аё51, Отс1, также было проверено и не было обнаружено.

А

DBD AD а0-Гал ьСтепень

активность увелич

Sfrl 4.8 1.0

Rad51 2143.7 448.5

Б

sfr1*-Myc 13: + +

pGST-rad5V: + +

анти-GST анти-Мус

Рис 1. Белок Sfrl взаимодействует с Rad51 in vivo. Результаты двугибридного анализа (А) и иммунопреципитации (Б).

Для подтверждения полученных нами данных двугибридного анализа о взаимодействии Sfrl-Rad51, был проведен эксперимент по иммунопреципитации белков. Плазмида, сверхэкспрессирующая GST-Rad51 под контролем nmt промотора, была введена в штаммы sfrl-Myclí и sfrl, белок Sfrl-Mycl3 был иммунопреципитирован, используя антитела против Мус. Как показано на Рис.1 Б (дорожка 2), GST-Rad51 иммунопреципитируется вместе с Sfrl-Mycl3. Контрольные иммунопреципитации были сделаны для проверки специфичности использованных антител (дорожки 1 и 3). Вместе взятые данные показывают сильное взаимодействие между белками Sfrl и Rad51.

Образование фокусов Rad51, индуцированных ионизирующей радиацией, уменьшено в мутанте sfrlA

Исследования, выполненные на дрожжах и позвоночных, показывают, что Rad51-паралоги, помогают белку Rad51 в образовании нуклеопротеинового филамента на поврежденной ДНК, что можно идентифицировать цитологически in vivo в виде репарационных фокусов. В клетках S. pombe

А. дикий тип Б. sfrlA

Rad51 фокусы - зеленый цвет Sfr1 фокусы - красный цвет

В. Sfr1 -myc

Г. Rad51

Д. колокализация

Рис. 2. Колокализация белков Rad51 и Sfrl на хроматиновых спредах.

Rad51-фокусы, индуцированные ионизирующей радиацией, обнаруживаются в клетках дикого типа. Однако их число было уменьшенным в мутанте г1гр55А. Поскольку Эй" 1 оперирует в Rad51 -зависимом пути репарации, параллельном РЪр55^Ьр57, мы тестировали образование Rad51-фокусов после облучения клеток я/г/Д и 5/г1-Мус13 гамма-лучами на предмет их количественной оценки при экспрессии и взаимодействия двух белков при иммуноокрашивании. Хроматиновые спреды были получены из гаплоидных штаммов, экспрессирующих слитые белки GST-Rad51 и 8Гг1-Мус13. Плазмида, экспрессирующая

GST-Rad51, была введена в штаммы дикого типа, sfrlД и sfrl-Mycli. Чтобы проверить, колокализуются ли белки GST-Rad51 и Sfrl-Мус в S. pombe, использовали антитела против эпитопов GST и Мус. Мы наблюдали отдельные ядерные фокусы при иммуноокрашивании для GST-Rad51 в клетках дикого типа (Рис.2А), sfrl А (Рис. 2Б) и sfrl-Мус 13 (Рис.2Г), а также фокусы для Sfrl-Myc в штамме sfrl-mycl3 (Рис.2В). Окрашивание ДНК проводили с помощью DAPI. Таким образом, белки GST-Rad51 и Sfrl-Myc экспрессируются в митотическом клеточном цикле и локализуются в ядерных фокусах. Распределение сигналов для GST-Rad51 и Sfrl-Myc указывало на колокализацию двух белков, что определялось перекрыванием фокусов (Рис.2Д).

Обработка клеток дикого типа и мутантных клеток rhp55A и sfrl Л ионизирующей радиацией приводило к сборке от 1 до 8 Rad51-фокусов на клетку в пределах 1 часа после облучения. Подсчет числа фокусов на клетку показал значительное увеличение числа клеток только с одним или двумя Rad51 -фокусами для обоих мутантов, rhp55A (72%) и sfrl А (64%), при сравнительном анализе с клетками дикого типа (32%) (Рис.3). Это позволяет предположить, что подобно Rhp55, белок Sfrl функционирует на ранних стадиях рекомбинационной репарации, участвуя в доставке Rad51 к сайтам повреждения ДНК и сборке RadSl-филамента. Таким образом, в дополнение к способности взаимодействовать с белком Rad51, функция белка Sfrl, как и Rhp55, медиаторов двух параллельных механизмов сборки Rad51-HyiGie0np0TeHH0B0r0 филамента, необходима для эффективного образования Rad51-фокусов в клетках облученных ионизирующей радиацией.

Идентификация нового мотива в белке Sfrl и его анализ

Сравнение аминокислотной последовательности белка Sfrl через программу BLAST не выявило значительных гомологов в известных базах данных, за исключением С-терминальной части белка S. pombe Swi2 с ролью в переключении типа спаривания. Этот анализ показал 24% идентичность аминокислотных последовательностей между Sfrl и С-терминальной частью Swi2. Анализ аминокислотных последовательностей Sfrl также показал, что терминальная часть белка включала coiled-coil домен (остатки аминокислот 178 - 236), предсказанный программой COILS. Другие известные мотивы не могли быть идентифицированы в Sfrl при использовании баз данных по мотивам и доменам.

Клетки

12345678 Число Rad51 фокусов на клетку

Рис.3. Распределение числа Rad51 - репарационных фокусов в штамме дикого типа, а также в штаммах с делениями в генах S. pombe sfrl и rhp55.

Нами были обнаружены два новых тандемных повтора приблизительно в 40 аминокислот в длину в районе предшествующему coiled-coil домену (Рис.4). Новый повтор назван PSA (pombe Sfrl associated). В белке Swi2 обнаружен такой же мотив, но состоящий лишь из одного повтора и соответствующий по месту локализации повтору PSA2 у белка Sfrl. Сравнение последовательностей повторов PSA с использованием программы CIustalW2 и программ, анализирующих вторичные структуры белков (Network Protein Sequence Analysis) показало, что повторы PSA состоят из центрального a-спирального кор участка, фланкированного районами с высокой аминокислотной консервативностью (Рис.4). Использование поисковых программ привело к обнаружению ряда белков с PSA повторами в других эукариотических организмах: Cryptococcus neoformans CNBF2390 (два повтора), Schizosaccharomyces japónicas SLAG-01708, S. pombe Swi2 (один повтор), Saccharomyces cerevisiae Sae2/Coml (один повтор) (Рис.4), Neurospora crassa EAA36464.1 (один повтор), Magnaporthe grísea MG03610.4 (один повтор) и Aspergillus nidulans AN0810.2 (один повтор). Клеточная функция большинства этих белков остается не известной. Но, по крайней мере, один из них, S. cerevisiae Sae2, непосредственно вовлечен в репарацию двухцепочечных разрывов ДНК, тогда как второй белок, S. pombe Swi2, вовлечен в процесс родственный репарации двухцепочечных разрывов ДНК, в частности, в процесс переключения типа спаривания. Различия в числе PSA повторов среди идентифицированных белков (с одним или двумя PSA повторами) могут быть связаны со специализированными типами рекомбинации / репарации в которых эти белки могли бы принимать участие.

F107E in PSA1 and F163E in PSA2

Sfrl PSA1 64 Sfrl PSA2 142 Swi2 PSA 545

Консенсус вторичной структуры

K108E in PSA1 and K164E in PSA2

8tB9s kkrareakm iPlCT^^^^Hlro tasHovadth 123

jS^LRTTPNSI K0- - Q К TL^^BE« С L ЫЦК S D P E I 179 К D 1д1аВЗк11 V И KM S vHk аНгЯдЭнрДИк ISRTRLTVSS 5 84

ccccccccc?hhhhhhhhhhhccccccccccccccccccc sfri psai ccccccccccccc?hhh-hhhhhccccccccccccccccc sfri psa2 cccccccccccc hhhhhhhhcc с с cc с с с ? ? с с е е е е есс Swí2 psa

alpha helix, с - random coil,

extended strand

se pHT STORHTH-J!S IEBOKRLHK^RI висЩркЩрН 17 9 кн тио уИмНр'н нИЯк i s eBsHIln G -™N 1,НЯьН 14 6

cccccccccccc-c?hhhhhhhhccccccccccccccc sfri psa2

cceeeeeeeeccccccchhhhhhccccch-ccchhhhh sae2 psa

h - alpha helix, с - random coil, e - extended strand

Рис.4. Сравнение PSA повторов белков S. pombe Sfrl и Swi2, а также S. cerevisiae Sae2. Консенсус вторичной структуры PSA повторов предсказан алгоритмами программы Network Protein Sequence Analysis server (Pole Biolnformatique Lyonnais, Франция). Черным цветом показаны идентичные аминокислоты, серым цветом -сходные аминокислоты

Sfrl PSA2 142 Sae2 PSA 110

консенсус вторичной структуры

Важным с точки зрения функции PSA повторов остается факт консерватизма расстояния между повторяющимися мотивами PSA в S. pombe Sfrl, С. neoformans CNBF2390 и S. japónicas SLAG-01708, включающих одновременно оба PSA повтора, PSA1 и PSA2. Константа длины спейсерной области между PSA повторами в этих белках может предполагать их сходную роль в нуклеации одноцепочечной ДНК при образовании Rad51 нукпеопротеинового филамента.

Повышенная экспрессия PSA повторов приводит к RadSl-зависимому доминант-негативному эффекту на выживаемость клеток

Идентификация PSA повторов в Sfrl предполагает, что они могут нести в себе какую-либо функцию. Мы решили проверить, вызовет ли повышенное количество PSA повторов доминантно-негативный эффект на клеточную выживаемость в условиях генотоксического стресса. Укороченный белок Sfrl (остатки аминокислот 71-176, включающие повторы PSA1 и PSA2) был экспрессирован на плазмиде при использовании индуцибельного nmt промотора в штамме дикого типа и проведен анализ клеток на чашках с метил метансульфонатом (ММС). Как показано на Рис.5, повышенная экспрессия PSA повторов при индукции экспрессии в отсутствии тиамина (- tili) вызывала умеренный

8

негативный эффект на клеточную выживаемость (ряды 1 и 3), что было более заметно на чашках с ММС в сравнении с клетками с репрессивной экспрессией (дорожки 2 и 4), или клетками с пустым вектором (ряды 5, 6, 7, и 8). Полученные данные предполагают, что PSA повторы могут являться белок - белковыми взаимодействующими модулями, и когда в клетках находятся в избытке, они могут титровать взаимодействующего партнера белка Sfrl и / или приводить к стехиометрическому дисбалансу мультипротеинового комплекса (комплексов). Поскольку Sfrl, как было обнаружено, взаимодействует с Rad51, мы решили проверить, является ли негативный эффект повышенной экспрессии PSA зависимым от функции белка Rad51. Тот же эксперимент был выполнен на клетках с отсутствием экспрессии S. pombe белка Rad51 (штамм rad51A), и обнаружено, что негативный эффект повышенной экспрессии PSA повторов был элиминирован в отсутствие функции Rad51 (сравнение дорожек 1 и 3 с 2 и 4).

thi: дикий тип rad51A

PSA1 +

PSA2

пустой вектор

"l

2 I+

1 l;

2 I+

• •••* % • .

•••в®£

без ММС

• • • *

• • S*

• •

• • •* • •

0.0075% ММС

без ММС

0.0075% ММС

Рис.5. PSA повторы являются функциональными доменами белка Sfrl. Эффект повышенной экспрессии повторов PSA1 и PSA2 на чувствительность клеток штаммов дикого типа и rad51A к метил метансульфонату (ММС).

Полученные данные по зависимости негативного эффекта повышенной экспрессии PSA повторов на клеточную выживаемость от функции Rad51 обеспечивают косвенное свидетельство в пользу роли Sfrl в репарации ДНК через взаимодействие PSA повторов с белком Rad51.

Мутации в PSA мотивах белка Sfrl приводят к ослабленной репарации ДНК

Чтобы выяснить более точную функцию PSA повтора, были получены мутации PSA1 и PSA2 введением аминокислотных замещений, которые изменяли бы заряд аминокислот на противоположный. Если предположить, что PSA повторы являются белок -белок взаимодействующими модулями, то переключение зарядов аминокислот на противоположный в PSA могло бы приводить к потере функции повторов. Нами получены

аминокислотные замещения лизина на глутамат в коровых участках PSA1 в положении 108 (PSA1) и PSA2 в положении 164 (К164Е) белка Sfrl и перенесены в геном (Рис.4). Как показано на Рис.6, одиночная мутация в любом из повторов не приводила к чувствительности клеток к высоким дозам камптотецина (СРТ), ингибитора топоизомеразы I с функцией в репликации ДНК и только немного повышала чувствительность к ММС, в то время как мутант sfrl Л был очень чувствительным к этим дозам химических препаратов. При комбинации двух мутаций в обоих повторах (sfrlK108E, К164Е) клетки становились значительно более чувствительными как к ММС, так и к камптотецину, хотя и не достигали уровней чувствительности мутанта sfrl А к этим веществам. Ряд белков рекомбинационной репарации в клетках низших и высших экариот, как известно, взаимодействуют с Rad51. Среди них Rad52, Rad54, BRCA2, а также паралоги белка Rad51. И лишь BRCA2 из этого ряда белков использует тандемно-повторяющиеся мотивы, BRC повторы, для ассоциации с Rad51.

Рис.6. Дроп-тест штаммов с мутациями в PSA повторах на чувствительность к метил метансульфонату и камптотецину.

Данные кристаллографии для белка RAD51 при связывании с BRC4 повтором показывают, что аминокислоты Phe и Ala консенсусного мотива BRC (Рис.7) располагаются в «кармашках» на поверхности Rad51, представляющие собой межсубъединичный интерфейс при полимеризации молекул Rad51. Консенсусная последовательность наиболее консервативной части PSA повтора, XFKSPX, также включает фенилаланин (Phe), но вместо аланина (Ala) располагается пролин (Pro) в том же положении. В этом контексте было интересным получить аминокислотные замещения консервативного фенилаланина в PSA повторах Sfrl на предмет его важности для взаимодействия белков Sfrl и Rad51. С помощью

сайт - направленного мутагенеза аминокислотный остаток фенилаланин в коровой части повторов PSA1 в положении 107 и PSA2 в положении 163 белка Sfrl был замещен на аминокислотный остаток глутамата, с образованием два мутантных аллелей, sfrlF107E и sfrlF163E (Рис.4). Мы получили штаммы с хромосомными мутациями в PSA замещением аллелей дикого типа аллелями sfrlF107E и sfrlF163E. С помощью спот-теста был изучен эффект этих мутаций на репарацию ДНК в условиях генотоксического стресса в клетках 5. pombe (Рис.6). Одиночные мутации sfrlF107E или sfrIF163E в любом из повторов не повышали чувствительность клеток к ММС. Однако когда две мутации в обоих повторах были комбинированы в одном штамме (sfrlF107E, F163E) клетки становились чувствительными к ММС, что было сравнимо с чувствительностью делеционного мутанта sfrl А

Х- любая h - I/L/M

Рис.7. Сравнение консенсусов коровых участков PSA в Sfrl и BRC в BRCA2 человека (где X - любая аминокислота)

Эти данные указывают, что PSA повторы важны для функции Sfrl в репарации ДНК, и функция каждого из повторов дублирует друг друга. Таким образом, наши результаты показывают, что PSA мотивы белка Sfrl критичны для функции Sfrl в репарации повреждений ДНК.

Мейотическая рекомбинация уменьшена в sfrl PSA-мутанте

Мутанты S. pombe rhp55& и sfrl А показывают дефекты различной степени в мейотической рекомбинации, где вариации в уменьшении частот межгенной и внутригенной рекомбинации располагаются в пределах от 1.5 - 3-кратного до 15 - 20-кратного, соответственно, и зависят от используемых в эксперименте аллелей и интервалов. Белки Rhp55 и Sfrl, по-видимому, имеют различные функции в мейотической рекомбинации, так как повышенная экспрессия sfrl супрессировала дефекты межгенной и внутригенной рекомбинации мутанта rhp55A. Чтобы определить, в какой степени мутации в PSA повторах Sfrl могут оказывать воздействие на мейотическую рекомбинацию, мы проанализировали межгенную и внутригенную рекомбинацию в условиях мейоза в штамме sfrl-F107E F163E. Снижения в частоте внутригенной рекомбинации составляли 1.4, 2.5 и 3.2-кратное для аллелей adel-150 х ade7-152, ade6-469 х ade6-M26 и ade6-469 х ade6-M26, соответственно (Табл.1). Межгенную рекомбинацию анализировали для двух интервалов: hisl-lys7 (хромосома I) и adel-lys4 (хромосома II). Нами обнаружено снижение рекомбинации в мутанте приблизительно в 1.9 и 2.4 раза, соответственно, в сравнении со скрещиваниями штаммов дикого типа (Табл.2). Снижения внутригенной и межгенной рекомбинации в мутантном штамме sfrl-F107E F163E были значительными, как указано с помощью не перекрывающихся стандартных отклонений. Полученные данные позволяют нам сделать заключение, что PSA-повторы Sfrl необходимы для уровней мейотической рекомбинации дикого типа в делящихся дрожжах. Однако снижение мейотической рекомбинации введением мутации sfrl-F107E F163E в PSA не было сравнимым с негативным эффектом делении rem sfrl.

Медиаторный комплекс Sfrl-Swi5 важен для образования нуклеопротеиновых филаментов и реакции обмена цепи в мейозе, стимулируемых обеими рекомбиназами, Rad51 и Dmcl на субстратах ДНК. Sfrl-Swi5 физически взаимодействует как с Rad51, так и с Dmcl, через субъединицу Sfrl. Это дает возможность предположить, что PSA повторы специфичны только для одной из рекомбиназ, а именно, Rad51, и для ассоциации Sfrl с Dmcl используются другие аминокислотные последовательности, отличные от PSA, что объясняет различие в частоте мейотической рекомбинации между штаммами с делецией sfrl и sfrl с мутациями в PSA повторах.

Хромосома и аллели3 Суммарное число Ade колоний Прототрофы/10б жизнеспособных спорь

Дикий тип sfrl-F107E 163Е Коэффициент снижения0

II L ade7-l50 х ade7-l52 104 266.5 ±14.3 185.4 ± 11.1 1.4

IHR ade6-469x ade6-M375 104 220.8 ± 15.5 70.2 ±5.1 3.2

IHR ade6-469x ade6-M26 104 2976.6+143.5 1192.9± 67.0 2.5

' Скрещиваемые штаммы: IBGY18 х IBGY555 и IBGY665 х IBGY667 (ade-152 х ade7-150 аллели); IBGY549 х IBGY551 и IBGY674 х IBGY672 (ade6-469 х ade6-M26 аллели); IBGY549 х IBGY553 и IBGY674 х IBGY673 (ade6-469 х ade6-M375 аллели).

(L) Левое и (R) правое плечи хромосом II и III, соответственно ь Среднее и стандартное отклонение от 4-7 независимых скрещиваний с Снижение показано относительно скрещивания штаммов дикого типа

Таблица 2. Мейотическая межгенная рекомбинация в мутантesfrI-F107E I63E.

ромосома и интервал3 Прототрофы/106 жизнеспособных спорь Коэффициент

Дикий тип sfrl-F107E 163Е снижения

1 hisl-lys7 18.6 ±4.5 9.8 ± 0.6 1.9

R adel-lys4 28.3 ±1.5 11.9 ±0.5 2.4

" Скрещиваемые штаммы: 1ВОУ55б х 1ВОУ558 и 1ВОУ668 х 1ВОУ6б9 (ИЬ1-1уз7 интервал); 1ВСУ560 х 1ВСУ564 и 1ВСУ676 х 1ВСУ675 №е1-1у*4 интервал); К - правое плечо хромосомы I и II

ь Среднее и стандартное отклонение от трех независимых скрещиваний. Для каждого интервала было проанализировано 1 ООО— 1100 случайных спор

с Снижение показано относительно скрещивания штаммов дикого типа

Sfrl-мутантные аллели дефектны для взаимодействия с Rad51

В клетках 5. pombe гетеродимер Sfrl/Swi5 взаимодействует с белком обмена цепи Rad51 через субъединицу комплекса Sfrl. Используя количественный двугибридный анализ, мы проверили, имеют ли мутации в PSA повторах влияние на ассоциацию белков Sfrl и Rad51. Для двугибридного анализа были сконструированы DBD и AD дрожжевые вектора с экспрессией N-терминально слитых полноразмерных интактных белков Rad51 и Sfrl, а также Sfrl-мутантных форм и проведен анализ попарных взаимодействий. Результаты этого анализа показали, что Sfrl сильно взаимодействует с белком Rad51, как и сообщалось ранее. Одиночные мутации F163E или К164Е в PSA2 повторе Sfrl показали 1.4 и 3.3-кратное снижение, соответственно, во взаимодействии с Rad51. Одиночные мутации F107E и К108Е в PSA1 повторе Sfrl показали 81 и 12-кратное снижение, соответственно, во взаимодействии с Rad51. Двойная мутация К108Е, К164Е в двух повторах PSA белка Sfrl снижала взаимодействие с Rad51 в 90 раз. Строгий эффект наблюдали для двойной мутации F107E, F163E в обоих повторах Sfrl с 585-кратным снижении в эффективности ассоциации с Rad51, что было сравнимо с данными контрольных экспериментов, в которых отсутствовал один из взаимодействующих партнеров. Ослабление функции Sfrl мутациями в PSA повторах не было обусловлено дестабилизацией структуры мутантных форм белка, поскольку схожие белковые уровни обнаруживались в целых клеточных экстрактах, препарированных из штаммов, содержащих высококопийную плазмиду с Sfrl дикого типа и его мутантных форм (Рис.8).

кК > ^ оЯЛ 4Л

е^ ///

jéíhéÍ !Ьмйм jLtfttgk ££_LöXA я^яр ^_Т ifi х

1 2 3

Рис.8. Стабильность мутантных белков. Мутантные PSA повторы Sfrl были экспрессированы как LexA слитые белки и определены визуально в белковых экстрактах с помощью иммуноблотинга с использованием антител к LexA.

IP: a-GST

+ + - - + + - + - +

— -• IB: a-GST

IB: a-Sfrl

12 3

Рис.9. Мутантная форма Sfrl -F107E F163E не иммунопреципитируется с Rad51.

С помощью иммунопреципитации белков мы исследовали ассоциацию Rad51 и Sfrl мутантной формы (Sfrl-F107E F163E), которая показала наиболее сильный негативный эффект на взаимодействие двух белков в двугибридном анализе (Рис.9). Плазмиду с повышенной экспрессией слитого белка GST-Rad51 под контролем nmt промотора трансформировали в штаммы дикого типа (дорожка 1) и в мутантный штамм sfrI-F107E, F163E (дорожка 2). Для контрольного эксперимента пустую векторную плазмиду pGST ввели трансформацией в штамм дикого типа (дорожка 3). Белок GST-Rad51 иммунопреципитировали с использованием моноклональных афинно-очищенных антител против GST. Как видно из Рис.9, Sfrl иммунопреципитируется с гибридным белком GST-Rad51 (дорожка 1), а мутантная форма белка Sfrl F107E, F163E не способна иммунопреципитироваться с GST-Rad51 (дорожка 2). Контрольный эксперимент по иммунопреципитации использовали для определения специфичности используемых антител, и что белок GST-Rad51 не специфически не связывался с белком G-сефарозы (дорожка 3). Полученные данные показывают, что PSA повторы Sfrl очень важны для взаимодействия белков Sfrl и Rad51 и являются их взаимодействующими модулями.

Модель образования Rad51 - нуклеопротеинового филамента с участием медиаторного комплекса Sfrl-Swi5.

Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу (Рис.10), что комплекс белков Sfrl-Swi5 переносит Rad51 через его связывание с субъединицей Sfrl к сайтам

pGST-rad51 р GST sfrl

sfrl -FIOTE, Fl 63E

повреждения ДНК, покрытой белком RPA, что можно обнаружить цитологически in vivo как Rad51-репарационные фокусы (Рис.2). Гетеродимер Sfrl-Swi5 для взаимодействия со стабильной фракцией свободного пула мономерных или димерных молекул Rad51 использует повторяющиеся аминокислотные последовательности PSA1 и PSA2 в Sfrl.

одДНК покрытая белком Rpa

3'i

3'

V

Sfrl/Sw¡5

Rad51

направление Rad51 ^

замещение Rpa полимеризации ± 3-

V

Rpa

Rad51 предсинаптический филамент

шит

mmm

Рис.10. Модель образования Rad51 нуклеопротеинового филамента с участием медиаторного комплекса Sfrl-Swi5 в делящихся дрожжах.

Таким образом, две различные последовательности Sfrl способны к взаимодействию с Rad51. Образующийся комплекс белков Sfrl -Swi5-Rad51 связывается с ДНК предпочтительно в местах стыков между двухцепочечной и одноцепочечной ДНК в области 3' выступающих концов одноцепочечной ДНК в местах разрывов. Ранее сообщалось, что комплекс Swi5-Sfrl обладает аффиностью как к одноцепочечной ДНК, так и к двухцепочечной ДНК in vitro, но с предпочтением к одноцепочечной ДНК. Рекомбиназа Rad51, является фактором замещения RPA с одДНК, а медиатор Swi5-Sfrl не участвует в замещении, а стабилизирует Rad51 на одноцепочечной ДНК в присутствии АТФ. Возможно,

что связывание образующегося комплекса Sfrl-Swi5-Rad51 в местах стыков между двухцепочечной ДНК и одноцепочечной ДНК способно регулировать направление Rad51 полимеризации на одноцепочечной ДНК, определяя рост филамента в 5'-3' направлении. Таким образом, медиатор Swi5-Sfrl способствует образованию и стабилизации Rad51 филаментов на одноцепочечной ДНК в присутствии АТФ и регулирует направление полимеризации на одноцепочечной ДНК.

В результате нашего исследования показано взаимодействие медиаторного комплекса Sfrl/Swi5 с рекомбиназой Rad51 через субъединицу Sfrl. Взаимодействие белков происходит с помощью белковых повторов в Sfrl. Анализ выявил ряд белков с PSA повторами и в других организмах, что предполагает их универсальность в клетках низших эукариот.

Выводы

1. Функция белка Sfrl необходима для взаимодействия с ключевым белком гомологичной рекомбинации Rad51 в клетках эукариот и его доставку к сайтам повреждения ДНК.

2. Обнаружены повторы (PSA, дотЬе Sfrl associated) аминокислотной последовательности в белке Sfrl, ответственные за взаимодействие с рекомбиназой Rad51.

3. Повышенная экспрессия PSA повторов Sfrl приводит к Rad51-зависимому доминант -негативному эффекту на выживаемость клеток.

4. PSA повторы являются важной функциональной частью белка Sfrl. Замещение фенилаланина в коровых участках повторов приводит к строгому ослаблению репарации ДНК и рекомбинации в мейозе, что указывает на важность химической природы этого аминокислотного остатка.

5. Предложена модель полимеризации белка Rad51 на одноцепочечной ДНК с участием медиаторного комплекса Sfrl-Swi5 в клетках делящихся дрожжей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Хасанова О.С.. Башкиров В.И., Хасанов Ф.К. Картирование сайта, определяющего взаимодействие между рекомбинационными белками в клетках дрожжей. Доклады Академии наук, 2010, том 434,2, с. 269-271.

2. Khasanov FK, Salakhova AF, Khasanova OS. Grishchuk AL, Chepurnaja OV, Korolev VG, Kohli J, Bashkirov VI. Genetic analysis reveals different roles of Schizosaccharomyces pombe sfrl /dds20 in meiotic and mitotic DNA recombination and repair. Curr Genet. 2008 54(4): 197-211.

3. Khasanova O.S.. Khasanov F.K. The novel protein motif that responsible for association with Rad51 in fungi. International Symposium «Control of Gene Expression and Cancer», Moscow, Russia, June 21-25,2010

4. Khasanova O. Khasanov F. A novel type of repeats mediates interaction between Schizosaccharomyces pombe Rad51 and Sfrl proteins. 4th Int. Moscow Conference on Computational Molecular Biology MCCMB'09, Moscow, Russia, July 20-23,2009

ЛР № 063109 от 04.02.1999 г

Формат 60x90/16. Заказ 967. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хасанова, Ольга Сергеевна

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Преимущества делящихся дрожжей для изучения репараци двухцепочечныхповреждений ДНК.

2.2. Гены рекомбинационной репарации S. Pombe.

2.2.1. Белки S. pombe, ответственные за образование 3' - выступающих однонитевых участков в сайтах повреждений ДНК.

2.2.2. Белки S. pombe, ответственные за образование Rad51 -нуклеопротеинового филамента.

2.3. Механизм рекомбинационной репарации в эукариотах.

2.4. Sfrl и толерантность к УФ-повреждениям ДНК.

2.5. Связь механизмов контроля клеточного цикла в репарации повреждений ДНК.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Штаммы, использованные в работе.

3.2. Ростовые среды.

3.3. Генетические скрещивания.

3.4. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli.

3.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.6. Выделение ДНК из агароного геля с помощью набора Nucleospin (Macherey-nagel).

3.7. Получение компетентных клеток E.coli DH5a.

3.8. Трансформация клеток штамма E.coli DH5a.

3.9. Трансформация клеток S. pombe.

3.10. Тесты клеток дрожжей на генотоксический стресс. 3.11. Полимеразная цепная реакция.

3.12. Выделение белка Sfrl из клеток S.pombe.

3.13. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

3.14. Эксперимент с повышенной экспрессией белка 8&

3.15. Тест на эффективность мейотической внутригенной рекомбинации в клетках & ротЬе.

3.16. Тест на эффективность мейотической межгенной рекомбинации в клетках S. pombe.

3.17. Тесты на белок - белковые взаимодействия.

3.18. Манипуляции с ДНК.

3.19. Очистка His6 - меченого белка в денатурирующих условиях на Ni-NT^^ агарозе . ^

3.20. Приготовление хроматиновых спредов.^ ^^

3.21. Иммунофлуоресцентная микроскопия.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЯ.^ ^

4.1. Белок S. pombe Sfr 1 взаимодействует с рекомбиназой Rad51.^ ^^

4.2. Идентификация нового мотива в белке Sfrl и его анализ.

4.3. Повышенная экспрессия PSA повторов приводит к Rad51 -зависимому доминант - негативному эффекту на выживаемость клеток.,

4.4. Мутации в PSA мотивах белка Sfrl приводят к ослабленной репара^^^ ДНК в клетках S. pombe. • *.

4.5. Мейотическая рекомбинация уменьшена в sfrl PSA — мутантных аллелях.

4.6. Sfrl-мутантные аллели дефектны для взаимодействия с Rad51.v

4.7. Образование фокусов Rad51, индуцированных ионизирующей радиацией, уменьшено в мутанте sfrl Л.^ * ■ * --.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

••••-.

ВЫВОДЫ. •••■•.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Хасанова, Ольга Сергеевна

выводы

1. Функция белка Sfrl необходима для взаимодействия с ключевым белком гомологичной рекомбинации Rad51 в клетках эукариот и его доставку к сайтам повреждения ДНК.

2. Обнаружены повторы (PSA, pombe Sfrl associated) аминокислотной последовательности в белке Sfrl, ответственные за взаимодействие с рекомбиназой Rad51.

3. Повышенная экспрессия PSA повторов Sfrl приводит к Rad51-зависимому доминант - негативному эффекту на выживаемость клеток.

4. PSA повторы являются важной функциональной частью белка Sfrl. Замещение фенилаланина в коровых участках повторов приводит к строгому ослаблению репарации ДНК и рекомбинации в мейозе, что указывает на важность химической природы этого аминокислотного остатка.

5. Предложена модель полимеризации белка Rad51 на одноцепочечной ДНК с участием медиаторного комплекса Sfrl-Swi5 в клетках делящихся дрожжей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хасанова, Ольга Сергеевна, Москва

1. Klar, A J. (2007) Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet 41, 213-236.

2. Wray, J., Liu, J., Nickoloff, J.A. and Shen, Z. (2008) Distinct RAD51 associations with RAD52 and BCCIP in response to DNA damage and replication stress. Cancer Res 68, 2699-2707.

3. Franco, S., Alt, F.W. and Manis, J.P. (2006) Pathways that suppress programmed DNA breaks from progressing to chromosomal breaks and translocations. DNA Repair (Amst) 5, 1030-1041.

4. Ehmsen, K.T. and Heyer, W.D. (2008) Biochemistry of Meiotic Recombination: Formation, Processing, and Resolution of Recombination Intermediates. Genome Dyn Stab 3, 91-164.

5. Bosco, E.E., Mayhew, C.N., Hennigan, R.F., Sage, J., Jacks, T. and Knudsen, E.S. (2004) RB signaling prevents replication-dependent DNA double-strand breaks following genotoxic insult. Nucleic Acids Res 32, 25-34.

6. Moore, J.K. and Haber, J:E. (1996) Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 16;,2164-2173.

7. Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A. and Gorbunova, V. (2008) Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst) 7, 1765-1771.

8. Mortimer, R.K. (1958) Radiobiological and genetic studies on a polyploid series (haploid to hexaploid) of Saccharomyces cerevisiae. Radiat Res 9, 312-326.

9. Egel, R. (2005) Fission yeast mating-type switching: programmed damage and repair. DNA Repair (Amst) 4, 525-536.

10. Lisby, M. and Rothstein, R. (2004) DNA damage checkpoint and repair centers. Curr Opin Cell Biol 16, 328-334.

11. Thompson, L.H. and Schild, D. (2002) Recombinational DNA repair and human disease. Mutat Res 509, 49-78.

12. Scully, R.E. (1997) Hormonally active ovarian tumors. Verh Dtsch Ges Pathol 81,245-252.

13. Scully, R., Chen, J., Plug, A., Xiao, Y., Weaver, D., Feunteun, J., Ashley, T. and Livingston, D.M. (1997) Association of BRCA1 with Rad51 in mitotic and meiotic cells. Cell 88, 265-275.

14. Huysmans, E., Dams, E., Yandenberghe, A. and Wachter, R.D. (1983) The nucieotide sequences of the 5S rRNAs of four mushrooms and their use in studying the pnytogenetk position of bastdiomycetes among the eukaryotes. Nucl. Acids Res. 11, 2871-2880.

15. Prabhala, G., Rosenberg, G.H. and K/jufer, N.F. (1992) Architectural Features of Pre-mRNA Introns in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Yeast 8, 171-182.

16. Mertins, P. and Gallwitz, D. (1987) Nuclear pre-mRNA splicing in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe strictly requires an intron-contained, conserved sequence element. Embo J 6, 1757-1763.

17. Nurse, P. (1990) Universal control mechanism regulating onset of M-phase. Nature 344, 503-508.

18. Davey, S., Nass, M.L., Ferrer, J.V., Sidik, K., Eisenberger, A., Mitchell, D.L. and Freyer, G.A. (1997) The fission yeast UVDR DNA repair pathway is inducible. Nucleic Acids Res 25, 1002-1008.

19. Yasuhira, S., Morimyo, M. and Yasui, A. (1999) Transcription dependence and the roles of two excision repair pathways for UV damage in fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Biol Chem 274, 26822-26827.

20. Phipps, J., Nasim, A. and Miller, D.R. (1985) Recovery, repair, and mutagenesis in Schizosaccharomyces pombe. Adv Genet 23, 1-72.

21. Paques, F. and Haber, J.E. (1999) Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev 63, 349-404.

22. Petrini, J.H., Bressan, D.A. and Yao, M.S. (1997) The RAD52 epistasis group in mammalian double strand break repair. Semin Immunol 9, 181-188.

23. Lim, D.S. and Hasty, P. (1996) A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol Cell Biol 16, 71337143.

24. Tsuzuki, T., Fujii, Y., Sakumi, K., Tominaga, Y., Nakao, K., Sekiguchi, M., Matsushiro, A., Yoshimura, Y. and MoritaT (1996) Targeted disruption of the Rad51 gene leads to lethality in embryonic mice. Proc Natl Acad Sci USA 93, 6236-6240.

25. Xiao, Y. and Weaver, D.T. (1997) Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mrel 1 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic Acids Res 25, 2985-2991.

26. Tavassoli, M., Shayeghi, M., Nasim, A. and Watts, F.Z. (1995) Cloning and characterization of the Schizosaccharomyces pombe rad.32 gene: a gene required for repair of double strand breaks and recombination. Nucleic Acids Res. 23, 383388.

27. Ajimura, M., Leem, S.H. and Ogawa, H. (1993) Identification of New Genes Required for Meiotic Recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 133, 51-66.

28. Eggleston, A.K. and West, S.C. (1997) Recombination initiation: easy as A, B, C, D. chi? Curr Biol 7, R745-749.

29. Sharpies, G.J. and Leach, D.R. (1995) Structural and functional similarities between the SbcCD proteins of Escherichia coli and the RAD50 and MRE11 (RAD32) recombination and repair proteins of yeast. Mol Microbiol 17, 12151217.

30. Wilson, S., Tavassoli, M. and Watts, F.Z. (1998) Schizosaccharomyces pombe rad32 protein: a phosphoprotein with an essential phosphoesterase motif required for repair of DNA double strand breaks. Nucleic Acids Res 26, 52615269.

31. Haber, J.E. (1998) The many interfaces of Mrel 1. Cell 95, 583-586.

32. Usui, T., Ohta, T., Oshiumi, H., Tomizawa, J., Ogawa, H. and Ogawa, T. (1998) Complex formation and functional versatility of Mrel 1 of budding yeast in recombination. Cell 95, 705-716.

33. Paull, T.T. and Gellert, M. (1998) The 3' to 5' exonuclease activity-of Mre 11 facilitates repair of DNA double-strand breaks. Mol Cell 1, 969-979.

34. Dong, Z., Zhong, Q. and Chen, P.L. (1999) The Nijmegen breakage syndrome protein is essential for Mrell phosphorylation upon DNA damage. J Biol Chem 274, 19513-19516.

35. Bianco, P.R., Tracy, R.B. and Kowalczykowski, S.C. (1998) DNA strand exchange proteins: a biochemical and physical comparison. Front Biosci 3, D570-603.

36. Muris, D.F., Vreeken, K., Carr, A.M., Broughton, B.C., Lehmann, A.R., Lohman, P.H. and Pastink, A. (1993) Cloning the RAD51 homologue of Schizosaccharomyces pombe. Nucleic Acids Res 21, 4586-4591.

37. Jang, Y.K., Jin, Y.H., Kim, E.M., Fabre, F., Hong, S.H. and Park, S.D. (1994) Cloning and sequence analysis of rhp51+, a Schizosaccharomyces pombe homolog of the Saccharomyces cerevisiae RAD51 gene. Gene 142, 207-211.

38. Jang, Y.K., Jin, Y.H., Myung, K., Seong, R.H., Hong, S.H. and Park, S.D. (1996) Differential expression of the rhp51+ gene, a recA and RAD51 homolog from the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Gene 169, 125-130.

39. Shinohara, A., Ogawa, H. and Ogawa, T. (1992) Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell 69, 457-470.

40. Sung, P. (1994) Catalysis of ATP-dependent homologous DNA pairing and strand exchange by yeast RAD51 protein. Science 265, 1241-1243.

41. Sugiyama, T., Zaitseva, E.M. and Kowalczykowski, S.C. (1997) A single-stranded DNA-binding protein is needed for efficient presynaptic complex formation by the Saccharomyces cerevisiae Rad51 protein. J Biol Chem 272, 7940-7945.

42. Kowalczykowski, S.C., Dixon, D.A., Eggleston, A.K., Lauder, S.D. and Rehrauer, W.M. (1994) Biochemistry of homologous recombination in Escherichia coli. Microbiol Rev 58, 401-465.

43. Ogawa, T., Yu, X., Shinohara, A. and Egelman, E.H. (1993) Similarity of the yeast RAD51 filament to the bacterial RecA filament. Science 259, 1896-1899.

44. Conway, A.B., Lynch, T.W., Zhang, Y., Fortin, G.S., Fung, C.W., Symington, L.S. and Rice, P.A. (2004) Crystal structure of a Rad51 filament. Nat Struct Mol Biol 11,791-796.

45. Zaitseva, E.M., Zaitsev, E.N. and Kowalczykowski, S.C. (1999) The DNA binding properties of Saccharomyces cerevisiae Rad51 protein. J Biol Chem 274, 2907-2915.

46. Johnson, R.D. and Symington, L.S. (1995) Functional differences and interactions among the putative RecA homologs Rad51, Rad55, and Rad57. Mol Cell Biol 15,4843-4850.

47. Hays, S.L., Firmenich, A.A. and Berg, P. (1995) Complex formation in yeast double-strand break repair: participation of Rad51, Rad52, Rad55, and Rad57 proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 6925-6929.

48. New, J.H., Sugiyama, T., Zaitseva, E. and Kowalczykowski, S.C. (1998) Rad52 protein stimulates DNA strand exchange by Rad51 and replication protein A. Nature 391, 407-410.

49. Shinohara, A. and Ogawa, T. (1998) Stimulation by Rad52 of yeast Rad51-mediated recombination. Nature 391, 404-407.

50. Benson, F.E., Baumann, P. and West, S.C. (1998) Synergistic actions of Rad51 and Rad52 in recombination and DNA repair. Nature 391, 401-404.

51. Sung, P. (1997) Yeast Rad55 and Rad57 proteins form a heterodimer that functions with replication protein A to promote DNA strand exchange by Rad51 recombinase. Genes Dev 11, 1111-1121.

52. Khasanov, F.K., Savchenko, G.V., Bashkirova, E.V., Korolev, V.G., Heyer, W.D. and Bashkirov, V.l. (1999) A new recombinational DNA repair gene from Schizosaccharomyces pombe with homology to Escherichia coli RecA. Genetics 152, 1557-1572.

53. Haruta, N., Kurokawa, Y., Murayama, Y., Akamatsu, Y., Unzai, S., Tsutsui, Y. and Iwasaki, H. (2006) The Swi5-Sfrl complex stimulates Rhp51/Rad51- and Dmcl-mediated DNA strand exchange in vitro. Nat Struct Mol Biol 13, 823-830.

54. Salakhova, A.F., Savchenko, G.V., Khasanov, F.K., Chepurnaia, O.V., Korolev, V.G. and Bashkirov, V.l. (2005) The dds20+ gene controls a novel

55. Rad51 Sp-dependent pathway of recombinational repair in Schizosaccharomyces pombe. Genetika 41, 736-745.

56. Tsutsui, Y., Khasanov, F.K., Shinagawa, H., Iwasaki, H. and Bashkirov, V.I. (2001) Multiple interactions among the components of the recombinational DNA repair system in Schizosaccharomyces pombe. Genetics 159, 91-105.

57. Lehmann, A.R., Walicka, M., Griffiths, D.J., Murray, J.M., Watts, F.Z., McCready, S. and Carr, A.M. (1995) The radl8 gene of Schizosaccharomyces pombe defines a new subgroup of the SMC superfamily involved in DNA repair. Mol Cell Biol 15, 7067-7080.

58. Verkade, H.M., Bugg, S.J., Lindsay, H.D., Carr, A.M. and O'Connell, M.J. (1999) Radl8 is required for DNA repair and checkpoint responses in fission yeast. Mol Biol Cell 10, 2905-2918.

59. Hartsuiker, E., Vaessen, E., Carr, A.M. and Kohli, J. (2001) Fission yeast Rad50 stimulates sister chromatid recombination and links cohesion with repair. Embo J 20, 6660-6671.

60. Kaykov, A. and Arcangioli, B. (2004) A programmed strand-specific and modified nick in S. pombe constitutes a novel type of chromosomal imprint. Curr Biol 14, 1924-1928.

61. Vengrova, S. and Dalgaard, J.Z. (2004) RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching. Genes Dev 18, 794-804.

62. Ostermann, K., Lorentz, A. and Schmidt, H. (1993) The fission yeast rad22 gene, having a function in mating-type switching and repair of DNA damages, encodes a protein homolog to Rad52 of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res 21, 5940-5944.

63. Grishchuk, A.L., Kraehenbuehl, R., Molnar, M., Fleck, O. and Kohli, J. (2004) Genetic and cytological characterization of the RecA-homologous proteins Rad51 and Dmcl of Schizosaccharomyces pombe. Curr Genet 44, 317-328.

64. Arcangioli, B. (1998) A site- and strand-specific DNA break confers asymmetric switching potential in fission yeast. Embo J 17, 4503-4510.

65. Game, J.C. (1993) DNA double-strand breaks and the RAD50-RAD57 genes in Saccharomyces. Semin Cancer Biol 4, 73-83.

66. Suto, K., Nagata, A., Murakami, H. and Okayama, H. (1999) A double-strand break repair component is essential for S phase completion in fission yeast cell cycling. Mol Biol Cell 10, 3331-3343.

67. Wold, M.S. (1997) Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem 66, 61-92.

68. Parker, A.E., Clyne, R.K., Carr, A.M. and Kelly, T.J. (1997) The Schizosaccharomyces pombe radll+ gene encodes the large subunit of replication protein A. Mol Cell Biol 17, 2381-2390.

69. Lee, S.E., Moore, J.K., Holmes, A., Umezu, K., Kolodner, R.D. and Haber, J.E. (1998) Saccharomyces Ku70, mrell/rad50 and RPA proteins regulate adaptation to G2/M arrest after DNA damage. Cell 94, 399-409.

70. Brush, G.S., Morrow, D.M., Hieter, P. and Kelly, T.J. (1996) The ATM homologue MEC1 is required for phosphorylation of replication protein A in yeast Proc Natl Acad Sci U S A 93, 15075-15080.

71. Brush, G.S. and Kelly, T.J. (2000) Phosphorylation of the replication protein A large subunit in the Saccharomyces cerevisiae checkpoint response. Nucleic Acids Res 28, 3725-3732.

72. Carty, M.P., Zernik-Kobak, M., McGrath, S. and Dixon, K. (1994) UV light-induced DNA synthesis arrest in HeLa cells is associated with changes in phosphorylation of human single-stranded DNA-binding protein. Embo J 13, 2114-2123.

73. Hays, S.L., Firmenich, A.A., Massey, P., Banerjee, R. and Berg, P. (1998) Studies of the interaction between Rad52 protein and the yeast single-stranded DNA binding protein RPA. Mol Cell Biol 18, 4400-4406.

74. Sugiyama, T., New, J.H. and Kowalczykowski, S.C. (1998) DNA annealing by RAD52 protein is stimulated by specific interaction with the complex of replication protein A and single-stranded DNA. Proc Natl Acad Sci USA 95, 6049-6054.

75. Sung, P. and Klein, H. (2006) Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 739-750.

76. Eggler, A.L., Inman, R.B. and Cox, M.M. (2002) The Rad51-dependent pairing of long DNA substrates is stabilized by replication protein A. J Biol Chem 277, 39280-39288.

77. Beernink, H.T. and Morrical, S.W. (1999) RMPs: recombination/replication mediator proteins. Trends Biochem Sci 24, 385-389.

78. Lisby, M., Barlow, J.H., Burgess, R.C. and Rothstein, R. (2004) Choreography of the DNA damage response: spatiotemporal relationships among checkpoint and repair proteins. Cell 118, 699-713.

79. Gasior, S.L., Wong, A.K., Kora, Y., Shinohara, A. and Bishop, D.K. (1998) Rad52 associates with RPA and functions with rad55 and rad57 to assemble meiotic recombination complexes. Genes Dev 12, 2208-2221.

80. Sugawara, N., Wang, X. and Haber, J.E. (2003) In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Mol Cell 12, 209219.

81. Shinohara, A., Shinohara, M., Ohta, T., Matsuda, S. and Ogawa, T. (1998) Rad52 forms ring structures and co-operates with RPA in single-strand DNA annealing. Genes Cells 3, 145-156.

82. Singleton, M.R., Wentzell, L.M., Liu, Y., West, S.C. and Wigley, D.B. (2002) Structure of the single-strand annealing domain of human RAD52 protein. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 13492-13497.

83. Sharan, S.K., Morimatsu, M., Albrecht, U., Lim, D.S., Regel, E., Dinh, C., Sands, A., Eichele, G., Hasty, P. and Bradley, A. (1997) Embryonic lethality and radiation hypersensitivity mediated by Rad51 in mice lacking Brca2. Nature 386, 804-810.

84. Amitani, I., Baskin, RJ. and Kowalczykowski, S.C. (2006) Visualization of Rad54, a chromatin remodeling protein, translocating on single DNA molecules. Mol Cell 23, 143-148.

85. Mazin, A.V., Alexeev, A.A. and Kowalczykowski, S.C. (2003) A novel function of Rad54 protein. Stabilization of the Rad51 nucleoprotein filament. J Biol Chem 278, 14029-14036.

86. Wolner, B. and Peterson, C.L. (2005) ATP-dependent and ATP-independent roles for the Rad54 chromatin remodeling enzyme during recombinational repair of a DNA double strand break. J Biol Chem 280, 10855-10860.

87. Heyer, W.D., Li, X., Rolfsmeier, M. and Zhang, X.P. (2006) Rad54: the Swiss Army knife of homologous recombination? Nucleic Acids Res 34, 41154125.

88. Tan, T.L., Kanaar, R. and Wyman, C. (2003) Rad54, a Jack of all trades in homologous recombination. DNA Repair (Amst) 2, 787-794.

89. Petukhova, G., Stratton, S. and Sung, P. (1998) Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature 393, 91-94.

90. Solinger, J.A., Kiianitsa, K. and Heyer, W.D. (2002) Rad54, a Swi2/Snf2-like recombinational repair protein, disassembles Rad51:dsDNA filaments. Mol Cell 10, 1175-1188.

91. Li, X. and Heyer, W.D. (2009) RAD54 controls access to the invading 3'-OH end after RAD51-mediated DNA strand invasion in homologous recombination in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res 37, 638-646.

92. Khasanov, F.K., Salakhova, A.F., Chepurnaja, O.V., Korolev, V.G. and Bashkirov, V.I. (2004) Identification and characterization of the rlpl+., the novel Rad51 paralog in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. DNA Repair (Amst) 3, 1363-1374.

93. Lambert, S. and Lopez, B.S. (2001) Role of RAD51 in sister-chromatid exchanges in mammalian cells. Oncogene 20, 6627-6631.

94. Shivji, M.K. and Venkitaraman, A.R. (2004) DNA recombination, chromosomal stability and carcinogenesis: insights into the role of BRCA2. DNA Repair (Amst) 3, 835-843.

95. Baumann, P., Benson, F.E. and West, S.C. (1996) Human Rad51 protein promotes ATP-dependent homologous pairing and strand transfer reactions in vitro. Cell 87, 757-766.

96. Yasui, A. and McCready, S.J. (1998) Alternative repair pathways for UV-induced DNA damage. Bioessays 20, 291-297.

97. Murray, J.M., Lindsay, H.D., Munday, C.A. and Carr, A.M. (1997) Role of Schizosaccharomyces pombe RecQ homolog, recombination, and checkpoint genes in UV damage tolerance. Mol Cell Biol 17, 6868-6875.

98. Boddy, M.N., Lopez-Girona, A., Shanahan, P., Interthal, H., Heyer, W.D. and Russell, P. (2000) Damage tolerance protein Mus81 associates with the FHA1 domain of checkpoint kinase Cdsl. Mol Cell Biol 20, 8758-8766.

99. Michel, B., Ehrlich, S.D. and Uzest, M. (1997) DNA double-strand breaks caused by replication arrest. Embo J 16, 430-438.

100. Kogoma, T. (1997) Stable DNA replication: interplay between DNA replication, homologous recombination, and transcription. Microbiol Mol Biol Rev 61, 21-2-238.

101. Martinho, R.G., Lindsay, H.D., Flaggs, G., DeMaggio, A.J., Hoekstra, M.F., Carr, A.M. and Bentley, N.J. (1998) Analysis of Rad3 and Chkl protein kinases defines different checkpoint responses. Embo J 17, 7239-7249.

102. McCready, S.J., Osman, F. and Yasui, A. (2000) Repair of UV damage in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Mutat Res 451, 197-210.

103. Myung, K., Chen, C. and Kolodner, R.D. (2001) Multiple pathways cooperate in the suppression of genome instability in Saccharomyces cerevisiae. Nature 411, 1073-1076.

104. Tercero, J.A. and Diffley, J.F. (2001) Regulation of DNA replication fork progression through damaged DNA by the Mecl/Rad53 checkpoint. Nature 412, 553-557.

105. Bashkirov, V.l., King, J.S., Bashkirova, E.V., Schmuckli-Maurer, J. and Heyer, W.D. (2000) DNA repair protein Rad55 is a terminal substrate of the DNA damage checkpoints. Mol Cell Biol 20, 4393-4404.

106. Weichselbaum, R.R., Nove, J. and Little, J.B. (1978) Deficient recovery from potentially lethal radiation damage in ataxia telengiectasia and xeroderma pigmentosum. Nature 271, 261-262.

107. Siede, W., Friedberg, A.S. and Friedberg, E.C. (1993) RAD9-dependent Gl arrest defines a second checkpoint for damaged DNA in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sei U S A 90, 7985-7989.

108. Kolodner, R.D., Putnam, C.D. and Myung, K. (2002) Maintenance of genome stability in Saccharomyces cerevisiae. Science 297, 552-557.

109. Tercero, J.A., Longhese, M.P. and Diffley, J.F. (2003) A central' role for DNA replication forks in checkpoint activation and response. Mol Cell 11, 13231336.

110. Broomfield, S., Hryciw, T. and Xiao, W. (2001) DNA postreplication repair and mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae. Mutat Res 486, 167-184.

111. Krogh, B.O. and Symington, L.S. (2004) Recombination proteins in yeast. Annu Rev Genet 38, 233-271.

112. Waddell, S., Jenkins, J.R. and Proikas-Cezanne, T. (2001) A "no-hybrids" screen for functional antagonizers of human p53 transactivator function: dominant negativity in fission yeast. Oncogene 20, 6001-6008.

113. Fousteri, M.I. and Lehmann, A.R. (2000) A novel SMC protein complex in Schizosaccharomyces pombe contains the Radl8 DNA repair protein. EMBO J 19, 1691-1702.

114. Santos-Rosa, H., Clever, B., Heyer, W.D. and Aguilera, A. (1996) The yeast HRS1 gene encodes a polyglutamine-rich nuclear protein required for spontaneous and hprl-induced deletions between direct repeats. Genetics 142, 705-716.

115. Pringle, J.R., Adams, A.E., Drubin, D.G. and Haarer, B.K. (1991) Immunofluorescence methods for yeast. Methods Enzymol 194, 565-602.

116. Egel, R., Beach, D.H. and Klar, A.J. (1984) Genes required for initiation and resolution steps of mating-type switching in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 3481-3485.

117. Combet, C., Blanchet, C., Geourjon, C. and Deleage, G. (2000) NPS@: network protein sequence analysis. Trends Biochem Sci 25, 147-150.

118. Mitchell, T.G. and Perfect, J.R. (1995) Cryptococcosis in the era of AIDS--100 years after the discovery of Cryptococcus neoformans. Clin Microbiol Rev 8, 515-548.

119. Symington, L.S. (2002) Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair. Microbiol Mol Biol Rev 66, 630-670, table of contents.

120. Pellegrini, L., Yu, D.S., Lo, T., Anand, S., Lee, M., Blundell, T.L. and Venkitaraman, A.R. (2002) Insights into DNA recombination from the structure of a RAD51-BRCA2 complex. Nature 420, 287-293.

121. Prinz, S., Amon, A. and Klein, F. (1997) Isolation of COM1, a new gene required to complete meiotic double-strand break-induced recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 146, 781-795.

122. Penkner, A., Portik-Dobos, Z., Tang, L., Schnabel, R., Novatchkova, M., Jantsch, V. and Loidl, J. (2007) A conserved function for a Caenorhabditis elegans Coml/Sae2/CtIP protein homolog in meiotic recombination. EMBO J 26, 50715082.

123. Tsubouchi, H. and Roeder, G.S. (2004) The budding yeast mei5 and sae3 proteins act together with dmcl during meiotic recombination. Genetics 168, 1219-1230.

124. Hayase, A., Takagi, M., Miyazaki, T., Oshiumi, H., Shinohara, M. and Shinohara, A. (2004) A protein complex containing Mei5 and Sae3 promotes the assembly of the meiosis-specific RecA homolog Dmcl. Cell 119, 927-940.

125. Young, J.A., Hyppa, R.W. and Smith, G.R. (2004) Conserved and nonconserved proteins for meiotic DNA breakage and repair in yeasts. Genetics 167,593-605.

126. Li, X. and Heyer, W.D. (2008) Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance. Cell Res 18, 99-113.

127. Yang, H., Li, Q., Fan, J., Holloman, W.K. and Pavletich, N.P. (2005) The BRCA2 homologue Brh2 nucleates RAD51 filament formation at a dsDNAssDNA junction. Nature 433, 653-657.

128. Bork, P., Blomberg, N. and Nilges, M. (1996) Internal repeats in the BRCA2 protein sequence. Nat Genet 13, 22-23.

129. Takahashi, M. (1989) Analysis of DNA-RecA protein interactions involving the protein self-association reaction. J Biol Chem 264, 288-295.

130. Forget, A.L., Kudron, M.M., McGrew, D.A., Calmann, M.A., Schiffer, C.A. and Knight, K.L. (2006) RecA dimers serve as a functional unit for assembly of active nucleoprotein filaments. Biochemistry 45, 13537-13542.

131. Donovan, J.W., Milne, G.T. and Weaver, D.T. (1994) Homotypic and heterotypic protein associations control Rad51 function in double-strand break repair. Genes Dev 8, 2552-2562.

132. Tanaka, K., Hiramoto, T., Fukuda, T. and Miyagawa, K. (2000) A novel human rad54 homologue, Rad54B, associates with Rad51. J Biol Chem 275, 26316-26321.

133. Liu, J., Doty, T., Gibson, B. and Heyer, W.D. (2010) Human BRCA2 protein promotes RAD51 filament formation on RPA-covered single-stranded DNA. Nat Struct Mol Biol.

134. Kurokawa, Y., Murayama, Y., Haruta-Takahashi, N., Urabe, I. and Iwasaki, H. (2008) Reconstitution of DNA strand exchange mediated by Rhp51 recombinase and two mediators. PLoS Biol 6, e88.

135. Tarsounas, M., Davies, D. and West, S.C. (2003) BRCA2-dependent and independent formation of RAD51 nuclear foci. Oncogene 22, 1115-1123.