Идентификация новых генов дрожжей S. pombe и их роль в рекомбинационной репарации ДНК

Хасанов, Фуат Каримович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация новых генов дрожжей S. pombe и их роль в рекомбинационной репарации ДНК
ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация новых генов дрожжей S. pombe и их роль в рекомбинационной репарации ДНК"

На правах рукописи УДК 575.1:579.852.11

Хасанов Фуат Каримович

Идентификация новых генов дрожжей £ ротЬе и их роль в рекомбинационной репарации ДНК

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

03.01.07 - молекулярная генетика

1 9 МАЙ 2011

Москва 2011

4847113

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН (ИБГ РАН)

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

Северинов Константин Викторович

Официальные оппоненты: член-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Лаврик Ольга Ивановна доктор биологических наук, профессор Богданов Юрий Федорович доктор биологических наук, профессор Глазков Михаил Васильевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук, Институт

молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва

Защита диссертации состоится «23» мая 2011 года в «_//_» часов на заседании Диссертационного совета Д002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН (ИБГ РАН) по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан «2.2. » с? т^Ье «о -9 2011 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук О Грабовская Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Двуцепочечные разрывы ДНК представляют собой серьезную опасность для жизнеспособности клеток и стабильности генома. Они являются наиболее тяжелыми повреждениями ДНК в клетке и возникают либо спонтанно во время нормального клеточного метаболизма, либо в результате действия экзогенных ДНК повреждающих факторов, таких как, ионизирующая радиация и канцерогены. Не репарирбванные или неправильно репарированные разрывы ДНК могут приводить к мутациям, геномным перестройкам и к генетической нестабильности, обычно обнаруживаемой в опухолевых клетках высших эукариот.

В ответ на повреждение ДНК происходит остановка клеточного цикла, индуцируется транскрипция репарационных генов и включаются различные пути репарации ДНК. Эти процессы регулируются механизмами контроля клеточного цикла, чекпойнтами повреждения ДНК, предотвращающими вхождение клетки в S-фазу или митоз до тех пор, пока повреждение ДНК не будет репарировано. Механизмы контроля клеточного цикла являются одной из составляющих клеточного ответа на повреждения ДНК, обеспечивая выживание клетки и стабильность ее генома.

Среди известных клеточных репарационных механизмов, рекомбинационная репарация является безошибочным процессом, обеспечивающим высокую точность наследования генетической информации, поскольку использует информацию неповрежденной сестринской хроматиды или хромосомы-гомолога для репарации разрыва ДНК. В Escherichia coli белок RecA выполняет центральную роль в функции рекомбинационной репарации и включает образование RecA нуклеопротеинового филамента на одноцепочечной ДНК, инвазию RecA ДНК - филамента в гомологичную дуплексную ДНК для последующей реакции обмена цепи ДНК, как завершающей стадии рекомбинационного процесса.

Изучение репарации ДНК у высших эукариот главным образом сконцентрировано на анализе генетических заболеваний, связанных с дефектами репарации повреждений генетического материала. Однако, в основе прогресса в этой области лежит выявление генов и установление их организации в биохимические пути репарации повреждений ДНК в низших одноклеточных эукариотах, например, в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Изучение репарации двуцепочечных разрывов ДНК в почкующихся дрожжах S. cerevisiae показало, что эпистатическая группа генов RAD52 вовлечена в рекомбинационную репарацию. Ряд исследований выявил эволюционную консервативность некоторых компонентов механизма рекомбинационной репарации у почкующихся дрожжей. Гомологи генов RAD52 группы были идентифицированы в других эукариотических организмов, включая человека.

Гены S. cerevisiae RAD51, RAD55 и RAD57 кодируют белки гомологичные белку Е. coli RecA. Белок Rad51 образует нуклеопротеиновый филамент во многом сходный с RecA-филаментом на одноцепочечной ДНК. Однако, оставалось не ясным, является ли функциональная диверсификация RecA-подобных белков в почкующихся дрожжах уникальной особенностью этого организма или общей особенностью механизмов рекомбинационной репарации и в других эукариотах. В бактерии Myxococcus xanthus были идентифицированы два гена RecA, что могло указывать на их функциональную диверсификацию RecA-подобных генов. Эта диверсификация была расширена в клетках почкующихся дрожжей с тремя RecA-подобными белками с функцией в репарации ДНК (Rad51, Rad55 и Rad57) и мейоз -специфичным белком Dmcl. Ситуация у млекопитающих оказалась даже более сложной, чем у дрожжевых клеток. Было идентифицировано уже семь генов, кодирующих белки с гомологией к Е. coli RecA.

Нами были проведены исследования по изучению механизмов рекомбинационной репарации в бактериальных клетках, Bacillus subtilis. В частности, были выделены новые гены с функциями в рекомбинационной репарации ДНК и мейозе, а также охарактеризованы фенотипы мутаций в этих генах. Для определения минимальной гомологии ДНК, необходимой для рекомбинации гомологичных участков ДНК в бактериальных клетках, бьиа развита система, способная дифференцировать события гомологичной и негомологичной (незаконной) рекомбинации. Выявлена линейная зависимость частоты гомологичной рекомбинации от длины гомологии ДНК и обнаружено, что приблизительно 70 нуклеотидов достаточно для гомологичной рекомбинации. Гомологичная рекомбинация не обнаруживалась при гомологии рекомбинирующих молекул ДНК в 25 нуклеотидов. Процесс рекомбинационной репарации уже был на начало выполнения настоящей работы наиболее хорошо исследован у бактерий, но недостаточно полно у дрожжей и мало изучен у млекопитающих и человека. В связи с этими обстоятельствами продолжение наших исследований механизмов репарации ДНК было перенесено на новый объект, где в качестве модельной системы нами был использован эукариотический организм - делящиеся дрожжи S. pombe. Выбор нового объекта для наших исследований был не случайным. Во-первых, дрожжи S. pombe представляют собой удачную модель для изучения репарации ДНК, включая репарацию с помощью гомологичной рекомбинации. Механизм рекомбинационной репарации в клетках делящихся дрожжей был практически не исследованным. Не были идентифицированы RecA-подобныв белки, за исключением Rhp51, гомолога S. cerevisiae Rad51, и их возможные функции в образовании нуклеопротеинового филамента у этого организма. Во-вторых, по структурной и функциональной организации геном дрожжей S. pombe эволюционно удален как от почкующихся дрожжей S. cerevisiae, так и от млекопитающих. Медиальное деление клеток,

интрон - экзонная организация генома, сплайсинг РНК, контроль клеточного цикла и эффективная незаконная рекомбинация - все это у 5. ротЬе более сходно с клетками позвоночных, чем с Б. сеге\тае. В-третьих, был начат проект по секвенированию генома & ротЬе (http://www.sanger.ac.uk/) и базы данных последовательностей ДНК были доступны для анализа, в отличие от аналогичного проекта по секвенированию генома В. ¡иЫШя, который оставался длительное время закрытым, поскольку носил коммерческий характер.

Представленная работа направлена на решение фундаментальной задачи - понимание механизмов рекомбинационной репарации в эукариотических организмах, в частности в клетках дрожжей 5. ротЬе. Проведенные исследования могут послужить основой для изучения этих механизмов, в виду их эволюционной консервативности, в клетках человека с выходом на генетические заболевания. Они также важны и для понимания процессов гомологичной рекомбинации при генных манипуляциях с клетками высших организмов.

Цель и задачи исследования

Основной целью диссертационной работы является выяснение молекулярных механизмов рекомбинационной репарации ДНК в эукариотах на примере изучения молекулярной структуры и функции белков - медиаторов образования Яаё51 -нуклеопротеинового филамента в рекомбинационной репарации 5. ротЬе.

В настоящем исследовании были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать с помощью методов компьютерного анализа профиля белков новые ЯесА - подобные белки в клетках дрожжей 5. ротЬе.

2. Определить функцию новых ЯесА - подобных белков в процессах репарации повреждений ДНК и в других клеточных метаболических процессах.

3. Обнаружить генетические взаимодействия между генами с целью понимания генетического контроля ранних фаз рекомбинационной репарации.

4. Провести цитологический анализ белков репарации индуцированных повреждений ДНК в вегетативных клетках (визуализация фокусов для репарационных белков) с целью определения их клеточной локализации.

5. Провести генетический анализ для определения функции генов в мейозе.

6. Определить возможные комплексы, образуемые белками рекомбинационной репарации в клетках дрожжей 5. ротЬе.

7. Провести молекулярный анализ репарационных белков с целью определения участков (доменов), важных для их функций в репарации ДНК.

Научная новизна и практическая ценность работы:

Впервые идентифицированы три новых гена (rhp55+, rlpl* и sfrl+) в клетках дрожжей S. ротЬе с функцией в рекомбинационной репарации двуцепочечных разрывов ДНК, два из которых, rhp55+ и rlpl*, кодируют белки S. pombe с гомологией к Е. coli RecA.

Открыт новый путь сборки Rad51 - нуклеопротеинового филамента, действующий параллельно Rad51-napanoraM Rhp55-Rhp57 и Rlpl. Полученные данные опровергают общепринятую модель одного линейного пути образования Rad51 - филамента в клетках дрожжей и позволяют рассматривать возможность многообразия механизмов медиаторных путей в клетках высших эукариот.

Показан новый Cdsl - независимый путь в механизме толерантности к УФ -повреждениям ДНК в дрожжах S. pombe, контролируемый белком Sfrl.

Идентифицирован новый домен (PSA) в белке Sfrl, используемый в качестве модуля для ассоциации с Rad51Sp, ключевым белком гомологичной рекомбинации. Молекулярный анализ привел к идентификации белков с потенциальными PSA повторами и в других эукариотических организмах, что позволяет предположить консервативность этих доменов в низших эукариотах, в частности, в грибах.

Знание и изучение молекулярных механизмов эукариотической рекомбинационной репарации является важным с точки зрения молекулярной патологии болезней человека и их возможной терапии. Поскольку ионизирующая радиация используется в качестве инструмента в медицинских диагностических целях и терапии рака, необходимо более полное понимание клеточных ответов на возможные повреждения ДНК. Радиационная устойчивость раковых клеток создает ряд проблем для противораковой терапии, вызывая повышенную репарационную способность таких клеток. Повышенные уровни рекомбинации, наблюдаемые у людей с такими синдромами с предрасположенностью к раку как синдромы Блюма или Вернера, первично вызывают геномную нестабильность в клетках больных людей. Наличие прямой связи между предрасположенностью к раковым заболеваниям молочной железы и яичника и репарационными процессами было продемонстрировано обнаружением взаимодействия онкогенных белков BRCA1 и BRCA2 с ключевым белком рекомбинационной репарации Rad51.

Апробация работы:

Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: FASEB Conference on Genetic Recombination (Snowmass Village, Snowmass, Colorado, USA, 1997 и 2004); Symposium on Molecular and Cellular Mechanisms of Genetic Recombination (Osaka, Japan, 1998);

International Conference "Molecular Genetics of Eukaryotes" (Москва, 2003; Meeting of International Research Scholars of Howard Hughes Medical Institute (1996-2005); Scientific Meeting on DNA Repair, Recombination & Replication (Zurich, Switzerland, 2006); 4th Int. Moscow Conference on Computational Molecular Biology MCCMB'09 (Москва, 2009); International Symposium «Control of Gene Expression and Cancer» (Москва, 2010; Межинститугском семинаре «Хромосома» (Москва, 2006 и 2011).

Публикации:

По результатам диссертации опубликованы 22 печатные работы, из которых 15 статей в российских и международных журналах и 7 тезисов докладов и материалов конференций.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 263 страницах и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Диссертация содержит 58 рисунков и 21 таблицу. Библиография включает 273 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ rhpSS + кодирует новый белок S. ротЪе с гомологией к RecA

При анализе базы данных нами была идентифицирована открытая рамка считывания (хромосома I в S. pombe, смежная с геном raslспособная кодировать полипептид со значительной гомологией к бактериальному белку RecA. Была обнаружена высокая гомология между транслированными аминокислотными последовательностями нового белка и белка S. cerevisiae Rad55 (Рис.1). Ген был назван rhp55* (rad homolog ¡lombe 55). не только из-за гомологии в последовательностях, но и из-за результатов, полученных в функциональном анализе, обсуждаемых ниже. Анализ открытой рамки считывания для rhp55+ обнаружил присутствие NTP - связывающих мотивов (Walker боксов А и В), типичных для RecA-подобных белков. Для идентификации полной кодирующей последовательности нового гена проведен скрининг кДНК библиотеки S. pombe, используя в качестве пробы 314 н.п. ПЦР фрагмент кДНК, окружающий Walker боксы. Полученная плазмида содержала вставку кДНК размером 1.44 т.п.н., для которой ручным секвенированием была определена нуклеотидная последовательность клонированной ДНК (AF053410 в GenBank). кДНК включала как полную открытую рамку считывания для rhp55так и 5'- и 3' - не транслируемые районы.

rhpS5+

1050

Рис. 1. Экзон - интронная структура гена делящихся дрожжей rhp55*. Открытая рамка считывания для гена rhp55+ показана в виде не закрашенной стрелки. Прямоугольник, закрашенный черным цветом, представляет собой область интрона. Числа указывают нукпеотиды кодирующей последовательности rhp55\

Была обнаружена поли - (Т)г4 последовательность, соответствующая polyA в мРНК, в 3' конце кДНК (положение 1303 от инициирующего кодона ATG). 1443 п.н. кДНК включала открытую рамку считывания размером 1050 п.н., которая могла быть транслирована в белок из 350 аминокислотных остатков с молекулярной массой 38,900. Обнаружен один интрон (44 п.н.) рядом с инициирующим ATG кодоном (Рис.1). Первый экзон включает в себя 16 нуклеотидов кодирующей последовательности. В 5' - области, предшествующей гену rhp55+, в экспериментах «primer extension» были картированы три возможные точки инициации транскрипции (-100, -153 и -182). Идентифицированы два потенциальных ТАТА-бокса: ТААААТАА (положение -235) и ТАТААА (-283). В 3' не транслируемом районе был обнаружен возможный сигнал полиаденилирования в положениях 1116 (ATTAAT), также как и возможные сигналы терминации синтеза мРНК (ТТТТТА) в положениях 1181 и 1253. Сравнение аминокислотных последовательностей Rhp55 с Е. coli RecA и другими родственными белками почкующихся и делящихся дрожжей обнаружило значительный уровень идентичности между ними (Рис.2В). Самый высокий уровень гомологии среди пяти белков определен в центральной части белков, окружающих NTP - связывающие мотивы А и В. Попарное сравнение (GCG Sequence Analysis Software Package) показало наивысшую степень гомологии между Rhp55 и S.cerevisiae Rad55 (24.2% идентичности и 48.2% сходства в аминокислотных последовательностях). Дендрограмма показывает тесное сходство Rhp55 с S.cerevisiae Rad55, чем к Rad57, Dmcl или Rad51 (Рис.2С).

-ш:

1 16 17

ООО Ofc

к к к

• - *

3 ¿3

J J к J j к CT ». А Я g M ИГЧГ-<ц с е.

н > J »Olk MOO

« < а и с*о и к к

и-а их». О о и

Irl

« к в а

* j ь ».

b X J > J < M H OH

J < J H

а я к x

*<<>••

> к w .

* О J J >•01*» doom

fa и J к

KK 'I

« M ■ PC

к о * к к к я к

И Н Н

* >• ►> X » к Д и

* • р. х;

и • К h

• •нм KOI * К в «в NN 'О

> НОЖ А к>1КК

< * о га te н К > И К

Н X О X >

N К И Oh К19>ОИ>

А Ь

а и у HQP] ахЕГ^о а о к и - м И Л о О »X X С X • 'X и И ► • »о < > К • -я

нмяаТГл

.... 4 о

NN« О . «С

И •< ;

• • X к • м

• 'Khbt

oQO • о и ОЕЗиПа а и м О Ч • О

• • К • О

ВВЕЗ* - я

у я а КК

ал »I ¡»ста

а • >qz

о < • Я W <

Ж~ 152 • • •!■»< О^'ШЧ'1 И ID

HMO» • к

к я я > •

• J к • •

• «а > и >

•«•<•< Я

MKOQQa (fftfti

ШН Hl III 111Ш Ullll

к м « к

* О

И ВП

о> J J

к м • и к * . н > ь . о ом • я х < • J fa >■ сто а <5 . О

< М Я

««]<•<

О Q X я о о • о о S. к. fa к в к о ими».

Л О X К

< Ь J Н и И "Я CT У

о я я я

КИ • я ом о о

J И Q М

J м я я

> Л «во

ЕЗЯЕЭЕЗ

X о К j

«-я

SpRhp55 ScRad5l

SpRhp51 HsRadSI ScOmcl SpDmcl HKLIM15 ScRad57 RccA

Рис.2. «Родственные» связи между эукариотическими RecA-подобными белками. (В) Сравнение аминокислотных последовательностей белка S. pombe Rhp55 с другими RecA-подобными белками S. cerevisiae и S. pombe. Сравнение проведено при использовании программ Pile-Up (GCG;) и Boxshade (Bioinformatics Group, ISREC). Идентичные аминокислоты закрашены черным цветом, сходные аминокислоты - серым цветом, которые представлены как Р, A, G, S и Т; Е, D, N и Q; V, I, L и М; F, W и

У; К, R и Н. Большими точками показаны консервативные остатки аминокислот в последовательности RecA, важные для структуры белка и его функции. (С) Дендрограмма была создана при использовании программы Pile-Up (GCG;). Sc, S. cerevisiae\ Sp, S, pombe; Hs, Homo sapiens.

гЬр$5 транскрибируется в вегетативно растущих клетках и индуцируется в мейозе.

Экспрессия гена г1гр55+ была изучена в вегетативно растущих клетках и в мейотическом цикле. В синхронизированном мейотическом цикле тотальная РНК была проанализирована на присутствие г/гр55-специфичных мРНК. Результат этого эксперимента (Рис.3) показал, что ген г!гр55* экспрессируется в митотических делящихся клетках до вхождения в мейоз (точка времени - 0 часов) и в мейозе (точки времени- 2-10 часов).

(час) О rhp55 —

byr1

1.3 kb

1.9 kb

Рис.3. Индукция экспрессии гена гкр55* в мейозе. Тотальная РНК бьиа проанализирована с помощью Нозерн - гибридизацией в указанных временных отрезках после индукции мейоза. Уровень сигналов определяли с помощью фосфоримаджера (1п^еС>иа1Ц). В качестве контроля для нормализации уровней экспрессии транскрипта гкр55 использовали ген Ьуг1

Был обнаружен только один вид мРНК размером приблизительно 1.4 т.п.н. на Northern блотах, что соответствовало размеру выделенной кДНК. В течение мейоза экспрессия гена градуировано увеличивалась с максимумом экспрессии при 8 часах, что соответствовало мейотической профазе первого мейотического деления. Уровень rhp55+ транскрипта был нормализован в каждой точке времени мРНК byrl+ в качестве контроля. Полученные данные позволяют предположить, что ген rhp55 * экспрессируется при вегетативном росте и в мейозе.

гИр55 + является геном репарации повреждений ДНК.

Чтобы определить, является ли ген гкр55* вовлеченным в репарацию повреждений ДНК, мы сконструировали его нуль - аллель с помощью гомологичной рекомбинации. Полная открытая рамка считывания для гЯр55 была замещена генами ига4+ или аг§3+. Делеционный мутант был жизнеспособным в гаплоидных клетках, указывая на то, что гЬр55+ не существенен для митотического роста. Мы тестировали чувствительность делеции гИр55А::ига4+ к алкилирующему агенту ММС и УФ-свету. Было показано, что мутант гИр55 чувствителен к ММС и в меньшей степени к УФ-свету при 30°С (Рис.4А). Чувствительность к ММС была

ниже, чем у мутантов гИр51 и гИр54. Чувствительность мутанта гИр55 к УФ-свету при 30°С была более выраженной при высоких дозах УФ (Рис.4А). При 18°С мутант гИр55 показал более высокую чувствительность к ММС и УФ. При этих условиях выживаемость мутантов гкр55 была не отличимой от выживаемости мутантов гИр51 и гкр54. Был изучен также эффект ионизирующего излучения. На Рис.4 показаны кривые выживаемости мутанта гИр55 при обработке его у-лучами при двух температурах (30°С и 20°С). Эти данные демонстрируют, что ген гИр55+ вовлечен в репарацию повреждений ДНК, индуцированных у-лучами, вызывающих преимущественно двуцепочечные разрывы ДНК. Чувствительность к у-лучам повышается при низких температурах, как это было обнаружено и для ММС- и УФ-повреждений (Рис.4А). Таким образом, гИр55+ является новым геном репарации повреждений ДНК в делящихся дрожжах.

кДНК гИр55+ комплементирует дефект в репарации повреждений ДНК, вызванный мутацией гИр55&.

Чтобы выяснить функциональную связь Нгр55* с известными гомологами 5. сегеуиг'ае, была исследована способность кДНК гИр55+ комплементировать ММС-чувствительность мутантов 5.сегеу«те га(151, га<155 и гас157. Для этого кДНК гИр55+ помещали на центромерные плазмиды под контроль набора промоторов .У.сегеушае различной силы. Все эти конструкции после их трансформации в 5. сегеуи/ае не были способны комплементировать ММС-чувствительность мутантов гаИ51, га(155 или га(157. Отсутствие межвидовой комплементации между почкующимися и делящимися дрожжами является общим случаем и отражает эволюционную дивергенцию между двумя организмами.

Рис.4. Чувствительность мутанта гИр55А к ММС и УФ. (А) Тест на выживаемость мутанта гИр55Д к ММС и УФ. Был проведен дроп - тест на чувствительность к ММС и УФ. Были использованы штаммы дикого типа, гИр55\ Лр51\ гкр54А и гас!22&. (Б) Комплементация ММС и УФ - чувствительности мутанта гИр55\ клонированными кДНК и близкородственными копиями генов. Штаммы инкубировали при указанных температурах.

5. ротЬе Ш1р55 функционирует в одном пут и с Ш1р51 и КЬр54.

Генетический анализ двойных мутантов позволяет отнести гены к той или иной эпистатической группе репарации ДНК, которые представляют собой различные пути для репарации специфических повреждений ДНК. Двойные мутанты гкр55 гИр51 и гкр55 гИр54 показали тот же уровень чувствительности к у-лучам при 30°С, что и одиночные мутанты гИр51 и гкр54 (Рис.5). Это указывает, что ген гИр55* эпистатичен гИр51+ и гИр54+ и функционирует в том же пути репарации ДНК.

А Б В

О 200 4«) ООО 800 0 200 400 600 S00 0 200 400 600 800 Дозы гамма - лучей (Gy)

Рис.5. Кривые выживаемости одиночных и двойных мутантов по генам репарации двухцепочечных разрывов ДНК S. ротЬе при действии гамма - лучей. (А) Для клеток rad22, rhp5S и rad22 rhp55. (Б) Для клеток rhp51, rhp55 и rhp51 rhp55. (В) Для клеток rhp54, rhp55 и rhp54 rhp55.

0.0001% ммс

Рис.6. Эпистатический анализ генов rhp5I*, rhp54* и rhpiS* по репарации ММС и УФ - повреждений ДНК при 30°.

Клетки г/гр55& содержат аберрантные нуклеусы и показывают повышенное содержание ДНК.

Мутант г!гр55А не показал выраженного слабого ростового фенотипа, но при 18°С

наблюдался слегка замедленный рост. Окрашивание вегетативных клеток гЛр55Л с ОАР1-

Са1соЯиог обнаружило присутствие приблизительно 17% элонгированных клеток, которые были, по крайней мере, в два раза длиннее клеток дикого типа, и эти клетки содержали аберрантные нуклеусы (Рис.7А). Это наблюдение в дальнейшем подкрепилось флуоресцентным анализом мутантов гИр55 (Рис.). Клетки дикого типа при росте в условиях ограниченного азота накапливаются в фазе 01 (Рис.7Б, верхняя панель). Это позволяет видеть два пика, один из которых соответствует в) с 1п ДНК, второй - клетки вг с 2п ДНК. Экспоненциально растущие клетки дикого типа делящихся дрожжей в полной среде содержат, главным образом, 2п или большее количество ДНК.

А Б

О« о -

Диким тип

1 81-г5'

Яя.

1 1 й-

:оо А'Ю ию Ю 1000 1

О-,

гЬр55

Рис.7. Флуоресцентная микроскопия и РАС5 анализ мутанта гНр55Д. (А) 0АР1 и СакоЯиог двойное окрашивание клеток дикого типа и гИр55А. (Б) Результаты РАС8 анализа. Слева, графики подсчета клеток при окрашивании пропидиум йодидом; справа, графики распределение клеток с пиками интенсивности флуоресценции пропидиум йодида и суммарной интенсивности. Результаты показывают гетерогенную природу клеток и организацию ядра. Контрольные клетки дикого типа росли в минимальной среде с ограничением источника азота в случае определения содержания ДНК клеток на стадиях клеточного цикла в! и 02 (верхний ряд).

Это связано с тем, что делящиеся дрожжи большую часть времени своего клеточного цикла проводят в фазе в2, и поэтому, после завершения синтеза ДНК (Б фаза), клетки остаются еще не разделенными (Рис.7Б, средняя панель). Однако, в мутанте гИр55 пик интенсивности флуоресценции пропидиума йодида сдвинут в направлении большего содержания ДНК. Распределение клеток (Рис.7Б, нижняя панель) также указывает на большую гетерогенность размеров клеток и содержания ДНК у мутанта по сравнению с диким типом. Приблизительно 48% мутантных клеток содержали ДНК, превышающее значение в 2п, по сравнению с 26% в

клетках дикого типа. Таким образом, клетки гИр55 показывают дефекты в ядерной морфологии и содержании ДНК.

Делеция гена Б. ротЬе гИр55 приводит к нарушениям мейоза и вызывает небольшое снижение мейотической рекомбинации.

Мы исследовали мейотические фенотипы клеток Я. ротЬе гИр55А. В результате этого исследования было установлено, что белок Юф55 имеет функцию в мейозе. Доказательством этого являются следующие полученные данные. Во-первых, мутант показал сниженную эффективность споруляции и жизнеспособность спор (Табл.1 и 2). Вероятно, ряд летальных мейотических событий было связано с накоплением геномных аберраций до мейоза, что выявлено цитологическим анализом вегетативно растущих клеток. Большая часть мутакгных клеток гИр55, по-видимому, имеют нормальное содержание ДНК, что может говорить о том, что не вся мейотическая летальность обусловлена предмейотическими событиями. Жизнеспособность спор у мутантов г1гр55 в делящихся дрожжах значительно выше, чем у мутантов гай55 в почкующихся дрожжах (<2.5%) (Табл.2). Одной из возможных причин может быть различие в числе хромосом у этих видов дрожжей. Во-вторых, ген гкр55* транскрипционно индуцируется в мейозе (Рис.3). В-третьих, мейотическая рекомбинация снижена в мутантах г!гр55 (Табл. 3 и 4). Наблюдаемое снижение может быть недооценено, так как могло быть проанализировано только жизнеспособное потомство. Более того, анализ мейотической рекомбинации приводит к отбору только жизнеспособных мейотических продуктов, которые могли возникать главным образом при скрещивании партнеров лишь с нормальным содержанием ДНК. Причина этих различий между делящими и почкующимися дрожжами остается не известной. Полученные данные позволяют заключить, что белок ИЬр55 необходим для эффективного мейоза в делящихся дрожжах.

Таблица 1. Споруляция в 5. ротЪе гкр55А

Штамм Споры Аски Вегетативные клетки Эффективность споруляции (%) Снижение"

Дикий тип 19.3 ±3.3 9.2 ± 2.9 69.9 ±4.1 26.9 ±4.7

гИр55& 4.6 ± 0.6 4.0 ± 0.7 90.8 ±1.0 10.2 ±3.0 2.6

' Кратность снижения эффективности споруляции приведена относительно скрещивания клеток

дикого типа.

Таблица 2. Жизнеспособность спор в S. pombe rhp55A.

Штамм Тетрады с жизнеспособными спорами Число тетрад % жизн-ных спор Снижение

4 3 2 1 0

w.t 64 13 3 2 0 82 92.4

rhp55 И 26 25 15 9 68 54.4 1.7

rad22 0 4 9 18 15 46 26.1 3.5

rad22 rhp55 13 11 10 2 0 36 74.3 0.8

rhpSl 0 0 0 5 11 16 7.8 11.8

Таблица 3. Мейотическая внутригенная рекомбинация в мутантах S. pombe rhp55

Хромосомы и аллели Прототрофы/106 жизнеспособных спор1 Снижение рекомбинации'

Дикий тип rhp5SA

II L ade7-150 х ade7-152 443 ±119 405 ± 92 1.1

IHR ade6-469 x ade6-M375 474 ± 53 164 ±42 2.9

IIIR ade6-469 x ade6~M26 8920 ±1454 5772 ±227 1.6

" Среднее и стандартное отклонение из трех независимых скрещиваний.ь Снижение рекомбинации показано относительно скрещиваний клеток дикого типа. (L) Левые и (R) правые плечи хромосом II и III, соответственно.

Таблица 4. Мейотическая межгенная рекомбинация в мутантах S. pombe rhp55

Хромосома и интервал Рекомбинанты (%)" Снижение рекомбинации"

Дикий тип Rhp55A

IR hisl - lys7 20.3 ±3.1 11.1 ± 0.7 1.8

II L ade7 - argó 10.1 ± 1.5 5.9 ± 0.4 1.7

IHR adeö-argI 36.0 ±0.1 25.7 ± 1.8 1.4

' Среднее и стандартное отклонение от трех независимых скрещиваний. Для каждого интервала было проанализировано 1000-1100 случайных спор.ь Снижение рекомбинации дано относительно скрещиваниям клеток дикого типа. (L) Левые и (R) правые плечи хромосом I, II и III, соответственно.

Rhp55 и Rhp57 взаимодействуют in vivo.

Двугибридный анализ позволил обнаружить взаимодействие между двумя гомологами Rad51 в S. pombe, Rhp55 и Rhp57 (Рис.8А). Не были обнаружены взаимодействия Rhp55-Rhp55 или Rhp57-Rhp57. Таким образом, Rhp55, по-видимому, взаимодействует с Rhp57 в соотношении 1:1. Существование комплекса Rhp55-Rhp57 в дрожжевой клетке подтверждено иммунопреципитацией белков. Для иммунопреципитации были использованы антитела к Rhp57 и показано, что белки Rhp55 и Rhp57 могут быть вместе иммунопреципитированы (Рис.8Б, дорожка 6).

DBD: 57 57 55 55 57 55 AD: - 55 - 57 57 55

экстракт

pHA-Rhp55 + -pRhp57 - +

Rhp57—

+ + + +

.....„ НА- # —т w _

Rhp55~1

1 2 3 4 5 6 IB: а-57(крыса)

1 2 3 4 5 6 IB: а-НА(мышь)

pHA-Rhp55 -pRhp57 а-НА(мышь) HA-Rhp55

экстракт

+ - + - + +

Rhp57—

1 2 3 4 5 6 IB: а-55(кролик)

+ + + +

2 3 4 5 6 IB: а-57(крыса)

Рис.8. Белки Rhp55 и RJhp57 строго взаимодействуют между собой и образуют комплекс m vivo. (А) Взаимодействие в дрожжевой двугибридной системе. (Б) Иммунопреципитация белков Rhp55 и Rhp57, используя антитела против Rhp57. (В) Иммунопреципитация белков Rhp55 и Rhp57 с антителами к НА.

Обнаружение Rhp55 было выполнено с использованием антител к НА, поскольку белок Rhp55 был слит с НА эпитопом. В контрольном штамме, в котором белок Rhp57 не экспрессировался, белок Rhp55 не был преципитирован (Рис.8В, дорожка 4), что указывает на то, что HA-Rhp55 просто сам не преципитировался. В штамме, теряющем HA-Rhp55, белок Rhp57 был преципитирован (Рис.8, дорожка 5, слева), но НА-специфичный сигнал не был обнаружен (Рис.8, дорожка 5, справа). Специфичность использованных антител была продемонстрирована в грубых клеточных экстрактах с антителами aHTH-Rhp57 (Рис.8Б, дорожки 1-3, слева) или антителами анти-НА (Рис.8В, дорожки 1-3, справа). Комплексы Rhp55-Rhp57 были также обнаружены в реципрокных иммунопреципитационных экспериментах с использованием

антител анти-НА для преципитации белка Rhp55 (Рис.8В, дорожки 6). Контрольные эксперименты продемонстрировали специфичность взаимодействия (Рис.8, дорожки 4 и 5) и специфичность антител (Рис.8, дорожки 1-3).

Мутации в Walker мотиве «А» белков Rhp55 и Rhp57 приводят к ослабленной репарации ДНК.

Ранее было показано, что мутации в консервативных аминокислотных остатках бокса Walker «А» (GxxxxGKT/S), ответственного за связывание и гидролиз АТФ у белка S. cerevisiae Rad55, но не Rad57, полностью устраняло функцию белка Rad55 в репарации повреждений ДНК. Мы задались вопросом, могут ли эквивалентные мутации в боксе «А» Rhp55 и Rhp57 приводить к нарушению репарации ММС - индуцированных повреждений ДНК. Консервативный лизин в пределах мотива GKT бокса «А» в белках Rhp55 и Rhp57 был замещен аланином или аргинином, с образованием двух мутантных аллелей, rhp55K57A и rhp55K57R, а также rhp57K106A и rhp57K106R, соответственно. Мы генерировали штаммы с хромосомными мутациями в боксе Walker «А» генов rhp55* и rhp5T с помощью замещения аллелей дикого типа. Чувствительность возникающих мутантов к ММС-инддуцированным повреждениям определяли в дроп-тесте (Рис.9).

Мутации К57А и K57R в rhp55', и К106А и K106R в rhp57 приводили к чувствительности клеток к ММС в сравнении с изогенными клетками дикого типа, и этот эффект был более выражен при низкой температуре инкубации клеток (Рис.9). Однако, мутантные штаммы были значительно более устойчивыми к ММС, чем штаммы с делениями генов rhpSS+ или rhp57¥. Комбинация КА мутаций в обеих субъединицах гетеродимера приводила к чувствительности клеток сравнимой с уровнем делеционного мутанта rhp55 (Рис.9). Более того, KR двойные мутанты также показали синергичное увеличение в чувствительности к ММС (Рис.9). Это показывает, что домен связывания и гидролиза АТФ в обоих белках является мажорным детерминантом функциональности комплекса Rhp55 - Rhp57 в репарации ММС-индуцированных повреждений ДНК. В обоих мутантах, rhp55 и rhp57, замещение лизина аргинином имело строгий эффект на клеточную жизнеспособность в присутствии ММС, чем замена лизина аланином (Рис.9). Однако, экспрессия мутантных белков Rhp55K57A или Rhp55K57R и Rhp57K106A или Rhp57K106R на высоко-копийных плазмидах приводила к восстановлению дефекта в репарации ММС-индуцированных повреждений соответствующих делеционных мутантов rhp55 и rhp57 (Рис. 1 OA и Б). Это указывает на то, что потребность в функции АТФ связывания/гидролиза Rhp55 и Rhp57 в репарации ММС повреждений может быть преодолено массой мутированного белка.

А 10°

дикий тип rhp55A rhp55K57A rhp55K57R

Б 10°

ДИКИЙ 'ГШ rhp57A rhp57K106A rhp57K106R

ФФООФ

в 10°

дикий тип rhp55K57A rhp55K57R rhp55A

rhp55K57A rhp57K106A rhp55K57R rhp57K106R

без MMC 3()OC 0.004% MMC

ЛЛ ШНЩЩ

2rc 0.004% MMC

Элонгироваиные клетки (%) П f.

Рис.9. Мутации в Walker А боксе Rhp55p и Rhp57p вызывают дефект в репарации ММС-индуцированных повреждениях ДНК. Последовательные разведения клеток из поздней логарифмической фазы роста были нанесены на чашки в присутствии ММС или без ММС. Чашки были инкубированы при 30° или 22°-23°. (А) Дроп-тест со штаммами дикого типа, rhp55Д, rhp55K57A и rhp55K57R. (Б) Дроп-тест штаммов дикого типа, rhp57A, rhp57K106R и rhp57K106A. (В) Дроп-тест и количественное определение фракции монтированных клеток штаммов дикого типа, rhp55K57A, rhpS5K57R, rhp55A, rhp55K57A rhp57K106A и rhp55K57Rrhp57K106R. Фракция монтированных клеток была определена подсчетом в экспоненциально растущих культурах при 23°. По крайней мере, микроскопически было изучено 1000 клеток.

Это также демонстрирует, что уровень мутантного белка критичен для возникающего клеточного фенотипа и позволяет предположить, что различие в репарационных дефектах между хромосомными мутациями КА и KR может быть результатом измененной стабильности белка. Поскольку как Rhp55, так и Rhp57, являются белками с очень низкой базальной экспрессией и не могут напрямую обнаруживаться в тотальном клеточном белковом экстракте, используя антитела к Rhp55 или к Rhp57, мы решили определить уровни белков Rhp57 дикого типа и мутантного белка Rhp57 в условиях их повышенной экспрессии. Те же штаммы, что и в дроп-тесте, (Рис.9) были использованы для индукции экспрессии белка при двух температурах, 22°С и 30°С, и белок Rhp57 был напрямую иммунообнаружен в клеточных экстрактах. На рис.ЮВ показано, что мутантные белки Rhp57K106A и Rhp57K106R менее стабильны (дорожки 2-3 и 6-7), чем белок дикого типа (дорожки 4 и 8) при обеих температурах. Более того, в то

время как при 30° оба мутантных белка показывают сходные уровни экспрессии, Rhp57K106R был менее стабильным при 22°С, чем Rad57K106A (дорожки 6 и 7). Тем не менее, экспрессируемое количество белка Rad57K106R было достаточным для комплементации репарационного дефекта клеток rhp57A при 22°С (Рис.ЮБ). Эти данные коррелируют с небольшим различием в чувствительности к ММС у мутантов К106А и K106R при 30°С и с более строгим репарационным дефектом клеток KI06R, чем К106А при 22°С (Рис.ЮБ). Таким образом, полученные результаты показывают, что нуклеотид-связывающие мотивы белков Rhp55 и Rhp57 критичны для функции гетеродимера в репарации ДНК. Наши данные позволяют также предположить, что различие между репарационными фенотипами, определяемыми мутациями KR и КА в Walker боксе «А» в гене rhp57+ и, допуская это для гена rhp55обусловлено различной стабильностью соответствующих мутантных белков.

Эффект мутаций в доменах связывания/гидролиза АТФ на функцию комплекса Rhp55-Rhp57 в клеточной пролиферации.

Ранее нами выявлено нарушение клеточной пролиферации в мутантах rhp55\ и rhp57\ в виде накопления элонгированных клеток с аберрантным нуклеусом. Мы проверили, сохраняют ли штаммы rhp55 с К57А- и K57R, и rhp57 сКЮбА- и K106R дефект в клеточной пролиферации, как и штаммы с делециями в соответствующих генах. В экспоненциально растущих клетках rhp55A и rhp57& при 30°, -17-18%, соответственно, клетки были элонгированы, по крайней мере, в два раза. Мутантные клетки rhp55K57A и rhp55K57R, также как и rhp57K106A и rhp57K106R, не показали повышенных уровней в элонгации клеток (<1.1%) ни при 30°С, ни при 22°С. Таким образом, мутации в нуклеотид-связывающих доменах в одной из субъединиц, Rhp55 или Rhp57, не нарушают функцию гетеродимера в клеточной пролиферации. Однако двойные мутанты rhp55KS7A rhp57K106A и rhp55K57R rhp57K106R показывают тот же строгий дефект в клеточной пролиферации (24 и 17%, соответственно), что и мутант rhp55\ (27%; Рис). Из этих данных можно сделать вывод о том, что функция АТФ-азы обеих субъединиц гетеродимера необходима не только для репарации индуцированных повреждений ДНК, но также и для успешной репликации ДНК. Однако, по сравнению с репарационным дефектом, один функциональный АТФ связывающий/гидролизующий домен на гетеродимер является достаточным, чтобы эффективно поддерживать нормальную клеточную пролиферацию.

Ю-3 10°Г-—Ю-3

+вектор +rhp5SKS7A +rhpS5K57R +rhp55+

+ вектор

+rhp57*

+ вектор

+rhp57K106A + rhp57K. +rhp57+

лпкия шжшшш iVIM Ф а ф 9 « *» ф 9 9 & ф 9' » »

30 °с 30°С,ММС

10-4 т°Г—_ ю-4

• • • » • ф ф ф 9 * о ■ • • • • » ф 9 9 * Ф Ф 9 •

зо°с 30°С,ММС

ю-4 10°i-—— ] О'4

• • "<•

е • • о ?

Ф 99 9 is

21°C

22°C. MM С

Л*

/У ^ / /V $ ^

* хл Х^ Xх хл

Rhp5?p

Рис.10. Повышенная экспрессия мутантных белков Rhp55 и Rhp57 супрессирует чувствительность соответствующих делеционных мутантов rhp55 и rhp57. (А) Дроп-тест штамма rhp55&, трансформированного пустым вектором pIRT2, pIRT2-rhp55*, p\KT2-rhp55K57A и pIRT2-rhp55K57R. (Б) Дроп-тест штамма rhp57 Д, трансформированного плазмидами pREPl, pREPl -rhp57*, pREPl-rhp57KI06A и pREPl-rhp57K106R. Последовательные разведения клеток из поздней логарифмической фазы роста были нанесены на селективные минимальные среды с ММС (0.004%) или без ММС. Чашки были инкубированы при 30°С или 22°С. (В) Клеточные уровни нативного или мутантного белка Rhp57 в условиях повышенной экспрессии. (Б). Экспрессия белка была индуцирована на среде EMM без тиамина в течение 18 часов при 30°С или в течение 48 часов при 22°С. Нативные и мутированные белки Rhp57 были визуализированы с помощью Вестерн-блотгинга с использованием антител к Rhp57.

Белки репарации двуцепочечных разрывов ДНК S. pombe образуют комплексы.

К настоящему времени, уже есть экспериментальные доказательства в пользу того, что белки рекомбинационной репарации функционируют в виде белковых комплексов в клетках почкующихся дрожжей и человека. Используя дрожжевую двугибридную систему, мы

выполнили глобальный анализ взаимодействий между всеми известными белками S. pombe с функцией в репарации разрывов ДНК. Эти взаимодействия отражены на диаграмме (Рис.11) в сравнении с известными белками 5. cerevisiae. Указанные взаимодействия не обязательно происходят одновременно, а скорее носят временный и последовательный характер. Среди них такие ассоциации как Rhp51 -Rhp51, Rhp55-Rhp57 и Rhp51-Rhp54 эволюционно консервативны, поскольку подобные ассоциации обнаружены для их гомологов в S. cerevisiae. Оба гомолога дрожжевого Rad52 в S. pombe, Rad22 и Rtil могут образовывать мультимеры и находиться в комплексе с RPA. Более того, белок Rad22 может ассоциировать с белком Rtil и действовать с ним совместно в рекомбинационной репарации. Следует также отметить, что, несмотря на общую схему взаимодействий, порядок использования доменов связывания у белков или субъединиц белкового комплекса отличается между двумя видами дрожжей, как это продемонстрировано для взаимодеиствии Rad51 Sp-(Rad22-Rtil) и Rad51Sp-(Rhp57-Rhp55), соответственно. Поэтому, способ взаимодействия между некоторыми компонентами предполагаемой "репарасомы" не является консервативным между отдаленно родственными дрожжами.

Рис. 11. «Репарасомы» в двух видах дрожжей, 5. ротЬе и 5.

Функция генов гИр51+ и г1гр55+ необходима для процесса переключения типа спаривания как механизма «половой» дифференциации в делящихся дрожжах.

Механизм переключения типа спаривания в клетках делящихся дрожжей инициируется двуцепочечным разрывом ДНК в локусе тш1. К настоящему времени мало данных, касающихся роли белков рекомбинационной репарации в процессе переключения типа

спаривания в клетках S. pombe. Для определения возможной роли белков рекомбинационной репарации S. pombe Rhp51 и Rhp55 в переключении типа спаривания тетрадным анализом были сконструированы гомоталличные штаммы с делециями в соответствующих генах. Клетки /гуо с делециями в генах rhp51+ и rhp55+ сегрегируют гетероталличные h~ и h+ йод - негативные колонии со сниженным уровнем образования двуцепочечных разрывов ДНК или не обнаруживаемым вовсе. Таким образом, секториальный фенотип клеток h9G с делециями обоих генов и их сегрегация на гетероталличные клетки указывают на важность функции генов rhp5I+ и rhp55+ в механизме переключения типа спаривания (Рис.12). Организация района типа спаривания в этих сегрегантах была проанализирована гибридизацией и секвенированием ДНК. Проведенные исследования показали, что h+ сегреганты имеют h'N или h90 конфигурацию области mat, тогда как конфигурация К сегреганта была h90 типа. Мы интерпретировали образование негативных производных штамма h90 rhp55 со стабильной (+) или (-) конфигурацией типа спаривания как результат ошибок репарационного синтеза и образования мутаций в mati:I, влияющих на уровень разрывов ДНК. Возникающие перестройки ДНК в локусе matl у сегрегантов, по-видимому, являются следствием аберрантной конверсии гена. Можно допустить, что инвазия цепи ДНК в гомологичную ДНК донора является менее эффективной без участия белка Rhp55 и происходит с использованием вырожденных последовательностей ДНК, затрагивая нуклеотидную последовательность смежную с mathl.

1,9 о

¡f'rhpisa

h"> гЬр55л (сегреганг) h,0 HipSlJ (сегрегант)

□ □

Рис.12. Колонии штаммов с генотипами, указанных на рисунке. Колонии штаммов были обработаны парами йода на среде МЕА. Темное окрашивание показывает присутствие спор, которые формируются после переключения типа спаривания, образования зигот и мейоза. «Крапчатые» колонии показывают области уменьшенного образования спор, указывая на дефект переключения типа спаривания.

rlpl+ кодирует новый RecA-подобный белок S. pombe с высокой гомологией к белку человека XRCC2.

Проанализировав базу данных 5. pombe с помощью программы TBLASTN 1.4.11 и используя аминокислотную последовательность Rhp55 в качестве матрицы, нами была обнаружена еще одна открытая рамка считывания SPBC1685.il на космиде SPBC1685 (картирована на хромосоме II), способная кодировать новый полипептид со значительной гомологией к белкам, принадлежащим к семейству белков Rad51/RecA. Ген был назван rlp]+ (RecA-jike grotein jj. Открытая рамка считывания для rlpl* состоит из 1094 п.н., которые могли быть транслированы в белок из 363 аминокислот с молекулярной массой 41,700. Три ТАА стоп кодона предшествовали ATG кодону, что делало высоковероятным использование этого кодона для инициации трансляции. Rlpl имеет высокую степень гомологии к Rad51-napanory у человека, XRCC2, особенно в его N-терминальной части (Рис. 13А).

Сравнение с аминокислотной последовательности S. pombe Rhp51 показывает, что белок R/pl структурно отличен, но при этом сохраняет ряд консервативных остатков. Попарное сравнение белковых последовательностей показывает, что Rlpl имеет 28% идентичность и 44% сходность с белком человека XRCC2, и в меньшей степени гомологичен с S. pombe Rhp51 (22% идентичности и 38% сходства) и с Rhp55 (20% идентичности и 34% сходства). Таким образом, Rlpl может представлять третий паралог S. pombe Rad51. Сравнительный и молекулярный филогенетический анализы с использованием программы ClustalX версии 1.81, также показывают наиболее близкое сходство между белками Rlpl и XRCC2 (Рис.13Б). Анализ последовательности белка Rlpl обнаружил присутствие Walker «А» бокса (GxxxxGKT/S), однако, остался не определенным Walker «В» бокс, как и у XRCC2 человека. В настоящее время мы не знаем, обладает ли Rlpl АТФ-гидролизной активностью и важна ли эта активность для его функции. Комплекс hXRCC2-RAD51D обладает ДНК-стимулирующей АТФ-азной активностью. Все эти данные могут указывать на то, что как в дрожжах, так и в позвоночных существует функциональная дивергенция среди субъединиц гетеромерных комплексов паралогов с только одной субъединицей, сохраняющей АТФ-связывающую функцию. Подобно XRCC2, белок Rlpl также может быть вовлечен в такой ассиметричный комплекс в качестве партнера с неактивным АТФ-связывающим сайтом. В скринниге белков, взаимодействующих с Rlpl были выделены белки нового комплекса, Swsl и Rdll (Rusell et.al., 2006). Rdll является еще одним Rad51 паралогом в клетках S. pombe с гомологией к Rad51D у человека. Белок S. pombe Rdll характеризуется лишь одним мотивом связывания и гидролиза АТФ, Walker "В". В комплексе Rlpl-Rdll делящихся дрожжей функциональная АТФ-азная активность, по-видимому, также зависит от индивидуального вклада Walker "А" и Walker "В" мотивов отдельных ее субъединиц.

HaXRCC2

SpRall

RecA

HsXRCC2

SpRall

RecA

i------MCSSFHHBEEGT^LLA------RLEERSSLKri

1 --MNAAEWVgELKRKHjJJsSFK-----EQKELVYDDq

l maidenkqkelaaEL^iEKQFGKGSIMRLEEDRSMD

62 TERCIgPKREGGLEVEflgFIDTDYHFDMlJ

63 ASNVLgRSg----QElSjIVSSEWBwSIKSBTEtiBHES

81 IEAAQREGK----TCAFIDAEHALBPIYA0KLGVDID4

FADE--------DS

-----------g

istgslsldialgagElpH

iRGVSjgTCKCNCAVKLE^STVHLQNgAREDpTDB

--TG0QALEICD0LARS|£AVD

I—-Epd-

HSXRCC2

SpRall

RecA

HSXRCC2

SpRall

RecA

110 YCLGRFiflVY---------------BsSSTHlgbTLYBLE SME^HPSLClgllflSL,

139 N^NDVSOSSGETMLQFPEHEPQHEBNREMECffYEE№STVY№KFWEDAER: 145 D®AALTPKAEIEG-------@IGD SHMGLAARM M§jQAMRKLAGN LKQSN it? ■

163---ЕЕ SVNlflEgTLRKgs------QgLEKL VND YEbVPFA TTQKlMQEAS SS---SE£> PS HASBtJgJVD IDY -

219 lriwkeaR^mhedfi^nktefneaEfdassBrlgc®mdglsSfywqlrlergytqvyad^

210 TTGENAlSFYAEvRLDIRRIGAVKEGENWG@ElGVKVVKNKIAAPfiSQAEFQILY®GINFYGE|iVELGVKEKLIEKAG

HsXRCC2

SpRall

RecA

230 HgQQLVg-----

2 99 ijSLLNNEQ----

2 90 HSysykgekigqckanatawiCdnpetakeiekkvi

RMFF SQQD DgQS-SgQFSLV S№ !LPIQCgRFR£ERRA{5ARFYX£l« F^LI

iKSNSLKKHEFIlg-SSG-vgFC-----------

V^klgeCJFYISSK£VQTK№MASPYSQQEMEKV 3enpnsEpdG®dds@gva[5tnedf--------

~SpRhp55 -Rlp1

-ХГСС2 -RecA

-hRad 510

-hRad5lB

-ScRad51

-SpRhpSI

-hRadSI

~SpRhpS7 -ScRad57

—ХгссЭ -hRadSlD

Рис.13. Сравнение аминокислотных последовательностей S. pombe Rlpl с Rhp51 делящихся дрожжей и XRCC2 человека, и связь Rlplp с другими RecA-подобными белками. (А) Черные и серые тени указывают на идентичные и сходные аминокислотные остатки, соответственно. (Б) Дендрограмма, показывающая связь между эукариотическими RecA-подобными белками, была получена с помощью программы ClustalX. Sp, S. pombe; Sc, S. cerevisiae, Hs, Homo sapiens.

rlpl+ является геном репарации повреждений ДНК, действующим в одном пути с rhp51+, rhp54* и rhpSSf.

Для того чтобы проверить наше предположение, что ген rlpl+ вовлечен в репарацию повреждений ДНК, была сконструирована делеция гена. Нуль-мутант оказался жизнеспособным в гаплоидных клетках, указывая на то, что ген rlpl+ не является существенным для митотического роста. Мутант rlpl показывает умеренную чувствительность

к ММС и у-лучам, но не чувствителен к УФ-свету и камптотецину (Рис. 14А,Б и Рис.15). Клеточная линия хомячка ¡'га/, как и клетки цыпленка ОТ40, с мутациями в гене ХИСС2 (гомолог гена г1р1* в клетках позвоночных), также показывают умеренную чувствительность к у-лучам. Однако, в отличие от клеток /пуУ, которые экстремально чувствительны к агентам, вызывающим поперечные сшивки ДНК (10-60 кратное), мутант £ ротЬе г1р! не чувствителен к митомицину С, хотя высокая чувствительность к ММС у мутантов по ЯА051 паралогам в клетках делящихся дрожжей (Рис. 14В) остается высокой. Таким образом, несмотря на гомологию Юр1 с ХЛСС2, дрожжевой белок не играет какой-либо роли в репарации поперечных сшивок в 51. ротЬе, в отличие от ХЯСС2 в клетках животных. Это указывает на то, что Я1р1 не является функциональным двойником ХЯСС2 человека в клетках делящихся дрожжей в отношении репарации поперечных сшивок ДНК, а скорее является паралогом Яас!51, выполняющим сходные с ним функции в репарации двуцепочечных разрывов ДНК и имеющим общего предка с ХЯСС2. Шр 1 функционирует в том же пути репарации ДНК, что и гИр51*, г/гр54+, гНр55+ и гай22* в клетках делящихся дрожжей (Рис.14Г).

23*С

30"С

23'С

ЗО'С

23*С

ф 1 ди ки й ти п

»1 и 111В плов 11111 I ж ЖЖа ГТТж!

• «б*

• • • • • • *

без ММС

О 005% ММС

0 0075% ММС

беэМС 50<«д/;ЛМС

15 эо 45 бе 35

п 0.5 ММв (шп)

ф 1 гас/22

гас/22 [I ф 1 Фр5 5 [ | ф 1 гЬ р51 гЬр55 [I Фр51 [I ф 1

I -'

> • *т *

>• »» * 1-\ т »-* * 14 1® •• *"*■-»•••V

дикийтип[ШЗзнн

• э » . . » + *

® * * ,

• „ © в» 4

0.0002% ММС 0.001%ММС 0.0075% ММС

Рис. 14. Чувствительность к ММС и митомицину С (МС), и эпистатический анализ гена Нр1+. (А) Тест на выживаемость мутанта г1р! к ММС при двух различных температурах (30°С и 23°С). (Б)

Выживаемость мутанта г1р1 в условиях временного ограничения действия ММС. (В) Тест на чувствительность к митомицину С, вызывающему поперечные сшивки ДНК. (Г) Эпистатический анализ гена г1р1* в репарации ММС-индуцированных повреждений ДНК.

гамма-лучи доза (ву)

Рис.15. Эпистатический анализ гена Нр1+ в репарации повреждений ДНК, индуцированных у - лучами. ■, дикий тип; о, г/р/; Д, гИр51\ о, гАр55; А, г!р1 гкр51\ Пр1 гИр55. Все кривые выживаемости были определены при 30°С.

гЬр55

50 100

УФ (.)/т2>

гЬр55 гЬр51 г1р1 щЛ

Рис.16. Тест на чувствительность мутанта Нр1 к агентам, затрудняющим репликации ДНК. (Б) Дроп-тест на чувствительность к 10 цМ СРТ с использованием 5-кратных последовательных разведений клеточных культур. (А) Кривые УФ выживаемости клеток дикого типа, г1р1А и гЬр55А.

В отличие от мутантов по другим паралогам ЯасШ, как сегеУ151'ае (гас155, гас!57), так и 51. ротЬе (гИр55, гИр57), мутант Нр1 не чувствителен к УФ или камптотецину, ингибитору топоизомеразы I (Рис.16), не участвует в механизме переключении типа спаривания. Более того, двойной мутант га<12 г1р1 жизнеспособен, в отличие от двойных мутантов гас12 с мутациями в генах семейства ротЬе Яас151. Также, в отличие от мутантов по другим митотическим ЛесА/КасШ-подобным генам £ ротЬе, делеция Нр1 не приводит к клеточной элонгации и ядерной аберрации. По-видимому, белок Юр1 не вовлечен в репарацию

©в*»« © о «•* х

0 в •• Г

® © •» * * .

69*9 V

без СРТ

10 цМ СРТ

спонтанных или индуцированных повреждений при спасении репликации гомологичной рекомбинацией, но Rlpl несет функцию в репарации повреждений, индуцированных ионизирующей радиацией и ММС, и действуют в том же пути, что и другие гены рекомбинационной репарации. Так как мутант rlpl чувствителен только к высоким дозам ММС, Rlpl может функционировать в репарации двуцепочечных разрывов, либо индуцированных непосредственно ионизирующей радиацией, либо косвенно, при действии ферментов эксцизии оснований на первичные повреждения, образованные при действии ММС. Однако нельзя исключить того, что Rlpl может участвовать в репарации определенных повреждений, отличных от двуцепочечных разрывов ДНК, возникающих при действии ионизирующей радиации и ММС.

Спонтанная митотическая внутрихромосомная и мейотическая рекомбинации в мутанте rlpl.

Ряд мутантов по генам S. pombe RAD52 группы показывают отличный от клеток дикого типа фенотип для внутрихромосомной митотической рекомбинации. При использовании соответствующих тестов было обнаружено, что мутант rad50 показывает сильное уменьшение в сестринской хроматидной рекомбинации, в то время как rtill показывал умеренный, а rhpSl и rhp54 - сильный гипер-рекомбинационный фенотип. Бьш определен уровень спонтанной митотической рекомбинации в мутанте rlpl измерением частоты сестринской хроматидной рекомбинации. Для этого была использована конструкция с маркером ига', фланкированном прямыми повторами adefr гетероаллелей (ade6-469 и ade6-M375) в гаплоидном штамме. Восстановление ade+ рекомбинантов является результатом гомологичной рекомбинации между ade аллелями одной сестринской хроматиды (внутри-сестринская) или между аллелями на различных сестринских хроматидах (межсестринская). Было обнаружено снижение частоты сестринской хроматидной рекомбинации в 2.2 раза в мутанте rlpl, что соответствовало 2.3 кратному уменьшению рекомбинации (метод медианы Lea-Coulson). Этот результат показывает, что rlpl* играет роль в гомологичной рекомбинации между сестринскими хроматидами в вегетативных клетках.

Какова же потенциальная роль идентифицированного нами белка Rlpl и образуемого им комплекса с Swsl и Rdll в репарации двуцепочечных разрывов ДНК в клетках делящихся дрожжей? Мы предполагаем, что гетеротримерный комплекс белков участвует на предсинаптической стадии репарационного процесса, на стадии предшествующей действию комплекса Rhp55-Rhp57. В клетках делящихся дрожжей потеря одной из субъединиц комплекса Rlpl-Swsl-Rdll приводит к снижению числа Rad22 (гомолога Rad52 в клетках S. cerevisiae и

человека) фокусов (Russell et.al. 2006). Таким образом, роль комплекса может сводиться к мобилизации Rad22 к сайтам повреждений (Рис.20).

Sfrl - высококопийный супрессор нарушения репарации клеток, лишенных S. pombe RadSl паралогов, Rhp55 (Rad55Sp) и Rhp57 (Rad57Sp).

С целью поиска новых генов, участвующих в рекомбинационной репарации был проведен скрининг геномной библиотеки S. pombe на предмет обнаружения высоко-копийных супрессоров ММС-чувствительности клеток с делецией S. pombe RadSl паралога, гена rhpSS*. Помимо генов rhp51* и rhp55+ в результате скрининга были выявлены несколько дополнительных фрагментов геномной ДНК. Среди них наиболее сильной супрессорной активностью обладала вставка ДНК размером 3.4 т.п.н. Клонирование рестрикционных фрагментов, составляющих вставку ДНК, показанное на Рис.17, позволило идентифицировать минимальный участок ДНК (Kprtl фрагмент размером 1475 п.н.), обладающий супрессорной активностью. Анализ Крп! фрагмента выявил потенциальную открытую рамку считывания, способную кодировать белок размером 299 аминокислот. Новый ген был назван dds20* (DNA damage sensitive изолят 20), впоследствии переименованный в sfrl*, согласно новой классификации. Клонирование кДНК копии sfrl* подтвердило, что ген не имеет интронов. Интересно, что клонирование кДНК обнаружило антисмысловую РНК, транскрибируемую в противоположном направлении и перекрывающуюся с мРНК sfrl* (Рис.17). Эта РНК имеет два интрона. Ген sfrl* соответствует открытой рамке считывания SPBC28F2.07 (хромосома II), идентифицированной в процессе секвенирования генома S. pombe.

Не известная РНК

> _

sfrV

Xhoi

Крп I

Рис.17. Схема делеционного анализа, первоначально клонированного геномного фрагмента ДНК с целью определения минимальной области, обладающей эффектом супрессии. Идентификация открытой рамки считывания фГ как одного из двух противоположно перекрывающихся транскриптов.

I А Б В

}Ки*р

}5}л>р }53л»р:а»1*

Время в ММС (мин) Доза у лучей (Оу) о.соз% Безммс

ммс

Рис.18. фГ - высоко-копийный супрессор репарационных дефектов делеции гена Лр55*, кодирующего ; Rad51 паралог в ротЬе. (А) Высокая копийность частично супрессирует чувствительность гИр55А к ММС. Тест на чувствительность к ММС штаммов дикого типа и гЬр55А, несущих вектор или вектор с геном -^/г-Г; (Б) Высокая копийность супрессирует чувствительность Лр55А к у-лучам. (В) Среди мутантов &4.Ш2 группы, высоко-копийный 5/гГ специфически супрессирует только чувствительность делеций по паралогам, гИр55А и гЪр57А к ММС.

вМ является членом пути рекомбинационной репарации ДНК, который действует в новом Кад51-зависимом пути, параллельно Rad51 паралогам НЬр55-ЯЬр57 и К1р1.

Эпистатический анализ (Рис.19) с использованием у-лучей и ММС показывает, что белок 8&1 функционирует в

Rad51Sp

-зависимом пути рекомбинационной репарации. В то же время был найден взаимный синергизм между Rad51Sp паралогами (гкр55+, гИр57+ и г1р1+) и (Рис.19А, Б, В и Д). Так как все три Rad51 паралога участвуют в Rad51 ^-зависимой рекомбинационной репарации, мы интерпретируем эти данные как свидетельство двух Rad518р-зависимых ветвей рекомбинации/репарации: одна контролируется Rad51 паралогами, а другая - | белком (Рис.20). Когда обе ветви элиминированы (мутант в]г1 гИр55), клетки становятся чувствительными к повреждению ДНК, как и клетки мутанта гасША (Рис. 19Б).

В соответствии с нашей моделью двух путей, 8&1-8\У15 действует до функции И1р51, поскольку многокопийность .у/г/ + не может компенсировать нарушения в репарации у мутантов по генам нижестоящих факторов, таких как гИр51 и гкр54 (Рис.18). Комплементационный анализ показывает, что два медиаторных пути в клетках ротЬе перекрываются друг с другом. Повышенная экспрессия я/г1+ частично супрессирует дефекты в репарации и клеточной пролиферации у мутантов гИр55А и гИр57А. Хотя два медиаторных пути рекомбинационной репарации частично перекрываются и степень нарушения репарации ДНК в мутантах и гИр55А сходна, некоторые фенотипы соответствующих мутантов значительно отличаются. В отличие от мутанта гИр55А, который имеет медленный рост, удлиненность клеток, аберантную морфологию ядерного материала, делеция я/г!+ не вызывает видимых эффектов на клеточную пролиферацию/репликацию. Более того, мутант ф1А га(12А жизнеспособен в отличие от гИр55А |

гас12А и всех других комбинаций гас12А с известными в настоящее время мутациями по генам ЯАР52 группы 5. ротЬе.

0.1 -1-.-.-1

О 20 40 60 80

Время в ММС (мин)

Ш<11

м» -I-■-,-1—--.

а 15 30 45 Ш 78

Время в ММС (мин)

Е 100

Ыг1 ф1

158 Зое 450

Доза т-лучей (ву)

■Л-_=£

А У*

леи

• Лр51 □ вМгЬр54

а »

Доза -у-пумей (<3у)

О 10

Рис.19. Эпистатический анализ мутанта ф1А при репарации повреждений, индуцируемых ММС и у-лучами. (А) мутант 5/г/ проявляет повышенную чувствительность к ММС. Обозначения: треугольники -дикий тип, кружки - ф1, и квадраты - гИр55. (Б) Синергизм между $/г1 и гкр55 в репарации ММС-индуцированных повреждений, (В) и Ыр1 аддитивно повышают чувствительность клеток к ММС.

(Г) я/г1 эпистатичен гИр51 и гИр54 в репарации ММС-повреждений. (Д) Эпистатический анализ мутантов гАр55 и Нр1 на чувствительность к у-лучам (Е). Выживаемость двойных мутантов гИр51 э/г1 и гИр54з/г1 при облучении у-лучами.

Б у, ММС, УФ

Мутации Агенты Эпистатический анализ

„ Rad50

и л

хо1

тр55 гас150 у, ММС

гЬр55 ехо1 ММС

габ50 ММС

5/г7 ехо1 у, ММС

г/)р55 у, ММС

гас150 ехо1 у, ММС

син.а син.ь син.ь син.ь син.с син.а

„

РНр55 $

КсИ1

Rad22

гас150 гай51 у, ММС эпист.а

оСгГ га с/5 7 у, ММС, УФ эпист.»« гЬр55 гас!51 у, ММС, УФ эпист.'

Я11р57

Я{ас151

¿X

Репарация ДНК УФ толерантность

Рис.20. Модель путей рекомбинационной репарации ДНК в митотических клетках 5. ротЬе. (А) Эпистатический анализ генов репарации ЯЛВ52 группы. (Б) Схема двух медиаторных путей. После повреждения ДНК, приводящего к двуцепочечному разрыву, концы ДНК процессируются нуклеазными активностями через частично перекрываемые пути, комплексом 11ас150/Кас132/КЪ51 и Ехо1. Лас151 нуклеопротеиновый филамент собирается на 3'-выступающих одно-цепочечных концах ДНК замещением КРА через два параллельных механизма, с участием Ыа<151 паралогов и Инвазия

цепи инициируется Лас151 филаментом, и дальнейший процессинг приводит либо к репарации ДНК, либо к толерантности УФ повреждений ДНК.

Это говорит о том, что 5&1 не участвует непосредственно в репарации и возобновлении функции поврежденных репликационных вилок, когда реплисома доходит до надреза ДНК, образуемого в клетках гас12А из-за нелигированных фрагментов Оказаки. Несмотря на отсутствие очевидных дефектов в репликации, мутант ф1 проявляет умеренную чувствительность к высоким дозам гидроксимочевины и камптотецина, которые блокируют репликацию, истощая пул дезоксинуклеотидтрифосфатов (зависшие репликационные вилки) и ингибируя топоизомеразу I (оборванные вилки репликации), соответственно. Когда репарация двуцепочечных разрывов в течение репликации происходит в условиях делеции гИр55, происходит запуск чекпойнта 8-фазы (что видно по клеточной элонгации) и повышенная экспрессия Эй"! может частично «спасать» этот дефект. Вместе взятые эти данные говорят о

минорной роли 8Й1 в восстановлении репликационных вилок после их остановки или коллапса. Остается не ясным, почему необходимы два медиаторных пути для эффективной сборки Яа(151 филамента. Одно из возможных объяснений, что могут существовать различия в структурных особенностях Яа(151 филамента, а также в способе его сборки, например во время репликации (филамент образуется на брешах в одноцепочечной ДНК), или во время репарации разрывов в фазе Ог (филамент образуется на концах, процессированных разрывов ДНК). Наши данные свидетельствуют, что в то время как гегеродимер Ш1р55-Ю1р57 играет важную роль при репликации ДНК, основная функция белка БМ лежит за пределами 8-фазы.

Белок 5. ротЬе 8Гг1 взаимодействует с рекомбиназой Ш1р51.

В дрожжах паралоги 51. сегемЫае Кас151, Кас!55-Ка<157 и Я. ротЪе ИЬр51, Ш1р55-Ю1р57, являются медиаторами образования нуклеопротеинового 1?.ас151 филамента. Было показано, что в & ротЬе существует параллельный Лас151 -зависимый путь сборки нуклеопротеинового филамента и идентифицирован новый ген .ф], контролирующий этот путь. Так как 8&1 действует в Яас151 -зависимом пути репарации двуцепочечных разрывов ДНК, мы проверили, используя количественный двугибридный анализ в дрожжах, взаимодействует ли 8&1 с другими белками, включая Яа(151, вовлеченными в рекомбинационную репарацию. Результаты этого анализа, представленные на Рис.21А, показывают, что БМ строго взаимодействует с белком Яа<151. Никаких значимых взаимодействий с другими членами ЯАй52 группы, Ш1р54, Юф55 и ИасШ, обнаружено не было. Мейотическая рекомбинация в дрожжах использует функции двух структурно-родственных КесА-подобных белков. Среди них, Яа<151 и Е)тс1 катализируют АТФ - зависимые реакции обмена цепи с гомологичной дуплексной ДНК и образуют нуклеопротеиновые филаменты в мейозе. Поскольку функция гена 8&1 необходима не только для Ла<151, но и для Отс1-зависимого пути мейотической рекомбинации, мы провели анализ взаимодействий между белками Б.ротЪе ЯМ и Отс1, используя дрожжевую двугибридную систему. Был сконструирован М-терминально слитый ген полноразмерного белка 8&1 на ОВО и АО соответствующих векторах и определены попарные взаимодействия между этими белками. Двугибридный анализ показал взаимодействие белков ЭМ и Отс1. Таким образом, как и в случае с ЯЬр51, так с Отс1, белок 8&1 образует временные связи с обеими рекомбииазами делящихся дрожжей.

Для подтверждения результатов двугибридного анализа взаимодействия БМ с ЯЬр51, был проведен эксперимент по иммунопреципитации белков. Плазмида рЕ8Р1, экспрессирующая 08Т-ЯЬр51 под контролем шм промотора, была введена в штаммы я/г!-Мус 13 и л/г/, и белок 8й:1-Мус13 был иммунопреципитирован с использованием антител против Мус. Как показано на Рис.21Б (дорожка 2), 08Т-ЯЬр51 иммунопреципитируется вместе с гибридным белком 8&132

Мус13. Контрольные иммунопреципитации были сделаны для проверки специфичности использованных антител (дорожка 3) и уверенности, что белок 08Т-11ас151 не просто преципитировал, или неспецифически связался с шариками Белок О-Сефарозы (дорожка 1). Наши данные в совокупности показывают сильное взаимодействие между белками Бй! и ЯЬр51.

DBD АО "/i-Гал ьСтепень

активность увелич.

Sfr! 4.8 1.0

Rad51 2143.7 448.5

s1r1'-Myc13: + +

pGST-rad5V: + +

анти-GST анти-Мус

Рис.21. Белок Sfrl взаимодействует с Rhp51 in vivo. (А) Дрожжевой двугибридный анализ взаимодействия Sfrl. ьСтепень увеличения определялась путем выражения специфической активности штаммов, содержащих обе DBD и AD плазмиды по отношению к специфическим активностям штаммов, имеющих только DBD плазмиду и пустой AD вектор. (Б) Белок Sfrl взаимодействует с Rhp51. GST-Rhp51 (дорожки 1 и 2) или только GST (дорожка 3) были экспрессированы в клетках с Sfrl (дорожка 1) или с Sfrl-Мус 13 (дорожки 2 и 3). Анти-Мус иммунопреципитаты были проанализированы с помощью анти-GST иммуноблоттинга.

Образование фокусов Rhp51, индуцированных ионизирующей радиацией, уменьшено в мутанте sfrl А

Исследования, выполненные на дрожжах и позвоночных, показывают, что Rad51-

паралоги, помогают белку Rad51 в образовании нуклеопротеинового филамента на

поврежденной ДНК, что можно идентифицировать цитологически m vivo в виде репарационных

фокусов. В клетках S. pombe Rhp5] -фокусы, индуцированные ионизирующей радиацией,

обнаруживаются в клетках дикого типа, но их число в мутанте rhp55A было уменьшенным.

Поскольку Sfrl оперирует в Rad51 ^-зависимом пути репарации, параллельном Rhp55-Rhp57,

мы тестировали образование Rhp51-фокусов после облучения клеток гамма-лучами.

Хроматиновые спреды были получены из гаплоидных штаммов, экспрессирующих слитые

белки GST-Rhp51 и Sfrl-Мус. Плазмида pESPl, экспрессирующая GST-Rhp51, была введена в

штаммы дикого типа, sfrlk и sfrl-Mycl3. Чтобы проверить, колоколизуются ли белки GST-

Rhp51 и Sfrl-Myc в S. pombe, были использованы моноклональные антитела против эпитопов GST и Мус. Мы наблюдали отдельные ядерные фокусы при иммуноокрашивании для GST-Rhp51 в клетках дикого типа (Рис.22А), sfrlA (Рис.22Б) и s/r J-Мус J 3 (Рис.22Г),а также фокусы при иммуноокрашивании Sfrl-Myc (Рис.22В). Окрашивание ДНК проводили с помощью DAPI. Таким образом, белки GST-Rhp51 и Sfrl-Myc экспрессируются в митотическом клеточном цикле и локализуются в ядерных фокусах. Распределение сигналов для GST-Rhp51 и Sfrl-Myc указывало на колоколизацию двух белков, что определялось перекрыванием фокусов (Рис.22Д).

А. дикий тип Б. sfrfA

Рис.22. Колокализация белков Ш1р51 и БМ на хроматиновых спредах.

Обработка клеток дикого типа и мутантных клеток гкр55Л и ф-1А ионизирующей радиацией приводило к сборке от 1 до 8 ЯЬр51 -фокусов на клетку в пределах 1 часа после облучения. Подсчет числа фокусов на клетку показал значительное увеличение числа клеток только с одним или двумя КЬр51 -фокусами для обоих мутантов, г!гр55А (72%) и я/г1А (64%), при сравнительном анализе с клетками дикого типа (32%) (Рис.23). Эти результаты позволяют предположить, что подобно ЯЬр55, белок ЭйЛ функционирует на ранних стадиях рекомбинационной репарации, участвуя в сборке ЯЬр51 -филамента.

Таким образом, в дополнение к способности взаимодействовать с белком КЬр51, функция обоих белков, 1?Ьр55 и 8<т1, как медиаторов двух параллельных механизмов сборки 1И1р51-нуклеопротеинового филамента, необходима и для эффективного образования ЯЬр51 -фокусов в клетках, облученных ионизирующей радиацией.

Клетки

12 34 567 8 Число Рас151 фокусов на клепс/

Рис.23. Распределение числа ЯЪр51 - репарационных фокусов в штамме дикого типа, а также в штаммах с делециями в генах 5. ротЬе ^^г/ и гИр55.

Синергизм во взаимодействии с мутантами гас/50 и ехо1, показывающими нарушения в процессинге двуцепочечных разрывов ДНК.

Как было сказано выше, что белок вШ оперирует на ранних стадиях репарации двуцепочечных разрывов ДНК в ЯЬр51-зависимом суб-пути, параллельным суб-пути, контролируемым ЯЬр51 паралогами (Югр55, Иф57), и обладает специфичной медиаторной ролью в сборке М1р51-нуклеопротеинового филамента, который, по-видимому, отличается от действия Яаё51 паралогов. Каё51 филамент формируется на одноцепочечной ДНК после процессинга двуцепочечного разрыва с помощью 5'-3' экзонуклеазных активностей. В клетках 5. сегеуише процессинг концов двуцепочечного разрыва зависит от двух частично перекрываемых механизмов: один определяется 5'-3' экзонуклеазной активностью комплекса

(Мге11/Яа(150/Хг82[№|81]) и другой - дополнительными экзонуклеазами, включающими 5'-3' экзонуклеазу Ехо1. Здесь мы определили связь между ЗШ-опосредованным суб-путем и путями процессинга двуцепочечных разрывов ДНК, действующими до сборки 11а(151 филамента. Эпистатический анализ в репарации ММС- и у-индуцированных повреждений с одиночными и двойными мутантами ф-1, ехо1 и гас150 представлен на Рис.24. Двойной мутант я/г] гас150 показал синергичное повышение ММС-чувствительности при сравнении с одиночными мутантами.

ММС (%)

Рис.24. Эпистатический анализ в/г1А с гас150А. ¿/г/Д синергичен с делеционным мутантом га/50, который вовлечен в процессинг разрывов ДНК при рекомбинации и репарации ДНК. Показаны кривые ММС выживаемости для ф1А, га<150А и двойного мутанта. Все кривые выживаемости определены при 30°С.

Эпистатический анализ 5/г/ с мутантами по ДНК-геликазам rqlll и

Делеция генов гкр55 или гИр57, как было показано выше, супрессирует чувствительность клеток гдИ1А к ДНК-повреждающим агентам. является ДНК геликазой с ролью в репарации, рекомбинации ДНК и толерантности к УФ повреждениям ДНК. Поскольку вй] оперирует в пути, который параллелен субпути, контролируемом Яаё51 паралогами, Ю1р55 и ЯЬр57, мы изучили генетическую связь между мутантами г^АУД и ¡/г]А в экспериментах по эпистатическому анализу. Обработка клеток двойного мутанта гд1г]А $/г]А с ММС указывало на частичную супрессию репарационного дефекта у мутанта гдИ1 А (Рис.25). Сходный эффект был получен, когда двойной мутант щЫА ф1 был подвержен действию УФ и гамма-лучей (Рис.25). Таким образом, эти данные показывают, что ЛцЫ действует после Эй"! на стадии разрешения рекомбинационных интермедиатов, возникающих в репарации УФ повреждений ДНК. В отсутствие И^Ы рекомбинационные интермедиа™ не могут быть процессированы, что приводит к значительной летальности мутанта гдк1А после обработки с ДНК повреждающими агентами. В случае, когда рекомбинация снижена (клетки ф1А гцИ/А), процессинг интермедиатов может происходить с участием других механизмов. Сходный результат был получен с двойным мутантом гкр55А гцИ1А. В случае клеток ф1А щЫА и гИр55А г^/г/Д летальные рекомбинационные интермедиа™ либо не образуются, либо процессируются альтернативным рекомбинационным механизмом.

Делеция гена £ ротЬе ¡гя2, кодирующего ДНК-геликазу в делящихся дрожжах,

приводит к умеренной чувствительности к действию УФ и ММС (Рис.25). Эпистатический

анализ показал, что двойной мутант в/г1 Д оказался более чувствительным к ДНК

повреждающему действию ММС и УФ, чем одиночные мутанты (Рис.25). Это указывало на то, что Эй-1 и 8гз2 участвуют в различных путях репарации ММС и УФ повреждений ДНК.

время в ММС (мин) доза уф (J/^!)

Рис.25. Эпистатический анализ sfrIA с мутантами по ДНК геликазам. sfrlA показал частичную супрессию чувствительности клеток rqhlA к ММС. (А), УФ - свет (Б), and у-лучи (В). Синергизм для sfrlA и srs2A при клеточной выживаемости после обработки ММС (Г) и УФ (Д). Все кривые выживаемости были определены при 30°С.

rqhU

ISO ЭЕО 4SI 600 7а

доза/лучей (Gy)

2D 40 60

доза УФ (J/m2)

Я) <0 60

время в ММС (мин)

rqhU '

Взаимодействие Sfrl с белками S. pombe Radl8 и Rad60

Нами обнаружен эпистатическое взаимодействие sfrl А с точковыми мутациями в Smc гене radl8 и radöO, дополнительных компонентах RAD52 пути в S. pombe (Рис. 26А). В то время как повышенная экспрессия sfrl частично уменьшает нарушения в репарации ММС-индуцированных повреждений и в низкой эффективности высева у гипоморфного мутанта rad60-l (Рис.26 Б и В), репарационное нарушение у мутанта radl8-na74 не могло быть исправленным. Для RadöO была показана функция в репарации поврежденных репликационных вилок посредством рекомбинации вместе с другими членами RAD52 группы, включая Rad51 и Rhp55. Более того, RadöO физически взаимодействует с функционально родственными белками комплекса SMC5/Ö. Первичная роль комплекса Smc5/6 может состоять в связывании дуплексов ДНК вместе с коллапсированными репликационными вилками. Наши выводы о том, что повышенная экспрессия Sfrl может приводить к более эффективному образованию Rad51-

филамента, находятся в соответствии с результатами in vitro (Iwasaki et.al., 2005). Эта стимуляция может быть связана с повышенной вероятностью инвазии цепи в гомологичный дуплекс ДНК, когда нарушается пространственное расположение дуплексов мутацией rad60-l. Остается не ясным, приводит ли повышенная экспрессия гетеродимера Rhp55-Rhp57 к супрессии дефектов мутанта rad60-l.

ID » 3D в 50

доза улучей (Gy)

wt + pUR19

0Л025

ММС (%)

,,, эффективность Штамм _Т,_„„, «л высева (%)

дикий тип pUR19 100

гаабСМ 7.5

pUR19

га<№-1 pUR19:siri 36.2

Рис.26. Взаимодействия sfrlД с мутантами radl8-na74 и rad60-l. (А) у-гау кривые выживаемости sfrlA, rad60-l, radl8-na74 и двойных мутантов. Делеция sfrl эпистатична мутациям rad60-l и radI8-na74. (Б) Высокий уровень экспрессии sfrl* частично супрессировал ММС чувствительность rad60-l. Количественные тесты на выживаемость были проведены в условиях длительной выдержки с ММС. Штамм rad60-l был трансформирован пустым вектором или вектором с pURI9:~jfrl*. (В) Повышенная экспрессия sfi-Г частично супрессировала низкую жизнеспособность гипоморфного мутанта rad60-l.

Sfrl участвует в Cdsl-независимом пути толерантности к УФ повреждениям ДНК.

В делящихся дрожжах повреждения ДНК приводят к каскаду сигнальной трансдукции через фосфорилирование белков (Рис. 28). Эти реакции инициируются чекпойнтной киназой Rad3. Как результат, активируются две киназы, Chkl и Cdsl, передающие сигнал для последующих эффекторов, действующих в контроле клеточного цикла, регуляции транскрипции, репликации и рекомбинации. Активация Chkl необходима для остановки клеточного цикла в фазе G2, тогда как активация Cdsl происходит только в S-фазе. Пиримидиновые димеры, генерированные действием УФ света в S-фазе представляют собой препятствие для репликационного аппарата, приводя к остановке репликационной вилки или ее коллапсу. Несмотря на два мажорных механизма репарации УФ повреждений ДНК, НЭР и UVDE, в делящихся дрожжах функционирует путь толерантности, который позволяет выживанию клеток с не репарированным повреждением ДНК. Cds 1 -зависимый путь толерантности к УФ повреждениям ДНК включает функции, по крайней мере, 6 генов: rqhl, mus&l, rad51, rhp54, radl8 и rad22. Проведенный нами эпистатический анализ УФ чувствительности позволяет предположить, что

Б Гг] оперирует в Rad51- зависимом пути, параллельном Яаё51 паралогам (Рис.27 А и Г). Анализ показал, что 8й-1 также вовлечен в путь толерантности к УФ повреждениям ДНК, поскольку $/г1А увеличивал чувтствительность двойного мутанта иуеУД гай13А, который был полностью не способным для репарации УФ-повреждений ДНК (Рис.27 Д). Однако, БМ вносил свой вклад в толерантность к УФ повреждениям, показывая синергизм с Сёэ!- зависимым механизмом толерантности к УФ повреждениям (Рис.27 Е). Эти данные и синергизм с другими мутантами по чекпойнтным киназам, гайЗА и скк1А, дают основание предположить существование уникального чекпойнт- независимой функции для в толерантности к УФ-повреждениям ДНК. Таким образом, представленные данные показывают существование двух Rad51-зависимых путей толерантности к УФ-повреждениям: один - Rad51 паралого-зависимый путь, активируемый чекпойнтом Б- фазы, и другой, БМ-опосредованный и, по-видимому, перманентно активный.

БГг1 не вовлечена в поддержание целостности хромосом и митотическую рекомбинацию.

Повышенные частоты потери минихромосом и фенотипы в митотической рекомбинации являются характерными особенностями большинства рекомбинационных генов. Нами проведены эксперименты на мутанте я/г/Д по определению частоты потери хромосомы в флуктуационном тесте. Было обнаружено, что у мутанта я/г!А уровень потери хромосом сравним с клетками дикого типа, тогда как частота потери хромосомы у г1гр55А превышала в 4140 раз частоты потери хромосом в клетках дикого типа. Значения частоты потери хромосомы могут быть транслированы в случае г1гр55А в 2300-кратное увеличение потери хромосомы на клеточное деление (метод медианы). Была также определена частота рекомбинации между гомологами. Уровень рекомбинации между гомологами в клетках ф!А была не отличимой от клеток дикого типа. В отличие от клеток э/г1А, клетки г!гр55А показали гипер-рекомбинационный фенотип: 17-кратное превышение частоты митотического кроссинговера на 1 х10б высеянных клеток. Это увеличение является статистически значимым и может быть транслировано в 11-кратное увеличение уровня рекомбинации на клеточное деление (метод медианы). Частота внутрихромосмной рекомбинации была слегка повышенной (1.2-кратное, результат статистически не достоверен) в з/г1А. В отличие от ф1А, в клетках гЬр55А частота внутрихромосомной рекомбинации была повышена в 4.1-раза, которая может быть транслирована в 3.2-кратное повышение частоты рекомбинации. Эти результаты показывают, что Бй"! не обладает функцией в исследованных типах гомологичной в вегетативных клетках.

в г

Рис.27. Анализ ответа на УФ и ММС повреждения ДНК в мутанте я/г1А. Все кривые выживаемости были определены при 30°С или, когда указано, при 20°С. (А и Б) Холодо-чувствительность фенотипа у мутанта ф1А при действии УФ света и ММС. (В) Эпистатический анализ между 5/г/Д и делециями генов ротЬе с функциями в НЭР и Ц\Т)Е пути репарации УФ - повреждений ДНК, и в гИр55А. (Г) Эпистатический анализ между ¡/г1А и делециями генов рекомбинационной репарации гЬр51 и гкр54. (Д) Синергизм между я/г]А и ШК-ЦУЛЕ двойного мутанта. (Е) Синергизм для ф!А и сск1А, мутантов по генам толерантности к УФ повреждениям ДНК. Все мутанты, использованные для экспериментов в (В-Е) имели делеции в соответствующих генах.

Мейотическая рекомбинация уменьшена в мутанте Д.

Мутант ф1А был проверен на мейоз - специфичные фенотипы. Обнаружено, что жизнеспособность спор в ф1А скрещивании была практически той же, что и в скрещивании клеток дикого типа, 88% и 92%, соответственно. Эффективность споруляции была слегка уменьшенной: 32% в клетках дикого типа и 25% у мутанта sfrIA. В •$//•/Д скрещиваниях выявлено снижение в частоте внутригенной рекомбинации, от 5 до 20-раз, в зависимости от использованных аллелей, и в межгенной рекомбинации от 15 до 19 раз, в зависимости от использованных интервалов. Таким образом, функция Бй:1 необходима для мейотической рекомбинации в делящихся дрожжах.

Мутант гИр55А характеризуется более серьезными нарушениями в мейозе. Повышенная экспрессия полностью супрессировала дефект делеции гИр55+ в эффективности

споруляции, частично «спасала» дефект в жизнеспособности спор, но не была способной супрессировать сниженную эффективность внутригенной и межгенной рекомбинации у мутанта гИр55А. Это может говорить о том, что КЬр55 и ЭГг1 имеют различные функции в мейотической рекомбинации.

УФ-ипеточный ответ в S pombeJ

[Толерантность к УФ-повреждению ДНК Рис.28. Схематичное изображение клеточного ответа в S. pombe на УФ - повреждения ДНК.

Sfrl является ядерным белком.

Для определения клеточной локализации белка Sfrl был сконструирован слитой ген sfrl с Мус-эпитопом. Была проведена иммунофлуоресценция в митотически делящихся клетках с использованием антител к Мус. Флуоресцентный анализ показал присутствие белка в нуклеусе митотических клеток, локализованного с хромосомной ДНК при окрашивании DAPI. Анализ показал присутствие Sfrl-Mycl3 в количествах приблизительно равных 30-50 фокусам на нуклеус. Эти результаты показывают, что Sfrl является ядерным белком.

Идентификация нового мотива в белке Sfrl и его анализ.

Белок Sfrl был идентифицирован как высококопийный супрессор нарушения репарации в клетках с делецией S. pombe Rad51 паралогов, генов rhp55 и rhp5 7. Было показано, что белок Sfrl в комплексе с белком Swi5, определяет новый путь сборки Каё51-нуклеопротеинового филамента параллельно действию Rad51 паралогов в S. pombe, Rhp55 и Rhp57. Гетеродимер Sfrl-Swi5 взаимодействует с Rad51 через Sfrl-субъединицу. Сравнение аминокислотной последовательности белка Sfrl через программу BLAST не выявило значительных гомологов в известных базах данных, за исключением С-терминальной части белка S. pombe Swi2 с ролью в

переключении типа спаривания. Этот анализ показал приблизительно 24% идентичность в аминокислотных последовательностей между С-терминальными частями обоих белков. Анализ аминокислотной последовательности Sfrl привел к обнаружению в С-концевой части белка coiled-coil домена (остатки аминокислот 178 - 236), что было предсказанно программой COILS (Рис.29). Другие известные мотивы не могли быть идентифицированы в Sfrl при использовании баз данных по мотивам и доменам.

strip

1 46 299

Swi2p I 1

1 490 719

Рис.29. Структура домена белка Sfrl и его связь с белком S.pombe Swi 2. Серым цветом помечена область гомологии между двумя белками. Черным цветом - coiled-coil домен (СС). Стрелками указана ориентация и число PSA повторов.

F107E in PSAI And F163E In PSA2

K108E in PSAI and K164E in PSA2

Sfrl PSAI 84 Sfrl PSA2 142 Swi2 PSA 54 S

Консенсус вторичной структуры

gSKKRAREAKtf Q TAS И<2 V A D T M 123

JLRT T P H S I KH- - Q K^THQBQQQH с L HQK S DP E I 179 К D 1-Одку|Зк M V HKM S V0K AQlQQgppgQyK ISRTRLTVSS S84

ccccccccc?hhhhhhhhhhhccccccccccccccccccc sfrl psai ccccccccccccc?hhh~hhhhhccccccccccccccccc sfrl psa2 cccccccccccchhhhhhbhccccccccc ? ?cceeeeecc Swi2 psa

h - alpha helix, с - random coil, «a - extended strand

Sfrl PSA2 Sae2 PSA

142 110

консенсус

вторичной структур«

SE рут SR KHTyQï.yg

cccccccccccc-c?hhhhhhhhccccccccccccccc cceeeeeeeeccccccchhhhhhccccch-ccchhhhh

h - alpha helix, с - random coil,

Sfrl PSA2 Sae2 PSA

extended strand

Рис.30. Сравнение PSA повторов белков S. pombe Sfrl и Swi2. Консенсус вторичной структуры PSA повторов предсказан алгоритмами программы Network Protein Sequence Analysis server (Pole Biolnformatique Lyonnais, Франция). Черным цветом показаны идентичные аминокислоты, серым цветом - сходные аминокислоты.

Нами были обнаружены два новых тандемных повтора приблизительно в 40 аминокислот длиной в районе предшествующему coiled-coil домену (Рис.29). Мы назвали этот новый повтор как PSA (pombe Sfrl associated). В белке Swi2 был обнаружен мотив, состоящий

лишь из одного повтора и соответствующий по месту локализации повтору PSA2 у белка Sfrl (Рис.29). Сравнение последовательностей повторов PSA с использованием програмы Clustal W2 и программ, анализирующих вторичные структуры белков (Network Protein Sequence Analysis) показало, что повторы PSA состоят из центрального а-спирального корового участка, фланкированного районами с высокой аминокислотной консервативностью (Рис.30). Поисковая программа TBLASTX выявила ряд белков с PSA повторами в других эукариотических организмах (Рис.31).

sfii-1 ai

Sfrl-2 142

Swi2 545

Sae2 89

CNBF2390-1 12a

CNBF2390-2 ig7

Slag-01708-1 73

Slag-01708-2 131

MG03S10 4 ggo

EAA36464 1 Q52

AN0810.2 853

HLP IRTHFS KKRARB|JK 11 X0LK¡

QEPvHsH— LRTTPHSlPjRQlc["" KDLiyP-gFKHVHKMS УЕЯАЦГ HKHTVOLPLVTMBPHR H|¡[R К I S 0SGQKRSLSQS ISeQ0ERvWKJ< TDSTLl^QAKWTPSHRS ЯКЦТ OOLF^TKlS RKRLRD VK STQF |üDlLSSSPSKASFVRkQrVK|

IIT T aJJJsPLRTK vprravdt ri MQLPGHAAKRRRVE LRh ATWRI MT S s iHhGKRRRLDQ0T ttHs[

JQT A0P <JV ДВТН SHCLHPKSDPEI ¡SKXSRIRLT vss HGLHHLSDLEDC

IviLtKnseitts ys DR0SAP SP S T MKLPLTPQHQHT |ASL KHSS DP ELV VAVAQSSSSFSA IHRTPPGDKPTD |l.0RPTP AVKDEAA

123 179 584 128 167 238 112 170 929

891

892

• -TPP-------

K-L-RPFKSPIR---S----

К LP

Рис.31. Сходство PSA последовательностей S. pombe Sfrl с PSA-подобными повторами в других белках у грибов. (А) для сравнения последовательностей были использованы программы Clustal W2 и Boxshade (Bioinformatics Group, ISREC). Идентичные остатки аминокислот окрашены черным цветом, сходные остатки аминокислот (Р, A, G, S и Т; Е, D, N и Q; V, I, L и М; F, W и Y; К, R и Н) — серым цветом. Звездочки указывают на высококонсервативные остатки аминокислот в последовательностях PSA 1 и 2 белка S. pombe Sfrl, важные для его функции. Сокращения: Sfrl-1, S. pombe Sfrl PSA1; Sfrl-2, S.pombe Sfrl PSA2; Swi2, S. pombe Swi2 PSA; Sae2, S. cerevisiae Sae2 PSA; CNBF2390-1, C. neoformans CNBF2390 PSA1; CNBF2390-2, C. neoformans CNBF2390 PSA2; Slag-01708-1, S. japónicas Slag-01708 PSA1; Slag-01708-2, S. japónicas Slag-01708 PSA2; MG03610.4, M. grísea MG03610.4 PSA; EAA36464.1, N. crassa EAA36464.1 PSA; AN0810.2, A. nidulans AN0810.2 PSA. (Б) Консенсус последовательностей PSA-подобных повторов, где "-", любая аминокислота.

Мутации в PSA мотивах белка Sfrl приводят к ослабленной репарации ДНК в клетках S. pombe.

Чтобы выяснить более точную функцию PSA повтора у Sfrl, нами были получены мутации введением аминокислотных замещений - аминокислотного остатка лизина на глутамат с образованием двух мутантных аллелей К108Е в PSA1 и К164Е в PSA2, и аминокислотного остатка фенилаланина на глутамат с образованием двух мутантных аллелей, sfrlF107E в PSA1 и sfrlF163E в PSA2 (Рис.30). Как показано на Рис.32, одиночные мутации К108Е в PSA1 или К164Е в PSA2 не приводили к изменению чувствительности клеток к высоким дозам СРТ и

только слегка повышали чувствительность клеток к ММС. При комбинации двух мутаций в обоих повторах (sfrlK108E, К164Е) клетки становились значительно более чувствительными как к ММС, так и к камптотецину, хотя и не достигали уровней чувствительности мутанта sfrlA. Одиночные мутации sfrlFlOTE или sfrlF163E в любом из повторов также незначительно повышали чувствительность клеток к ММС. Когда две мутации в обоих повторах были скомбинированы вместе в одном штамме (sfrlF107E, F163E), клетки по чувствительности к ММС оказались сравнимыми по чувствительности с мутантом sfrl Л (Рис.32). Таким образом, наши результаты показывают, что PSA мотивы белка Sfrl критичны для функции Sfrl в репарации повреждений ДНК.

10°

sfrl К164Е sfrl К108Е sfrl К108,164Е SfrlA wild type Sfrl F163E Sfrl F107E sfrl F107,163E

2 0 UM СИ?

без ММС 0.0075% ММС

Рис.32. Мутации в PSA мотивах белка Sfrl приводят к ослабленной репарации ДНК в клетках S. ротЬе.

Мейотическая рекомбинация уменьшена в sfrl PSA-мутантных аллелях.

Мутант sfrlA показывает нарушения в мейотической рекомбинации (Табл. 5 и 6). Чтобы определить, в какой степени мутации в PSA повторах Sfrl могут оказывать воздействие на мейотическую рекомбинацию, мы проанализировали межгенную и внутригенную рекомбинации в штамме sfrl-F107E F163E. Полученные результаты позволяют сделать заключение, что PSA-повторы Sfrl необходимы для уровней мейотической рекомбинации дикого типа в делящихся дрожжах. При этом снижение мейотической рекомбинации в клетках введением мутаций F107E, F163E в PSA было значительно меньшим и не сравнимым с негативным эффектом делеции гена sfrl.

Таблица 5. Мейотическая внутригенная рекомбинация в мутанте sfrl-Fl07Е I63E

Хромосома и аллели" Суммарное число Ade+ колоний Прототрофы/106 жизнеспособных спор

Дикий тип sfrI-F107E 163Е Коэффициент снижения'

II L ade7-l 50 х ade7-l 52 104 266.5 ±14.3 185.4 ±11.1 1.4

IHR adeö-469 х ade6-M375 104 220.8 + 15.5 70.2 ±5.1 3.2

IHR ade6-469 x ade6-M26 104 2976.6+ 143.5 1192.9 ±67.0 2.5

(L) Левое и (R) правое плечи хромосом II и III, соответственно. Среднее и стандартное отклонение от 47 независимых скрещиваний. с Снижение показано относительно скрещиания штаммов дикого типа.

Таблица 6. Мейотическая межгенная рекомбинация в мутанте sfrl-Fl07E 163Е.

Хромосома и интервал Прототрофы/106 жизнеспособных спорь Коэффициент снижения0

Дикий тип sfrl-F107E 163Е

IR hisl-lys7 18.6 ±4.5 9.8 ±0.6 1.9

II R adel-lys4 28.3 ± 1.5 11.9 ±0.5 2.4

Я - правое плечо хромосомы I и II. Среднее и стандартное отклонение от трех независимых скрещиваний. Для каждого интервала было проанализировано 1000-1100 случайных спор с Снижение показано относительно скрещивания штаммов дикого типа

С помощью иммунопреципитации белков мы исследовали ассоциацию Яаё51 и 8&1 мутантной формы (81г1 -Р107Е Е163Е), которая показала наиболее сильный негативный эффект на взаимодействие двух белков в двугибридном анализе (Рис.34). Плазмиду с повышенной экспрессией слитого белка ОВТ-ЯасШ под контролем лт/ промотора трансформировали в штаммы дикого типа (дорожка 1) и в мутантный штамм ф1-Е107Е, Е163Е (дорожка 2).

Рис.33. Взаимодействие Sftl мугантных аллелей в двугибридном анализе

Белок GST-Rad5I иммунопреципитировали с использованием антител против эпитопа GST, Как видно из Рис.34, Sfrl иммунопреципитируется с гибридным белком GST-Rad51

(дорожка 1), а мутантная форма белка Sfrl FI07E, F163E не способна иммунопреципитироваться с GST-Rad51 (дорожка 2). Полученные данные показывают, что PSA повторы Sfrl очень важны для взаимодействия белков Sfrl и Rad51Sp и являются их взаимодействующими модулями.

IP: ct-GST

pGST-jrad51 -f +

pesT +

sfrl + - +

sfrl-F107E,FISSE - +

—- —- IB: a-GST

IB: a-Sfrl

12 3

Рис.34. Мутантная форма белка Sfrl-F707Е Fl63Е не коиммунопреципитируется с Rad51.

Полученные данные позволяют выдвинуть гипотезу (Рис.35), что комплекс белков Sfrl-Swi5 переносит Rad51 через связывание с субъединицей Sfrl к сайтам повреждения ДНК, покрытой белком RPA, что можно обнаружить цитологически in vivo как Rad51-репарационные фокусы (Рис.22). Rad51 фокусы, индуцированные у-лучами, обнаружены в клетках дикого типа. Однако число Rad51 фокусов было значительно уменьшенным в клетках sfrlД и r/¡p55A (Рис.). Гетеродимер Sfrl-Swi5 для взаимодействия со стабильной фракцией свободного пула димеров Rad51 использует повторяющиеся кор - участки PSA в Sfrl (Рис.35).

Комплекс Sfrl-Swi5 с Rad51 может связываться с ДНК предпочтительно в местах стыков между двуцепочечной и одноцепочечной ДНК, со строгой специфичностью к 3' выступающим ДНК в местах двуцепочечных разрывов ДНК. Rad51, но не медиатор Swi5-Sfrl, является фактором замещающим RPA с ДНК, а медиатор Swi5-Sfrl не участвует в замещении, а лишь стабилизирует Rad51 на одноцепочечной ДНК в присутствии АТФ. Возможно, что связывание образующегося комплекса Sfrl-Swi5-Rad51 в местах стыков между двухцепочечной ДНК и одноцепочечной ДНК способно регулировать направление Rad51Sp полимеризации на одноцепочечной ДНК, определяя рост филамента в 5'-3' направлении.

одЦНК покрытая белком Rpa •3'

Sfrl/SwiS ©

замещение Rpa

RjdSl

направление Rad51 полимери гации

Rad51 п редей наптическийфиламент

УШЛЮ-

Рис.35. Рабочая гипотеза образования Rad51 - нуклеопротеинового филамента с участием медиаторного комплекса Sfrl-Swi5.

ВЫВОДЫ

1. Идентифицированы три новых гена, rhp55+, rlpl* и sfrl f, в клетках дрожжей S. pombe с функцией в рекомбинационной репарации двуцепочечных разрывов ДНК, два из которых, rhp55+ и rlpl*, кодируют белки с гомологией к Е. coli RecA.

2. Охарактеризованы фенотипы мутантов по генам S. pombe rhp55+, rlpl+ и sfrl* в репарации повреждений ДНК, мейозе и репликации ДНК.

3. Молекулярный анализ показывает образование стабильного комплекса между Rhp55 и другим RecA-подобным белком Rhp57 в клетках S. pombe in vivo. Мутации в сайтах связывания и гидролиза АТФ у белков Rhp55 и Rhp57 приводят к ослабленной репарации ДНК и нарушениям в клеточной пролиферации, что указывает на важность этих доменов в репарации ДНК.

4. Впервые установлено, что функции генов rhp51+ и rhp55* важны для процесса переключения типа спаривания, как механизма «половой» дифференциации в клетках дрожжей.

5. Впервые выявлены взаимодействия между белками репарации двуцепочечных разрывов ДНК, образующих «репарасому» в клетках S. pombe.

6. Показан новый механизм сборки Rad51 - нуклеопротеинового филамента с участием белка Sfrl и действующий параллельно механизму, контролируемому Rhp51 паралогами, Rhp55-Rhp57 и RípJ. Полученные данные позволяют рассматривать возможность многообразия механизмов медиаторных путей в клетках высших эукариот.

7. Показан новый путь в рекомбинационном механизме толерантности к УФ -повреждениям ДНК, контролируемый белком Sfrl.

8. Обнаружен новый домен (PSA повторы) в белке S. pombe Sfrl, ответственный за взаимодействие с ключевым рекомбинационным белком Rhp51. PSA повторы являются важной функциональной частью белка Sfrl. Замещение фенилаланина в коровых участках повторов приводит к строгому ослаблению репарации ДНК и рекомбинации в мейозе, что указывает на важность химической природы этого аминокислотного участка.

9. Биоинформатический анализ позволил идентифицировать белки с потенциальными PSA повторами и в других эукариотических организмах, что предполагает консервативность этих доменов в низших эукариотах, в частности, в грибах.

10. Предложена модель полимеризации белка Rhp51 на одноцепочечной ДНК с участием медиаторного комплекса Sfrl-Swi5 в клетках делящихся дрожжей.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Гаврилова Е.В., Мехедов С.Л., Прозоров А.А., Хасанов Ф.К. Ген В. subtilis гес223: клонирование и функция белка. Генетика. 1992 28:29-39.

2. Khasanov F.K., Zvingila D.J., Zainullin А.А., Prozorov A.A., Bashkirov V.I. Homologous recombination between plasmid and chromosomal DNA in Bacillus subtilis requires approximately 70 bp of homology. Molecular and General Genetics. 1992. 234:494-497.

3. Sekiguchi J., Akeo K., Yamamoto H., Khasanov F.K., Alonso J.C., Kuroda A. Nucleotide sequence and regulation of a new putative cell wall hydrolase gene, cwlD, which affects germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 1995. 177:5582-5589.

4. Khasanov F.K., Savchenko G.V., Bashkirova E.V., Korolev V.G., Heyer W.D., Bashkirov V.I. A new recombinational DNA repair gene from Schizosaccharomyces pombe with homology to Escherichia coli RecA. Genetics. 1999. 152:1557-1572.

5. Хасанов Ф.К., Башкиров В.И. Амплификация ДНК происходит между коровой последовательностью репликационного ориджина ori+ ts плазмиды, инегрированной в хромосому, и его аналогом в геноме клетки. Молекулярная биология. 2000 34:804-808.

6. Tsutsui Y, Khasanov FK, Shinagawa H, Iwasaki H, Bashkirov VI. Multiple interactions among the components of the recombinational DNA repair system in Schizosaccharomyces pombe. Genetics. 2001. 159:91-105.

7. Хасанов Ф.К., Башкиров В.И. Рекомбинационная репарация в Schizosaccharomyces pombe: роль в поддержании целостности генома. Молекулярная биология. 2001. 35:750-763.

8. Khasanov FK, Salakhova AF, Chepurnaja OV, Korolev VG, Bashkirov VI. Identification and characterization of the rlpl+, the novel Rad51 paralog in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. DNA repair (Amst). 2004. 3:1363-1374.

9. Салахова А.Ф., Савченко Г.В., Хасанов Ф.К., Чепурная О.В., Королев В.Г., Башкиров В.И. Ген dds20+ контролирует новый RadSISp - зависимый путь рекомбинационной репарации в Schizosaccharomyces pombe. Генетика. 2005 41:736-745.

10. Вагин Д.А., Хасанов Ф.К., Башкиров В.И. Роль белков рекомбинационной репарации в переключении типа спаривания в клетках делящихся дрожжей. Генетика. 2006. 42:487-493.

11. Вагин Д.А., Башкиров В.И., Хасанов Ф.К. Анализ мутаций в локусе matl у штамма Schizosaccharomyces pombe с делецией гена rhp55+. Генетика. 2006. 42:602-610.

12. Султанова А.Н., Салахова А.Ф., Башкиров В.И., Хасанов Ф.К. Клеточные фенотипы мутанта по гену, кодирующему Rad51 паралог в делящихся дрожжах. Генетика. 2007. 43:183188.

13. Салахова А.Ф., Башкиров В.И., Хасанов Ф.К. Dds20 оперирует в cdsl - независимом механизме толерантности УФ - индуцированных повреждений ДНК в клетках Schizosaccharomyces pombe. Генетика. 2007. 43:417-421.

14. Khasanov F.K., Salakhova A.F., Khasanova O.S., Grishchuk A.L., Chepurnaja O.V., Korolev V.G., Kohli J., Bashkirov V.I. Genetic analysis reveals different roles of Schizosaccharomyces pombe sfrl/dds20 in meiotic and mitotic DNA recombination and repair. Current Genetics. 2008. 54:197-211.

15. Хасанова O.C., Башкиров В.И., Хасанов Ф.К. Картирование сайта взаимодействия между рекомбинационными белками в дрожжевых клетках. Доклады Академии Наук. 2010. 434:242244.

Тезисы конференций:

16. V. Bashkirov, F. Khasanov, G. Savchenko, V. Korolev and W.-D. Heyer Schizosaccharomyces pombe rhp55+ encodes a novel protein with homology to bacterial RecA proteins. Abstracts of FASEB Conference on Genetic Recombination, Snowmass Village, Snowmass, Colorado, USA, August 3-7 1997.

17. W.-D. Heyer, V.I. Bashkirov, F.K. Khasanov, and G.V. Savchenko. The Schizosaccharomyces pombe rhp55+ gene is involved in recombinational repair of DNA double-

strand breaks. Abstracts of Symposium on Molecular and Cellular Mechanisms of Genetic Recombination, Osaka, Japan, 1998.

18. D.A. Vagin, F.K. Khasanov, V.I. Bashkirov. rhp55+ gene is involved in mating-type switching in S. pombe. Abstracts of International Conference "Molecular Genetics of Eukaryotes", Moscow. February 4-7 2003.

19. Khasanov Fuat, Albina F. Salakhova, Edgar Hartsuiker, Galina V. Savchenko, Vladimir G. Korolev, Alexandra Grishchuk, Juerg Kohli, Antony M. Carr, Vladimir I. Bashkirov. Novel Rad5Independent pathway of recombination/repair in Schizosaccharomyces pombe mediated by Dds20 protein. Genetic Recombination & Genome Rearrangements. FASEB Meeting. Snowmass Village, Snowmass, Colorado, USA. July 26-31 2004.

20. Khasanov F.K. Khasanova O.S. Recombinational repair in the fission yeast. Scientific Meeting on DNA Repair, Recombination & Replication, Zurich, Switzerland, December 13-15 2006.

21. Khasanova O, Khasanov F. A novel type of repeats mediates interaction between Schizosaccharomyces pombe Rad51 and Sfrl proteins. 4th Int. Moscow Conference on Computational Molecular Biology MCCMB'09, Moscow, Russia, July 20-23, 2009.

22. Khasanova O.S., Khasanov F.K. The novel protein motif that responsible for association with Rad51 in fungi. International Symposium «Control of Gene Expression and Cancer», Moscow, Russia, June 21-25, 2010.

Формат 60x90/16. Заказ 1410. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Хасанов, Фуат Каримович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Рекомбинационная репарация в б1. ротЬе: роль в поддержании целостности генома.

2.2. Преимущества делящихся дрожжей для изучения репарации двухцепочечных разрывов ДНК.

2.3. Гены рекомбинационной репарации & ротЬе.

2.3.1. Белки 51. ротЬе, ответственные за образование 3'- выступающих однонитевых участков в сайтах повреждений ДНК.

2.3.2. Белки, ответственные за образование 11ас151-нуклеопротеинового филамента.

2.4. Механизм рекомбинационной репарации в эукариотах.

2.5. 8Ш и толерантность к УФ - повреждениям ДНК.

2.6. Связь механизмов контроля клеточного цикла и репарации повреждений

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Штаммы, среды и ростовые условия.

3.2. Использованные библиотеки ДНК и плазмиды.

3.3. Конструирование делеции гена & pom.be гкр55+.

3.4. Конструирование делеционного штамма Б.ротЪе Нр1.

3.5. Обнаружение и клонирование & ротЬе

3.6. Конструирование делеционного мутанта & ротЬе з/г!А::а^З+.

3.7. Эксперимент с повышенной экспрессией белка БМ.

3.8. Выделение белка БАГ из клеток ротЬе.

3.9. Манипуляции с ДНК.

3.10. Тесты на клеточный ответ на генотоксический стресс.

3.11. Мейотический тайм-курс и Нозерн анализ.

3.12. Определение уровня образования двуцепочечных разрывов ДНК в локусе S. ротЪе matl.

3.13. Тесты на белок - белковые взаимодействия.

3.14. Конструирование слитого белка His6-Rhp55.

3.15. Конструирование аллелей rhp55K57A и -K57R, а также rhp57K106A и K106R в хромосоме S. ротЪе.

3.16. Конструирование аллелей sfrl-K108E и sfrl-K164E, а также sfrl-F107E и sfrl-F163E в хромосоме S. pombe.

3.17. Рекомбинационный эксперимент на митотических клетках.

3.18. Эффективность споруляции и жизнеспособность спор.

3.19. Тесты на определение уровней мейотической рекомбинации.

3.20. Цитология и проточная цитометрия.

3.21. Приготовление хроматиновых спредов.

3.22. Иммунофлуоресцентная микроскопия.

3.23. Тест на образование ДНК - белковых комплексов в агарозном геле.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЯ.

4.1. rhp55 + кодирует новый белок S. pombe с гомологией к RecA.

4.2. rhp55+ транскрибируется в вегетативно растущих клетках и индуцируется в мейозе.

4.3. rhp55 + является геном репарации повреждений ДНК.

4.4. кДНК rhp55+ комплементирует дефект в репарации повреждений ДНК, вызванный мутацией rhp55A.

4.5. S. pombe Rhp55 функционирует в одном пути с белками Rad и Rhp54.

4.6. Клетки rhp55A содержат аберантные нуклеусы и показывают повышенное содержание ДНК.

4.7. Делеция гена S. pombe rhp55 приводит к нарушениям мейоза и вызывает небольшое снижение мейотической рекомбинации.

4.8. Rhp55 и Rhp57 взаимодействуют in vivo.

4.9. Мутации в Walker мотиве «А» белков Rhp55 и Rhp57 приводят к ослабленной репарации ДНК.

4.10. Эффект мутаций в доменах связывания/гидролиза АТФ на функцию комплекса Rhp55-Rhp57 в клеточной пролиферации.

4.11. Белки репарации двуцепочечных разрывов ДНК S. pombe вовлечены во взаимные взаимодействия.

4.12. Взаимодействия, включающие белки S. pombe Rad22, Rtil и Rpal.l

4.13. Штаммы h90 с делециями генов rhp51+ и rhp55+ показывают «крапчатый» фенотип и образуют гетероталличные сегреганты.

4.14. Дефект клеток мутанта с делецией гена rhp55+ в переключении типа спаривания возрастает при понижении температуры.

4.15. Анализ организации геномной области, ответственной за переключение типа спаривания в клетках сегрегантов.

4.16. Секвенирование области smt у сегрегантов h90 с делецией гена rhp55+ показывает присутствие перестроек ДНК.

4.17. Замещение последовательности ТТТССА на GTTTGTG в области SAS2 не коррелирует с низким уровнем образования разрывов ДНК в matl:l.

4.18. rlpl+ кодирует новый RecA-подобный белок S. pombe с высокой гомологией к белку человека XRCC2.

4.19. rlpl + является геном репарации повреждений ДНК, действующим в одном пути с rhp51+, rhp54+ и rhp55+

4.20. Rlpl не имеет роли в репарации УФ-повреждений и в ответе на репликационный стресс.

4.21. Спонтанная митотическая внутрихромосомная рекомбинация в мутанте rlpl.

4.22. Мейоз и переключение типа спаривания в мутанте rlpl.

4.23. Дрожжевой двугибридный анализ взаимодействий Rlpl с другими белками рекомбинационной репарации.

4.24. Дрожжевой двугибридный анализ взаимодействия Rlpl с мейотическим гомологом S.pombe.

4.25. Доминантно-негативный эффект повышенной экспрессии Rhp51 на чувствительность мутанта rlpl к метил метансульфонату.

4.26. Sfrl - высококопийный супрессор нарушения репарации клеток, лишенных S. ротЪе Rad51 паралогов, Rhp55 (Rad55Sp) и Rhp57 (Rad57Sp).

4.27. Sfrl является членом пути рекомбинационной репарации ДНК, который действует в новом Rad51-зависимом пути, параллельно Rad51 паралогам Rhp55-Rhp57 и Rlpl.

4.28. Sfrl не играет существенной роли в возобновлении остановленной репликации и в переключении типа спаривания.

4.29. Белок S. pombe Sfrl взаимодействует с рекомбиназой Rhp51.

4.30. Образование фокусов Rhp51, индуцированных ионизирующей радиацией, уменьшено в мутанте sfrl Л.

4.31. Синергичное взаимодействие sfrl с мутантами г ad50 и exol с нарушениями в процессинге двуцепочечных разрывов ДНК.

4.32. Эпистатический анализ sfrl с мутантами по ДНК-геликазам rqhl и srs2.

4.33. Взаимодействие Sfrl с белками S. pombe Radi 8 и Rad60.

4.34. Sfrl участвует в Cdsl-независимом пути толерантности к УФ повреждениям ДНК.

4.35. Sfrl не вовлечена в поддержание целостности хромосом и митотическую рекомбинацию.

4.36. Мейотическая рекомбинация уменьшена в мутанте sfrl А.

4.37. Sfrl является ядерным белком.

4.38. Белок S. pombe Sfrl взаимодействует с Rad51Sp^n,HHK филаментом in vitro.

4.39. Идентификация нового мотива в белке Sfrl и его анализ.

4.40. Повышенная экспрессия PSA повторов приводит к Rad51 ^-зависимому доминантно-негативному эффекту на выживаемость клеток.

4.41. Мутации в PSA мотивах белка Sfrl приводят к ослабленной репарации ДНК в клетках S. Pombe.

4.42. Мейотическая рекомбинация уменьшена в б/г1 РБА-мутантных аллелях.

4.43. 8М-мутантные аллели дефектны для взаимодействия с Ыас1518р.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. & ротЪе Ш1р55, гомолог 5". сегехпягае Кас155, является новым белком рекомбинационной репарации в клетках делящихся дрожжей.

5.2. Белки Ы1тр51, Шхр54 и Ш1р55 образуют одну эпистатическую группу рекомбинационной репарации.

5.3. Белок КЬр55 вовлечен в поддержание стабильности генома и мейоз.

5.4. Свойства гетеродимера Я. ротЪе Ш1р55-Штр57.

5.5. Роль белков рекомбинационной репарации в механизме переключения типа спаривания у дрожжей.

5.6. Возможная функция Шр1, нового 11ас1518р паралога, в клеточном ответе «£ ротЪе на повреждение ДНК.

5.7. Особенности 8М-8"м5 медиаторного пути и ее эволюционная консервативность в клетках эукариот.

5.8. ЯасШ-зависимые суб-пути рекомбинационной репарации в клетках делящихся дрожжей.

5.9. 8£г1 и толерантность к УФ повреждениям ДНК.

5.10. Функция повторов аминокислотной последовательности белка 8М в рекомбинационной репарации & ротЪе.

ВЫВОДЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Хасанов, Фуат Каримович

выводы

1. Идентифицированы три новых гена, rhp55+, rlpl+ и sfrl+, в клетках дрожжей S. pombe с функцией в рекомбинационной репарации двуцепочечных разрывов ДНК, два из которых, rhp55+ и rlpl+, кодируют белки с гомологией к Е. coli RecA.

2. Охарактеризованы фенотипы мутантов по генам S. pombe rhp55+, rlpl+ и sfrl+ в репарации повреждений ДНК, мейозе и репликации ДНК.

4. Впервые установлено, что функции генов rhp51+ и rhp55+ важны для процесса переключения типа спаривания, как механизма «половой» дифференциации в клетках дрожжей.

6. Показан новый механизм сборки Rad51 — нуклеопротеинового филамента с участием белка Sfrl и действующий параллельно механизму, контролируемому Rhp51 паралогами, Rhp55-Rhp57 и Rlpl. Полученные данные позволяют рассматривать возможность многообразия механизмов медиаторных путей в клетках высших эукариот.

7. Показан новый путь в рекомбинационном механизме толерантности к УФ - повреждениям ДНК, контролируемый белком Sfrl.

234 ослаблению репарации ДНК и рекомбинации в мейозе, что указывает на важность химической природы этого аминокислотного участка.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Хасанов, Фуат Каримович, Москва

1. Shinohara, A., Ogawa, H., Matsuda, Y., Ushio, N., Ikeo, K. and Ogawa, T. (1993) Cloning of human, mouse and fission yeast recombination genes homologous to RAD51 and recA. Nat Genet 4,239-243.

2. Muris, D.F., Vreeken, K., Carr, A.M., Broughton, B.C., Lehmann, A.R., Lohman, P.H. and Pastink, A. (1993) Cloning the RAD51 homologue of Schizosaccharomyces pombe. Nucleic Acids Res 21,4586-4591.

3. Norioka, N., Hsu, M.Y., Inouye, S. and Inouye, M. (1995) Two recA genes in Myxococcus xanthus. J Bacteriol 177, 4179-4182.

4. Lovett, S.T. (1994) Sequence of the RAD55 gene of Saccharomyces cerevisiae: similarity of RAD55 to prokaryotic RecA and other RecA-like proteins. Gene 142, 103-106.

5. Heyer, W.D. (1994) The search for the right partner: homologous pairing and DNA strand exchange proteins in eukaryotes. Experientia 50, 223-233.

6. Schwacha, A. and Kleckner, N. (1997) Interhomolog bias during meiotic recombination: meiotic functions promote a highly differentiated interhomolog-only pathway. Cell 90, 1123-1135.

7. Cartwright, R., Dunn, A.M., Simpson, P.J., Tambini, C.E. and Thacker, J. (1998) Isolation of novel human and mouse genes of the recA/RAD51 recombination-repair gene family. Nucleic Acids Res 26, 1653-1659.

8. Dosanjh, M.K., Collins, D.W., Fan, W., Lennon, G.G., Albala, J.S., Shen, Z. and Schild, D. (1998) Isolation and characterization of RAD51C, a new human member of the RAD51 family of related genes. Nucleic Acids Res 26, 1179-1184.

9. Albala, J.S., Thelen, M.P., Prange, C., Fan, W., Christensen, M., Thompson, L.H. and Lennon, G.G. (1997) Identification of a novel human RAD51 homolog, RAD51B. Genomics 46, 476-479.

10. Rice, M.C., Smith, S.T., Bullrich, F., Havre, P. and Kmiec, E.B. (1997) Isolation of human and mouse genes based on homology to REG2, a recombinational repair gene from the fungus Ustilagomaydis. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 7417-7422.

11. Gavrilova, E.V., Mekhedov, S.L., Prozorov, A.A. and Khasanov, F.K. (1992) Bacillus subtilis gene rec223: molecular cloning and proposed function of its protein product]. Genetika 28, 29-39.

12. Sekiguchi, J., Akeo, K., Yamamoto, H., Khasanov, F.K., Alonso, J.C. and Kuroda, A. (1995) Nucleotide sequence and regulation of a new putative cell wall hydrolase gene, cwlD, which affects germination in Bacillus subtilis. J Bacterid 177, 5582-5589.

13. Khasanov, F.K., Zvingila, D.J., Zainullin, A.A., Prozorov, A.A. and Bashkirov, V.I. (1992) Homologous recombination between plasmid and chromosomal DNA in Bacillus subtilis requires approximately 70 bp of homology. Mol Gen Genet 234, 494-497.

14. Huysmans, E., Dams, E., Vandenberghe, A. and Wachter, R.D. (1983) The nucieotide sequences of the 5S rRNAs of four mushrooms and their use in studying the pnytogenetk position of bastdiomycetes among the eukaryotes. Nucl. Acids Res. 11,2871-2880.

15. Prabhala, G., Rosenberg, G.H. and K^ufer, N.F. (1992) Architectural Features of Pre-mRNA Introns in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Yeast 8, 171-182.

16. Mertins, P. and Gallwitz, D. (1987) Nuclear pre-mRNA splicing in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe strictly requires an intron-contained, conserved' sequence element. Embo J 6,1757-1763.

17. Nurse, P. (1990) Universal control mechanism regulating onset of M-phase. Nature 344, 503-508.

18. Thompson, L.H. and Schild, D. (2002) Recombinational DNA repair and human disease. Mutat Res 509, 49-78.

19. Scully, R.E. (1997) Hormonally active ovarian tumors. Verh Dtsch Ges Pathol 81,245-252.

20. Scully, R., Chen, J., Plug, A., Xiao, Y., Weaver, D., Feunteun, Ji, Ashley, T. and Livingston, D.M1 (1997)} Association of BRCA1 with; Rad51- in mitotic and meiotic cells. Cell 88, 265-275.

21. Paulovich, A.G., Toczyski, D.P. and Hartwell, L.H. (1997) When checkpoints fail. Cell 88, 315-321.

22. Paques, F. and Haber, J.E. (1999) Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev 63, 349-404.

23. Lin; Y., Lukacsovich, T. and Waldman, A.S. (1999) Multiple pathways for-repair of DNA double-strand breaks in mammalian chromosomes. Mol Cell Biol 19, 8353-8360.

24. Davey, S., Nass, M.L., Ferrer, J.V., Sidik, K., Eisenberger, A., Mitchell, D;L. and? Freyer, G.A. (1997) The fission yeast UVDR DNA repair pathway is inducible. Nucleic Acids Res 25, 1002-1008. ;

25. Yasuhira, S., Morimyo, M. and Yasui, A. (1999) Transcription dependence and the roles of two excision repair pathways for UV damage in fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Biol Chem 274, 26822-26827.

26. Phipps, J;, Nasim, A. and Miller, D.R. (1985) Recovery, repair, and. mutagenesis in Schizosaccharomyces pombe. Adv Genet 23j 1-72.

27. Paques, F. and Haber, J:E. (1999) Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Mol Biol Rev 63, 349-404;

28. Petrini; J.H., Bressan, D.A. and Yao, M.S. (1997) The RAD52 epistasis group in mammalian double strand break repair. Semin Immunol 9, 181-188.

29. Lim, D.S. and Hasty, P. (1996) A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53. Mol Cell Biol 16, 71337143.

30. Tsuzuki, T., Fujii, Y., Sakumi, K., Tominaga, Y., Nakao, K., Sekiguchi, M., Matsushiro, A., Yoshimura, Y. and MoritaT (1996) Targeted disruption of the Rad51 gene leads to lethality in embryonic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 6236-6240.

31. Xiao, Y. and Weaver, D.T. (1997) Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mrel 1 protein in murine embryonic stem cells. Nucleic Acids Res 25, 2985-2991.

32. Tavassoli, M., Shayeghi, M., Nasim, A. and Watts, F.Z. (1995) Cloning and characterization of the Schizosaccharomyces pombe rad32 gene: a gene required for repair of double strand breaks and recombination. Nucleic Acids Res. 23, 383388.

33. Ajimura, M., Leem, S.H. and Ogawa, H. (1993) Identification of New Genes Required for Meiotic Recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 133, 51-66.

34. Eggleston, A.K. and West, S.C. (1997) Recombination initiation: easy as A, B, C, D. chi? Curr Biol 7, R745-749.

35. Sharpies, G.J. and Leach, D.R. (1995) Structural and functional similarities between the SbcCD proteins of Escherichia coli and the RAD50 and MRE11 (RAD32) recombination and repair proteins of yeast. Mol Microbiol 17, 12151217.

36. Wilson, S., Tavassoli, M. and Watts, F.Z. (1998) Schizosaccharomyces pombe rad32 protein: a phosphoprotein with an essential phosphoesterase motifrequired for repair of DNA double strand breaks. Nucleic Acids Res 26, 52615269.

37. Haber, J.E. (1998) The many interfaces of Mrel 1. Cell 95, 583-586.

38. Usui, T., Ohta, T., Oshiumi, H., Tomizawa, J., Ogawa, H. and Ogawa, T. (1998) Complex formation and functional versatility of Mrel 1 of budding yeast in recombination. Cell 95, 705-716.

39. Paull, T.T. and Gellert, M. (1998) The 3' to 5' exonuclease activity of Mre 11 facilitates repair of DNA double-strand breaks. Mol Cell 1, 969-979.

40. Dong, Z., Zhong, Q. and Chen, P.L. (1999) The Nijmegen breakage syndrome protein is essential for Mrell phosphorylation upon DNA damage. J Biol Chem 274, 19513-19516.

41. Bianco, P.R., Tracy, R.B. and Kowalczykowski, S.C. (1998) DNA strand exchange proteins: a biochemical and physical comparison. Front Biosci 3, D570-603.

42. Jang, Y.K., Jin, Y.H., Kim, E.M., Fabre, F., Hong, S.H. and Park, S.D. (1994) Cloning and sequence analysis ofrhp51+, a Schizosaccharomyces pombe homolog of the Saccharomyces cerevisiae RAD51 gene. Gene 142, 207-211.

43. Jang, Y.K., Jin, Y.H., Myung, K., Seong, R.H., Hong, S.H. and Park, S.D. (1996) Differential expression of the rhp51+ gene, a recA and RAD51 homolog from the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Gene 169, 125-130.

44. Mûris, D.F., Vreeken, K., Schmidt, H., Ostermann, K., Clever, B., Lohman, P.H. and Pastink, A. (1997) Homologous recombination in the fission yeast

45. Schizosaccharomyces pombe: different requirements for the rhp51+, rhp54+ and rad22+ genes. Curr Genet 31, 248-254.

46. Shinohara, A., Ogawa, H. and Ogawa, T. (1992) Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell 69, 457-470.

47. Sung, P. (1994) Catalysis of ATP-dependent homologous DNA pairing and strand exchange by yeast RAD51 protein. Science 265, 1241-1243.

48. Sugiyama, T., Zaitseva, E.M. and Kowalczykowski, S.C. (1997) A single-stranded DNA-binding protein is needed for efficient' presynaptic complex formation by the Saccharomyces cerevisiae Rad51 protein. J Biol Chem 272, 79407945.

49. Kowalczykowski, S.C., Dixon, D.A., Eggleston, A.K., Lauder, S.D. and Rehrauer, W.M. (1994) Biochemistry of homologous recombination in Escherichia coli. Microbiol Rev 58, 401-465.

50. Ogawa, T., Yu, X., Shinohara, A. and Egelman, E.H. (1993) Similarity of the yeast RAD51 filament to the bacterial RecA filament. Science 259, 1896-1899.

51. Conway, A.B., Lynch, T.W., Zhang, Y., Fortin, G.S., Fung, C.W., Symington, L.S. and Rice, P.A. (2004) Crystal structure of a Rad51 filament. Nat Struct Mol Biol 11,791-796.

52. Zaitseva, E.M., Zaitsev, E.N. and Kowalczykowski, S.C. (1999) The DNA binding properties of Saccharomyces cerevisiae Rad51 protein. J Biol Chem 274, 2907-2915.

53. Johnson, R.D. and Symington, L.S. (1995) Functional differences and interactions among the putative RecA homologs Rad51, Rad55, and Rad57. Mol Cell Biol 15, 4843-4850.

54. Hays, S.L., Firmenich, A.A. and Berg, P. (1995) Complex formation in yeast double-strand break repair: participation of Rad51, Rad52, Rad55, and Rad57 proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 6925-6929.

55. New, J.H., Sugiyama, T., Zaitseva, E. and Kowalczykowski, S.C. (1998) Rad52 protein stimulates DNA strand exchange by Rad51 and replication protein A. Nature 391, 407-410.

56. Shinohara, A. and Ogawa, T. (1998) Stimulation by Rad52 of yeast Rad51-mediated recombination. Nature 391, 404-407.

57. Benson, F.E., Baumann, P. and West, S.C. (1998) Synergistic actions of Rad51 and Rad52 in recombination and DNA repair. Nature 391, 401-404.

58. Sung, P. (1997) Yeast Rad55 and Rad57 proteins form a heterodimer that functions with replication protein A to promote DNA strand exchange by Rad51 recombinase. Genes Dev 11, 1111-1121.

59. Khasanov, F.K., Savchenko, G.V., Bashkirova, E.V., Korolev, V.G., Heyer, W.D. and Bashkirov, V.I. (1999) A new recombinational DNA repair gene, from Schizosaccharomyces pombe with homology to Escherichia coli RecA. Genetics 152, 1557-1572.

60. Haruta, N., Kurokawa, Y., Murayama, Y., Akamatsu, Y., Unzai, S., Tsutsui, Y. and Iwasaki, H. (2006) The Swi5-Sfrl complex stimulates Rhp51/Rad51- and Dmcl-mediated DNA strand exchange in vitro. Nat Struct Mol Biol 13, 823-830.

61. Salakhova, A.F., Savchenko, G.V., Khasanov, F.K., Chepurnaia, O.V., Korolev, V.G. and Bashkirov, V.I. (2005) The dds20+ gene controls a novel Rad5 ISp-dependent pathway of recombinational repair in Schizosaccharomyces pombe]. Genetika 41, 736-745.

62. Tsutsui, Y., Khasanov, F.K., Shinagawa, H., Iwasaki, H. and Bashkirov, V.I. (2001) Multiple interactions among the components of the recombinational DNA repair system in Schizosaccharomyces pombe. Genetics 159, 91-105.

63. Lehmann, A.R., Walicka, Mi, Griffiths, D.J., Murray, J.M., Watts, F.Z., McCready, S. and Carr, A.M. (1995) The radl8 gene of Schizosaccharomyces pombe defines a new subgroup of the SMC superfamily involved in DNA repair. Mol Cell Biol 15, 7067-7080.

64. Verkade, H.M., Bugg, S.J., Lindsay, H.D., Carr, A.M. and O'Connell, M.J. (1999) Radl8 is required for DNA repair and checkpoint responses in fission yeast. Mol Biol Cell 10, 2905-2918.

65. Hartsuiker, E., Vaessen, E., Can-, A.M. and Kohli, J. (2001) Fission yeast Rad50 stimulates sister chromatid recombination and links cohesion with repair. Embo J 20, 6660-6671.

66. Kaykov, A. and Arcangioli, B. (2004) A programmed strand-specific and modified nick in S. pombe constitutes a novel type of chromosomal imprint. Curr Biol 14,1924-1928.

67. Vengrova, S. and Dalgaard, J.Z. (2004) RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching. Genes Dev 18, 794-804.

68. Ostermann, K., Lorentz, A. and Schmidt, H. (1993) The fission yeast rad22 gene, having a function in mating-type switching and repair of DNA damages, encodes a protein homolog to Rad52 of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res 21, 5940-5944.

69. Grishchuk, A.L., Kraehenbuehl, R., Molnar, M., Fleck, O. and Kohli, J. (2004) Genetic and cytological characterization of the RecA-homologous proteins Rad51 and Dmcl of Schizosaccharomyces pombe. Curr Genet 44, 317-328.

70. Arcangioli, B. (1998) A site- and strand-specific DNA break confers asymmetric switching potential in fission yeast. EMBO J 17, 4503-4510.

71. Game, J.C. (1993) DNA double-strand breaks and the RAD50-RAD57 genes in Saccharomyces. Semin Cancer Biol 4, 73-83.

72. Suto, K., Nagata, A., Murakami, H. and Okayama, H. (1999) A double-strand break repair, component is essential for S phase completion in fission yeast cell cycling. Mol Biol Cell 10, 3331-3343.

73. Wold, M.S. (1997) Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem 66, 61-92.

74. Parker, A.E., Clyne, R.K., Carr, A.M. and Kelly, T.J. (1997) The Schizosaccharomyces pombe radll+ gene encodes the large subunit of replication protein A. Mol Cell Biol 17, 2381-2390.

75. Lee, S.E., Moore, J.K., Holmes, A., Umezu, K., Kolodner, R.D. and Haber, J.E. (1998) Saccharomyces Ku70, mrell/rad50 and RPA proteins regulate adaptation to G2/M arrest after DNA damage. Cell 94, 399-409.

76. Brush, G.S., Morrow, D.M., Hieter, P. and Kelly, T.J. (1996) The ATM homologue MEC1 is required for phosphorylation of replication protein A in yeast. Proc Natl Acad Sci USA 93, 15075-15080.

77. Brush, G.S. and Kelly, T.J. (2000) Phosphorylation of the replication protein A large subunit in the Saccharomyces cerevisiae checkpoint response. Nucleic Acids Res 28, 3725-3732.

78. Carty, M.P., Zernik-Kobak, M., McGrath, S. and Dixon, K. (1994) UV light-induced DNA synthesis arrest in HeLa cells is associated with changes in phosphorylation of human single-stranded DNA-binding protein. Embo J 13, 2114-2123.

79. Hays, S.L., Firmenich, A.A., Massey, P., Banerjee, R. and Berg, P. (1998) Studies of the interaction between Rad52 protein and the yeast single-stranded DNA binding protein RPA. Mol Cell Biol 18, 4400-4406.

80. Sugiyama, T., New, J.H. and Kowalczykowski, S.C. (1998) DNA annealing by RAD52 protein is stimulated by specific interaction with the complex of replication protein A and single-stranded DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 6049-6054.

81. Sung, P. and Klein, H. (2006) Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 739-750.

82. Eggler, A.L., Inman, R.B. and Cox, M.M. (2002) The Rad51-dependent pairing of long DNA substrates is stabilized by replication protein A. J Biol Chem 277, 39280-39288.

83. Beeraink, H.T. and Morrical, S.W. (1999) RMPs: recombination/replication mediator proteins. Trends Biochem Sci 24, 385-389.

84. Lisby, M., Barlow, J.H., Burgess, R.C. and Rothstein, R. (2004) Choreography of the DNA damage response: spatiotemporal relationships among checkpoint and repair proteins. Cell 118, 699-713.

85. Gasior, S.L., Wong, A.K., Kora, Y., Shinohara, A. and Bishop, D.K. (1998) Rad52 associates with RPA and functions with rad55 and rad57 to assemble meiotic recombination complexes. Genes Dev 12, 2208-2221.

86. Sugawara, N., Wang, X. and Haber, J.E. (2003) In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination. Mol Cell 12, 209219.

87. Shinohara, A., Shinohara, M., Ohta, T., Matsuda, S. and Ogawa, T. (1998) Rad52 forms ring structures and co-operates with RPA in single-strand DNA annealing. Genes Cells 3, 145-156.

88. Singleton, M.R., Wentzell, L.M., Liu, Y., West, S.C. and Wigley, D.B. (2002) Structure of the single-strand annealing domain of human RAD52 protein. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 13492-13497.

89. Sharan, S.K., Morimatsu, M., Albrecht, U., Lim, D.S., Regel, E., Dinh, C., Sands, A., Eichele, G., Hasty, P. and Bradley, A. (1997) Embryonic lethality and radiation hypersensitivity mediated by Rad51 in mice lacking Brca2. Nature 386, 804-810.

90. Amitani, I., Baskin, R.J. and Kowalczykowski, S.C. (2006) Visualization of Rad54, a chromatin remodeling protein, translocating on single DNA molecules. Mol Cell 23, 143-148.

91. Mazin, A.V., Alexeev, A.A. and Kowalczykowski, S.C. (2003) A novel function of Rad54 protein. Stabilization of the Rad51 nucleoprotein filament. J Biol Chem 278, 14029-14036.

92. Wolner, B. and Peterson, C.L. (2005) ATP-dependent and ATP-independent roles for the Rad54 chromatin remodeling enzyme during recombinational repair of a DNA double strand break. J Biol Chem 280, 10855-10860.

93. Heyer, W.D., Li, X., Rolfsmeier, M. and Zhang, X.P. (2006) Rad54: the Swiss Army knife of homologous recombination? Nucleic Acids Res 34, 41154125.

94. Tan, T.L., Kanaar, R. and Wyman, C. (2003) Rad54, a Jack of all trades in homologous recombination. DNA Repair (Amst) 2, 787-794.

95. Petukhova, G., Stratton, S. and Sung, P. (1998) Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins. Nature 393, 91-94.

96. Solinger, J.A., Kiianitsa, K. and Heyer, W.D. (2002) Rad54, a Swi2/Snf2-like recombinational repair protein, disassembles Rad51:dsDNA filaments. Mol Cell 10,1175-1188.

97. Li, X. and Heyer, W.D. (2009) RAD54 controls access to the invading 3'-OH end after RAD51-mediated DNA strand invasion in homologous recombination in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res 37, 638-646.

98. Khasanov, F.K., Salakhova, A.F., Chepurnaja, O.V., Korolev, V.G. and Bashkirov, V.I. (2004) Identification and characterization of the rlpl+, the novel

99. Rad51 paralog in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. DNA Repair (Amst) 3, 1363-1374.

100. Lambert, S. and Lopez, B.S. (2001) Role of RAD51 in sister-chromatid exchanges in mammalian cells. Oncogene 20, 6627-6631.

101. Shivji, M.K. and Venkitaraman, A.R. (2004) DNA recombination, chromosomal stability and carcinogenesis: insights into the role of BRCA2. DNA Repair (Amst) 3, 835-843.

102. Baumann, P., Benson, F.E. and West, S.C. (1996) Human Rad51 protein promotes ATP-dependent homologous pairing and strand transfer reactions in vitro. Cell 87, 757-766.

103. Yasui, A. and McCready, SJ. (1998) Alternative repair pathways for UV-induced DNA damage. Bioessays 20, 291-297.

104. Murray, J.M., Lindsay, H.D., Munday, C.A. and Can-, A.M. (1997) Role of Schizosaccharomyces pombe RecQ homolog, recombination, and checkpoint genes in UV damage tolerance. Mol Cell Biol 17, 6868-6875.

105. Boddy, M.N., Lopez-Girona, A., Shanahan, P., Interthal, H., Heyer, W.D. and Russell, P. (2000) Damage tolerance protein Mus81 associates with the FHA1 domain of checkpoint kinase Cdsl. Mol Cell Biol 20, 8758-8766.

106. Yamaguchi-Iwai, Y., Sonoda, E., Sasaki, M.S., Morrison, C., Haraguchi, T., Hiraoka, Y., Yamashita, Y.M., Yagi, T., Takata, M., Price, C., Kakazu, N. and

107. Takeda, S. (1999) Mrell is essential for the maintenance of chromosomal DNA in vertebrate cells. Embo J 18, 6619-6629.

108. Michel, B., Ehrlich, S.D. and Uzest, M. (1997) DNA double-strand breaks caused by replication arrest. Embo J 16, 430-438.

109. Kogoma, T. (1997) Stable DNA replication: interplay between DNA replication, homologous recombination, and transcription. Microbiol Mol Biol Rev 61,212-238.

110. Martinho, R.G., Lindsay, H.D., Flaggs, G., DeMaggio, A.J., Hoekstra, M.F., Carr, A.M. and Bentley, N.J. (1998) Analysis of Rad3 and Chkl protein kinases defines different checkpoint responses. Embo J 17, 7239-7249.

111. McCready, S J., Osman, F. and Yasui, A. (2000) Repair of UV damage in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Mutat Res 451, 197-210.

112. Myung, K., Chen, C. and Kolodner, R.D. (2001) Multiple pathways cooperate in the suppression of genome instability in Saccharomyces cerevisiae. Nature 411,1073-1076.

113. Tercero, J.A. and Diffley, J.F. (2001) Regulation of DNA replication fork progression through damaged DNA by the Mecl/Rad53 checkpoint. Nature 412, 553-557.

114. Bashkirov, V.I., King, J.S., Bashkirova, E.V., Schmuckli-Maurer, J. and Heyer, W.D. (2000) DNA repair protein Rad55 is a terminal substrate of the DNA damage checkpoints. Mol Cell Biol 20, 4393-4404.

115. Weichselbaum, R.R., Nove, J. and Little, J.B. (1978) Deficient recovery from potentially lethal radiation damage in ataxia telengiectasia and xeroderma pigmentosum. Nature 271, 261-262.

116. Siede, W., Friedberg, A.S. and Friedberg, E.C. (1993) RAD9-dependent G1 arrest defines a second checkpoint for damaged DNA in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 7985-7989.

117. Kolodner, R.D., Putnam, C.D. and Myung, K. (2002) Maintenance of genome stability in Saccharomyces cerevisiae. Science 297, 552-557.

118. Tercero, J.A., Longhese, M.P. and Diffley, J.F. (2003) A central role for DNA replication forks in checkpoint activation and response. Mol Cell 11, 13231336.

119. Broomfield, S., Hryciw, T. and Xiao, W. (2001) DNA postreplication repair and mutagenesis in Saccharomyces cerevisiae. Mutat Res 486, 167-184.

120. Krogh, B.O. and Symington, L.S. (2004) Recombination proteins in yeast. Annu Rev Genet 38, 233-271.

121. Beach, D., Rodgers, L. and Gould, J. (1985) ranl+ controls the transition from mitotic division to meiosis in fission yeast. Curr Genet 10, 297-311.

122. Watanabe, Y., Lino, Y., Furuhata, K., Shimoda, C. and Yamamoto, M. (1988) The S.pombe mei2 gene encoding a crucial molecule for commitment to meiosis is under the regulation of cAMP. EMBO J 7, 761-767.

123. Manivasakam, P. and Schiestl, R.H. (1993) High efficiency transformation of Saccharomyces cerevisiae by electroporation. Nucleic Acids Res 21, 4414-4415.

124. Hindley, J., Phear, G., Stein, M. and Beach, D. (1987) Sucl+ encodes a predicted 13-kilodalton protein that is essential for cell viability and is directly involved in the division cycle of Schizosaccharomyces pombe. Mol Cell Biol 7, 504-511.

125. Fleck, O., Rudolph, C., Albrecht, A., Lorentz, A., Schar, P. and Schmidt, H. (1994) The mutator gene swi8 effects specific mutations in the mating-type region of Schizosaccharomyces pombe. Genetics 138, 621-632.

126. Waddell, S. and Jenkins, J.R. (1995) arg3+, a new selection marker system for Schizosaccharomyces pombe: application of ura4+ as a removable integration marker. Nucleic Acids Res 23, 1836-1837.

127. Waddell, S., Jenkins, J.R. and Proikas-Cezanne, T. (2001) A "no-hybrids" screen for functional antagonizes of human p53 transactivator function: dominant negativity in fission yeast. Oncogene 20,6001-6008.

128. Waddell, S. and Jenkins, J.R. (1995) arg3+, a new selection marker system for Schizosaccharomyces pombe: application of ura4+ as a removable integration marker. Nucleic Acids Research 23, 1836-1837.

129. Wright, A.P., Maundrell, K. and Shall, S. (1986) Transformation of Schizosaccharomyces pombe by non-homologous, unstable integration of plasmids in the genome. Curr Genet 10, 503-508.

130. Bahler, J.^ Wyler, T., Loidl, J. and Kohli, J. (1993) Unusual nuclear structures in meiotic prophase of fission yeast: a cytological analysis. J Cell Biol 121,241-256.

131. Grimm, C., Schaer, P., Munz, P. and Kohli, J. (1991) The strong ADH1 promoter stimulates mitotic and meiotic recombination at the ADE6 gene of Schizosaccharomyces pombe. Mol Cell Biol 11, 289-298.

132. Nadin-Davis, S.A. and Nasim, A. (1990) Schizosaccharomyces pombe rasl and byrl are functionally related genes of the ste family that affect starvation-induced transcription of mating-type genes. Mol Cell Biol 10, 549-560.

133. Donovan, J.W., Milne, G.T. and Weaver, D.T. (1994) Homotypic and heterotypic protein associations control Rad51 function in double-strand break repair. Genes Dév 8,2552-2562.

134. Gyuris, J., Golemis, E., Chertkov, H. and Brent, R. (1993) Gdil, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cell 75, 791-803.

135. Santos-Rosa, H., Clever, B., Heyer, W.D. and Aguilera, A. (1996) The yeast HRS1 gene encodes a polyglutamine-rich nuclear protein required for spontaneous and hprl -induced deletions between direct repeats. Genetics 142, 705-716.

136. Pringle, J.R., Adams, A.E., Drubin, D.G. and Haarer, B.K. (1991) Immunofluorescence methods for yeast. Methods Enzymol 194, 565-602.

137. Forsburg, S.L. and Sherman, D.A. (1997) General purpose tagging vectors for fission yeast. Gene 191, 191-195.

138. Scherer, S. and Davis, R.W. (1979) Replacement of chromosome segments with altered DNA sequences constructed in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 76, 4951-4955.

139. Lea, D.E. and Coulson, C.A. (1949) The distribution of the number of mutants in bacterial populations. J. Genet. 49, 264-285.

140. Hoheisel, J.D., Maier, E., Mott, R., McCarthy, L., Grigoriev, A.V., Schalkwyk, L.C., Nizetic, D., Francis, F. and Lehrach, H. (1993) High resolution cosmid and PI maps spanning the 14 Mb genome of the fission yeast S. pombe. Cell 73, 109-120.

141. Prabhala, G., Rosenberg, G.H. and Kaufer, N.F. (1992) Architectural features of pre-mRNA introns in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Yeast 8,171-182.

142. Russell, P., Moreno, S. and Reed, S.L (1989) Conservation of mitotic controls in fission and budding yeasts. Cell 57, 295-303.

143. Devereux, J., Haeberli, P. and Smithies, O. (1984) A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucleic Acids Res 12, 387-395.

144. Lovett, S.T. and Mortimer, R.K. (1987) Characterization of null mutants of the RAD55 gene of Saccharomyces cerevisiae: effects of temperature, osmotic strength and mating type. Genetics 116, 547-553.

145. Bergerat, A., de Massy, B., Gadelle, D., Varoutas, P.C., Nicolas, A. and Forterre, P. (1997) An atypical topoisomerase II from Archaea with implications for meiotic recombination. Nature 386, 414-417.

146. Lin, Y. and Smith, G.R. (1994) Transient, meiosis-induced expression of the rec6 andrecl2 genes of Schizosaccharomyces pombe. Genetics 136, 769-779.

147. Mumberg, D., Muller, R. and Funk, M. (1995) Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156, 119-122.

148. Russell, P. and Nurse, P. (1986) Schizosaccharomyces pombe and Saccharomyces cerevisiae: a look at yeasts divided. Cell 45, 781-782.

149. Forsburg, S.L. and Nurse, P. (1991) Cell cycle regulation in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Annu Rev Cell Biol 7, 227-256.

150. Nielsen, O. and Egel, R. (1989) Mapping the double-strand breaks at the mating-type locus in fission yeast by genomic sequencing. EMBO J 8, 269-276.

151. Fleck, O., Heim, L. and Gutz, H. (1990) A mutated swi4 gene causes duplications in the mating-type region of Schizosaccharomyces pombe. Curr Genet 18,501-509.

152. Beach, D., Nurse, P. and Egel, R. (1982) Molecular rearrangement of mating-type genes in fission yeast. Nature 296, 682-683.

153. Arcangioli, B. and Klar, A.J. (1991) A novel switch-activating site (SAS1) and its cognate binding factor (SAP1) required for efficient matl switching in Schizosaccharomyces pombe. EMBO J 10, 3025-3032.

154. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. and Lipman, D.J. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215, 403-410.

155. Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol 48,443-453.

156. Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. and Higgins, D.G. (1997) The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res 25, 48764882.

157. Tavassoli, M., Shayeghi, M., Nasim, A. and Watts, F.Z. (1995) Cloning and characterisation of the Schizosaccharomyces pombe rad32 gene: a gene requiredfor repair of double strand breaks and recombination. Nucleic Acids Res 23, 383388.

158. Doe, C.L., Ahn, J.S., Dixon, J. and Whitby, M.C. (2002) Mus81-Emel and Rqhl involvement in processing stalled and collapsed replication forks. J Biol Chem 277, 32753-32759.

159. Arcangioli, B. and de Lahondes, R. (2000) Fission yeast switches mating type by a replication-recombination coupled process. EMBO J 19, 1389-1396.

160. Sauvageau, S., Stasiak, A.Z., Banville, I., Ploquin, M., Stasiak, A. and Masson, J.Y. (2005) Fission yeast rad51 and dmcl, two efficient DNA recombinases forming helical nucleoprotein filaments. Mol Cell Biol 25, 43774387.

161. Grishchuk, A.L. and Kohli, J. (2003) Five RecA-like proteins of Schizosaccharomyces pombe are involved in meiotic recombination. Genetics 165, 1031-1043.

162. Martin, V., Chahwan, C., Gao, H., Blais, V., Wohlschlegel, J., Yates, J.R., 3rd, McGowan, C.H. and Russell, P. (2006) Swsl is a conserved regulator of homologous recombination in eukaryotic cells. EMBO J 25, 2564-2574.

163. Kaykov, A., Holmes, A.M. and Arcangioli, B. (2004) Formation, maintenance and consequences of the imprint at the mating-type locus in fission yeast. EMBO J 23, 930-938.

164. Akamatsu, Y., Tsutsui, Y., Morishita, T., Siddique, M.S., Kurokawa, Y., Ikeguchi, M., Yamao, F., Arcangioli, B. and Iwasaki, H. (2007) Fission yeast

165. Mitchell, T.G. and Perfect, J.R. (1995) Cryptococcosis in the era of AIDS--100 years after the discovery of Cryptococcus neoformans. Clin Microbiol Rev 8, 515-548;

166. Symington, L.S. (2002) Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair. Microbiol Mol Biol Rev 66, 630-670, table of contents.

167. Pellegrini, L., Yu, D.S., Lo, T., Anand, S., Lee, M., Blundell, T.L. and Venkitaraman, A.R. (2002) Insights into DNA recombination from the structure of a RAD51-BRCA2 complex. Nature 420, 287-293.

168. Heyer, W.D. and Kohli, J. (1994) Homologous recombination. Experientia 50, 189-191.

169. Shortle, D. (1989) Probing the determinants of protein folding and stability with amino acid substitutions. J Biol Chem 264, 5315-5318.

170. Mandelkow, E.M. and Mandelkow, E. (1994) Tau protein and Alzheimer's disease. Neurobiol Aging 15 Suppl 2, S85-86.

171. Geissler, S., Siegers, K. and Schiebel, E. (1998) A novel protein complex promoting formation of functional alpha- and gamma-tubulin. EMBO J 17, 952966.

172. Guthrie, C., Nashimoto, H. and Nomura, M. (1969) Studies on the assembly of ribosomes in vivo. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 34, 69-75.

173. Lhoest, J. and Colson, C. (1981) Cold-sensitive ribosome assembly in an Escherichia coli mutant lacking a single methyl group in ribosomal protein L3. Eur J Biochem 121,33-37.

174. Friedberg, E.C. (1988) Deoxyribonucleic acid repair in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev 52, 70-102.

175. Birkenbihl, R.P. and Subramani, S. (1992) Cloning and characterization of rad21 an essential gene of Schizosaccharomyces pombe involved in DNA double-strand-break repair. Nucleic Acids Res 20, 6605-6611.

176. Sonoda, E., Sasaki, M.S., Buerstedde, J.M., Bezzubova, O., Shinohara, A., Ogawa, H., Takata, M., Yamaguchi-Iwai, Y. and Takeda, S. (1998) Rad51-deficient vertebrate cells accumulate chromosomal breaks prior to cell death. EMBO J 17, 598-608.

177. Morrison, C. and Takeda, S. (2000) Genetic analysis of homologous DNA recombination in vertebrate somatic cells. Int J Biochem Cell Biol 32, 817-831.

178. Thompson, L.H. and Schild, D. (1999) The contribution of homologous recombination in preserving genome integrity in mammalian cells. Biochimie 81, 87-105.

179. Schild, D., Lio, Y.C., Collins, D.W., Tsomondo, T. and Chen, D.J. (2000) Evidence for simultaneous protein interactions between human Rad51 paralogs. J Biol Chem 275, 16443-16449.

180. Sung, P., Higgins, D., Prakash, L. and Prakash, S. (1988) Mutation of lysine-48 to arginine in the yeast RAD3 protein abolishes its ATPase and DNA helicase activities but not the ability to bind ATP. EMBO J 7, 3263-3269.

181. Rehrauer, W.M. and Kowalczykowski, S.C. (1993) Alteration of the nucleoside triphosphate (NTP) catalytic domain within Escherichia coli recA protein attenuates NTP hydrolysis but not joint molecule formation. J Biol Chem 268, 1292-1297.

182. Sung, P. and Stratton, S.A. (1996) Yeast Rad51 recombinase mediates polar DNA strand exchange in the absence of ATP hydrolysis. J Biol Chem 271, 2798327986.

183. Sonoda, E., Sasaki, M.S., Morrison, C., Yamaguchi-Iwai, Y., Takata, M. and Takeda, S. (1999) Sister chromatid exchanges are mediated by homologous recombination in vertebrate cells. Mol Cell Biol 19, 5166-5169.

184. Jiang, H., Xie, Y., Houston, P., Stemke-Hale, K., Mortensen, U.H., Rothstein, R. and Kodadek, T. (1996) Direct association between the yeast Rad51 and Rad54 recombination proteins. J Biol Chem 271, 33181-33186.

185. Clever, B., Interthal, H., Schmuckli-Maurer, J., King, J., Sigrist, M. and Heyer, W.D. (1997) Recombinational repair in yeast: functional interactions between Rad51 and Rad54 proteins. EMBO J 16, 2535-2544.

186. Tan, T.L., Essers, J., Citterio, E., Swagemakers, S.M., de Wit, J.,.Benson, F.E., Hoeijmakers, J.H. and Kanaar, R. (1999) Mouse Rad54 affects DNA conformation and DNA-damage-induced Rad51 foci formation. Curr Biol 9, 325328.

187. Golub, E.I., Kovalenko, O.V., Gupta, R.C., Ward, D.C. and Radding, C.M. (1997) Interaction of human recombination proteins Rad51 and Rad54. Nucleic Acids Res 25,4106-4110.

188. Tanaka, K., Hiramoto, T., Fukuda, T. and Miyagawa, K. (2000) A novel human rad54 homologue, Rad54B, associates with Rad51. J Biol Chem 275, 26316-26321.

189. Krejci, L., Damborsky, J., Thomsen, B., Duno, M. and Bendixen, C. (2001) Molecular dissection of interactions between Rad51 and members of the recombination-repair group. Mol Cell Biol 21, 966-976.

190. Mazin, A.V., Bornarth, C.J., Solinger, J. A., Heyer, W.D. and Kowalczykowski, S.C. (2000) Rad54 protein is targeted to pairing loci by the Rad51 nucleoprotein filament. Mol Cell 6, 583-592.

191. Story, R.M., Weber, I.T. and Steitz, T.A. (1992) The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature 355, 318-325.

192. Aihara, H., Ito, Y., Kurumizaka, H., Yokoyama, S. and Shibata, T. (1999) The N-terminal domain of the human Rad51 protein binds DNA: structure and a DNA binding surface as revealed by NMR. J Mol Biol 290, 495-504.

193. Kurumizaka, H., Aihara, H., Kagawa, W., Shibata, T. and Yokoyama, S. (1999) Human Rad51 amino acid residues required for Rad52 binding. J Mol Biol 291, 537-548.

194. Park, M.S., Ludwig, D.L., Stigger, E. and Lee, S.H. (1996) Physical interaction between human RAD52 and RPA is required for homologous recombination in mammalian cells. J Biol Chem 271, 18996-19000.

195. Davis, A.P. and Symington, L.S. (2003) The Rad52-Rad59 complex interacts with Rad51 and replication protein A. DNA Repair (Amst) 2, 1127-1134.

196. Bai, Y. and Symington, L.S. (1996) A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev 10, 2025-2037.

197. Bai, Y., Davis, A.P. and Symington, L.S. (1999) A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence ofRAD51 or RAD59. Genetics 153, 1117-1130.

198. Van Dyck, E., Hajibagheri, N.M., Stasiak, A. and West, S.C. (1998) Visualisation of human rad52 protein and its complexes with hRad51 and DNA. J Mol Biol 284, 1027-1038.

199. Jia, S., Yamada, T. and Grewal, S.I. (2004) Heterochromatin regulates cell type-specific long-range chromatin interactions essential for directed recombination. Cell 119, 469-480.

200. Klar, A J. and Bonaduce, M.J. (1991) swi6, a gene required for mating-type switching, prohibits meiotic recombination in the mat2-mat3 "cold spot" of fission yeast. Genetics 129, 1033-1042.

201. Vagin, D.A., Khasanov, F.K. and Bashkirov, V.I. (2006) The role of recombinational repair proteins in mating type switching in fission yeast cells]. Genetika 42, 487-493.

202. Sugawara, N., Ira, G. and Haber, J.E. (2000) DNA length dependence of the single-strand annealing pathway and the role of Saccharomyces cerevisiae RAD59 in double-strand break repair. Mol Cell Biol 20, 5300-5309.

203. Petukhova, G., Stratton, S.A. and Sung, P. (1999) Single strand DNA binding and annealing activities in the yeast recombination factor Rad59. J Biol Chem 274, 33839-33842.

204. Sung, P. and Robberson, D.L. (1995) DNA strand exchange mediated by a RAD51-ssDNA nucleoprotein filament with polarity opposite to that of RecA. Cell 82, 453-461.

205. Parsons, C.A., Baumann, P., Van Dyck, E. and West, S.C. (2000) Precise binding of single-stranded DNA termini by human RAD52 protein. EMBO J 19, 4175-4181.

206. Navadgi, V.M., Dutta, A. and Rao, B.J. (2003) Human Rad52 facilitates a three-stranded pairing that follows no strand exchange: a novel pairing function of the protein. Biochemistry 42, 15237-15251.

207. Ira, G. and Haber, J.E. (2002) Characterization of RAD51-independent break-induced replication that acts preferentially with short homologous sequences. Mol Cell Biol 22, 6384-6392.

208. Nakayama, J., Klar, A.J. and Grewal, S.I. (2000) A chromodomain protein, Swi6, performs imprinting functions in fission yeast during mitosis and meiosis. Cell 101,307-317.

209. Alexiadis, V. and Kadonaga, J.T. (2002) Strand pairing by Rad54 and Rad51 is enhanced by chromatin. Genes Dev 16,2767-2771.

210. O'Regan, P., Wilson, C., Townsend, S. and Thacker, J. (2001) XRCC2 is a nuclear RAD51-like protein required for damage-dependent RAD51 focus formation without the need for ATP binding. J Biol Chem 276, 22148-22153.

211. Braybrooke, J.P., Spink, K.G., Thacker, J. and Hickson, I.D. (2000) The RAD51 family member, RAD51L3, is a DNA-stimulated ATPase that forms a complex with XRCC2. J Biol Chem 275, 29100-29106.

212. Sultanova, A.N., Salakhova, A.F., Bashkirov, V.l. and Khasanov, F.K. (2007) Cell phenotypes of a mutant in the gene encoding a Rad51 paralog in. fission yeast]. Genetika 43, 183-188.

213. Jones, N.J., Cox, R. and Thacker, J. (1987) Isolation and cross-sensitivity of X-ray-sensitive mutants of V79-4 hamster cells. Mutat Res 183,279-286.

214. Dronkert, M.L. and Kanaar, R. (2001) Repair of DNA interstrand crosslinks. Mutat Res 486, 217-247.

215. Abe, H., Wada, M., Kohno, K. and Kuwano, M. (1994) Altered drug sensitivities to anticancer agents in radiation-sensitive DNA repair deficient yeast mutants. Anticancer Res 14, 1807-1810.

216. Xiao, W., Chow, B.L. and Rathgeber, L. (1996) The repair of DNA methylation damage in Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet 30, 461-468.

217. Cervantes, M.D., Farah, J.A. and Smith, G.R. (2000) Meiotic DNA breaks associated with recombination in S. pombe. Mol Cell 5, 883-888.

218. Fukushima, K., Tanaka, Y., Nabeshima, K., Yoneki, T., Tougan, T., Tanaka, S. and Nojima, H. (2000) Dmcl of Schizosaccharomyces pombe plays a role in. meiotic recombination. Nucleic Acids Res 28, 2709-2716.

219. Masson, J.Y., Tarsounas, M.C., Stasiak, A.Z., Stasiak, A., Shah, R., Mcllwraith, M.J., Benson, F.E. and West, S.C. (2001) Identification andpurification of two distinct complexes containing the five RAD51 paralogs. Genes Dev 15, 3296-3307.

220. French, C.A., Masson, J.Y., Griffin, C.S., O'Regan, P., West, S.C. and Thacker, J: (2002)> Role of mammalian RAD51L2 (RAD51C) in recombination and genetic stability. J Biol Chem 277, 19322-19330.

221. Vagin; D.A., Bashkirov, V.I. and Khasanov, F.K. (2006) Analysis of mutations in the matl region of Schizosaccharomyces pombe strain with the deletion of gene rhp55+]. Genetika 42, 602-610.

222. Hayase, A., Takagi, M., Miyazaki, T., Oshiumi, H., Shinohara, M. and Shinohara, A. (2004) A protein complex containing Mei5 and Sae3 promotes the assembly of the meiosis-specific RecA homolog Dmcl. Cell 119, 927-940.

223. Tsubouchi, H. and Roeder, G.S. (2004) The budding yeast mei5 and sae3 proteins act together with dmcl during meiotic recombination. Genetics 168, 12191230.

224. Ellermeier, C., Schmidt, H. and Smith, G.R. (2004) Swi5 acts in meiotic DNA joint molecule formation in Schizosaccharomyces pombe. Genetics 168, 1891-1898.

225. Akamatsu, Y. and Jasin, M. (2010) Role for the mammalian Swi5-Sfrl complex in DNA strand break repair through homologous recombination. PLoS Genet 6, el001160.

226. Bryant, H.E., Schultz, N., Thomas, H.D., Parker, K.M., Flower, D., Lopez, E., Kyle, S., Meuth, M., Curtin, N.J. and Helleday, T. (2005) Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature 434, 913-917.

227. Kurokawa, Y., Murayama, Y., Haruta-Takahashi, N., Urabe, I. and Iwasaki, H. (2008) Reconstitution of DNA strand exchange mediated by Rhp51 recombinase and two mediators. PLoS Biol 6, e88.

228. Murayama, Y., Kurokawa, Y., Mayanagi, K. and Iwasaki, H. (2008) Formation and branch migration of Holliday junctions mediated by eukaryotic recombinases. Nature 451, 1018-1021.

229. Waga, S. and Stillman, B. (1998) The DNA replication fork in eukaryotic cells. Annu Rev Biochem 67, 721-751.

230. Boddy, M.N., Shanahan, P., McDonald, W.H., Lopez-Girona, A., Noguchi, E., Yates, I J. and Russell, P. (2003) Replication checkpoint kinase Cdsl regulates recombinational repair protein Rad60. Mol Cell Biol 23, 5939-5946.

231. Ampatzidou, E., Irmisch, A., O'Connell, M.J. and Murray, J.M. (2006) Smc5/6 is required for repair at collapsed replication forks. Mol Cell Biol 26, 9387-9401.

232. Laursen, L.V., Ampatzidou, E., Andersen, A.H. and Murray, J.M. (2003) Role for the fission yeast RecQ helicase in DNA repair in G2. Mol Cell Biol 23, 3692-3705.

233. Caspari, T., Murray, J.M. and Carr, A.M. (2002) Cdc2-cyclin B kinase activity links Crb2 and Rqhl-topoisomerase III. Genes Dev 16, 1195-1208.

234. Prinz, S., Amon, A. and Klein, F. (1997) Isolation of COM1, a new gene required to complete meiotic double-strand break-induced recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 146, 781-795.

235. Penkner, A., Portik-Dobos, Z., Tang, L., Schnabel, R., Novatchkova, M., Jantsch, V. and Loidl, J. (2007) A conserved function for a Caenorhabditis elegans Coml/Sae2/CtIP protein homolog in meiotic recombination. EMBO J 26, 50715082.

236. Young, J.A., Hyppa, R.W. and Smith, G.R. (2004) Conserved and nonconserved proteins for meiotic DNA breakage and repair in yeasts. Genetics 167, 593-605.

237. Li, X. and Heyer, W.D. (2008) Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance. Cell Res 18, 99-113.

238. Yang, H., Li, Q., Fan, J., Holloman, W.K. and Pavletich, N.P. (2005) The BRCA2 homologue Brh2 nucleates RAD51 filament formation at a dsDNAssDNA junction. Nature 433, 653-657.

239. Bork, P., Blomberg, N. and Nilges, M. (1996) Internal repeats in the BRCA2 protein sequence. Nat Genet 13, 22-23.

240. Takahashi, M. (1989) Analysis of DNA-RecA protein interactions involving the protein self-association reaction. J Biol Chem 264, 288-295.

241. Forget, A.L., Kudron, M.M., McGrew, D.A., Calmann, M.A., Schiffer, C.A. and Knight, K.L. (2006) RecA dimers serve as a functional unit for assembly of active nucleoprotein filaments. Biochemistry 45, 13537-13542.

242. Liu, J., Doty, T., Gibson, B. and Heyer, W.D. (2010) Human BRCA2 protein promotes RAD51 filament formation on RPA-covered single-stranded DNA. Nat Struct Mol Biol.

Информация о работе

Хасанов, Фуат Каримович
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.07

Диссертация

Идентификация новых генов дрожжей S. pombe и их роль в рекомбинационной репарации ДНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы