Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Репарация лучевых повреждений и радиочувствительность клеток

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Репарация лучевых повреждений и радиочувствительность клеток"

НоНгр к ¿и'Тоии ьг/иере^Рва О 719 /Г. /Л

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИ

На правах рукописи 19-89-707

ГЛАЗУНОВ Александр Викторович

УДК 577.391: 663.12/1Ч

РЕПАРАЦИЯ ЛУЧЕВЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ И РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОК

Специальность: 03.00.01 - Радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Обнинск 1989

Работа вьшолнЕна в Объединенном институте ядерных исследований

Официальные оппоненты:

доктор биологически* наук Г.М. Аветисов

доктор биологических наук В.Г.Петин

доктор биологических наук В.А.Тарасов

Ведущая организация - Институт цитологии АН СССР, Ленинград

Защита диссертации состоится "___"__________19__года

на заседании специализированного Совета по радиобиологии Д. 120. 81.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии Госкомиссии СССР по продовольствию и закупкам (Москва, Волков переулок, д.4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной радиологии. Отзывы на автореферат просьба направлять по адресу: 242020, Калужская область, г.Обнинск, ВНИИСХР, специализированный совет.

Автореферат разослан "___"_________19 __г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Н. И. Санжарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Центральную роль а обеспечении устойчивости клеток к облучению ионизирующей радиацией играет репарация радиационных повреждений. В этом аспекта фундаментальное значение приобретает изучение репарации ДНК, обеспечивающей надежность генетического аппарата клетки в условиях воздействия ионизирующей радиации, и связанных с ней процессов восстановления жизнеспособности клетки.

Актуальность данного направления исследования связана прежде всего с тем, что его развитие должно привести к решению одной из основных проблем радиобиологии - описанию молекулярных механизмов, ответственных за лучевую инактивацию клеток. Вместе с тем важность данного направления исследований обусловлена и ев несомненным практическим значением в таких прикладных отраслях науки как защита от ионизирующих излучений, радиационная гигиена, лучевая терапия и других. Исследование репарационных процессов, имеющих место в облученных клетках, оценка вклада репарации радиационных повреждений разного типа в радиорезистентность клеток позволит выработать научно обоснованные нормы радиационной безопасности.

Репарация ДНК и процессы восстановления широко исследуются иа протяжении последних трех десятилетий. За это время достигнуты впечатляющие успехи в этом направлении. Однако при анализе данных литературы отчетливо просматривается определенный разрыв в изучении процессов, имеющих место на хромосомном уровне при воздействии повреждающих агентов (индукция и репарация повреждений ДНК), и процессов, протекающих в ответ на повреждающее воздействие на уровне клетки (восстановление жизнеспособности и других функций клвтки). Причины этого понятны. Чтобы проследить всю цепь событий от первичных повреждений ДНК до реакции на уровне клетки, необходимо знать механизмы большинства биохимических процессов, имеющих место в клетке, что, конечно, не соответствует современному состоянию биологии. В связи с этим особое значение

приобретает разработка систем, для которых была бы четко и однозначно показана связь между эффектом повреждающего агента на молекулярном уровне и реакцией на клеточном уровне. Таких систем по данным литературы крайне мало.

Одним из самых тяжелых повреждений генетического аппарата

клетки является двунитевой разрыв (ДНР) ДНК. С этими

повреждениями связывают репродуктивную гибель клеток после

воздействия ионизирующей радиации и ряда других инактивирующих

агентов. Клетки про- и эукариот способны репарировать этот вид

повреждений. Способность к репарации ДНР ДНК - важнейшая

характеристика надежности генетического аппарата клетки. Однако

механизмы репарации ДНР ДНК практически не изучены: имеются

лишь гипотетические схемы этого процесса (Королев, Грачева, /1/ /2/ 1972'; иееп^ск, 1976'^'). Причем лишь в одном случае

установлена четкая связь между процессом репарации ДНР ДНК

(ЬисЬпИс et а1. ,1977/'^//) с пострадиационным восстановление;.;

дрожжевых клеток при выдерживании в непитательной среде

(Корогодин,19б6''^//). Между тем известно, что данный тип

пострадиационного восстановления клеток не вносит значительного

вклада в регистрируемую радиорезистентность клеток при

стандартных условиях облучения и пострадиационного

культивирования, поэтому способность к данному виду репарации

ДНР ДНК не может служить адекватной характеристикой надежности

генетического аппарата дрожжевых клеток.

Ц§ль_и_3§Д§чи_работы

В связи со сказанным выше, целью настоящей работы явилось изучение процессов пострадиационного восстановления, определяющих радиорезистентность клеток, и выявление молекулярных механизмов, лежащих в основе этих процессов. Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1) Выбор объекта исследований и разработка экспериментальных подходов для выявления и изучения процессов пострадиационного восстановления, вносящих существенный вклад в радиорезистентность клеток. Количественная оценка вклада пострадиационного восстановления в радиорезистентность клеток.

2) Изучение закономерностей пострадиационного восстановления дрожжевых клеток разных видов и генотипов.

Изучение генетического контроля пострадиационного восстановления у дрожжей.

3) Разработка экспериментальны* подходов для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе пострадиационного восстановления дрожжевых клеток. Использование других инактивируюиих факторов (неионизирующее излучение, химические агенты, гипертермия, сочетанное воздействие) для изучения механизмов пострадиационного восстановления дрожжевых клеток.

4) Установление связи пострадиационного восстановления жизнеспособности дрожжевых клеток с репарацией ДНР ДНК. Изучение механизмов репарации ДНР ДНК в дрожжевых клетках.

5) Разработка модельной системы для изучения репарации ДНР ДНК на основе плазмидных векторов, позволяющей количественно оценивать основные параметры репарационных процессов. Относительная оценка вклада разных видов репарации в элиминацию ДНР ДНК.

6) Формулировка качественной модели лучевой инактивации гаплоидных и диплоидных дрожжей с учетом современных данных молекулярной биологии и генетики и на основании собственных результатов исследований.

Научная_новизн§

Получены следующие основные результаты, имеющие принципиальную новизну, которые выносятся на защиту:

1) Данные, демонстрирующие способность дрожжевых клеток к неизвестному ранее типу пострадиационного восстановления жизнеспособности - быстрому пострадиационному восстановлению.

2) Данные по генетическому контролю быстрого пострадиационного восстановления и оценке его вклада в регистрируемую радиорезистентность клеток.

3) Закономерности быстрого пострадиационного восстановления дрожжевых клеток.

4) Сравнительный анализ быстрого пострадиационного восстановления с процессами восстановления после воздействия других инактивируюиих факторов (УФ-излучение, химические агенты, гипертермия).

5) Результаты, демонстрирующие, что в основе быстрого пострадиационного восстановления дрожжей лежит быстрая

репарация ДНР ДНК.

6) Данные, показывающие, что быстрая и ранее известная у

дрожжей в с1-$азе клеточного цикла медленная репарация (ШсЬпИс /3/

et а1.,1977 ) являются разными путями репарации ДНР ДНК у облученных в С1-$азе клеточного цикла дрожжей при их выдерживании в непитательной среде.

7) Данные по оценке вклада быстрой репарации ДНР ДНК в радиорезистентность диплоидных клеток.

8) Разработка модельной системы для изучения репарации ДНР ДНК, на основе автономно реплицирующегося дрожжевого вектора. Система позволяет оценивать эффективность репарации ДНР плазмидной ДНК в дрожжевых клетках разных генотипов, а также соотношение рекомбинационного и нерекомбинационного путей репарации ДНР ДНК.

9) Данные по эффективности рекомбинационной и нерекомбинационной репарации ДНР плазмидной ДНК у дрожжевых клеток разных генотипов.

Ю) Данные, демонстрирующие связь рекомбинационной репарации ДНР плазмидной ДНК с быстрой и медленной репарацией ДНР ДНК у дрожжей.

11) Общая схема инактивации дрожжевых клеток, подвергнутых воздействию ионизирующей радиации. Схема построена на основе полученных здесь экспериментальных результатов, а также данных, известных ранее.

ВР§£1ИЬ§еК§Э_В§йй9£1Ь_рабдты

В работе решена крупная научная проблема, связанная с исследованием механизмов, обеспечивающих радиоорезистентность клеток, а также устойчивость клеток к комбинированным воздействиям. Совокупность представленных в диссертации экспериментальных данных, обоснованных научных положений и теоретических обобщений можно рассматривать в целом как развитие нового перспективного научного направления в радиобиологии клеток, имеющего важное значение для понимания механизмов, обусловливающих разную радиочувствительность клеток.

Полученные в диссертационной работе результаты имеют важное теоретическое и практическое значение. Обнаруженные в

работе эффекты быстрого пострадиационного и

постгипертермического восстановления, а также восстановление от повреждений, возникающих в результате комбинированного воздействия гипертермии и радиации, необходимо учитывать при разработке методов радиосенсибилизации опухолевых клеток. ЗФФект быстрого восстановления можно использовать как простой тест для определения способности клеток к рекомбинационной репарации ДНК. Данные, касающиеся быстрого пострадиационного восстановления, вошли в учебник по радиобиологии С. П. Ярмоненко "Радиобиология человека и животных" М. 1985.

Обнаруженный эФФект увеличения частоты трансформации дрожжевых клеток в результате линеаризации плазмиды в участке, гомологичном хромосомной ДНК клетки-хозяина, перспективен для использования в качестве теста для определения рекомбиногенной способности исследуемых штаммов. Это может быть особенно важно для промышленных штаммов, для которых, как правило, не развиты классические генетические тесты.

Выводы, касающиеся лучевой инактивации клеток, вскрывающие молекулярные механизмы, которые лежат в основе реакции клеток на воздействие ионизирующей радиации, имеют важное значение для разработки методов мониторинга радиочувствительности и методов защиты от ионизирующей радиации.

Апробация,диссертации

Основные положения диссертационной работы доложены на 13-ой Международной конференции по молекулярной биологии и генетике дрожжей (Франция, Монтпелье, 1982); 1-ом Биофизическом съезде (Москва, 1982); Школе-семинаре по надежности биологических систем (Чернигов, 1982); 14-ой Ежегодной конференции Европейского общества по мутагенам внешней среды (Москва, 1984); Всесоюзном семинаре "Проблемы количественной радиобиологии" (Чернигов, 1986); 9-ой Всесоюзной конференции "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях" (Ленинград,1986); 5 и 6-ом Всесоюзном совещании "Актуальные проблемы микродозиметрии" (Усть-Нарва, 1986, Канев,1989); 4 и 5-ом Всесоюзном семинаре по' молекулярной генетике дрожжей (Петергоф, 1987,1989); 5-ом Съезде ВОГИС им. Н.И.Вавилова (Москва,1988); Рабочем совещании по молекулярным

механизмам мутагенеза (Новосибирск, 1988); Рабочем совещании по генетическому действию корпускулярных излучений (Дубна,1988); з-ем Симпозиуме памяти Н.В. Тимофеева-Ресовского (Ереван,1989); 1-ом Радиобиологическом съезде (Москва,1989).

Диссертационная работа апробирована на Биофизическом семинаре Объединенного института ядерных исследований (22 июня 1989г.) и семинаре ВНИИ сельскохозяйственной радиологии Госкомиссии СССР по продовольствию и закупкам (9 октября 1989 г. ).

Публикации

Основные результаты исследований, представленные в диссертационной работе, изложены в зЗ публикациях, из них 7 опубликованы в виде тезисов доклада.

Структура и объем

Диссертационная работа состоит из б глав, которым предшествует введение, заключения и выводов. В первой главе описаны материалы и методы исследований. Вторая глава посвящена анализу данных литературы, формулировке задач исследования и иллюстрирована собственными экспериментальными данными, касающимися известных основных положений радиобиологии клеток. В последующих 4 главах излагаются результаты и проводится обсуждение собственных экспериментальных и теоретических исследований.

Диссертация изложена на 4-14 страницах текста, включающего список литературы, иллюстирована 67 рисунками и 31 таблицей. Библиографический указатель включает 81 работу на русском языке и 259 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В главе 1 диссертации описаны материалы и основные методические подходы, использованные в работе.

Основным объектом исследований, использованным здесь, являются дрожжевые клетки разных видов и генотипов. Дрожжи являются одноклеточным эукариотическим организмом, удобным для радиобиологических и генетических исследований. Для дрожжей хорошо развиты методы классической и молекулярной генетики. Кроме того, имеется возможность поддерживать вегетативную гаплоидную и диплоидную фазу, что дает возможность изучать роль

плоидности в обеспечении надежности функционирования генетического аппарата клетки при воздействии повреждающих агентов. Всего в работе использованы 34 гаплоидных и диплоидных штамма дрожжей s.cerevisiae разных генотипов. Кроме того, использованы также з штамма дрожжей pichia pinus. В отдельных экспериментах использованы клетки Escherichia coli, а также клетки китайского хомячка линии V79-4.

Клетки облучали у-квантами 137Cs (Установка "ГУПОС" (B0HU АМН СССР); мощность дозы 6,7 + о.з Гр/мин и установка "Свет"

** 239

(ИМБП АН СССР); мощность дозы 35 + з Гр/мин) и a-частицами Ри

(ЛПЗ F 180 кэВ/мкм; мощность дозы 21 Гр/мин). Использованы 12

также ионы С (4 МэВ/нуклон, ЛПЗ = ззо кэВ/мкм, Ускоритель У-200 (ОИЯИ)).

у-Облучение и гипертермическую обработку дрожжевых клеток проводили в суспензии. В случае клеток млекопитающих обработке радиацией и (или) гипертермией подвергали монослой клеток в стеклянных Флакоиых с ростовой средой.

Облучение тяжелыми частицами проводили на поверхности

/К/

голодного агара по методу В.Г. Петина (1969)' .

В качестве основного биологического теста в работе использована выживаемость клеток, определяемая по способности клеток сформировать макроколонию на твердой питальной среде.

В отдельных разделах работы в качестве теста использовали реципрокную и нереципрокную генетическую рекомбинацию, а также генетическую трансформацию дрожжевых клеток плазмидными векторами.

Для выявления индукции и репарациии ДНР ДНК в облученных

клетках дрожжей использован метод седиментации ДНК в градиенте

концентрации нейтральной сахарозы, модифицированный

В.М.Глазером (МГУ)/3/.

Выделение, рестрикционный анализ плазмидной ДНК проводили

/6/

стандартными методами (Маниатис и др.,1985'°').

Трансформацию дрожжей плазмидными векторами проводили "литиевым" методом (Altherr et al. ,1978^^) с использованием ДНК-носителя (гетерологичная ДНК, подвергнутая ультразвуковой обработке).

Статистическую обработку результатов проводили

/о/

стандартными методами (Тейлор, 1985').

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Быстрде_пост|зади§ционное_вдсс^

В главе з описан ранее неизвестный феномен быстрого пострадиационного восстановления жизнеспособности дрожжевых клеток и исследованы его закономерности, что позволило вскрыть молекулярный механизм, лежащий в основе данного явления.

В первом разделе настоящей главы дано описание феномена быстрого пострадиационного восстановления.

На рис.х представлены результаты опытов по г-облучению диплоидных дрожжей S.cerevisiae 2873-lB в gl-фазе клеточного цикла. Видно, что при высеве клеток на стандартную питательную среду yepd их выживаемость не зависит от температуры облучения (о или 20°С) и от выдерживания облученных клеток в воде при 28° С в течение i ч перед высевом (кривые х-з). Высев клеток, облученных при 20°С, на солевую среду yepd + 8% Nací приводит к снижению их выживаемости (кривая 4). Этот эффект хорошо известен в радиобиологии дрожжей. Подобное снижение выживаемости не связано с подавлением репарационных процессов, а с

Рис.3.1. Кривые выживания диплоидных дрожжей S.cerevisiae 2873-1В после облучения г-квантами.

20

АО

10

Светлые символы - высев на среду УЕРй; темные символы - высев на среду уерэ + 8% ЫаС1. 1,4 - облучение при 2о°С, высев сразу после облучения; 2,5 - облучение при о°С, высев сразу

после облучения; з,б - облучение при о°С,

N

выдерживание в течение 1 ч при 28°С. По оси абцисс -доза, Гр; по оси ординат -выживаемость, %.

повышением вероятности проявления лучевых повреждений величина модификации выживаемости хлористым натрием одинакова как для только что облученных клеток, так и для клеток, претерпевших максимально возможное восстановление в воде (в течение 2-4 сут) и сохранивших только необратимые повреждения

/а/

(Кабакова, Капульцевич, 1Э69,С"). Добавление Nací в питательную среду не уменьшает величину dq, а снижает величину экстраполяционного числа кривой выживания: при достаточно высоких концентрациях Nací сигмоидная кривая' может превратиться в экспоненциальную. Поэтому и максимально возможная величина модификации выживаемости зависит от Формы кривой выживания чем меньше экстраполяционное число, тем меньше модификация выживаемости, а у объектов с экспоненциальными кривыми выживания (гаплоидные дрожжи) Nací вообше не влияет на выживаемость . В данном случае добавление в питательную среду 8% Nací привело к снижению выживаемости клеток, облученных в дозе 350 Гр, с во до 40% (кривая 4), однако кривая выживания клеток на солевой среде еще сохраняет сигмоидную Форму -экстраполяционное число fee составляет около 2 (соответствующая кривая данного штамма на стандартной среде имеет экстраполяционное число 4 и выше ). По-видимому, для превращения этой кривой в экспоненту необходимы более высокие концентрации Nací.

Неожиданные результаты дал вариант опыта, в котором клетки облучали при о°С и высевали на солевую среду (рис.1,кривая 5). Оказалось, что снижение температуры облучения с 20 до о0 С при высеве клеток на солевую среду приводит к резкому уменьшению выживаемости - у клеток, облученных в дозе 350 Гр, выживаемость снизилась с 40 до 5,6%, т.е. в 7 раз. Поскольку в двух вариантах опыта (кривые 4 и 5) все условия, кроме температуры во время облучения были идентичными, естественно предположить, что во время облучения при 20°С клетки восстанавливались от лучевых повреждений, летальное действие которых проявляется при повышенном содержании хлористого натрия в питательной среде, а низкая температура во время облучения препятствовала восстановлению, поэтому выживаемость клеток на солевой среде оказалась пониженной. В случае справедливости этого предположения следовало ожидать, что если клетки, облученные

при о°С, выдержать в воде при оптимальной температуре 28° С перед высевом на солевую среду, то и* выживаемость должна повыситься. И действительно, выдерживание таких клеток при 28°С в течение 1 ч привело к повышению выживаемости (кривая 6) почти до уровня соответствующей величины для клеток, облученной при 20°С (кривая 4).

Рис.2. Кривые выживания диплоидных дрожжей в.сегеухахае 2873-1В после облучения а-частицами. Обозначения те же, что и на рис.1.

50 100 150 200

Результаты опытов по «-облучению диплоидных дрожжей б.сегеуХэхае 2873-хв представлены на рис.2. Как и в предыдущей серии экспериментов, высев клеток на стандартную среду не дал никаких различий в выживаемости клеток, облученных при з-4°С и 20°С или облученных при з-4°С и выдержанных при 28°С в воде в течение 1 ч (кривые 1-3). Более того, даже высев клеток на солевую среду сразу после облучения при 20° С не привел к снижению выживаемости (кривая 4). Это можно объяснить тем, что кривая выживания в этом случав имеет относительно небольшое плечо (экстраполяционное число п = 1,7), а модифицирующее действие хлористого натрия на выживаемость клеток, облученных при 23°С, как уже упомянуто выше, зависит от величины плеча Таким образом, в отличие от результатов предыдущих опытов, выживаемость клеток, облученных «-частицами при 20°С оказывается одинаковой на стандартной и солевой питательных средах. Другими словами, сам по себе хлористый натрий не усиливает летального действия радиации. Тем не менее, снижение температуры во время облучения до з-4°С и в этих опытах привело к значительному

уменьшению выживаемости на солевой среде (кривая 5), а выдерживание облученных клеток при 28°С в течение i ч повысило выживаемость до исходного уровня (кривая б). Поскольку в данном случае хлористый натрий уменьшает выживаемость лишь тех клеток, которые были облучены при низкой температуре, а после вьиерживания при 28°С их выживаемость на солевой среде оказывается такой же, как и на стандартной питательной среде, наиболее правдоподобным объяснением наблюдаемых изменений выживаемости является пострадиационное восстановление клеток от лучевых повреждений.

Представленные результаты опытов с диплоидными клетками s.cerevisiae допускают следующую интепретацию. Клетки способны очень быстро (в пределах одного часа) восстанавливаться от некоторой части лучевых повреждений, индуцируемых облучением. Это быстрое восстановление можно полностью или частично подавить снижением температуры или повышенными концентрациями Nací. При выращивании облученных клеток на полноценной питательной среде быстрое восстановление успевает завершиться полностью (репликация ДНК и почкование дрожжей начинается лишь через з-4 ч после высева клеток, находящихся в стационарной Фазе роста культуры (Корогодин,1966^^)), поэтому выживаемость клеток оказывается независимой от температуры облучения - 20 или о°С. Если облучение и последующая процедура разбавления клеточных суспензий и высева их на питательную среду проводилась при комнатной температуре, то быстрое восстановление также успевало завершиться, поэтому выживаемость клеток на солевой среде оказьвалась такой же, как и на полноценной среде (облучение «-частицами, рис.2), или несколько пониженной за счет повышения вероятности проявления оставшихся лучевых повреждений (г-облучение, рис.1). Если же облучение клеток проводили при пониженной температуре, а затем высевали их на солевую среду, то быстрое восстановление частично или полностью подавлялось, что приводило к существенному снижению выживаемости. Повышение температуры после облучения до 28°С способствовало осуществлению быстрого восстановления, что проявлялось в повышении выживаемости клеток на солевой среде.

Альтернативная гипотеза, объясняющая повышение выживаемости клеток после вьиерживания при 28°С не

восстановлением, а снятием сенисибилизирующего действия низкой температуры, противоречит представленным в работе экспериментальным данным.

Рис.з. Выживаемость диплоидных дрожжей S.cerevisiae 2873-1В на солевой среде (yepd + 8% Nací) после облучения г-квантами (1 - доза облучения 340 Гр) и «-частицами (2 - доза Ю5 Гр) в зависимости от продолжительности выдерживания в воде при 28°С.

По оси абцисс - время, мин; по оси ординат -выживаемость,%.

Для оценки скорости обнаруженного восстановления мы определили выживаемость клеток s.cerevisiae 2873-iB, облученных у-квантами или «-частицами, после разных сроков выдерживания в воде при 28°С перед высевом на солевую среду (рис.з).Как видно, уже через зо мин выдерживания кривая увеличения выживаемости выходит на плато как для клеток, облученных r-квантами, так и «-частицами. Это означает, что скорость данного восстановления на 1-2 порядка выше скорости медленного восстановления, регистрируемого по повышению выживаемости клеток на полноценной питательной среде после их выдерживания в воде (Корогодин,1э66/4'/).

Описанное здесь пострадиационное восстановление дрожжевых клеток названо "быстрым", в отличие от известного ранее -"медленного".

Оказалось, что изогенные использованномы выше штамму гаплоидные клетки s.cerevisiae 2873-2А, г-облученные в Gi-Фазе клеточного цикла, не способны к быстрому восстановлению.

Далее было выяснено, что быстрое пострадиационное восстановление можно подавить, высевая клетки на полноценную питательную среду, содержащую 1,5 м кс1 или kno^.

Быстрое восстановление также можно обратимо подавить при облучении в 8% Nací или 10% KCl. Удаление Nací (KCl) и ресуспендирование облученных клеток в 12,5% глюкозе с

Рис.4. Кривые выживания диплоидных дрожжей s.cerevisiae XS800 (RAD/RAD)(А),XS1806 (rad50-l/rad50-l)(В), XS806 (rad51-l/rad51-l)(С), XS1898 (rad52-l/rad52-l)(D), XS1889 (rad53-l/rad53-l)(E), T3 (rad54/rad54)(F), XS1935 (rad55-3/rad55-3)(G), XS1988 (rad57-l/rad57-l)(H) после облучения r-квактами.

Светлые символы - высев на среду yepd; темные символы - высев на среду yepd + 1,5 м kcl.

о • - облучение при о°с, высев сразу после облучения ; А А ~ высев после выдерживания в • воде при 28° С

в течение 1ч; М - выживаемость в зависимости от времени вьиерживания облученных (доза 210 Гр) клеток в воде при 28°С. По оси абцисс - доза, Гр (вверху), время, мин (внизу); по оси ординат - выживаемость,%.

последующим выдерживанием при 28°С в течение i ч приводит к

осуществлению быстрого востановления в полном объеме.

Изучен генетический контроль быстрого пострадиационного восстановления дрожжевых клеток. На рис.4 приведены кривые вшивания диплоидных радиочувствительных мутантов дрожжей Б.сегеухз1ае после »--облучения. Как видно, мутации гас!51, гас152, га<354 и га(155 подавляют быстрое пострадиационное восстановление дрожжевых клеток.

Далее изучены основные закономерности процесса быстрого пострадиационного воестановления.

Кратко перечислим основные свойства быстрого восстновления. При этом сравним быстрое и медленное восстановление дрожжевых клеток. Итак, быстрое восстановление:

1) Имеет место у диплоидных клеток з.сегеу1Б1ае в С1-фазе клеточного цикла; более эффективно у клеток в логарифмической Фазе роста культуры, по сравнению со стационарной Фазой;

2) Отсутствует у гаплоидных клеток Б.сегеу1з1ае в С1-фазе клеточного цикла, но имеет место в б- и С2-фазе;

3) Осуществляется, как и медленное восстановление, по принципу "уменьшения эффективной дозы".

4) Отсутствует у гаплоидов и диплоидов р.р1пиэ в стационарной Фазе роста культуры. В то же время диплоидные клетки Р.рхпиэ в стационарной Фазе роста способны к медленному пострадиационному восстановлению;

5) Имеет место у дыхательного мутанта з.сегеу1Б1ае Мегри 139-Б, не способного к медленному восстановлению;

6) Подавлено у диплоидных клеток, инкубированных после облучения в воде при о°С;

7) Одинаково эффективно в воде и полноценной питательной среде; для некоторых штаммов дрожжей скорость восстановления в питательной среде выше, чем соответствующая величина при выдерживании облученных клеток в воде, для других - скорости примерно одинаковы в обеих средах.

8) Не подавляется циклогексимидом, в отличие от медленного восстановления.

9) Отсутствует после УФ-облучения ;

137

ю) Одинаково эффективно после у-облучения ( Сб) и после облучения «-частицами (4Не, ЛПЭ = 180 кэВ/мкм) для диплоидных клеток з.сегеу151ае 2873-1В; с другой стороны, для штамма

s.cerevisiae XS800 эффективность быстрого восстановления уменьшается с ростом ЛПЭ излучения;

11) Контролируется генами RAD51, RAD52 И RAD54, как и медленное восстановление;

12) Подавлено у диплоидного мутанта s.cerevisiae, гомозиготного по rad55, способного к медленному восстановлению;

13) Имеет место у диплоидного мутанта s.cerevisiae, гомозиготного по radso, не способного к медленному восстановлению;

14) Имеет место после воздействия этилметансульфоната;

15) Связано с рекомбинационными процессами в клетке: частота митотического кроссиноговера снижена в условия* подавления быстрого восстановления.

Кроме того, повреждения, элиминирующиеся в процессе быстрого восстановления, Фиксируются к первому

пострадиационному деления ядра клетки.

На основании перечисленных свойств быстрого восстановления можно сделать вьвод о том, что механизмы, лежащие в основе быстрого и медленного восстановления, различны, но имеют общие этапы. Действительно, оба процесса диплоид-специфичны и контролируются генами RAD51, RAD52 и RAD54. С ДРУГОЙ СТОРОНЫ, генетический контроль обоих типов восстановления не идентичен (см. пп.12, 13); по-разному сказывается на обсуждаемых процессах циклогексимид (п.8). Дыхательный мутант штамма Мегри 139-6 способен к быстрому, но не к медленному восстановлению (п. 5). Кроме того, у диплоидов p.pinus, способных к быстрому восстановлению, подавлено медленное восстановление (п.4).

Оказалось, что эффект, аналогичный быстрому пострадиационному восстановлению, имеет место также и после гипертермической обработки клеток. Выживаемость дрожжей, подвергнутых гипертермической обработке, увеличивается при постгипертермическом выдерживании клеток в воде при 28°С перед высевом на среду, содержащую 1,5 М KCl. Процесс завершается за 3-4 ч выдерживания и таким образом, является более медленным, нежели быстрое пострадиационное восстановление. Сравнительный анализ постгипертермического и быстрого пострадиационного восстановления показал, что в основе этих процессов лежат разные механизмы. Так, постгипертермическое восстановление

имеет место (в отличие от быстрого пострадиационного восстановления) у гаплоидных клеток s.cerevisiae (в Gi-йазе клеточного цикла), а также у мутантов, гомозиготных по radsi, rad52, rad55. С другой стороны, оказалось, что мутация rad54 блокирует как быстрое пострадиационное, так и постгипертермическое восстановление.

Для конкретизации механизмов, лежащих в основе быстрого пострадиационного восстановления, дрожжевые клетки подвергали комбинированному воздействию гипертермии и радиации. Оказалось, что гипертермическая обработка обратимо подавляет быстрое пострадиационное восстановление дрожжевых клеток. Выдерживание клеток, последовательно обработанных гипертермией и радиацией, в непитательной среде (перед высевом на среду, содержащую 1,5 М КС1 или kno^) приводит к последовательному осуществлению постгипертермического, а затем быстрого пострадиационного восстановления жизнеспособности. Таким образом, была установлена связь пострадиационного и постгипертермического восстановления: субстрат, реактивирующийся в ходе постгипертермического восстановления, необходим для

Рис.5. Выживаемость диплоидных дрожжей S.cerevisiae штаммов Ti (А) и тз (Б), подвергнутых воздействию гипертермии (50°С) и (или) r-квантов, в зависимости от времени вьиерживания клеток в воде при 28°С перед высевом на среду yepd + 1,5 м knog. 1,4,5,6 - гипертермическая обработка в течение 5, ю, 4 и 7 мин, соответственно; 2,7 -облучение в дозе 700 и 70 Гр , соответственно; 3,8,9 -обработка гипертермией и последующее обличение (3 - 50 С? 5 мин, 700 Гр; 8 - 50° С, 4 мин, 70 Гр; 9 - 50°С, 7 мин, 70 Гр). По оси абцисс - время, ч; по оси ординат - выживаемость,%.

осуществления быстрого пострадиационного восстановления.

Довольно неожиданными оказались данные по комбинированной

100 , 1

02« 6 0 2 4 6

обработке гипертермией и радиацией диплоидного мутанта, гомозиготного по rad54 (рис.5). Клетки высевали на среду, содержащую 1,5 M kno^. Как было показано выше, мутация rad54 блокирует как пострадиационное, так и постгипертермическое восстановление. Как видно (рис.56), выдерживание облученных или подвергнутых гипертермической обработке клеток в воде при 28°С не изменяет их выживаемость. Однако немедленный после комбинированной обработки высев клеток дает в результате Таблица 1. Коэффициент синергического взаимодействия (КСВ) в зависимости от времени выдерживания клеток в в воде при 28°С.

Время Т1 тз

выдер- _

жива- Режим обработки

ния, ч _

t5r20a t4r2 t7}"2

0 б + ' 2 4 + 1 5 + 1

1,0 9 + 3 - -

1,5 6 + 2 _ _

2,0 3 + 1 1б 2,5 + 0,7

4,0 2 + 1 _ _

6,0 3 + 1 I6 1б

аЪ5}-2о - последовательная обработка гиперетмией (50°С, 5 мин) и радиацией (20 мин при мощности дозы 35 Гр/мин) ^Величины и достоверно не различаются (« >0.5). синергическое взаимодействие гипертермии и радиации, которое убывает при выдерживании клеток в воде при 28°С. Синергический эффект гипертермии и радиации можно количественно описать коэффициентом синергического взаимодействия (КСВ), численно . равным /б^ ( , б выживаемость клеток после

гипертермии, облучения и комбинированной обработки, соответственно). Уменьшение синергического взаимодействия гипертермии и радиации в данном случае выражается в увеличении выживаемости клеток, подвергнутых комбинированной обработке, при выдерживании в воде, в то время как выживаемость клеток,

обработанных каждым из факторов в отдельности, практически не изменяется в этих условиях. Синергическое взаимодействие гипертермии и радиации также убывает при выдерживании в воде клеток штамма Ti (дикий тип) (рис.5а), а также для других штаммов дрожжей. Данный эффект отсутствовал, если клетки высевали на стандартную среду.

Данные об изменении КСВ при выдерживании клеток штаммов И и Тз в воде приведены в таблице 1.

Представленные данные формально можно интепретировать как восстановление дрожжевых клеток от t*-повреждений, индуцированных в клетках в результате комбинированной обработки гипертермии и радиации. Этот тип "восстановления" , так же, как и пострадиационное восстановление, можно подавить повышенными концентрациями кс1 или KNOj. Тот Факт, что повышенные концентрации соли подавляют восстановление клеток от радиационных, термических повреждений, а также повреждений, индуцированных комбинированной обработкой гипертермией и радиацией, наводит на мысль о существовании у дрожжей универсального механизма, обеспечивающего адаптивный ответ клеток на стрессовые воздействия. Эффект уменьшения синергического взаимодействия гипертермии и радиации при выдерживании в ростовой среде имеет место и для клеток млекопитающих.

2. Механизмы_быстрого_пострадиационного §9££1§й9§л§ния_ дрожжевых,, к леток

Изученные закономерности быстрого пострадиационного восстановления у дрожжей позволили установить молекулярные механизмы, лежащие в основе быстрого пострадиационного восстановления дрожжей. Этому посвящена глава 4 настоящей работы.

Как установлено ранее, в основе медленного восстановления

жизнеспособности дрожжевых клеток лежит медленная репарация ДНР

I'M

ДНК (Luchnik et ai., 1977' ), которая осуществляется по

/1/

рекомбинационому механизму (Королев, Грачева, 1972 ; Resnick, 1976' ^ ). Нами также установлена связь быстрого восстановления с рекомбинационными процессами в ДНК. Кроме того, мутации RAD51, RAD52 и RAD54 подавляют как быстрое восстановление, так и митотическую рекомбинацию у дрожжей. С

учетом того, что для осуществления быстрого восстановления требуется, по крайней мере, двойной набор хромосом, можно предположить, что в основе быстрого пострадиационного восстановления лежит особый путь репарации ДНР ДНК, отличающийся от известного ранее у диплоидных клеток в Gi-фазе клеточного цикла (последний ответственен за медленное пострадиационное восстановление). Тот Факт, что предполагаемый путь репарации ДНР ДНК не был обнаружен в опытах по седиментации ДНК из облученных дрожжевых клеток в градиенте нейтральной сахарозы, можно объяснить его высокой скоростью, в результате чего он завершается до начала лизиса облученных клеток на поверхности градиента. Здесь нами разработана методика, предотвращающая репарацию ДНР ДНК во время процедуры выделения ДНК из облученных клеток, что дало возможность выявить быструю репарацию ДНР ДНК.

Предварительно было установлено, что ю% KCl ингибирует быстрое пострадиационное восстановление дрожжей. Выдерживание облученных клеток в l М сорбитоле или о,04 М ЭДТА (рн 8,3) не влияет на эффективность быстрого пострадиационного восстановления. Последнее означает, что в стандартных условиях лизиса дрожжевых клеток (с промежуточным этапом получения протопластов) процесс быстрого восстановления столь же эффективен, как и при выдерживании облученных дрожжей в воде. В связи с этим всю процедуру получения протопластов из облученных клеток проводили в присутствии ю% KCl (инкубация с 2-меркаптоэтанолом и зимолиазой), который ингибирует быстрое пострадиационное восстановление.

На рис.6 приведены профили седиментации ДНК из облученных в дозе 570 Гр диплоидных клеток 2873-1В в градиенте концентрации нейтральной сахарозы. Протопласты из облученных клеток получали либо стандартным методом (рис.бА), либо в присутствии ю% KCl (рис.бБ). Параллельно во всех вариантах опыта определяли выживаемость клеток на стандартной ' (yepd) и солевой (yepd + 12%кс1) среде. Как видно, r-облучение приводит к сдвигу пика профиля седиментации ДНК в сторону Фракций с меньшей молекулярной массой по сравнению с необлученным контролем: среднечисленная молекулярная масса мп в результате облучения уменьшается примерно в 1,3 раза, если протопласты

получали стандартным методом (рис. 6А), ив 1,6 раза, если

2

5

S

3

10 20 30 40

Б

Г\

2 -3 -

Рис.6. Пробили седиментации ДНК диплоидных клеток 8.сегеу1гд.ае 2873-1В в градиенте концентрации 15-зо% нейтральной сахарозы. Протопласты получали стандартным методом- (А) и в присутствии ю% кс1 (Б). 1 - ДНК из необлученных клеток; 2 -облучение в дозе 570 Гр, лизис клеток сразу после облучения; 2 - облучение в дозе 570 Гр,

ш лизис клеток после выдерживания

в воде при 28°С в течение 1 ч. По оси абцисс - номер Фракции; по оси ординат - [14С]~

радиоактивность во Фракции (в % от общей радиоактивности).

протопласты получали в присутствии хлористого калия (рис.бБ). Выживаемость клеток, высеянных на стандартную и солевую среду сразу после облучения, составляла в данном опыте 32 и 0,60%, соответственно. Выдерживание облученных клеток перед лизисом в воде при 28°С в течение 1 ч при концентрации 1 • ю® клеток/мл практически не изменяло профиль седиментации ДНК, если протопласты получали стандартным способом, и приводило к сдвигу профиля седиментации в сторону Фракций с большей молекулярной массой, если протопласты получали в присутствии ю% kci (рис.бБ): величина Мп в этом случае увеличивается примерно в 1,2 раза. Выживаемость облученных клеток, выдержанных в воде в течение 1 ч перед высевом на стандартную и солевую среду, в данном опыте составила соответственно 36 и 4,7%.

Представленные данные можно интерпретировать двояко. Традиционная интерпретация заключается в том, что увеличение молекулярной массы ДНК в результате выдерживания облученных клеток в воде есть следствие репарации ДНР ДНК. Стандартная методика седиментации ДНК в градиенте концентрации нейтральной сахарозы не позволяет выявить эту репарацию, так как она завершается до нанесения протопластов на градиент. Выделение

ДНК из облученных клеток в присутствии ю% KCl, ингибирующего быструю репарацию ДНР ДНК, дает возможность наблюдать этот процесс в эксперименте.

С другой стороны, можно представить, что получение протопластов из облученных клеток в присутствии ю% KCl по каким-то причинам приводит к образованию дополнительных ДНР из однонитевых разрывов (ОНР) ДНК, индуцированных в клетках облучением. Согласно второй интерпретации, увеличение молекулярной массы ДНК из облученных клеток в результате вьиерживания их в воде отражает репарацию ОНР, но не ДНР ДНК.

Рис.7. Пробили седиментации ДНК из гаплоидных (А) и диплоидных (Б) клеток S.cerevisiae штаммов 2873-2а и 2873-ib в градиенте концентрации 15-зо% нейтральной сахарозы. Протопласты получали в присутствии 10% KCl. Обозначения те же, что на рис.6. ,

t

г $5

Г

вер*

А if \ \ 3------- JJ ¡\ \

- j^flCij*.-Г

»

10 20 ЭО 40

Б Ж I—

О-' \Чч

Выбор между двумя предложенными гипотезами можно сделать на основании опытов по седиментации ДНК из облученных гаплоидных клеток б. сегеу1з1ае 2873-2А, результаты которых приведены на рис.7. Использованные здесь штаммы 2873-2А и 2873-1В являются полностью изогенными (за исключением различий в локусе типа спаривания). На рис.7 представлены профили седиментации ДНК гаплоидных (А) и диплоидных (Б) клеток в градиенте концентрации нейтральной сахарозы. Клетки обоих штаммов облучали здесь в дозе 460 Гр. Протопласты из облученных клеток получали здесь в присутствии ю% кс1. Как видно, выдерживание облученных клеток в воде при 28°С в течение 1 ч не изменяет профиль седиментации облученных гаплоидов, и в то же время в случае диплоидов приводит к сдвигу пика седиментограммы в сторону Фракций с большей молекулярной массой (величина Мп увеличивается примерно в 1,2 раза). Таким образом, если бы согласно второму предположению, инкубация клеток в ю% ксг способствовала

трансформации части ОНР в ДНР ДНК, то для гаплоидов мы также должны были бы наблюдать увеличение молекулярной массы ДНК в результате выдерживания облученных клеток в воде, так как гаплоидные клетки s.cerevisiae эффективно репарируют ОНР ДНК.

Результаты приведенных экспериментов свидетельствуют о том, что при выдерживании облученных диплоидных клеток, находящихся в Gi-фазе клеточного цикла, в воде при 28° С в течение 1 ч имеет место репарация ДНР ДНК, которая подавляется повышенными концентрациями хлористого калия. Это позволяет утверждать, что быстрое пострадиационное восстановление жизнеспособности обусловлено репарацией ДНР ДНК. Эта репарация не может быть выявлена при использовании стандартной методики лизиса облученных клеток (без KCl ).

Оценки, приведенные в диссертации показывают, что в результате быстрой репарации ДНР ДНК в клетках диплоидного штамма 2873-iB репарируется для разных доз облучения около 50% первоначально индуцированных ДНР ДНК

Интересно, что эффективность быстрого восстановления диплоидного штамма 2873-iB, определенная как Do/Do' составляет 1,9 + о,з , где dq - соответствующие параметры кривой выживания при немедленном высеве на солевую среду (Yepd •+ 1,5 м KCl) и после завершения быстрого восстановления, усредненные по нескольким опытам. Таким образом, уменьшение примерно в 2 раза среднего числа ДНР ДНК на клетку в результате i-часового выдерживания в воде сопровождается приблизительно двукратным уменьшением величины dq кривой выживания облученных клеток.

С учетом того, что быстрый и медленный типы

пострадиационного восстановления, за которые ответственны

быстрая и медленная репарация ДНР ДНК, отличаются по

генетическому контролю и ряду других свойств (см. выше), был

сделан вывод о том, что быстрая репарация ДНР ДНК является

особым путем репарации ДНР ДНК в дрожжевых клетках

s.cerevisiae, находящихся в Gi-фазе клеточного цикла. Этот путь

отличается от известной ранее у дрожжевых клеток (в Gi-фазе)

медленной репарации ДНР ДНК при выдерживании в непитательной

/3/

среде (Luchnik et al.,1977'J/).

Быстрая репарация ДНР ДНК, будучи диплоид-специфической,

осуществляется по рекомбинационному механизму ( в подтверждение этого в работе была показана связь быстрого восстановления с рекомбинациоными процессами).

Конкретные механизмы быстрой репарации ЛНР ДНК не ясны. Не исключено, например, что быстрая репарация (в отличие от медленной) не требует обширного репаративного синтеза ДНК.

Изучение детальных механизмов рекомбинационной репарации ДНР ДНК с использованием современных подходов проведено в следующей главе.

з. Изучение_механизмов_репарации_ДНР_ДНК_с помощью,модельных_систем В главе 5 настоящей работы разработана модельная система, использующая плазмидные вектора, для изучения репарации ДНР ДНК.

Тупик, наметившийся в изучении детальных механизмов репарации ДНР ДНК в конце семидесятых годов, сейчас в значительной степени преодолен благодаря развитию техники рекомбинантных молекул. Для изучения процессов репарации ДНР, а также ДНБ -делегированных участков плазмидной ДНК в районе ДНР - в настоящее время широко используется генетическая трансформация клеток с помощью плазмид, линеаризованных эндонуклеазой рестрикции. В результате такой трансформации в значительном числе случаев имеет место репарация плазмиды посредством рекомбинации с гомологичной хромосомной ДНК, при этом часто происходит восстановление утраченной части генетического материала плазмиды (если исходная плазмида несла ДНБ). В случае использования автономно реплицирующегося вектора (содержащего origin репликации дрожжевой ДНК) возможна репарация плазмиды как с кроссинговером (в результате чего плазмида встраивается в хромосому), так из без кроссинговера (репарированная плазмида остается в клетке в автономном состоянии) (orr-weaver, Szostak,1983^®'). Такой подход для изучения репарации ДНР ДНК имеет несомненные преимущества перед использованными ранее, так как дает возможность непосредственно анализировать продукты репарации одного Фиксированного ДНР, выделяя репарированную плазмиду. Недостатком таких систем, на наш взгляд, является то, что они не позволяют проводить количественую оценку параметров репарационных процессов, а также корректно сравнивать эти параметры для клеток разных

генотипов. Действительно, известно, что частота плазмидной трансформации клеток (а именно по этой величине судят об эффективности репарации плазмидной ДНК) варьирует в широких пределах от опыта к опыту для одного штамма и столь же сильно колеблется для клеток разных генотипов. В настоящей работе мы поставили задачу разработать собственную модельную систему для изучения рекомбинационной репарации ДНР ДНК, которая была бы в значительной мере лишена этих недостатков.

Здесь использована автономно реплицирующаяся бифункциональная плазмида pLH2, несущая два дрожжевых гена LYS2 и LEU2, а также ее производная ры,12-вх, имеющая делецию в гене LYS2 размером 391 п.н. в районе xhoi-сайта . Обе ппазмиды имеют уникальный xhoi-сайт рестрикции в гене LYS2. Кроме того,

D

плазмида рЫЛ2-вх имеет уникакльный BamHi-сайт в гене tet последовательности pBR322. Дрожжевые клетки разных генотипов трансформировали либо кольцевой, либо линеаризованной по Xhoi-сайту плазмидой "литиевым" методом. Трансформакты отбирали на селективной среде без лейцина. Оказалось, что линеаризованные по xhoi-саяту плазмиды рьыг и ры.12-вх трансформируют клетки штамма dcs (his3 1еи2-з,И2) значительно эффективнее соответствующих кольцевых молекул.

Выяснилось, что величина l (отношение частоты трансформации кольцевой плазмидой к соответствующей величине для линеаризованной молекулы) варьирует от опыта к опыту значительно меньше, нежели абсолютные значения частот трансформации. В таблице 2 приведены значения .величины L, усредненной по нескольким опытам. Как видно, линеаризованная плазмида на порядок эффективнее кольцевой трансформирует клетки штамма dc5.

Эффект повышенной частоты трансформации линеаризованной по Xhoi-сайту плазмидой имеет место, если в качестве реципиента использовать клетки штамма 2Б-Д241, несущего делецию lys2-25 размером около 2,1 т.п.н., расположенную на расстоянии примерно i т.п.н,. от xhoi-сайта рестрикции гена LYS2. Причем величина L в данном случае близка к соответствующей величине

Таблица 5.1. Эффективность трансформации дрожжевых клеток разных генотипов кольцевой и линеаризованной плазмидами

Штамм Плазмида Сайт

линеаризации

х 1СГ

Доля нестабильных по ОЭРРа Leu фенотипу клонов среди общего числа трансформантов кольцевая линеариз. плазмида плазмида

DC5 pLL12 Xhol 9,0+0,46 10 + 2 20/20 44/55

PLL12-BX Xhol 9,2+0,2 10 + 2 - -

pLL12-BX BamHI 1,0B 0

2Б-Д241 pLL12 Xhol 8,1+1,9 11 + 3 24/24 35/48

(lys2-25)

2Г-Д252 pLL12 Xhol 97 + 9 0 24/24 23/24

(lys2-29) 1,0B

DC52 pLL12 Xhol 0 - -

(rad52)

DC53 pLL12 Xhol 73+4 0,4+0,1 23/24 21/24

(rad53)

DC54

(rad54)

23°C pLL12 Xhol 14 + 2 6,1+0,9 22/24 18/24

34°C 1> 0 - -

Величину ОЭРР рассчитывали по Формуле (2). ^Приведена стандартная ошибка среднего значения по 3-5 опытам. вЧастоты трансформации кольцевой и линеаризованной плазмидами достоверно не различались (« > о,5).

для штамма DC5, несущего интактный ген LYS2. Однако, если линеаризованной плазмидой трансформировать штамм 2Г-Д252, у которого делетирован ген LYS2, то частоты трансформации кольцевой и линеаризованной молекулами практически совпадают (L = 1). Точно также совпадают частоты трансформации штамма DC5 кольцевой и линеаризованной по BamHi-сайту плазмидами plli2-bx.

Таким образом, эффект повышенной частоты трансформации линеаризованной плазмидой (по сравнению с соответствующей величиной для кольцевой плазмиды) имеет место только в том случае, если линеаризация проводится в участке, имеющем гомологию с хромосомной ДНК. Это позволяет предположить, что рассматриваемый эффект связан с репарацией плазмидной ДНК посредством рекомбинации с хромсомоной ДНК. Прямое доказательство этого утверждения состояло в следующем. Мы проанализировали плазмиды, выделенные из 19 клонов штамма ос5, трансформированных плазмидой рьыг-вх, линеаризованной по хьо1-сайту. Оказалось, что 18 из 19 проанализированных трансформантов содержали плазмиду, содержащую 2 ватН1-сайта (как в плазмиде рьыг), тогда как исходная плазмида рш.2-вх содержала только 1 Ваюнх-сайт (в гене tet последовательности рвиз22). Таким образом, здесь мы имеем дело с репарацией ДНБ плазмиды рьыг-вх, в результате чего восстанавливается последовательность, содержащая утраченный ватщ-сайт в гене

Такая репарация возможна только в результате рекомбинации с хромосомной ДНК- Еще один вывод можно сделать из этих результатов, а именно: большинство репарированных в результате рекомбинации с хромосомой плазмид находятся в клетке в автономном состоянии. Этот вывод подтверждается и данными по стабильности плазмид, приведенными в таблице 2: большинство 1*еи+ -трансформантов нестабильны по Фенотипу ьеи+и теряют его при пассировании в неселективных условиях .

Таким образом, эффект увеличения частоты трансформации в результате линеаризации пладмиды в участке гомологии с хромосомной ДНК связан с рекомбинационной репарацией ДНР плазмидной ДНК, вызванного эндонуклеазой рестрикции. Следует подчеркнуть, что рассматриваемый эФФект наблюдается только при "литиевой" трансформации клеток плазмидной ДНК в присутствии ДНК-носителя (гетврологичная ДНК, подвергнутая обработке ультразвуком).

Изложенное выше позволило разработать способ количественной оценки эффективности рекомбинационной репарации ДНР плазмидной ДНК, а также оценить соотношение рекомбинационного и нерекомбинационного путей репарации плазмиды. Под нерекомбинационным путем репарации здесь

понимается рециклизация линеаризованной плазмиды с помощью лигирования липки* концов или незаконной рекомбинации.

Показано, что в случае трансформации плазмидой ры,12, линеаризованной по хьох-сайту, долю плазмид, репарированных нерекомбинационным путем (среди общего числа репарированных молекул) для штаммов разных генотипов можно приближенно оценить из соотношения:

Ь - РЬ/(РК+ рь) - (Ч

где ¡0, - частоты трансформации клеток кольцевой и

линеаризованной плазмидой; рк, р^вероятности рекомбинационной и нерекомбинационной репарации плазмиды.

Относительная эффективность рекомбинационной репарации (ОЭРР) плазмидной ДНК определяется в нашей системе из соотношения:

рк — ОЗРР = (гип/Г0 - 1) (2)

Более строго соотношение рекомбинационного и нерекомбинационного пути репарации можно оценить для плазмиды, имеющей два уникальных сайта рестрикции (в нашем случае р1х12-вх): один - в участке гомологии с хромосомной ДНК (Х1ю1-сайт в гене ЬУЭ2), другой - в участке, не имеющем

о

гомологии с хромосомной ДНК (ВатН1-сайт в гене рвй322).

В этом случае для величин ъ и ОЭРР справедливы соотношения: Ь - Рц/'Рк + Рь> = гВаш/£ХЬо <3> °ЭРР = ^ХЬо^Ваш" <4>

где ^хьо' ^ват ~ часТ0ТЫ трансформации клеток плазмидой, линеаризованной в участке, имеющем и не имеющем гомологии с хромосомной ДНК, соответственно.

Показано, что в каа+-клетках около эо% трансформантов содержат плазмиды, репарированные путем рекомбинации с гомологичной хромосомой. Следовательно, можно сделать вывод о том, что нерекомбинационная репарация ДНР плазмидной ДНК на порядок менее эффективна, нежели рекомбинационный путь репарации.

Используя приведенные способы оценки эффективности репарации, изучен генетический контроль репарации ДНР плазмидной ДНК. Оказалось, что мутации га<152, га<154 полностью блокируют репарацию ДНР плазмидной ДНК. Мутации гас153, гас157

осуществляют неполный блок репарации. Мутация гаа55 не влияет на эффективность рекомбинационной репарации ДНР плазмидной ДНК. Таким образом, генетический контроль репарации ДНР . плазмидной ДНК совпадает с таковым для хромосомной ДНК.

Представленная выше система была использована для изучения детальных механизмов репарации ДНР плазмидной ДНК.

Одним из важных, на наш взгляд, вопросов в клеточной радиобиологии является роль плоидности в радиорезистентности клеток. В предыдущей главе показано, что быстрая репарация ДНР ДНК в значительной мере обусловливает повышенную радиорезистентность диплоидов по сравнению с гаплоидами в ба-фазе клеточного цикла. С другой стороны, известно, что гаплоидные дрожжевые клетки в б- и -фазе клеточного цикла способны к эффективной репарации ДНР ДНК-

Возникает, однако, вопрос, влияет ли сама по себе диплоид-ность на эффективность репарации ДНР ДНК, или же их способность репарировать обсуждаемый вид повреждений в С1-фазе,в отличие от гаплоидов, обусловлена исключительно наличием второй копии генома. Для ответа на поставленный вопрос необходимо корректно провести сравнение эффективности репарации ДНР ДНК у гаплоидных и диппоидных клеток, например, в логарифмической фазе роста культуры. Очевидно, что используя традиционные подходы сделать подобное сравнение очень сложно. Разработанная здесь система позволяет в известной мере решить эту задачу.

Оказалось.что эффективность рекомбинационной репарации плазмидной ДНК пропорциональна отношению количества копий последовательности хромосомной ДНК, гомологичной плазмидной ДНК в районе ДНР, к общему количеству ДНК в клетке. Таким образом, можно сделать предварительный вывод, что в отношении рекомбинационной репарации ДНР ДНК гаплоиды и диплоиды з.сегеухехае практически не отличаются, а эффективность репарации у этих клеток определяется только наличием неповрежденной последовательности ДНК, гомологичной участку в районе ДНР. ч

Используя термочувствительный мутант ОС54 (гаа54-з), мы изучили кинетику репарции ДНР плазмидной ДНК (рис.8). Оказалось, что кинетика репарации линеаризованной плазмиды

0 12 3

18

72

рыл.2-вх имеет двухфазный завершается, по крайней мере

Рис.8. Частота трансформации клеток Б.сегеУ1з1ае ОС54

(гай54-з) линеаризованной по хьо1-сайту плазмидой рьыг-вх в зависимости от времени выдерживания трансформационной смеси при пермиссивной

температуре 23°С. По оси абцисс - время,ч; по оси ординат -частота трансформации, относительные единицы, характер: первая фаза -быстрая-за 1ч выдерживания клеток в пермиссивных условиях; вторая - медленная - за 14-18 ч выдерживания. Быстрый компонент репарации ДНР плазмидной ДНК удалось также выявить, высевая трансформационную смесь на селективную среду, содержащую повышенные концентрации хлористого калия. Таким образом, быстрый компонент репарации плазмиды обусловлен механизмами, лежащими в основе быстрой репарации ДНР хромосомной ДНК.

Важным в молекулярной радиобиологии является об эффективности репарации "прямых" и "косых" ДНР ДНК. Традиционная точка зрения состоит в том, что "косой" ДНР, возникающий путем накопления однонитевых разрывов ДНК, репарируется клеткой более эффективно, нежели "прямой" ДНР, возникающий при разрыве обеих нитей ДНК в результате прохождения трека ионизирующей частицы. Использование предложенной системы дает основание для пересмотра подобной точки зрения, по крайней мере, в отношении дрожжевых клеток.

Показано, что рекомбинационная репарация плазмид с "косыми" ДНР (липкие концы) и "тупыми" ДНР (липкие концы, обработанные нуклеазой Б1) осуществляется с одинаковой эффективностью.

Эффективность нерекомбинационной репарации плазмиды с "тупыми" концами резко снижена по сравнению с соответствующей величиной для плазмиды с липкими концами.

Показано, что двунитевые бреши плазмидной ДНК размером до 2,з т.п.н. репарируются посредством рекомбинации с гомологичной

хромосомоной ДНК приблизительно с той же эффективностью, что и ДНР. Причем удаление примерно 2/з плазмидного гена ьуб2 (центрального участка размером 4 т.п.н.) снижает эффективность репарации ДНБ в з-з,5 раза (по сравнению с соответствующей величиной для ДНР), которая тем не менее остается довольно высокой (ОЭРР = 3).

Последние результаты представляются важными для понимания детальных механизмов репарации ДНР ДНК в клетках.

4. Общая_схема_луч§вой_инактивации_клетдк Как итог экспериментальных исследований, в главе б

Р =1.5-г 3; £ = 008 - 0.12ч"1

1.5-25

Быстрая репарация РА051РА052.

Медленна^ ( репарация

|аыдерживание

-I—,_ув непитатель-у

НРк^^нои среде

? Р<1,1 нереконбинационная репарация

Рис- 9. Схема лучевой инактивации диплоидной дрожжевой клетки. Условные обозначения: ОНР,ДНР - однонитевые и двунитевые разрывы ДНК; г = о^ /ьо, где ^ - наклон экспоненциального участка кривой выживания до и после завершения репарации ДНР; Р - скорость репарации,; юшбо - 1Ш)55 - гены, контролирующие репарацию ДНР.

сформулирована качественная модель лучевой инактивации дрожжевых клеток. Основным исходным постулатом данной модели является определяющая роль ДНР ДНК и репарации повреждений этого типа в формировании реакции дрожжевой клетки на облучение ионизирующей радиацией.

Показано, что исходя из представленных здесь и известных ранее данных можно в значительной степени преодолеть

количественный дисбаланс между выходом ДНР и числом потенциально летальных повреждений.

Показано, что вклад летальных по Д.Франкенбергу ДНР ДНК (двух ДНР, индуцированных в соответствущих участках гомологичных хромосом) в лучевую инактивацию клеток мал.

На рис. 9 представлена схема лучевой инактивации клеток. Излучение индуцирует в клетках ДНР ДНК, либо непосредственно при прохождении трека ¿-электрона через обе нити ДНК (прямой ДНР), либо косвенным образом. Второй механизм образования ДНР предполагает их образование в результате накопления однони-тевых разрывов ДНК.

Индуцированные излучением (вне зависимости от механизма их

образования) ДНР ДНК являются субстратом для быстрой репарации.

По нашим оценкам, быстрая репарация залечивает примерно 50-ю%

от общего числа ДНР, индуцированных в клетке. Скорость этого

процесса составляет 2 - 5 ч (число ДНР, приходящихся в

среднем на одну клетку, убывает со временем по экспоненциальному

-1

закону с показателем экспоненты 2 - 5 ч ).

На данном этапе возможен также нерекомбинационный путь репарации ДНР , однако он, как показывают наши данные, для дрожжей не вносит сколь-нибудь заметного вклада в радиорезистетность клеток. Оценки, приведенные в диссертации, показывают,что нерекомбинационным путем в дрожжевых клетках репарируетмя не более ю% от общего числа ДНР ДНК (а скорее всего, много меньше этой величины).

В диплоидных клетках, высеянных на полноценный питательный агар сразу после облучения (стандартные условия опыта для определения величины выживаемости), быстрая репарация ДНР ДНК полностью завершается до первого пострадиационного деления клетки, когда ДНР Фиксируются. Вклад быстрой репарации в регистрируемую радиорезистентность клеток дикого типа (в качестве меры радиорезистентности обычно берут величину оо) составляет примерно 50%, т.е. в результате быстрого восстановления величина увеличивается приблизительно в 2 раза (см. выше).

Часть из облученной популяции клеток содержит нерепарированные ДНР, которые приводят к образованию клонов с летальными секторами (эффект дорастания). Предложен механизм

образования летальных секторов, предположительно возникающих в результате неправильной рекомбинации между поврежденной и неповрежденной хромосомой.

Выдерживание в непитательной среде после облучения дает возможность клетках осуществить в полном объеме медленную репарацию ДНР ДНК. Скорость этого процесса 0,02-0,12 ч (см.выше). Вклад этого процесса в радиорезистентность для клеток дикого типа составляет в среднем 50-70%, т.е. в результате медленного пострадиационного восстановления величина dq увеличивается в 2-з раза (для отдельных штаммов дрожжей этот вклад может достигать 80%).

Проведена количественная проверка следствий из рассматриваемых гипотез. Расчеты не противоречат экспериментальным данным,

"^Королев В.Г.,Грачева Л.М.//Генетика.-1972.-Т.8.-С.ш.

/2/Resnick K.A.//J.Theor.Biol.-1976.-Vol.57.-P.97

/3/,Luchnik, A.N., Glaser, V.M. and Shestakov S.V. //Molec.Biol.Reps.-1977.-Vol.3.-P.437.

''^Корогодин В.И.// Проблемы пострадиационного восстановления. М. .-Атомиздат. 1966.

/5/Петин В.Г.//Радиобиология.-1969.-Т.9.-С.421.

/Б/

Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.//Методы генетической инженерии: Молекулярное клонирование: Пер с англ.- М.: Мир.1985.

^fAltherr M.R., Queen L.A., Kodo C.I., Rodrogues R.L.

//Lurquin P.F.,Klienhofs A. (Eds) Genetic engineering in eukaryotes.-Plenum Publ.Corp. Washington,1983.-P.33.

■^Тейлор Д. Введение в теорию ошибок. М.: Мир. 1982.-272 с.

•^Кабакова Н.М., Капульцевич Ю. Г .//Радиобиология .-1969. -Т .9. -С.892.

/'10/'orr-Weaver T.L., Szostak J.W.//Proc.Natl.Acad. Sei. USA.

-1983.-Vol.80.-P.4417.

ВЫВОДЫ

N

На основании полученных в данной работе результатов сделаны следующие основные выводы:

1) Обнаруженное в данной работе быстрое пострадиационное восстановление дрожжей является «актором, в значительной степени определяющим радиорезистентность клеток. Вклад быстрого пострадиационного восстановления в радиорезистентность дрожжей может достигать з - з,5 по »актору изменения дозы.

2) Быстрое пострадиационное восстановление в значительной степени обеспечивает повышенную радиорезистентность диплоидных дрожжей по сравнению с гаплоидными, а также почкующихся гаплоидных дрожжей по сравнению с непочкующимися.

3) В основе быстрого пострадиационного восстановления жизнеспособности клеток лежит быстрая репарация ДНР ДНК.

4) Быстрая репарация ДНР ДНК осуществляется по рекомбинационному механизму.

5) Быстрая и известная ранее медленная репарация ДНР ДНК являются отдельными путями репарации ДНР ДНК при выдерживании облученных в G1-фазе клеточного цикла диплоидных дрожжей в непитательной среде.

6) ДНР плазмидной ДНК репарируются посредством тех же механизмов, что и хромосомная ДНК.

7) Кинетика репарации ДНР плазмидной ДНК имеет быстрый и медленный компоненты, соответствующие быстрой и медленной репарации ДНР хромосомной ДНК.

8) Эффективность нерекомбинационной репарации ДНР плазмидной ДНК в клетках дрожжей примерно на порядок меньше соответствующей величины для рекомбинационной репарации.

9) Лучевую инактивацию дрожжевых клеток можно непротиворечиво описать в предположении о решающей роли индукции и репарации ДНР ДНК как Факторов, обусловливающих радиочувствительность клеток.

Список_работ^_опубликованных^ :

1. Глазунов A.B., Капульцевич Ю.Г., Лобачевский П.Н. Влияние плоидности дрожжевых клеток на относительную биологическую эффективность плотноионизируюших частиц.//Радиобиология.-1982. -Т.22.- ВЫЛ .1.С.54-61.

2. Глазунов A.B., Капульцевич Ю.Г. Новый тип пострадиационного восстановления жизнеспособности у диплоидных дрожжей Saccha-romyces cerevisiae.//Радиобиология.-1982.-Т.22.-Вып.1.-

С.62-69.

3. Глазунов A.B., Капульцевич Ю.Г. Закономерности быстрой репарации у радиочувствительных мутантов дрожжей Saccharomyces cerevisiae.//Радиобиология.-1982.-Т.22.-ВЫП.5.-С.633-636.

4. Глазунов A.B. Быстрое пострадиационное восстановление у дрожжевых клеток. //1-ый Всесоюзный биофизический съезд.

Тез. ДОКЛ. Т.2. М.1982.- С. 263-264.

5. Glasunov A.V., Kapultcevich Yu.G. Fast liquid holding recovery of yeast exposed to ionizing radiation.//11-th int. Conf. Yeast Genet. Molec.Biol.: Abstracts. P.37. Plenum Press. Montpelier.1982.

6. Глазунов A.B., Капульцевич Ю.Г. Изучение радиочувствительности ДИПЛОИДНЫХ дрожжей Saccharomyces cerevisiae при r-облучении в растворе хлористого натрия. //Радиобиология.-1983.-Т.23.-ВЫЛ.1.- С.63-69.

7. Глазунов A.B., Лобачевский П-Н. Пострадиационное восстановление дрожжевых клеток Pichia pinus. //Радиобиология. -1983.-Т.23.-ВЫП.3.- С.409-411.

8. Глазунов A.B., Капульцевич Ю.Г. О механизме быстрого пострадиационного восстановления у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.// Радиобиология.-1983.-Т.23.-Вып.3 -С.344-348.

9. Глазунов A.B., Борейко A.B. Восстановление дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae от летальных последствий воздействия гипертермии.//Препринт ОИЯИ. Р19-83-890. Дубна.1983.-7 с.

10. Борейко A.B., Насонова Е.А., Глазунов A.B. Быстрое пострадиационное восстановление у дрожжей: подавление на питательных средах , содержащих повышенные концентрации солей калия.// Радиобиология.-1984.-Т.24.-С.543-545.

11. Глазунов A.B., Борейко A.B. Сравнительный анализ восстановления дрожжевых клеток от летальных последствий воздействия гипертермии и радиации.//14-ая Ежегодная конференция Европейского общества по мутагенам внешней среды. Тез. докл.

М.1984.-С.193.

12. Глазунов A.B., Борейко A.B. Постгипертермическое восстановление дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. //Цитология.-1985.- Т.25.-N1.-С.88-93.

13. Глазунов A.B., Борейко A.B. Восстановление дрожжевых клеток после комбинированного воздействия гипертермии и ионизирующей радиации.//Радиобиология.-1985.-Т.25.-Вып.1.-С.37-42.

14. Глазунов A.B., Борейко A.B. Влияние мутации rad54 на способность дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae восстанавливаться от радиационных и термических повреждений .//Радиобиология.-1985.-Т.25.- Вып.5.-С.612-616.

15. Глазунов A.B., Борейко A.B. О связи процессов восстановления дрожжевых клеток от термических и радиационных повреждений. //Цитология.-1986.-N9.-с. 993-999.

16. Оводков Ю.В., Фоменкова Т.Е., Глазунов A.B. Восстановление клеток млекопитающих от термических повреждений, фиксируемых

обработкой хлористым натрием.//Цитология.-1987.-Т.29.-N7.-

С.851-853.

17. Глазунов A.B., Борейко A.B. Анализ процессов восстановления дрожжевых клеток от повреждений, образующихся в результате комбинированного воздействия гипертермии и радиации.//9-ая Всесоюзная конференция "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях." Тез. докл. Изд.ЦНИИРРИ. J1.1986. С.24-25.

18. Глазунов A.B., Перера Д.Р., Глазер В.М-, Борейко A.B. Модельная система для изучения репарации двунитевых разрывов ДНК у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.//MonEK.генет. микробиол. вирусол.-1987.-N8.-С.19-25.

19. Глазунов A.B., Борейко A.B. Пострадиационное и постгипер-термическое восстановление дрожжей: Формальный анализ взаимосвязи двух процессов.//Иванов В.И., Филюшкин И.В. (Ред.) Микродозиметрия и ее применение в радиобиологии. М.: Изд. Ин-та биофизики Минздрава СССР. 1988. С.56-66.

20. Глазунов A.B., Борейко A.B., Эссер А.Х. Быстрое пострадиационное восстановление дрожжей: связь с реципрокной митотической рекомбинацией и генной конверсией.//Генетика. -1988.-T.24.-N3. -С.428-435.

21. Перера Д.Р., Глазунов A.B., Глазер В-М. Изучение рекомбинационной репарации двунитевых разрьвов плазмидной ДНК У радиочувствительных мутантов дрожжей Saccharomyces cerevisiae.// 5-ый Съезд ВОГИС.Тез докл. Т.2. М.1988.С.2И.

22. Глазунов A.B., Глазер В.М. Быстрая репарация двунитевых разрывов ДНК при выдерживании г-облученных дрожжей в непитательной среде.//Молек. генет.микробиол.вирусол.

-1988.-N8.-С.36-41.

23. Насонова Е.А., Глазунов A.B. Восстановление клеток китайского хомячка после комбинированного воздействия гипертермии и радиации.//Цитология.-1988.-Т.зо.-N ю.

-С.1273-1276.

24. Perera D.R., Glasunov A.V., Glaser V.M., Boreiko A.V. Repair of double strand breaks in plasmid DNA in the yeast Saccharomyces cerevisiae.//Molec.Gen.Genet.-1988.-Vol.213.

-P.421-424.

25. Глазунов A.B., Борейко A.B., Эссер А.Х. Относительная конкурентоспособность гаплоидных и диплоидных дрожжей при росте в смешанных популяциях.//Препринт ОИЯИ. Р19-88-672. Дубна.1988. - 18 с.

26. Глазунов A.B. Механизмы лучевой инактивации диплоидных дрожжей.//Сообщения 0ИЯИ.-Р19-вв-в42. Дубна леве.-14 с.

27. Глазунов A.B., Лобачевский П.Н. Роль плоидности в УСТОЙЧИВОСТИ дрожжевых клеток вассЬасопусоа Cerevisina к облучению ионизирующей радиацией.//Эвристичность радиобиологии. -Киевi Науковв думка. 1988.-С.48-60.

28. Glaeunov А.V., Glaser V.M., Kapultcevlch Yu.G. Two pathways of DNA double-atrand break repair In Gl celia of Saccharomycos cerevleiae.//Yeast.-1989.-Vol.5.-H2.-P.131-139.

29. Глазунов A.B., Борейко A.B. Закономерности пост-гипертермического восстановления гаплоидных и диплоидных дрожжей Saccharoraуевв cerevisiae и Pichia pinua.// ЦИТОЛОГИЯ. -1989.-Т.31.-N7.-С.785-790.

30. Глазунов A.B. Репарация двунитевых разрывов ДНК и радиочувствительность клеток.//Труды рабочего совещания по генетическому действию корпускулярных излучений. Д19-89-143. Изд.ОИЯИ. Дубна. 1989. С. 120-137,

31. Борейко A.b., Глазунов A.B. Индукция митотической рекомбинации в дрожжевых клетках с помощью комбинированного воздействия гипертермии и радиации.// Там же. С.138-144.

32. Глазунов A.B. Роль репарации двунитевых разрьшов ДНК в радиорезистентности дрожжевых клвтох.//1-ый Всесоюзный радиобиологический съезд. Тез. докладов. -Т. 1. Пущино. 1989. -

С. 101-102.

33. Глазунов A.B., Борейко A.B., Насонова Е.А. Восстановительные процессы в клетках дрожжей и млекопитающих после сочвтанного воздействия гипертермии и ионизирующей радиации.//Там же. -Т. 5.-С. 1181-1182.

1'укоиись поступила и нздитольский отдел 10 октября 1989 годи.