Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ДЕЙСТВИЯ НА КЛЕТКИ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ЛПЭ (ИССЛЕДОВАНИЯ НА ESCHERICHIA COLI)

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "ЗАКОНОМЕРНОСТИ ДЕЙСТВИЯ НА КЛЕТКИ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ЛПЭ (ИССЛЕДОВАНИЯ НА ESCHERICHIA COLI)"

с/- £g£>M

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР . ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИИ

На правах рукописи УДК 577.391.547

- 19-85-746

АМИРТАЕВ Куанышбек Ганиевич

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ДЕЙСТВИЯ НА КЛЕТКИ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ЛПЭ (ИССЛЕДОВАНИЯ НА ESCHERICHIA COLI)

Специальность: 03.00.01 - радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск 1985

Работа шлоднена в Объединённом институте ядерных исследований.

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Е.А.Красавин.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук М.Н. Мясник кандидат'биологических наук Б. И. Сарацульцев.

Ведуная организация - Институт цитологии АН СССР, Ленинград.

Защита диссертации состоятся "/т* 1985 года на

заседании специализированного Совотапорадаобиологии К 120.81.01 при Воеооюэксм ыаучно-иоследовательсксм институте сельскохозяйствен- кой радиология 1СХ СССР по адресу: 127550, г. Москва й-550, ул. Оря-< шкова, б, корпус 17,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесошного • научно-иссл*' ".овательского института овдьсхохохяйственноК радиологии. Отзывы ;ореферат просим направлять по адресу: 249030, Калужская ^ г.Обнинск, ВНИИСХР, Спецсовет.

Авг- ,г разослан

г.

секретарь специализированного Совета

Н.И.Санжарова

ОВЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш

Проблема относительной биологической эффективности (ОБЭ) ионизирующих излучений с разной линейной передачей энергии (ЛПЭ, L) продолжает оставаться центральной в радиобиологии. От её решения зависят многие вопросы, связанные с различными областями науки, промышленности, сельского хозяйствами медицины.

Интенсивное изучение действия излучений, различапцихся по ЛПЭ в широком диапазоне, на клетки про- и эукариот было начато в конце 50-х годов, посла создания, первых ускорителей многозарядных ионов. В результате этих исследований СЬло установлено, что зависимость ОБЭ от ЛПЭ носит сложный к неоднозначный характер. Для её объяснения были предложены многочисленные математические модели, основанные лота на учёте особенностей передачи энергии излучений чувствительным шпеням клеток. Однако было установлено /Корогодив В.И. и соавт., ЮТ/1/,что на величину ОБЭ излучений оказывают влияние не только их физические характеристики, но и свойство клеток восстанавливаться от лучевых повреждений. Вместе с тем систематические исследования зависимости ОБЭ ионизирупщх излучений от ЛПЭ о учетом свойства клеток в восстановлению до последнего времена не были проведены.

Молекулярные механизмы репарации лучевых повреждений в настоящее время наиболее изучены у прокариот. У бактерий üecherichia coli выделены чувствительные и суперрезиотентные к у-облученив пэогенные штаьыц, изучены механизмы в пути генетического контроля их радиочувствительности. В связи с этим можно полагать, что на бактериях Б. coli с разным репарационным генотипом можно наиболее глубоко изучить роль восстановительных процессов в характере зависимости ОБЭ от ЛПЭ.

Дель и аадачв исследования

Шль» данной работы является изучение закономерностей действия излучений с разной ЛПЭ на клетки Б.coli , различающиеся по способности к восстановлению от лучевых повреждений. При выполнении работы необходимо било решить следушие основные задачи*.

— Исследовать зависимость радиочувствительности бактерий E.coii дикого типа, радиочувствительного и суперрезистентного мутантов от ЛПЭ.

— Изучить влияние условий пред— и пострадиационного культивирования на зависимость радиочувствительности клеток дикого типа от ЛПЭ.

^Радюбиаюг*я,1ЭТ7, т. 17, №5. сЛ00-7Ю.

ЦЕНТРАЛЬНАЯ

научная библиотека Моск. свльс1со*оз ' им. rt.

иив.

• Исследовать зависимость форш кривых шдования клеток при действии излучений с разной ЛПЭ от условий пред- а пострадиационного культивирования.

• Изучать модифицирующее влияние аноксии и двух радиопротекторов на чувствительность различал штаммов а. сои к действию иониэирупщх излучений разного качества. . . ,

Научная новизна и практическая ценность работы

- Вперше получены материалы, свидетельствующие о том, что зависимости радиочувствительности бактерий Б.соИ от ЛПЭ излучений* определяются генетически детерминированными процессами (исследования проведены в широком диапазоне ЛПЭ). "

- Впервые изучено влияние пред- и пострадиационных условий культивирования на зависимость радиочувствительности бактерий от ЛПЭ излучений.

- Проведены детальные исследования факторов, вялящих на форму кровых выживания клеток при действии излучений разного качества.

- Изучено модифицирующее влияние аноксии и двух радиопротекторов на зависимость радиочувствительности бактерий от ЛПЭ, Показана генетическая детерминированность родиозалштного влияния модификаторов при действии ¿-лучей и отсутствие таковой при действии тяжелых

ионов. ; .

Результаты проведенных исследований имеют важное значение для дальнейшего развития радиобиологии. Материалы, полученные в данной работе, могут служить основой для проведения аналогичных исследований на клетках «укариот.

Объём работы

диссертация состоят из введения, 4 глав и шведов; изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрируется 29 рисунками и 16 таблицами. Список литературы содержит 137 наименований, из них<

• 42 работы на русском языке. ■ , „

Апробация

Материалы диссертации доложены на Вюфизическда семинаре ОИЯИ (Дубна, 1984, 1985) , 1У Всесоюзном совещании-сеюшаре "Актуальные проблемы микродозиметрни" (Усть-Нарва, 1383), XIX Международной Ев- ' ропейской конференции по радиационной бяологий (Чехословакия, Прага, 1905) . '

Диссертационная работа апробирована на мехдабораторном научно/ семинаре ВНШСХР, состоявшемся'27 сентября 1985 г.

На ЙЯ1ЦИГУ выносятся:

— Результаты оштов по исследованию зависимости радиочувстви— тельности изогенных штаммов бактерий е. coll от ЛПЭ.

— Результаты исследования влияния вред- и пострадиационных условия культивирования на зависимость радиочувствительности, клеток дикого типа от ЛПЭ.

— Дашше о факторах, влияпдах ва фО£му кривых, выживания бактерий В. coll.

— Результаты исследования влияния условий аноксиа и радиопротекторов ва чувствительность бактерий к действию излучений с разной ЛПЭ..

МАТЕИШШ И МЕТОДИКИ

Источники иптщзи иуилшх излучений:

Для решения поставленных перед настоящим исследованием задач (необхоДнмрбшоиспальэовать ионизирушие излучения, раэличаициеся по ЛПЭ вшироксм диапазоне. К таким излучениям относятся моноэнергетические пучки ускоренных тяжелых ионов. Ейсперименш: проводили на ускорителе многозарвдных ионов 7-200 Объединенного института ядерных исследований. Использовали ускоренные иош гелия и углерода. В качестве "стандартного" излучения применяли Д-лучи ,37Cs . Источник cu а—частиц являлся 2^Ри . Физические характеристики использованных излучений представлены.в табл.1. Эксперименты на ускорителе проводила на специально созданной установке с комплексом электронно-физической аппаратура.

Таблица I. Физические характеристики использованных . * излучений

Вид излучения aiejOTM, ЫэВ/нуклон ка^икм Модность дозы, Гр/с Источник

jf—лучя _ 0,3 0,58

рентгеновы — . 2,5 0,58 ETO-20Q-2O-5

лучи

а-частииы ПО 0,35 239^

11е4 8,0 22 1,5 У-200

Не4 3,5 42 1,6 7-200 '

Не4 2,0 63 1.5 у-гоо

С12 7.5 205 1.5 7-200

с12 4;о 333 1.5 У-200

С12- 3.0 410 1.5 7-200

Штаммы

В работе использованы следующие спали бактерий Escherichia coli к—12 î дикий тип AB XI57 ( tbr-1 leu-б pro А2 Ы.а-4 arc S3 lac y1 ©il KZ àra-14 xyl-5 mtl-t tex-33 etr a31 sup 237 ); ¿-резистентный мутант dl 1114 (Garar444 ); радиочувствительные мутанта AB 2463 ( reo л13" ), JO 5547 (гас Л13~в21~с22~ ) и р 3478 (pol л1~ ); термочувствительный мутант lo 173 (daataa46 ) и дикий тип к термочувствительному мутанту сд 34/45 .

Среды

Использованы следуювдае питательные среды; минимальная среда Elvis : Ш-буфер с добавлением 0,08$ глюкозы, 5 шт/«л тишна, 0,1 % кислотного гидролиззта казеина, 0,0001 % тиамина; среда YSP : I % пептона, I % дрожжевого экстракта,-1 % хлористого натрия;" среда •> ' АШ 1/2: приготовлена на основе акавопептида разбавлением в три раза 0,15 U на«. В некоторых опытах била использована среда АШ 1/3: приуготовлена на основе ашшодедтида разбавлением в четыре раза 0,15 U Had. В раде опытов к питательным средам добавляли 2% глюкозы. Разведение суспензии проводила в М9-буферв;Иэ.7 mu Jíh^ci, 43*7 miî Га2нро4, 23»2 mK Ю12РО+, 1 mLí KßSO^ 0,1 гаЦ CaClj, 9 mía IlaCl .

Определение радиочувствительности

Шращавание бактериальных культур проводили до стационарной фазы. Затем клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин (8000g ), культуру ресуспендировали в М&-буфере-Облучение монослоёв клеток тяжелыми ионами и ч-частицами проведали при коглнатной температуре на поверхности лавсановых ядерных фильтров (диаметр пор 0t&3 мкм), расположенных ва поверхности "голодного агара4 (4 % агар-агар), /-облучение проводили как в суспензии во флаконах объёмом IÛ ил, так и на поверхности ядерных фильтров. Способ облучения клеток не влиял на чувствительность к действию tf-лучей, После облучения суспензии клеток разводили в НЭ-буфере в рассевали на чашки Петри с твёрдой питательной средой улт ( среда yep с добавлением 2 % агар-агара). Опыты повторяй 3-5 раз.'. В ряде специально поставленных опытов суспензию клеток до облучения выдерживали разное время в МЭ-буфере.

Модификация радиочувствительности

В качестве радиопротекторов использовали глицерин в концентрации I M и цистеамин в концентрации 2.1СГ2. М. Инкубацию образцов с протекторами осуществляли в течение 20 мин перед облучением. Условия аноксии создавали путём барботации образцов азотом в течение 30 мин перед облучением. " . „ .

Методы статистического анализа

Подученные результаты,подвергали статистической обработке на ЭВМ (упроченный вариант метопа Розенброка). СЕибки относительных величин определяли из наибольшей шибки любой из сопоставляемых вели-поцученных в параллельных акслерпментах.

ЕЕЗУЛЬТАга И ОНДгаДЕШЩ

I. Роль генотипа в хатактдр^ адрисимости "радиочувствительности клеток B.coli к—12 i от линейной передачи a-нергии излучений' Кривые вышшанш клеток изученных штаммов бактерий при действии S-дучей, о£-частиц, ускоренных ионов гелия и углерода представлены на рис.1. Бак можно видеть из этого рисунка, чувствительность клеток АВ 2463. АВ 1157 и bl III4 к действию излучений с возрастающими значениями ЛПЭ ведет себя различным образом* Боли радиочувствительность ( d;1 ) клеток АВ 2463 с ростом ЛПЭ постоянно уменьшается, то у клеток АВ 1157 и BL III4 отмечается вначале её возрастание (шк-стольное при действии ш-частиц) и затем наблюдается снижение при дальнейшем возрастании ь излучений.

Рис.1. Выживаемость клеток АВ 2463 (а). АВ 1157 (б) и blIII4 (в) ори действии излучений о разной ь.

I - ¿г^лучи

137,

се ; 2 - ио-

ны гелия; 3 - «-частицы 239ри ; 4 - иона углерода. По оси абсцисс: доза облучения, Гр; по оси ординат: выживаемость, %.

S

На основании этих данных в материалов,.изложенных в диссертации, были построены зависимости радиочувствительностей клеток дикого типа, чувствительного и суперрезистентного мутантов огг ь . Результат» приведены на рис.2.. Как можно вздеть, у изученных штаммов, бактерий значения радиочувствительности наиболее сильно различаются при ¿•облучении, при действии ос-частвц наблвдаемые различия практически нивелируются. Значения о«1 при ¿г-облучении клеток ¿В 1157, АВ 2463 а вь 1114 соответственно равна 1,71+0,04 • КГ2, 9,97+0,57» 1СГ2 и 0,40±£,03-НГ2 Гр-1, а при с*-облучении,- 2,50^0,06-10^, 3,20+0,08*10"^ и 2,70^0,27*10^ Различия в величине иё1 при

действии на клетки излучений с малой ь и определяют различный характер зависимости о„1 (ь) V ниспадащий тип зависимости у клеток ¿В 2463 и с максимумам у клеток АВ 1157 и ЕЬ 1Д4, причем максимум, как можно, видеть, наиболее ярко .выражен у клеток вь 1114.

ю 100 тэ, ««vmoi

1000

Рис,2. Зависимость радиочувствительности клеток ВЬП14 (4) АВ 1157 (2,3) и ¿В 2463 (I) от ЛПЭ. фивая (2) для клеток, выращенных на минимальной среде ЕЫЭ; кривая (3> для клеток, выращенных на среде АМП 1/3. По оси абсцисс: ЛПЭ, кзВ/мкы; по оси ординат: радиочувстви-

тельность, Гр

7-1

Полученные наш материалы можно интерпретировать с учётом особенностей индукции и репарации повреждений ДНК излучениями разного качества.. Известно, что среди широкого спектра первичных повреждений ДНК, индуцируемых излучением, наиболее значимыми являются одноште-вые и двунитеше разрывы ДНК /Кашан С., 1972/2/.Установлено, что истинные двунитеше и сдаонитевае разрывы (ДР и ОР) ДНК составляют только определенную долю всех, образующихся в клетке, ДР и ОР ДНК / ^зеслер С,Е., Ноский Л,А,, 1978/ЗД Большая часть ОР и ДР ДНК воэ-

№ В ни, "Современные проблемы радиационных исследований*'. Ц.

•Наука", 1972, с Л28-137. ^'Радиобиология, 1978, т.1Б, а 4, с,548-555.

кивает в процессе действия ретарацпонных ферментов. Репарация 0Р- ДНК у бактерий"осуществляется с участием механизмов- pol л-зависимой (бастров) а ■ reo А-lex а-зависимой (медленной) репараций- В экспериментах на бактериях Шло показано / Bomire et al, 1975, Бреслер С.Е-и соавт., 1981^^.410 при ¿--облучении ведущая роль в образовании . ДР ДНК принадлежит энзиматическим двунитевда! разрывам (ЭДР). При возрастании L излучений увеличивается вклад прямых двунитешх разрывов (ПДР) ДНК и снижается выход ЭДР /Коэубек С., Красавин Е.А., 1984/Z5/^Следовательно, при ¿--облучении клеток в.coli различия в их чувствительности должны в основном определяться выходом ЭДР ДНК, что,в свою очередь, связано с работой репарационных ферментов, степенью их баланса /^»еслер С.Е.и соавт.»- .

В отличие, от дикого типа летальным,событием для клеток; reo Кутанта являются не только ДР ДНК, но в основном GP ДНК /Вреслер С.К н соавт.,1978'3', 1981^^Генетический блок репарации медленного типа определяет высокую чувствительность клеток штамма AB 2463 к ¿'-облучению. Поскольку с возрастанием ЛПЭ выход ОР ДНК снижается в силу возрастания флуктуации энергии частиц, для клеток AB 2463 мы дслжны наблюдать кисвададцую зависимость о^Чь) . Летальными повреждениями для клеток дикого типа AB II57 являются ДР ДНК» Расчёты шхода разных типов ДР ДНК в зависимости от ЛПЭ /Коэубек С., - Красавин Б. А., I9&4/5// показали, что выход ПДР ДНК с увеличением ь возрастает,, а ЭДР - снижается. Поскольку чувствительность клеток дикого типа х ¿•-облучению определяется выходом ЭДР, а при действии тяжелых частиц с высокими значениями L - ПДР ДНК, то характер зависимости D0~'(L) у клеток дикого типа будет определяться степень» их устойчивости к J-—облучению: при высокой их устойчивости к ¿■-облучению должна наблюдаться зависимость с максимумсм и наоборот..У клеток

bl III4, у которых имеется низкий шход ЭДР ДНК вследствие более пасокой степени сбалансированности репарационных ферментов по сравнении с клетками дикого типа, должна наблцдаться зависимость d£1{l) с ярко выраженным максимумом,. Действительно, как можно видеть из мате риалов, представленных на рте.2, указанный тип зависимости имеет место. . ' ' ■ *

Таким образом, нами показано, что зависимость d,1(l) определяется не. только физическими характеристиками излучений и гесметрией мишени, но также биологическим фактором - способностью клеток к репарации повреждений ДНК.

A/Радиобнология, .1981, T.2I.JH, с. 3-0. /5/Твлж обиология, I9Ö4, т.24, М, с.462-467, ^'Радиобиология, IS76, т. 16, №6, с.824-829.

Как уже указывалось, чувствительность клеток с нормальный гено-. типом к ¿Г-облучению определяется в основном ЭДР ДНК,.выход которых зависит от ряда привходящих условий. В следупцем разделе представлены результаты опытов по изучении зависимости у клеток дикого типа при различных-условиях пред- и пострадиационного культква-рования.. .

2. Модификация зависимости Р^Чь) у клеток дикого типа К»coll К-Т2 условиями культивирования •

Известно, что чувствительность клеток дикого типа к.coli g у -облучении варьирует в широких пределах в зависимости' от условий предредиационной инкубации /Мясник pollard b.c., Han-

dull в.P., 1973/, Установлено, что при выращивании клеток на бедных питательных.средах интенсивность белкового синтеза уменьшается /Stent g., 1972/.- Это отражается на экспрессии ряда генов, контролирующих скорость выражения индувдбельных функций, а следовательно, и на выходе ЭДР, ДНК.. Если чувствительность клеток вря ¿г-облучевии-определяется в основном выходом ЭДР ДНК, то ври возрастании значений L в инактивации клеток преимущественную роль начинают играть, как было отмечено выше, ЩР ДНК. Следовательно, при возрастания х> влияние условий разных сред на клеточную чувствительность будет уменьшаться. Это должно приводить к различному характеру зависимости DÔ1(L) У клеток дикого типа, шрощиваешх до облучения на рядр»т средах.

В наших опытах при облучении клеток частицами с разной L подучены материалы, свидетельствующие о тш, что при ¿"-облучении, штамма AB 1157 наиболее резистентной является культура, доращенная в предродиациопный период в наиболее "богатой" питательной среде, наиболее чувствительной — культура, выращенная на минимальной среде ЕМ9. Значения равны соответственно 158,0+17,4 и 33,$¿2,2 Ifc, то есть различаются ночей в 5 раз. При возрастании L различая в чувствительности клеток,, шращенных на разных средах;, постепенно нивелируются. При этом величина Dä1 у клеток, выращенных на "богатой" питательной среде, с ростом L изменяется Шстрее по сравнению с радиочувствительностью клеток,твыраценшх на минимальной среде,- Тая,- значения Dê1 оря J- и ot-облучегаш составляют у клеток, выращенных на мини--мальной среде, соответственно 2,95+0,19*10^^ 2,50+0,06-ХСГ^ Гр"1, а у клеток, выращенных на богатой питательной среде,.соответственно 0,63+0,07*ИГ2 и 2,50+0,06*КГ2 Гр-1. Это обстоятельство обусловливает разный характер зависимости Dj1(b) клеток дикого типа, выращенных на разных питательных средах. Как видно из рис.2, щи выра-

.^В кн.: Генетический контроль радиочувствительности бактерий. Атомиэдат, M..-I974.

давании клеток на минимальной.среде зависимость ü«1 (ь) hs имеет шксимумаД. кривая 2),. а при выращивании на богатой питательной среде — имеет ярко выраженный шксимуи при L »110 кэВ/ш<м (кривая 3).

Таким образом, на основании полученных результатов можно прийти к заключению,. что условия предрадпационного культивирования, по-видамочу,' влияют на шхсщ ЭДР ДНК. И поскольку ЭДР играют существенную роль в инактивации клеток лишь про малых. значениях L , то в конечном итоге они и определяют различный характер зависимости О^Чь).

Изменение активности фераентов, участвующих в репарации повреждений ДНК, , может приводить к различному выходу ЭДР, а следовательно, и различному характеру зависимости Dñ1(L) . В наших экспериментах в качестве модификатора радиочувствительности клеток в пострадиационный период , использовали.0,5 И Kaci. Обнаружено* что . при I-2-часовом выдерживании клеток дикого типа после облучения в 0,5 М NaCl чувствительность клеток к у-облучению возрастает приблизительно в 2 раза.. При действии ионов углерода сенсибидвзируший эффект отсутствует. Следовательно, и пострадиационные условия культивирования влияют на характер зависимости ué'tb).

3. Влияние условий культивирования на Фоту ктягеых выживания бактв- ■ тжй B.coii к—12 при облучении ионизирующими излучениями с шзной 1

Изложенные выше материалы о зависимости радиочувствительности клеток разных штаммов бактерий от ь излучений получены на уровне экспоненциального участка кривых выживания (КБ). Анализ факторов, вяияпцпх ва форму КВ и её зависимость от L излучений, не проводился. Шесте с тем известно, что форма КВ клеток является одной из важшх характеристик.биологического действия излучений.

Б материалах диссертации предотавлены данные, свидетельствуй щае о том, что в разных условиях предрадиапионного культивирования форма зависимости выживания клеток от дозы облучения (S(D)) различна, .Так,, при выращивании клеток бактерий на богатых питательных средах выявляются сдгмопдкые КВ, а при выращивании на минимальной среде — экспоненциальные..

Известно,что в богатых питательных средах /Kragln р., iiutchin-eon У., 1977/ число эквивалентов генома на клетку достигает 4-6, в сравнении о этим "ксшийность" генош клеток, выращенных па шгап-шльной среде, приближается к гаплоидной. Учитывая это, можно предположить, что именно фактор копи йн ости генома наиболее существенно влияет на формирование "плеча' КВ. В случае наличия нескольких копий генош для инактивации клеток необходимо поражение всех копий, "выживание" даже одной копии генома приводит к образования клеткой

шкрсколонш. Это обстоятельство может обусловливать нелинейный характер зависимости з(В) .

Известно /Етапа 1.М., -Ь*Ъег1а II. , 1975/, что в неблагоприятных условиях роста у клеток Б.соИ не образуется ноше точки инициации репликации ДНК,.а ухе имеющиеся решшкативные видки успешно дорешга-цируются с последующим делением клетки. Следовательно, в' неблагопри— - ятных условиях должно снижаться среднее число копий генома на кдет-,ку, что может приводить к трансформации сигыоиднах КВ.в аксповенца- , альные.-Лдя■проверки этого предположения намп^Цли поставлены опыты, в которых суспензия клеток до облучения выдерживалась в М9-буфере в течение 1-2 часов. Результаты опытов приведены на рис.З. Действительно, сшмсидные КВ клеток дикого типа и *ес а- -мутанта, выращенных на богатой питательной среде, при выдерживании в Ш-буфере трансформируются в экспоненциальные. При этом наклон КВ не меняется. Отсутствие экспоненциальности КВ при выдерживании клеток' вь П14, по-видимому, может свидетельствовать о тем, что з клетках этого штамод, возможно, сохраняется несколько копий.гена® даже при длительном выдерживании, что свойственно," например, и. га41о&игдп8 /Нао-яви м.т., 1970/.

\\ \\ \ V V ' л 6 , чс с

Рис.З,- ВшЕВае-мость клеток . Е.«о11 К-12 ЩИ у—облучении в различных условиях предрадиацп-онного культивирования. (а) — клетки АВ 1X57, .****«" 2-часовое предра-

диационное внде^ хивание в Ш-буфере (I); без выдерживания в ЫЭ-буфере (2); клетки вх,1114 (3): без выдерживания (•); с 2-часовым выдерживанием в ЫЭ-буфере (*);. (б) — АВ 2463: (X) — 2-часовое предварительное выдерживание в Ш-буфере; (2) - без выдерживания в ЫЭ-буфере; (в) - клетки АВ 1157: (I) - культура, выращенная-на среде ГОР ; (2) - культура, ш разе иная на среде тгбг + 2 % глюкозы; (г) — клетки ьс Г73, выращенные на АШ-среде до стационарной фазы (2), (I) - клетки, инкубированные перед облучением в течение 3 ч при непермиссивной температуре. По оса абсцисс: доза облучения, Гр; по осп ординат:'выживаемость, %.

Наше предположение о. существенной рола •"пловдиости" генома клеток в формировании сагмоидности КВ можно проверить в опытах с тер- . . нечувствительным по инициации авторе шшкации ДНК мутантсм. Известно /Pralick J.à. , 1978/, что у таких клеток при инкубации-в непержс-сивных условиях воше точки инициации репликации ДНК не образуются, а элонгация нитей ДНК успешно завершается. В связи с этим при инкубации клеток в перииссивных и непермиссившх условиях степень "ко* шйности" генома должна бить различна, что должно отражаться на форме КВ.. Действительно, как видео из рис.3, при культивировании клеток : до облучения в пермиссивных условиях характерна сишоидная КБ, которая трансформируется в экспоненциальную при непершссивной температуре. При этом надо заметить, что наклон КВ не меняется,

1 " . i

На рис.3 приведены кривые выживания клеток АВ 1157, выращенных .. на среде ïep с глюкозой и без неё. Как можно видеть, добавление в среду глшозы приводит к трансформации экспоненциальных- КВ клеток в сигмондные. Ife.исключено, что повышенное содержание глюкозы в среде влияет на степень "копийности" гежх.и.

Известно, что сигмоидные при ¿'—облучении КВ клеток про- и эука-риот во многих случаях трансфоршруются в экспоненциальные при возрастании L излучений /lodd г, I9CT, 1968/. Полученные наш материалы также с виде те льствуют об «см. Как видно из рис.1, где представлены кривые выживания клеток АВ 1157, АВ 2463 и bl III4 при действии -лучей, «-частиц и ионов гелия и углерода, сигмощцще при £-облучении КВ становятся экспоненциальными.при облучении тяжелнки ионами: гелия (АВ 1157 и АВ 2463) и углерода ( BL Ш4). Это связано о тем, что при возрастании L частицы, проходящие через клеточную мишень, о большой вероятностью повреждает .одновременно все эквиваленты генома клетки.

Совокупность полученных данных позволяет нам сформулировать вывод о 1Ш, что на фодоу КВ существенно влияет именно "плоидкость" генома клеток.. Наиболее существенно роль этого фактора проявляется при. ¿"—облучении. При действии' излучений с высокими ь фора КВ клеток определяется лишь физическими свойствами излучений.

Особенности биологического действия излучений с разной ь можно глубже понять,используя агенты, модифицирующие,радиочувствительность клеток. С этой цель» мы провели исследование влияния акоксии и двух радиопротекторов на чувствительность клеток при действии излучений о разной ь .

4. Влияние условий аноксии на чувствительность бактерий к действию, излучений с разной ь -

На рис. 4а-д представлены результаты исследований кислородного аффекта (КЭ) у бактерий ü.coli ори ¿"-облучении и действии ионов утл er рода.-Как можно видеть, при ¿-облучении величина КЭ зависит от генотипа и возрастает в ряду изученных штамдов к.colli reo А~-мутант * Вес а~в"\Г -мутант — дикий тши- овипг444-мутант pol л" -мутант. Значения КЭ соответственно равны .1,77+0,23 ♦ 1,98+0 ДО 3,38±0,29 + ЗД9±0,51 —4,6%0,44. Следовательно, генетический блок репараций медленного и быстрого типа влияет на величину КЭ по-разному: блокирование гес а-lex л -завистного типа репарации приводит к уменьшению величины КЭ, а блок pol а -зависимого типа репарации, наоборот, уси-

|*<1. г г

Рис.4. Выживаемость клеток í¡.coli к-12 AB Ц57 (а,д,е,к,л,п), AB 2463 (г,з,ы,о), BL III4 (б) и Р 3478 (в,ж,и,н) про действии излучений о разной ЛПЭ, Верхний ряд: (I) - нереальные условия; (2) - в условиях аноксии; (3) - в условиях аноксии с 2-часовым предваритадъ-кьгм выдерживанием в МЭ-буфере; {а,б,в,г) - при ¿"-обручении; (д) -при.облучения ионами углерода. Средний, ряд: (I) - нереальные условия; (2) - облучение в присутствии цистеашаа; (3) - облучение в присутствии цистеамщза в аноксических условиях; (е,к,з,и) - при ¿--облучении; (к) - облучение ионами углерода. Нижний ряд: (I) - нормальные условия; (2) - облучение в присутствии глицерина; (3) облучение d присутствии глицерина в аноксических условиях; (л,ц,н) - при ¿--облуче- ' пал; (о,п) — облучение ионами углерода. По оси абсцисс:-доза облучения, Г^р; по оси ординат: выживаемость, %.

ливает защитное действие аноксии в сравнении с клеткамидакого типа. Gamr444 -мутация существенно не влияет на величину КЭ. - Аналогичные результата о рели мутаций гее А" и pol д~ на величину ЯЭ при ¿-об— лучениибыли получены и другими автораш / зарога о.,, pioiden к.ы., Lorerock P.S, , 1977/.

Анализ представленных в диссертации материалов свидетельствует о том, что на величину КЭ оказывает влияние не только генотип клеток, но его проявление существенно варьирует' и у клеток с нормальным генотипом. Так, при выращивании - в предрадиационный период клеток AB 1157 на минимальной среде ЕШ величина КЭ равна 1,73+0,34, тогда как на брод* АШ 1/2 - 4,20+0,34. ~ . .

На рис. 4д представлены кривые выживания клеток дикого типа, облученных ионами углерода в нормально оксиге кировалкых и ансжсичес-ких условиях. Видно,-что КЭ в этш случае практически не выявляется. "Последнее обстоятельство кокет указывать на то, что с возрастанием £ излучений увеличивается выход повреждений, не модифицируемых кисло-родш и не восстанавливаемых pol л -зависишм типом репарации /Козу-бек С., Красавин Е,А., 1983/0^. ^

5. Влияние радиопротекторов на чувствительность бактерий ü.cqii к действии излучений с разной ь

Результаты исследования влияния цистеамина на чувствительность разных штаммов бактерий б.coli к действии ¿-лучей и ионов углерода представлены на рис.4э-к. Вущо, что защитный эффект цнетеамина наибов лее четко выражен только для клеток дикого типа. -Фактор изменения дозы (ФИД) равен в этом случае 2,28±0,35. Для репарационных мутантов радиоэащатыое дейстшо цистеамина резко снижено. Значение ФИД для pol а-— и гес а" • -мутантов равны1,3%0,2Х и 1,00+0,04 соответственно. Защитное влияние цистеамина при ¿f-облучешш клеток pol л" — мутанта в условиях аноксии также отсутствует (рис.4). Совокупность полученных нами данных свидетельствует о генетической детерминированности защитного действия цистеамина,так же как и данные.полученные другими авторами /^еслер С.Е. и соавт., 1974'9/|Г, 1976'6'/-Показано, что защитное действие аминотиодов на выживаемость клеток к. coli с нормальным генотипем реализуется посредством влияния их на баланс ' ферментов, участвулцих в деградации:л ресингезе ДЩ{. ,1^чтая сбалансированность процессов репарации ДНК в условиях препарата приводит к снижена» выгода ЭДР ДНК. При действии шотноионизирушкх излучений,, как ш указываливыше, мцдуцлцуцгея; преимущественно ВДР ДНК. Это об-

)Ö/ОИЯИ 19-83-743, Дубна, I9&3, o.I-IO. •Шщл, АНСССР, 1974, т.219, А4.-С.985.

стоятельство должно приводить к снижению защитного действия цистеами-ва. Действительно, как видно из рис.,4к, при облучении клеток иенами углерода защитное действие цастеамина отсутствует.

Результаты исследований радиозащитного действия глицерина приведены на рис.4л—п.Видно, что характер генотипа также влияет на величину его защитного действия. Однако, в отличие от цистеамина,. он заключается не в уменьшении или исчезновении протекторного влиянии препарата, а в возрастании защитного действия в ряду, изученных штаммов в.coli : reo а" -мутант —дикий тип —pol А~ -одтант. Величина «НД составляет соответственно: 2,03+0,32 —2,53^0,25—2,80t0,26. Аналогичная направленность генетической детерминированности защитного действия, как уже указывалось, проявляется и для кислородного аффекта. Облучение ангасических клеток е.coli в присутствии глицерина выявляет дополнительный к аноксии защитный эффект для. гее х'чфтав» та, клеток дикого типа и pol л~ -мутанта с величиной ФВД,равной соответственно 2,04+0,27, 1,88+0,26 и 1,78+0,39.

Зависимость радиозащитнаго действия глицерина от репарационного генотипа клеток можно связать о тем, что глицерин; перехватывая возникающие в процессе радисишза воды радикалы ОН*, уменьшает выход повреждений ДИК, восстанавливаемых pol л -зависима» типш репарации» Согласно /Козубек С., Красавин Е.А., 1903^^/ такое уменьшение1 приводит к генетической детерминированности защитного действия, аналогичной действию аноксии. Постоянная величина кислороднезависимого кш-лонента радиозащитного влияния глицерина у разных штаммов е. coli может свидетельствовать о тем, что в присутствии глицерина снижается также выход повреждений, не ра парируемых pol а -зависимым типом репарации, а восстанавливаема лишь шдленным типом репарации. Совокупность подученных нами результатов по 'защитному действию глицерина ' при ^-облучеюш клеток бактерий Б. coli с разным генотипе« свидетельствует о тш, что запятнай эффект глицерина есть результат физи- -ко-химических процессов.

Нарис,4о-а представлены результаты экспериментов по исследованию защитного действия глицерина на клетки u.coli разных шамлов при облучении ионами углерода. Наличие защитного эффекта, по-видимому, может свидетельствовать о том, что в условиях глицерина уменьшается. выход ОДР ДНК, а также: о том, что в присутствии глицерина изменяются г геометрические характеристики чувствительного объёма - бактериального нуклеоада / Красавин Е.А..и соав.,. .

• ^^Радиобиология, 1971, т.И, № 2. с.249-252.

BIB одн

I. Зависимость радиочувствительности (dJ1 ) клеток бактерий е.coli к-12 от линейной передача ввергни <1) определяется генетически детермшшровщщнми процессами. Для g -чувствительных мутантов характерна ниспадащая форма зависимости D«4b) . для у-разлстент-ного мутанта - зависимость d»1(x>) с максимумом при промежуточных значениях ъ .

2. Форш зависимости Dâ'(i>) 7 клеток дикого типа е.coll различна при разных условиях предрадпационного культивирования. В условиях роста на минимальной питательной среде характерна нистадаюдая зависимость , при шрашвании на богатых питательных средах -зависимость dI4l) с максимумом при промежуточных значениях ь .

ЭГЦри значении L излучений, равном НО кэВ/мкм, происходит нивелирование различий в радиочувствительности всех втаммов: чувствительность клеток определяется физическими характеристиками излучений* геометрией мишени. •

4. Оещим из основных факторов, определяющих сигмазданй характер кривых выживания клеток s.coli при ¿■-облучении, по-видимому, является количество вквявалентов генша в клетке. С ростом L излучений сигмоидные кривые выживания клеток трансформируются в экспоненциальные.

5. Радиозащитное действие аноксии и кекотсдах химических протекторов при ^-облучении клеток s.coli определяется генетически детерминированными процессами. Защитный эффект цистеамина проявляется за счёт уменьшения выхода ЭДР ДНК. Радиозащитное действие глицерина есть результат физико-химических процессов. При действии излучений в высокими значениями l защитное влияние условий авоксин а цистеамина отсутствует. Глицерин ващиярет клетки бактерий и при действии тяжелых ионов.

По теш диссертации опубликованы следующие работы; -Амиртаев К.Г., Красавин Е.А., Козубек С., Нямсамбуу А. Влияние «-облучения на чувствительный и суперрезистентный мутанты бакте-*\риЗ Escherichia coli - Радиобиология, 1985, т.25, №1, с.20-23.

-К.Г.Амиртаев, Е.А.Красавин, С.Козубек, Б.Токарова, А.Нямсамбуу. Роль генотипа в редиоэапитнсм действии глицерина при у-облучении бактерий Escherichia coli. - Studie Blophysica, 1965, vol.106i numb,*2, p, 131-142*

B.A.Kraaavln, S.Kozubek, К.a.Amirtay©v. The role of EKA Repair la realisation of oxygen effect la. different mutants of Escherichia coll. - Abstracts European society.for Badiation biology 19th Annual meeting, Prague, 1985, p* 115*

Красавин E.A., Амиртаев К.Г., Козубек С., Токарева Б., Сиыо- . t. нян Н.В., Дкашоладан Н.Л., Степанян Л.Г.,' Череьатенко А. П. Роль генотипа в протекторном влиянии цистеамива и глицерина на клетки Escherichia сои при действии излучений с развой линейной передачей энергии. - Сообщение ОИЯИ, PI9-85-72I, Дубна, .1965, с.1-7.

Рукопись поступила в издательский отдал 21 октября 1385 года.

к

Редактор Е.К.Аксенова.

Не кет Н, А. Киселевой.

Подписано е печать 24.10.85. Формат 60x90/16. Офсетная печать. Уч.-изд.листов 1,01, Тираж 140. Закаа 36863.

Издательский отдел Объединенного института ядерных исследований. Дубна Московской области.