Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РЕПАРАЦИЯ ЛУЧЕВЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ И РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОК

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "РЕПАРАЦИЯ ЛУЧЕВЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ И РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОК"

, ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СССР

ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИ

На правах рукописи , 19-89-707

ГЛАЗУНОВ Александр Викторович

УДК 577.391: 663.12/14

РЕПАРАЦИЯ ЛУЧЕВЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ" И РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОК

Специальность: 03.00.01 - Радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Обнинск 1989

■ ■- 'Г; )

Работа' втолвена в, Объединенном институте ядерных' исследований

.Л < ■■ "

Официальные оппоненты

доктор биологических внук Г. М. Аве тисов

доктор биологических наук В. Г.Петин

доктор биологических наук В.А.Тарасов

Ведущая организация - Институт антологии АН СССР, Ленинград

Заюта диссертации состоится ■ш -жт 1_:1Э З&ода па заседании специализированного Совета nd радиобиологии Д. 120. 81.01 ори Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии Госкомиссии СССР- по продовольствие и 'закупкам (Москва, Волков переулок, д. 4)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной радиологии. Отзывы на авторе»ерат просьба неправпять по адресу: 242020, Калужская область, г. Обнинск, ВНИИСХР, специализирован ный совет.

Автореферат разослан "

Ученый секретарь специализированного совета к&пдидат биологических наук -

К. И. Санжарова

. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ« ■

Центральную роль в обеспечении устойчивости' клеток к облучению ионизирующей радиацией играет репарация радиационных повреждений. 8 этом аспекте шундаментальное- значение приобретает изучение репарации ДНК, обеспечивающей надежность генетического аппарата клетки в условиях воздействия ионизирующей радиации« , и . связанных. с ней процессов восстановления жизнеспособности клетки* -,г ■

Актуальность данного направления,, исследования связана преждеесего с тем« что его развитие .должно привести к режению одной из основных■ проблем радиобиологии описании молекулярных механизмов* ответственных за лучевую инактивацию клеток. Вместе, с тем важность данного направления исследований обусловлена и ¿е несомненным практическим , значением в таких - прикладных ; отраслях науки как запита л. от. ионизирующих ' излучений« радиационная гигиена, лучевая терапия и других. Исследование репарационных процессов, имевших место а ■ облученных клетках, опенке вклада репарации радиационных повреждений разного типа а радиорезистентность - клеток , позволит выработать научно обоснованные нормы радиационной безопасности*

,: - Репарация,ДНК:и'процессы восстановления вирою исследуются на протяжении последних- трех* десятилетий. . За' это., время достигнуты впечатляющие успехи в этом направлении* Однако при анализе / данных литературы ~ отчетливо ..просматривается определении) разрыв в изучении процессов, имеющих место на хромосомном' уровне при г воздействии повреждающих агентов (индукция и репарация повреждений ДНК), и процессов, протекающих в ответ на 'повреждающее воздействие не уровне .клетки, (восстановление жизнеспособности и других Кункцип^ клетки!. Причины этого понятны.' Чтобы проследить . всю цепь ; событий от* первичных .повреждений, ЛНК до реакции на уровне; клетки, необходимо знать механизмы больпинства биохимических процессов, имеющих место в клетке,, что, конечной ' не соответствует современному состоянию биологии. В связи сэтим.особое значение

\ У : :

V ЦЕНТРАЛЬНАЯ НДУЧИДЯ '

■ '' БН ЛИ01£КД : ' Ч /' .. ;

■.■-■'. о ся- иям

■ СШШГЗШШШШ ' ДиДДЕПЕЗ ' . ^ .

' • • " (Г Д. рм •

приобретает разработка систем,' для которых; была бы четко -и однозначно показана связь между'эффектом | повреждавшего агента ~ на молекулярном уровне и реакцией на* клеточном уровне« Таких систем по данным литературы крайне мало., * \ - ^ V .

Одним из' самих тяжелых. повреждении генетического , аппарата клетки '; является двунитевой ^'разрыв (ВНР) ДНК. * С этими повреждениями сеязшают' репродуктивную"'гибель 1 клеток после воздействия ионизирующей радиации: и ряда других инактивирующих -.агентов.' Клетки про- и эук^риот способны рёпарировать ¿тот вид повреждений. Способность *к ' репарации7'. ЛНР. ЛНК важнейшая .'характеристика, надежности генетического' аппарата клетки. Однако^ механизмы репарации ДНР ДНК практически_ не изучены!: имеются лишь' гипотетические схемы ' этого ''процесса ■*" (Королёв' Грачева,,' -V« Кввп1ск, йтв'2') ; ;; Причем ' лишь' в ' одном- случае ' установлена четкая связь", между! процессом' репарации''ДНР . ДНК '. (ЬисЪп1к еь ■■ а1.',1977'') с'- пострадиационным ' восстановлением дрожжевых: клеток 'ори ' вшерживании в . непитательной ' среде, (Корогодин,19бБ'+/1. Между тем известно^ что ■ '. данный/ тип пострадиационного восстановления клеток'не вносит'значительного вклада в регистрируемую V радиорезистентность -клеток( при 1 стандартных условиях : облучения т~ и : пострадиационного культивирования, поэтому способность к данному виду репарации ДНР ДНКне может служить;адекватной характеристикой'надежности генетического аппарата»дрожжевых клеток^ '■.'■•- :'-'1

; .; Иепь_и.заичи_работу .>.-- . -...';'. ■ ,■ .¡..^ :,.

-«В- связи со сказанньм'выше, цельюнастоя вея работы явилось -изучение ' процессов < . пострадиационного'. восстановления," определяющих ■', радиорезистентность клеток. ■ и выявление молекулярных механизмов;7 лежащих5 в . основе' этих ^процессов. . Для'* этого необходимо было решить следующие задачи!-■' *' >I) : Выбор объекта V исследования' ; 1 и - - разработка экспериментальных подходов для1 выявления и, изучения процессов пострадиационного восстановления( вносящих существенный вклад в радиорезистентность клеток.' Количественная' . оценка ,. вклада пострадиационного восстановления в: радиорезистентность -клеток

, 2) -1 Изучение - - закономерностей : пострадиационного восстановления дрожжевых клеток ■ разных ; видов и генотипов.

Изучение ' генетического - контроля ,- пострадиационного восстановления ■ у дрожжей.;' : * * /

3)' Разработка экспериментальны* подходов' для ■ изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе / пострадиационного восстановления дрожжевых,, '• клеток. *. Использование других ив активирующих . факторов (не ионизирующее излучение ', х имические агенты, гипертермия, сонетаиное воздействие) для изучения' механизмов пострадиационного восстановления.дрожжевых клеток.

4) Установление связи пострадиационного восстановления жизнеспособности дрожжевых клеток с ■ репарацией ■ ДНР ДНК: Изучение механизмов репарации ДНР-ДНК в дрожжевых; клетка*. ■

5) Разработка модельной системы для изучения репарации ДНР ДНК.на основе плазмидных векторов, * позволя»ивЯ, количественно оценивать основные."■■ параметры * репарационных процессов.

- Относительная оценка вклада разных видов репарации в элиминацию

дкр днк. : \у ■ 1

«) Формулировка качественной модели ' лучевой .'инактивации гаплоидных и диплоидных дрожжеп с учетом современных . данных молекулярной биологии и генетики *,и на основании собственных результатов исследований., . -

Вахзваз.ьевит ; ..V"X..

V Получены следующие основные результаты,' имеющие принципиальную новизну, которые выносятся на защиту г.

1) Данные > демонстрирующие способность дрожжевьк клеток к неизвестному ранее 'типу пострадиационного; восстановления жизнеспособности 7 быстрому;пострадиационному восстановлению.

.2) Данные ло - генетическому контролю быстрого А пострадиационного восстановления и оценке 'его вклада 'В : регистрируемую радиорезистентность клеток • ' : - <.,-' '.(

3) Закономерности быстрого пострадиационного восстановления дрожжевых клеток. . .- ■■.'>-''.

4) Сравнительна- анализ , быстрого - пострадиационного восстановления с процессами восстановления после воздействия других инактивирующих: »акторов (УФ-мзлучение, химические агенты, гипертермия). .."■■- ' .

; 5): Результаты/' демонстрирующие ,Ччто в основе быстрого пострадиационного восстановления , дрожжей лежит быстрая

репарапия ДНР ДНК.

■ : с) Данньв. показывающие, что быстрая и ранее известная у дрожжей в <31-Фазв клеточного цикла медленная репарация (шсЬп!к «г а!.-,1977'?') является разным путями /репараций •'ДНР ДНК у облученных в С1-«азе клеточного' цикла - дрожжей" при' ■ и* выдерживании в непитательной среле.

7> Данные по оценке вклада быстрой репарации ДНР - ДНК в радиорезистентность.диплоидных' клеток. 1"

в) Разработка модельной системы для изучения репарации ДНР ДНК. на основе автономно реплицирующегося дрожжевого вектора• Система - позволяет оценивать: .эффективность репарации - ДНР плазмидноя ДНК в дрожжевых клетках разных ' Генотипов, а также соотношение . рекомбинационного и нерекомбинационного путей репарации ДНР ДНК.

9) Данные по эффективности ре комбинационной и . нерекомбинационной репарации ДНР плазмидной ДНК у дрожжевых клеток разных генотипов.

Ю) Данные,, демонстрирующие ■■■ связь ре комбинационной репарации ДНР плазмидной ДНК с быстрой и медленной репарацией ДНР, ДНК у дрожжей. ■ ' > >■.

. и) Обшая схема инактивации дрожжевых клеток ( Подвергнутых воздействию ионизирующей радиации. Схема построена на основе полученных здесь экспериментальных результатов, а также данных., известных ранее. .

!!&1!Е1Вческ8я_денвдс1ь_р5&е1ы : В работе репена крупная научная проблема, связанная с исследованием механизмов, обеспечивающих радиоорезистелтность -клеток г . а также устойчивость клеток - к комбинированным воздействиям. Совокупность: представленных? в диссертации экспериментальных ланнш, . обоснованных научных .положений, и теоретических обобщений можно рассматривать в целом как развитие , нового перспективного научного направления в радиобиологии клеток, имеющего важное значение для понимания механизмов, обусловливающих . разную радиочувствительность ' клеток ...,,

. Полученные в диссертационной работе' результаты . имеют важное теоретическое и практическое значение. Обнаруженные в

работе , эмекты быстрого пострадиационнохо и постгипертермического восстановления, а;также восстановление от повреждений, возникающих ' в;. • результате ' комбинированвого воздействия гипертермии и радиации, необходимо учитывать при разработке методов радиосенсибилизации опухолевых клеток. Эффект быстрого восстановления=можно использовать как простой .тест'для определения способности клеток к ре комби на о нов ной репарации ДНК. Данные, касавшиеся- быстрого ■'■ пострадиационного восстановления, вошли в учебник ло радиобиологии ; С. П.Ярмоненко "Радиобиология человека и животных" ML1985.

Обнаруженный эффект увеличения частоты трансформации дрожжевых клеток в:результате линеаризации плазмиды в участке, гомологичномхромосомной ДНК клетки-хозяина! . перспективен.■; для1 . использования в качестве теста для определения: рекомбиногенной способности исследуемых штаммов. Это может быть особенно важно для промышленных штаммов i для которых * - как правило, не развиты классические генетические тесты.

Вьводы, касающиеся лучевой инактивации клеток, вскрывающие молекулярные механизмы, которые лежат в основе , реакции клеток на воздействие-ионизирующей радиации, имеют важное значение для разработки методов мониторинга радиочувствительности , и' методов зашиты от ионизирующей радиации. -' ■

ÍDBS$9ÍB5_5!JS£§BIS8ü!J ■1 -, Основные' положения диссертационной 1 работы доложены на 13-ой Международной' конференции ло молекулярной ■ биологии и генетике дрожжей ЛФранция, Монтпелье, 1Э82)» i-ом Биофизическом съезде (Москва, 1982)í Иколе-семинаре по надежности биологических систем (Чернигов, 1982)* 14-ой Ежегодной конференции Европейского общества по мутагенам внешней среды (Москва, 199«)t Всесоюзном семинаре "Проблемы количественной радиобиологии" (Чернигов, 1эев); 9-оЯ Всесоюзной конференции "Восстановительные и компенсаторные , процессы при лучевых поражениях" (Ленинград,198«)t1 s и «-ом Всесоюзном совещании "Актуальные: проблемы кикродозиметрии" (Усть-Кареа, 1986, Канев,19в9); 4 и 5-ом Всесоюзном семинаре по* молекулярной генетике дрожжей (Петергоф, 1987,1989)> 5-ом Съезде ВОГИС им. Н.И.Вавилова (Москва,1988); Рабочем совещании по молекулярным

механизмам мутагенеза (Новосибирск. 1988)j Рабочем совепавин по генетическому действиюкорпускулярвы» излучения (Дубна,19вв)» з-еи Симпозиуме памяти Н.В. Тимофеева-Ресовского (Ереван, 1эвэ) г; 1-ом Радиобиологическом съезде (Москва,1989)

Диссертационная работа апробирована на Биофизическом семинаре Объединенного института ядерны* исследований (22 июня 19В9Г.) и семинаре ВНИИ сельскохозяйственной радиологии Госкомиссии СССР ло продовольствию и закупкам (Э октября 198Э г. ). /\; - : '

Публикации .

Основные результаты исследований, представленные в диссер-таиконноя работе, ;изложены в 33 публикация!, из них

7 опубликованы в виде тезисов доклада.

Структура и объем .-. Диссертационная работа состоит из б. глав,- которым предпествует введение, заключения и выводов. В первой главе описаны материалы и методы исследования. Вторая глава посвящена анализу, данных литературы, Формулировке задач исследования и иллюстрирована собственными экспериментелькьмн ' данными, касающимися известных основных положения радиобиологии клеток.

8 последующих.4 главах излагаются • результаты и проводится обсуждение1 собственны* экспериментальных' и • теоретических исследования.

Диссертация изложена на 41+ страницах текста, включающего список литературы, иллюстирована 67 рисунками н 31 таблицей. Библиогравическия указатель включает в1 работу на русском языке и 259 работ зарубежных авторов. ■' '.

■* , : МАТЕРИАЛЫ И METOflU \ г

. 8 главе - 1 диссертации описаны. материалы и; основные методические подходы, использованные в работе.

' Основным объектом исследования, использованным ;здесь,. являются дрожжевые клетки разных видов и, генотипов. Дрожжи являются одноклеточным эукариотическим организмом, удобным для радиобиологических и генетических исследования. Для дрожжей хорошо развиты методы классической й молекулярной генетики-Кроме того, имеется возможность поддерживать . вегетативную гаплоидную и диплоидную «азу, что дает возможность изучать роль

плоидаости ' в . обеспечеиии нале «я ости - вуыкционнрования генетического аппарата клетки при воздействии повреждавших агентов . Всего в работе использованы 34 гаплоидных и диплоидных штамма: дрожжей s.c«r«visiae резных, генотипов. Кроме .того« -использованы также э штамма дрожжей-Pichl» plnua. В, отдельных . экспериментах использованы клетки Escherichia coli, а также клетки китайского хомячка линии V79-4. ' .

Клетки облучали г-квантами " С» (Установка "ГУПОС" - (80НЦ AW( СССР); мощность дозы 6,7 + о.з Гр/мин и установка "Свет" (ИМЕЛ АН СССР)J мощность дозы 35 + э Гр/мия) и «-частицами 239ри {ЛПЭ » 180 кэВ/икм» мощность'' дозы 21 Гр/мин)." Использованы также ионы (4 НэВ/нуклон, ЛПЭ - . эзо к»В/мкм, Ускоритель

У-гоо (ОИЯИ)). У-.-

' V-Облучение и гипертермическуо обработку дромевш клеток! проводили в суспензии. В случае клеток млекопитающих обработке радиацией и (или) гипертермией подвергали монослой клеток в стеклянных влаконых* с ростовой средой. ;

Облучение тяжелыми частицами', проводили на поверхности голодного агара по методу В.Г. Петина (1969)^®^' .

В качестве i основного биологического теста в/ работе . использована выживаемость клеток, определяемая по способности клеток.сформировать макроколонию я&,твердой питальноя среде.

В отдельных разделах работы в качестве теста использовали реципрокную и нереципрокную генетическую рекомбинацию, а также генетическую . трансформацию' дрожжевых „' клеток . плазмиаными ■ векторами. . /.}..':'.'. ^ '

" Для выявления индукции и репарацию) ДНР ДНК в ; облученных . клетках дрожжей использовав метод седиментации ДНК в градиенте концентрации нейтральной сахарозы, модифицировании) В.М.Глазером (МГУ)/3/.

Выделение, рестрикционный анализ алазмидяой ДНК проводили стандартными методами (Маииатис и др^.ивз'6'). , ' Трансформацию дрожжей плазмндяыми векторами ' проводили "литиевым", методом (Altherr *t о использованием

ДНК-носителя (гетерологичная ДНК, - подвергнутая ультразвуковой обработке).

Статистическую обработку' результатов проводили

• /О $

стандартными методами (Тейлор.196S .

Г'.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ* И ТЕОРЕТИЧЕСКИХ 1

• ' ' ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ■ ."'л-4;;;

^ . В главе: 3 описан ' ранее: неизвестно). ; яеномен быстрого пострадиационного восстановления жизнеспособностидрожжевых ■ клеток к исследованы его закономерности, что позволило: вскрыть молекулярный -механизм, лежащий в основе данного явления, ."• • В первом разделе, настоящей главы,' дано, описание феномена быстрого воет ради а цнои и ого восстановления.-. - ' "'■.-.

'-.*", , На рис. ^представлены результаты опытов по г-облучению диплоидных; дрожжей'б.свгв71&1а« гвтз-1В в С1-фазе . клеточного кикла. Видно, что при высеве клеток;на стандартную питательную' среду тгеро их выживаемость не зависит ,от температуры облучения (о или 20°С) йот выдерживания облученных клеток в воде при 28° С в течение.! ч перед высевом. '(кривьв 1-3).. рысев .клеток, . облученных при 20°С, на солевую,среду уерЬ + а* маС1 приводит к снижению их выживаемости (кривая 4). Этот эйвектхорошо известен в радиобиологии дрожжей. Подобное снижение выживаемости не' связано с подавлением; репарационных; . процессов, о с : ::'Л:' .д. „г ' РисД'-'1. Кривые выжива-

-- 100 200 300чоо и . •

ния диплоидных дрожжей S.cerevislae 2873-1В П0СЛ6 .

облучения г-квантами.

' Светлые символы - высев на среду yepdi темные символы - высев на среду yepd + в% Kaci. 1,4 - облучение при 20°С,' высев сразу 'после облучения! 2^5облучение .

' при о°С,' высев сразу ; после облучения t з,б,- облучение ; при о°С, выдерживание в течение 1 ч при 28°С. По оси абцисс -доза^-Гр* по оси ординат -

1 выживаемость/ ,1 ■

■ .'■•(> ■„■ ■■■■'■i-..-' '

повышением вероятности проявления > ■ лучевых повреждения■' -величина .модификации выживаемости хлористым> натрием , одинакова как для' только что облученных клеток, так. и для клеток« претерпевших максимально возможное. восстановление в-, воде * (в течениез-4 сут) и сохранивших только необратимые повреждений (Кабакова. Капульцевич, иеэ'9'). Добавление Kaci в питательную среду не уменьшает величину - °0 •' ® - снижает . величину' экстраполяционного-числа' кривой выживания: при достаточно высоких концентрациях (feci снгмондная' кривая может превратиться в экспоненциальную. Поэтому.' и максимально возможная ' величина модификации выживаемости зависит от формы кривой выживания: - -чем меньше экстраполяционное число, тем меньше модификация выживаемости, а у объектов с эксповенпнальнши кривыми выживания; (гаплоидные дрожжи) Had вообще не влияет на выживаемость; . В данном случае добавление в питательную среду в% Haci привело к снижению выживаемости . клеток, облученных. в дозе экс Гр,'с ао до 40% (кривая 4), . однако' кривая выживания' клеток на солевой :среде ешв сохраняет сигмоиднув * форму -экстралоляционное число ее составляет около 2 (соответствующая кривая . данного хггвмка,' . на стандартной среде имеет экстраполяционное' число 4 и '■■ ■выл» >. По-видимому,.' ■ для ^ превращения этой кривой в экспояенту'необходимы ; более* высокие концентрации Kaci. ■ ':"* .■ *■■'

Неожиданные результаты дал вариант опыта, в котором клетки облучали при<о°С и высевали на солевую среду.(рис.1гкривая 5). Оказалось', что снижение температуры облучения с го до о° С при высеве клеток на солевую среду приводит к резкому уменьшению выживаемости— у клеток, облученных-в дозе. 350 Гр, выживаемость снизилась с 40 до * 3,6*, т.е. в 7 раз..' Поскольку в двух .вариантах опыта (кривые 4 и 5) все условия; кроме температуры во время облучения были идентичными, естественно предположить, что во время облучения при зо°С клДтки восстанавливались ■ от' лучевых повреждений, летальное действие которых проявляется при повышенном содержании«пористого натрия в питательной среде, а низкая, температура .во время . облучения препятствовала , восстановлению, поэтому выживаемость клеток . на , солевой.. среде оказалась пониженной. В случае справедливости этого предположения следовало ожидать, что если клетки, облученные

при о°С, выдержать в воде при оптимальной температуре 'ге° С. перед высевом на солевую среду, то ш выживаемость должна повыситься.')! действительно* выдерживание таких клеток при 28°С в течение.1 ч привело к'повышению выживаемости (кривая - 6) почти до уровня соответствующей величины для клеток, облученной при ЗоРс . (кривая >4). ^ '

Рис.2. Кривые выживания ■ диплоидных дрожжей г.с«геу151а« 2В73-1В после облучения «-частицами. Обозначения те же, что; и на рис.1.

100 150 200

■ ■'. Результаты опытов по "»-облучению диплоидны* дрожжей 8.сеге¥1в1аё:2в73-1В представлены на рис.2. Как и в предыдущей серии экспериментов, высев клвток на стандартную среду не дал никаких:различий в.выживаемости клеток, облученных при з-4°С и го°С или облученных'при 3-4°С и выдержанных при 28°С в - воде в течение11 ч (кривые 1-3). Более .'. того, даже . высев клеток на солевую среду сразу после - облучения при 20° С не привел к снижению выживаемости (кривая 4). Это можно объяснить тем, ч!о-' кривая"выживания в этом случае имеет относительно небольшое; плечо' (экстраполяционное число п—1,7), ' а : модифицирующее -действие хлористого натрия на-выживаемость клеток; облученных при 23°С,;как уже упомянуто выпе, зависит отвеличины плеча' Таким образом, в 1 отличие от ■ результатов ' предыдущих опытов, выживаемость клеток/ облученных «-частицами при го°С оказывается одинаковой'на стандартной и солевой питательных средах'. Другими словами,' сам по себе хлористш натрий не усиливает, летального' действия радиации. Тем не'менее,;снижение температуры во 'время облучения до з-4°С и в этих -опытах привело к значительному

уменьшено. выживаемости «а сопевол ере ее (крив е. л-. 3), и выдерживание облученных клеток ■ при га°с в течение I ч • повысило выживаемость до исходного уровня (кривая.«)'. Поскольку в данном случав хлористьв! натрий уменьшает выживаемость лиш> тех клеток«' которые были облучены при низкой .температуре,/ а после выавржнвания при зв^С их.выживаемость на сопееоп среда оказывается такой же, как и на стандартной ' питательной среда* наиболее правлоподобнш объяснением наблюдаемых изменений выживаемости является постравпмшонное восстановление' квдток от лучевых повреждений.". - V, -

Представленные результаты опытов с диплоидными клетками з.сегву1в1аа допускает слеаувиуо ивтепретаиию. Клетки способны очень быстро (в пределах■'; одного часа) восстанавливаться огне которой части лучевых повреждений, индуцируемых облучением. -Это . быстрое восстановление/можно полностью'' или частично подавить снижением температуры или. ловышеяндеи.. концентрациями Нас1. При в ыр вшивании об луче анш ■ клеток ка полноценной питательной среде бштрое восстановление - успевает ~ завершиться полностью (репликация ДНК и почкование дрожий начинается аииь через ч после высева ^ клеток, нехолящихся в стаиионаряой вазе роста культуры (Корогодин,19бб/+Л) »поэтому выживаемость клеток оказывается независимой от температуры облучения - 20 или о°с. Если облучение ; и последу оиа я .процедура разбавления клеточных суспензий И ^высева и* , на питательную среду проводиласьпри комнатной /.-л температуре, . то ■ быстрое восстановление также:успевало завердоться, поэтому выживаемость клеток на солевой среде оказывалась - такой же, как и на полноценной среде (облучение ы-частипами, рис.2) , или аесколъжо пониженной за.счет повышения вероятности проявления оставшихся лучевых повреждений (г-обвученне, ' рис.1). Сели же . облучение клеток проводили при пониженной температуре , а затек : вкеваш их иа солевую среду, то- быстрое восстановление частично или полностью подавлялось, что приводило к , существенно*/ сиижеп»х> выживаемости* Повкаенне'те«дературц ооспе облучения до гв°С способствовало осуществлению быстрого . восстановления, - что проявлялось в повышении выживаемости к латок и а солевой среде..

Альтернативная гипотеза,. объясняющая поа давние - выживаемости клеток после вццержкеання при пв '

низкой работе

- восстановление*» а снятием сеиисибиинзирующаго действии температуры,' противоречит. представденнш ■ в экслеримёнтельндо д&кнш.

' Рис.з. Выживаемость .

диплоидных дрожжей " /

S-cat-evieiae 2873-1В' на'

солевой среде; (*efo +

в* НаС1) после облучения

г-квантами (1 - доза

облучения 340 "гр> и

«-частицами (2 - доза ios

Гр) в зависимости . от

продолжительности

выдерживания в воде при ... 2вос> ■ ■ j .

По оси абяисс - врем, мин; по оси ординат' -; выживаемость,*." . ■

Для оцеаки скорости обнаруженного восстановления мы определили выживаемость клеток s.certvisias 2873-iß, облученных у-квавтами или «-частицами, после разных сроков выдерживания в. dütta «рк перед высевом на солевую среду {рис.э> .Как видно, уже через 30 мин выдерживания кривая увеличения выживаемости выходит на плато как для клеток, облучении* г-квантами. так и «-частн«ами;.Это означает, что скорость данного восстановления на 1-2 порядка вше скорости медленного: - восстановления, регистрируемого по повихени» выживаемости клеток на полноценной питательной среде после - т выперживания - в воде (Корогоднн,1<>66/Ч/). -. ,

.. Описанное здесь пострадиационное восстановление дрожжевых клеток названо "быстрым", в отличие от, известного ранее -"медлен нот о" * ' ■■■ ■

Оказалось/ что иэогеяные использованномы выше втамму гаплоидные клеткЬ s.cereviaiae гатз-гл, у-облученные в Gi-яазе ■».лат очного никла, не способны к быстрому, восстановлению.

Далее было выяснено, ; что , быстрое пострадиационное восстановление можно подавить,, высевая клетки на полноценную питательную среду, содержащую i,s М KCl или кио^.

Быстрое восстановление также можно обратимо подавить при Облучении в 8% НаСХИЛИ 10% КСХ. Удаление ЫаС1 (КС1) и ресуспендирование- облученных клеток в 12,5% глюкозе - с-

■ Ч" < ®Р° А \ ► . 14 * \ • 0 К to с О Л

1 in ир МО vp 190 2» Jp

ц ■ я ц> ю' ^Ь \\ f « ■ А 'И \

Рис.4..Кривые выживания ДИПЛОИДНЫ« дрожжей S.cerevieiae * XS300 (RAD/RAD)(А).XS1806 (ra<J50-l/rad50-l) (Б) , XS806 , (radSl-l/rad51-l)(С), XS1S9B (rad52-l/rad52-l>(D), XS1889 (rad53-l/rad53-l>(E), Тэ (rad54/rad54)(F), XS193S - (Md55-Vrad55-3) (G) , XS198& (rad5?-l/rad57-l) (H) ПОСЛЕ

облучения »•-квантами. . Светлые символы - высев на среду yepd» темные символы - высев на среду vepd + 1,5 и kci.._ : .. ■.r-i--"■'*.'.'' * О • •облучение при о0 с, высев сразу после облучения; ДА - высев после выдерживания в воде, при '28°. С

в течение 1 41 т — выживаемость в зависимости , от времени выдерживания облученных (доза 210 Гр) клеток в воде при 28°С. По оси абцисс - доза, Гр (вверху), время, мин (внизу); по оси ординат - выживаемость,%.

последующим выдерживанием при 28°С в течение 1ч приводит к

осуществлении бистроговостановления в полном объеме.

Изучен генетический контроль быстрого пострадиационного : восстановления дрожжевых клеток. На 'рис.4 приведены кривые выживания ■ диплоидных : радиочувствительных мутантов дрожжей г.с«ге\г1а1а« после -; г-облучения. ; Как видно, мутации гаая, ; гас552, га<154 и *»455 подавляют ■ быстрое пострадиационное : восстановление дрожжевых; клеток. ' ..'.■.;'*■

' Далее изучены ос новиьв закономерности процесса быстрого • пострадиационного восстановления. "

•Кратко ■ перечислим \ основные свойства быстрого восстновления. При ' этом сравним :. быстрое . и медленное восстановление дрожжевых;клеток. Итак, быстрое восстановление:

1) Имеет место у диплоидны* клеток 8.овгву181ав в м-фазе клеточного цикла; более эффективно у клеток' ^ в логарифмической фазе роста культуры, по сравнению со стационарной фазой; ; ■

2) Отсутствует у гаплоидных клеток 5.свгеу!«1ае в . сх-Фазе клеточного цикла, но имеет место в б- и С2-«азе;

' 3) Осуществляется, ' как и медленное восстановление,: по

■ принципу "уменьшения эффективной дозы";: '

.4) Отсутствует : у гаплоидов' и; диплоидов : Р.р1гтз. в стационарной Фазе роста культуры. В то же время диплоидные ; клетки Р.р1пиа в стационарной фазе роста способны к медленному ' пострадиационному восстановлению; '*.'"■'..

5) Имеет место у дыхательного мутанта Б.с«гёу181аа Негри 139-Е; не способного к медленному восстановлению; ; -

■ ; ;* в).Подавлено у диплоидных клеток, инкубированных после облучения >в' воде при о°С? V> .'; .*.. : : ■■".;

-7) Одинаково эффективно в воде и полноценной - питательной среде г для:некоторых втаммов дрожжей скорость восстановления - в питательной среде;' выше, - чем /* соответствующая ■■ величина ■ при выдерживании облученных клеток е воде, для' .других - скорости-примерно одинаковы в обеих средах. ■ - ,.'"." •

' в) Не подавляется циклогексимидом, а отличие,от медленного восстановления. ; 1'.'.'.. .-■■"■':■■ ■'.*,"-■ 7Ч/ ■

■ '.- 7 9) Отсутствует после УФ-облучения» \ .".

■ 10) Одинаково эффективно после г-облучения (137Сз) и после облучения .«-частицами (4Н*, ЛПЭ ° 180^ кэВ/мкм) для диллондных' клеток,з.сегеу!»1ае 2873-1В! - с другой стороны,. для ктамма

З.сег<^1в1ав Х5800 эффективность быстрого ВСССГаноВленИЯ уменьшается с ростом ШЭ излучения > ,

И) Контролируется генами кы)51, йА052 и тоо»*,. как и медленное восстановление/ .

12) Подавлено, у диплоидного мутанта 8.седог1&1а«, гомозиготного по гл<353, способного к медленному восстановленнег

13) Имеет место у диплоидного мутанта гомозиготного по га<550, не способного к медленному восстановлении;

.14) Имеет место после воздействия этилметансульфоната;

151 Связано с рекомбияациомкши = процессами • в клетке I частота ыитотнчесхого кроссикоговера снижена в условиях подавления быстрого восстановления

Кроме того, повреждения, элиминирующиеся в процессе быстрого восстановления, фиксируются к первому пострадиационному деления ядра клетки.

На основании леречисленных свойств быстрого восстановления можно сделать вывод о том, что механизмы, лежащие в основе быстрого и медленного восстановления, различны, но имеют обине этапы. Действительно, оба процесса диплоид-специфичны и контролируются генами иы>51, ваоез и као5а. с другой стороны, генетический контроль обоих типов восстановления не идентичен (см. пп.12, по-разному сказывается на обсуждаемых

' процессах ни к лог е к с ими д (п.в). Дыкательный мутант штамма №гри 133-Б способен к быстрому, но не к медленному восстановлению (п.5К Хроме того, у диплоидов Р.р1пи», способных к быстрому восстановлению, подавлено медленное восстановление (п.4).

Оказалось, что эффект,- аналогичный быстрому пострадиационному восстановлению, имеет место также и после гилертермической обработки клеток. Выживаемость дрожжей, подвергнутых гипертермической обработке, увеличивается при 'лостгипертермическом выдерживании клеток в воде при 28°С перед высевом на среду, содержащую 1,5 М кс1. Процесс завершается за з—4 ч выдерживания и таким образом, является более медленным, нежели быстрое пострадиационное восстановление. Сравнительный анализ постгилертериического и быстрого пострадиационного восстановления показал, что-, в основе этих процессов лежат разные механизмы. Так, лостгипертермическое восстановление

имеет место (в - отличие от быстрого пострадиационного восстановления)-у гаплоидных клеток а.cerevisJ.se (в вцаазе клеточного цикла), а также у мутантов, гомозиготных по гаая, га<152, г»<355. С другой стороны, оказалось, что мутация гаЛ54 блокирует как' быстрое пострадиационное, так и постгипертерническое'восстановление■'

Зля ковкретизации'мехвнизмов, лежащих в основе .быстрого пострадиационного восстановления, дрожжевые клетки подвергали комбинированному воздействию гипертермии и радиации. Оказалось, что гипертермическая обработка ' обратимо подавляет быстрое пострадиационное восстановление дрожжевых клеток. Выдерживание клеток, последовательно обработанных гипертермией и радиацией, в непитательной среде (перед высевом на среду / содержащую 1,5 М КС1 ■ или КЫОд) приводит к последовательному • осуществлению постгипертеркического, & затем быстрого пострадиационного восстановления жизнеспособности. Таким образом, была установлена связь пострадиационного и постгипертермического восстановления) субстрат, реактивирующийся в ходе постгипертермичвского восстановления, необходим для

Рис.5. -Выживаемость диплоидных дрожжей Б.с«г«у1з1ле втаммов Т1 (А) и ТЗ (8), подвергнутых воздействию гипертермии (5о°С) и (или) г-квантов, в зависимости от времени выдерживания клеток в воде ори 2В°С перед высевом на среду-У£И) + 1,5 Н кно^. 1,4,5,6 - гипертермическая обработка в течение 5, ю, 4 и 7 мин, соответственно) 3,7 -облучение в дозе 7оо и 7« Гр , соответственно с з.е,» -обработка - гипертермией и ■ '■ "' последующее обличение (з - 50 С? 5 мин, 700 Гр» а - 50° С, 4 мин, 70 Грт 9 - 50°С, 7 мин, 70 Гр). По,оси абцисс - время, чI по оси ординат - выживаемость,%. '1 ?

осуществления быстрого пострадиационного восстановления.

Довольно неожиданными оказались данные по комбинированной

обработке гипертермией и; радиацией диплоидного мутанта» гомозиготного по . гай34 (рис.5). Клетки высевали на среду, содержащую 1,5 М кмо^. Как было показано выше, ' мутация* га454 блокирует как/7 пострадиационное, так и лостгнпертермическое восстановление .' Как - видно' (рис.50), выдергивание облученные или . подвергнуты*.гнлертермической обработке клеток в воде при зв°С не изменяет и* выживаемость. 'Однако >немедленньй после комбинированной обработки высев клеток дает а результате;

Таблица 1.;Коэффициент синергического взаимодействия / ■ ЧКСВ) в зависимости от времени выдерживания клеток в.

I-Л '.в воде при 2»°С. .* ■'.. ' ■' У- - ""

Время /' Т1 ;'."."■■ * тз - ■■■•

' • выаер- _:_ - ■ -■ ' - '■■■■•..- ■ ■ ■'■--■ : ■ ■ ■

'жива- '■■*■ - Режим обработки,

нив,! Ч • • ■

Ь7|-2

0 • 6±'2 . 4 + 1 . 5 + 1

'■'."." 1,0 9 + з Г". ■.

. 1,5 б + 2 > > - ■'_■'■'■

2,0 3 ♦ 1 . - 1® • 2,5 + 0,7'.

4,0 . 2 + 1 ;..; - ■'* ;

' ' 6,0 ''■.'..■■.■ 3 + 1 *' I6 I6 '

,, - *Ъ5г2о последовательная обработка' гипертермией г (50°С, 5 мин) ' И радиацией (20 мин-при мощности дозы 35 Гр/мин) ^Величины и достоверно'не. различаются (а >0.5). ."> ' синергическое взаимодействие гипертермии и радиации, которое/ убывает при выдерживании клеток в воде при 28°С. Оинергический. эффект гипертермии иррадиации можно количественно описать коэффициентом . синергического; взаимодействия -(КСВ), численно . '. . равньм; ( $ выживаемость клеток после

гипертермии, облучения- и комбинированной.обработки, . соответственно) . Уменьшение 1 синергического взаимодействия - ; гипертермии и радиации в данном случае.выражается в - увеличении выживаемости клеток, подвергнутыхкомбинированной обработке, т при'выдерживании в воде, в то время как« выживаемость' клеток, -

обработанных каждьм из «акторов в отдельности,- практически- не изменяется в этих 1 условиях. Синергическое взаимодействие гипертермии и радиации также убывает при. выдерживании в воде клеток штамма И (дикий тип) (рис.5а), а . также . для других штаммов -" дрожжей. Ланнья : эффект отсутствовал>\*если ' . клетки высевали на стандартную среду. V . .' ■ '■■•'■■

, Данные об изменении КСВ' при выдерживании клеток, штаммов Тх н 13 в воде -приведены в таблице, 1. .;.

.'^Представленные данные формально.можно интепретировать как восстановление дрожжевых . клеток от ; Ъг-повреждений индуцированных в клетках в результате комбинированной обработки гипертермии й радиации. Этот, тип "восстановления", так жв, как и пострадиационное восстановление,'можно - подавить повышенными концентрациями КС1 или КнОд. Тот Факт, что повышенное концентрации соли ; подавляют восстановление клеток^ ' от радиационныхтермических; повреждении, а -также повреждений, индуцированных комбинированной 'обработкой гипертермией и радиацией,;:наводит на мысль' о существовании у дрожжей универсального .механизма, обеспечивающего адаптивный ответ клеток ; на : стрессовые ,-воэделствия. Эффект уменьшения синергического . взаимодеяствия /гипертермии и ; радиациипри виаерживании в :ростовой среде имеет место и для клеток млекопитающих..; - "V ' : - "-

.1 - : - " ■ 655518 ЙО|5?ния,дрржжевьи_ 8леток --

., Изученные ^ закономерности быстрого , пострадиационного восстановления у дрожжей V позволили установить молекулярные -механизмы, -> лежащие ; - в .. основе . быстрого - пострадиационного восстановления дрожжей. Этому г посвящена главанастоящей: : работы. . ; т. V. ■»''.."-. ■" '<.•■"'' .'■*''' 1'- ; -

. Как установлено-ранее, в.осноее медленного восстановления' жизнеспособности дрожжевых клеток лежит медленная репарация ДНР ДНК' (1«сИп1к'«ъ , ^ которая осувествляется по

рекомбинационому . механизму .; (Королев, Грачева, 1972^г ■' Ке»п1сх,: 19?б'*^). , Нами также установлена ■■*- связь быстрого восстановления с ~ рекомбинационньии процессами: в ДНК. Кроме того, мутации' КАР51, -,мб52 и ЕА054' подавляет . как - быстрое восстановление, так и мктотическую.' рекомбинацию' у дрожжей. С

учетом того., .что для осуществления 'быстрого восстановления требуется, по крайней мере, двойной набор~ хромосом, можно ■ /" предположить, ..что, , ■ в., основе быстрого пострадиационного восстановления* лежит особый путь репарации ДНР ДНК, отличающийся от известного ранее у диплоидных клеток в С1-«азе клеточного . _ цикла. (последний ответственен за', медленное пострадиационное восстановление). Тот ввкт, что- предполагаемый . ..путь репарации; ДНР ДНК не был обнаружен " в опытах по седиментецин ДНК из облученных' дрожжевых клеток в градиенте нейтральной сахарозы, можно объяснить его высокой скоростью, в результате чего он ; завершается до' начала лизиса; облученных' клеток на поверхности градиента... Здесь ' нами разработана методика, лредотврапаювая репарацию'ДНР ДНК во время процедуры выделения/ДНК из ,облученных клеток,, что дало возможность выявить быструю репарацию ДНР ДНК. • 1 . . . Предварительно было установлено, что io% KCl - ннгибирует быстрое; пострадиационное восстановление /'дрожжей. ; Выдерживание ' облученных клеток в l М сорбитопе или о,о« К ЭДТА (рн в,з) не влияет /,/ на . эффективность \ быстрого' - L пострадиационного восстановления. Последнее означает; что в стандартных- условиях лизиса дрожжевых: клеток (с 1 промежуточным этапом получения ; протопластов) : процесс быстрого ^.восстановления . столь . же . эффективен, как и при выдерживании облученных дрожжей в воде.,В связи с этим всю,процедуру получения протопластов из облученных, клеток проводили в присутствии ' Ю% кс! : (инкубация ... с ■, - 2-меркаптоэтанолом и з'имолиазой), ' который >. ингибирует ■ быстрое . 'Пострадиационное восстановление.. .■'/.. ■ — i

■ На рис.6 приведены пробили:седиментации ДИК из облученных* в дозе > 570 . Гр . диплоидных клеток 2873-1В в градиенте ; концентрации нейтральной сахарозы.; Протопласты из л облученных клеток получали либо /стандартным методом . (рис.«А), - либо в присутствиию% KCl (рис.бБ)Параллельно во . всех вариантах7 / опыта определяли выживаемость клеток ка стандартной (yepd) и / солевой (KEPD + 12%кс1) среде..Как видно, а—облучение* приводит к сдвигу пика профиля седиментации. ДНК в сторонуг> фракций 'с меньвей молекулярной массой по сравнению с , необлученным контролем* срелнечисленная молекулярная'масса №г в результате облучения уменьшается примерно в 1,3 раза, '.- если . протопласты

получали стандартbum методом (рис. 6А), ив 1, б раза; ; если

: Рис.6. Пролили седиментации ■■".'. í. ДНК диплоидных клеток. s.cerevi«í«e 2873-1Б в градиенте концентрации 15-зо* " нейтральной сахарозы.'Протопласты получали ' , стандартным методом- (А) 'и .в присутствии Ю* КС1(Б).1 - ДНК из ивоблучепных клеток i '2 _-; облучение в дозе 570 Гр, лизис ' клеток сразу после облучения t з[ ~ облучение ...' в дозе 570 Гр»-лизис клеток после выдерживания . г .■ в воде при га°С в течение 1 ч. ~ . По оси.абцисс - помер фракции г- по оси ординат - i1* Cipa диоактивность во йраккии (в * от обшей радиоактивности).

протопласты получали в присутствии хлористого калия /(рис.бБ)'. Выживаемость клеток 'i высеянных * на стандартную и солевую среду сразу после облучения, составляла в данном'.опыте 32 и.о,«о%, соответственно. Выдерживание облученных клеток перед лизисом, в воде при 28°С в;течение i ч при концентрации 1 • 10е клеток/мл практически не ' изменяло ' профиль седиментации ДНК,' если протопласты получали стандартным способом, и приводило к сдвигу

■ профиля седиментации всторонуфракций с большей- молекулярной массой,если- протопласты получали: в присутствии lot * KCl (рис.бБ); величина Мл в этом случае увеличивается примерно в 1,2 раза. Выживаемость облученных■ клеток, выдержанных в воде в течение 1 ч перед высевом на стандартную и солевую" среду, в данном опыте составила соответственно' зб и 4,7*. ~ ■

Представленные данные' можно . интерпретировать ^двояко. Традиционная интерпретация заключается в том,' что увеличение молекулярной массы ЛНК в результате Г выдерживания облученных клеток в воде есть следствие ' репарации " ДКР ..ДНК. Стандартная

■ методика седиментации ДНК в градиенте концентрации, нейтральной сахарозы не > позволяет выявить эту репарацию, ' так. как / она завершается до нанесения протопластов ■>"■ на, градиент.: Выделение

ДНК из облученных клеток в присутствии ю%~ KCl, ингибируююего быструю репарацию ДНР ДНК, дает возможность наблюдать этот процесс в эксперименте I

С другой стороны, можно представить, что получение протопластов из облученных клеток в ' присутствии' 10% KCl по каким-то причинам приводит к образованию дополнительных ДНР из однонитевых разрывов (ОНР) ДНК, индуцированных в клетках облучением. Согласно, второй интерпретации, увеличение молекулярной массы ДНК из облученных ' клеток в результате выдерживания их в воде отражает репарацию ОНР, но не ДНР ДНК. .

- , ' Рис.7. Профили седиментации 9 *** ' ДНК из гаплоидных (А) и

zzz, диплоидных (Б) клеток

S.cerevisia« птвммов 2В73-2Л и 2873-1В в ' градиенте концентрации • 15-301 нейтральной сахарозы. Протопласты получали в присутствии ю* KCl. Обозначения те же, что на рис.6.

в В » «I

Выбор между двумя предложенными гипотезами можно сделать на основании опытов по седиментации ДНК из облученных гаплоидных клеток S. cerevlsiae 2В73-2А, результаты которыхприведены па рис.7. Использованные здесь втаммы гвтз-ЗА и 2873-1В являются полностью изогенными , (за исключением различий в локусе типа спаривания). На рис.7 представлены пробили седиментации ДНК гаплоидных (А) и диплоидных (Б) клеток в градиенте концентрации нейтральной сахарозы. Клетки обоих птаммов облучали здесь в дозе 460 Гр. Протопласты из облученных клеток получали здесь: а присутствии ю% КС1. Как видно, выдерживание облученных клеток в воде при 28°с в течение 1 ч не. изменяет профиль седиментации облученных гаплоидов, и в то же время в случае диплоидов приводит к сдвигу пика :..седиментограммы в сторону фракций с большей молекулярной массой (величина Мп увеличивается примерно в 1,2 раза). Таким образом, если ■ бы - согласно второму предположению, ; инкубация клеток в ю% кс1 способствовала

трансформации части ОНР в ДНР ДНК; то для гаплоидов мы также доджвы Были бы наблюдать увеличение молекулярной массы ДНК в результате выдерживания облученных клеток в воде,/ так как гаплоидные клетки s.eerevielae эффективно репарируют ОНР ДНК.

.Результаты приведенных экспериментов i свидетельствуют о том, что при выдерживании облученных. диплоидных клеток, каходявихся в в1-Фазе клеточного цикла, в воде при 28° с в течение 1 ч имеет место репарация ДЛР ДНК, которая подавляется повше иными концентрациями хлористого калия. 3 то позволяет утверждать, что быстрое лострадиационное восстановление жизнеспособности обусловлено репарацией ДНР ДНК. Эта репарация не может бить выявлена.при использовании стандартной методики лизиса облученных клеток (без KCl ).

.Оценки, приведенные в диссертации показывают, что в результате быстрой репарации ДНР ДНК в клетках диплоидного штамма 2873-18 реларируется для разных доз облучения около sot первоначально индуцированных ДНР ДНК

Интересно, что эффективность быстрого , восстановления диплоидного штамма 2В73-1В,. . определенная как D^/t>0, составляет 1,9 + 0,з .где dq - соответствующие параметры кривой выживания при немедленном высеве на солевую среду (YEPD + 1,5 к KCl) и после завершения быстрого восстановления, усредненные по нескольким опытам. Таким образом, уменьшение примерно 8 2 раза среднего числа ДНР ДНК на клетку в результате 1-часового выдерживания в воде сопровождается приблизительно двукратным уменьшением величины dq кривой выживания облученных клеток.'■

С : учетом того,' что быстрый и медпеннш типы пострадиационного восстановления, за которые ' ответственны быстрая и медленная репарация ДНР ДНК, отличаются по генетическому' контролю й'ряау других свойств (см. вьгае), был сделан вывод о том, что быстрая репарация ДНР ДНК является особъм' путем репарации ДНР ДНК'. в дрожжевых клетках s.cecevisiae, находящихся в С1^$азеклеточиого цикла. Этот путь отличается от известной ранее у дрожжевых клеток (в ci-Фазе) медленной репарации ДНР ДНК при выдерживании в непитательной среде (lAichni* et al.,i977/3/).

Быстрая репарация ДНР ДНК, будучи диллоид-специфической,

осуществляется по рекомбинационному механизму ( в подтверждение этого в работе была-показана связь быстрого восстановления с рекомбинациоными процессами). >■;'■"■ • -■-..:■-; •

Конкретные механизмы быстрой репарации ДНР ДНК неясны. Не исключено, :например.' что быстрая репарация (в отличие .от медленной)^ не требует - обиирного репаративного ■ синтеза ДНК.

Изучение детальных: механизмов.рекомбивационной репарации ДНР ДНК -с .использованием .современных подходов проведено в следующей главе. . Г , ■

з- 1Й¥чен»8_механиз^в_репава^^ ;■ .

п$^тью_мрдельну5-£05К!? ] ■','/,--■'

В главе 5 настоящей работы разработана модельная, система, использующая плазмидные вектора, для изучения репарации ДНР ДНК.

Тупик, наметившийся в изучении.' детальных механизмов репарации ДНР .ДНК в конце .'семидесятых^ ■ годов, сейчас : в значительной .степени преодолен .благодаря; развитию . техники рекомбинантных молекул..Для изучения процессов репарации ДНР, а также ДНБ -делетированных участков плазмидной ДНК в районе ДНР - ; в настоящее время, . широко * используется генетическая^ трансформация ~ клеток с помощь» плазмид,/. линеаризованных эндонуклеазой рестрикции.,В результате такой трансформации, в значительном'■, числе случаев имеет место" репарация плазмиды посредством рекомбинации с гомологичной хромосомной ДНК, при этом часто происходит.;, восстановление утраченной части ' генетического материала плазмиды (если.исходная плазмила несла ДНБ).,8 случае использования автономно реллипирухшегося вектора (содержащего . origin г репликации> лдрожжевой _ ДНК) ' возможна репарация плазмиды как с1 кроссинговером (в результате ■ чего плазмила встраивается:в хромосому) / так из ; без кроссинговера (репарированная ~ плаз мила остается, в - клетке >,в; -автономном состоянии)- (Orr-weaver,■ szostaX, •'. Такой .подход . для

изучения репарации.ДНР ДНК имеет несомненные преимущества перед: использованными ранее, так как дает возможность непосредственно анализировать' продукты репарации.: одного фиксированного ДНР,. выделяя репарйрованную плазмиду. Недостатком таких систем,' на наи взгляд, является то/что; они не позволяют проводить количественую оценку параметров репарационных .. процессов, 1 а также корректно сравнивать эти параметры для клеток ' разных

генотипов. Действительно,' известно, что частота плаз мил ной трансформации клеток (а именно по этой величине судят об эффективности репарации плазмидвоя ДНК) варьирует' в широких пределах от опта к опыту для одного штамма и столь же сильно . колеблется для клеток разных генотипов. 8 настоящей работе мы. поставили задачу разработать собственную модельную систему 'для изучения рекомбинационной репарации*ДНР ДНК, которая была бы в значительной мере лижена этих недостатков.

Здесь использована автономно реплицирующаяся бифункциональная плазмида ры.12, несущая два ' дрожжевых гена lys2 и leu2, а также ее производная piii2-bx, имеющая делецию в гене LYS2 размером 391 п.н» в районе Xhol-саита ..Обе плазмиды имеют уникальный xhoi-сайт рестрикции в гене ьтаг. Кроме того, плазмида ри.12-вх имеет уникакльньй вал>Н1ч:айт в гене tetR последовательности pBR322. Дрожжевые клетки разных генотипов трансформировали либо кольцевой,' либо линеаризованной по xhox-сайту плазмидой "литиевым" методом. Трансформанты отбирали на селективной среде без лейцина. Оказалось,. что линеаризованные по xhoi-сапту плазмиды ры.12 и рьыг-вх трансформируют клетки штамма DC5 (his3 Ieu2-3,ii2) значительно эффективнее соответствующих кольцевых молекул.

. Выяснилось, что величина L (отношение частоты трансформации кольцевой плазмидой к соответствующей величине для линеаризованной молекулы) варьирует от опыта к опыту, значительно меньше, нежели абсолютные значения частот трансформации. В таблице 2 приведены значения величины Ь, усредненной по нескольким опытам. Как видно, „ линеаризованная плазмида на порядок эффективнее кольцевой трансформирует клетки штамма dcs. '

Эффект повышенной частоты трансформации.линеаризованной по хьох-сайту плазмидой имеет местом если в качестве реципиента ' использовать клетки нтамма гВ-Д241, несущего делецию iys2-25, размером около 2,1 т.п.»., расположенную на расстоянии примерно i т.п.1^. от xhoi-сайта рестрикции гена lys2. Причем величина Ь в'данном случав близка к соответствующей величине -

Таблица 5.1. Эффективность трансформации дрожжевых кпеток разных генотипов кольцевой и линеаризованной плазмидами ■■,■■■■

Итамм Плазмилэ Оайт - ; Доля нестабильных по,

,' линед- Ь ОЭРРа - Leu фенотип/ клонов

ОС5 р1ДД2 Xhol »,0+0,4® 10 + 2 .20/20 44/55 .

pLL12-BX Xhol 9,2+0,2 10 + 2 - ■'_.■•■

pLLlï-BX BamHI 1,0® -, О- : - ■; ■ '.'.-.

1Б-Д241 рЫЛ.2 ХЬоХ 8,1+1,9 11 + Э g4/24 ■ ■ 35/48

2Г-Лг52 : риЛ-2 Xbot «7 + ,9 О 24/24 -23/24

(1увг-29) ■ " ■ ' " ' "

СС32 pLL12 Xhol ' 1,Ов О ; , . - ■ " : ■ VTbd52>

ОС53 - pl£12 , Xhol 73 ♦ 4 0,4+0,1 23/24 ,21/24

frad531 . • "'■ . ■ ■

(ratJ34) ■ "■•<■■ ■..'-■ '.,':'

ptblî Xhaï,-/ 14 + 2- 6,1+0,9 22/24 IB/24

34°C ■■ 1,0й 0 • ■■

. ^Величину ОЭРР рассчитывали по Формуле (2). г ;

^Приведена стандартная ошибка среднего значения по Э-5 опытам. B4n<vtQ-m траке?ормаиин кольцевой и линеаризованной плазмидами достоверно не различались fe > о,5). 1 .

для штамма DC5, несущего нятактяый ген lys2. Однако, если' линеаризованной плазмилon трансформировать ■штамм 2Г-Д252, у кдтадого аепетироваи ген Lïsî , то частоты трансформации кольцевой и линеаризованной молекулами практически совпадают (L - 1). Точно также.совпадают частоты трансформации ктамма oes кольцевой и линеаризованной по Ватт-сайту пла зияла мм ршг-вх,

риза- . ции * 102

среди общего числа

трапс®ор«аятов кольцевая лине а риз. ■ плаэмида плазмнда

Таким-образом, эффект — повыше иной, частоты, трансформации линеаризовавной лл&змндой {по сравнение, с ; соответствующей величиной для кольцевой ппазмиды), имеет место только - в том . случае, ."если -„,линеаризация проводится в . участке, имеющем гомологню'е хромосомной ДНК. Это позволяет предпопожить, что рассматриваемая эффект связан с репарацией плаз ми дн од ДНК посредством . рекомбинации с хромсомоноя ДНК. Прямое доказательство' этого утверждения " состояло ;в следушем., Мы проанализировали плазмиды, выделенные из 1» клоков втамма oes, трансформированию . плазтдоя 'р£&12-&х,; линеаризованной по Xhol-сайту. .Оказалось,' что'. 1В ■■ из 19 проанализированных транс Формантов содержали плазмиду, /содержащую; 3. вавШ!-сайта (как в плазмиде рыл.г>,"тогда как исходная плаэмида ; рылг-вх содержала только 1 ваши i-септ (в гене ^^.последовательности рвнзаг). Таким образом, здесь мы имеем дело с репараяиея ДИВ плазмиды ршг-вх, - в результате ' чего восстанавливается последовательность, содержащая ~ утраченный .Bamai-caRt В гене' usa. Такая1 репарация возможна только в,результате рекомбинации С.хромосомной ДНК. ■ Еще - один вывод можно сделать .из' этих результатов, а именно: большиство ре парированных в ■■'.результата рекомбинации с , хромосомой плазмид находятся' в клетке ~ .в автономном состоянии. Этот вывод подтверждается и данными по. стабильности плазмид, приведенными в таблице 2: больвинстао Leu*-трансфермантов нестабильны по фвнотипу Leu* и теряют его при пассировании в неселективных Условиях.

- Таким образом, эффект Увеличения-частоты трансформации в результате . лнкееркзааки ; лпаямиды в участке 1 гомологии с хромосомной , ДНК связан: с рекомбинационной репарацией - ДНР плазмидной ДНК,".вызванного . зндонуклеазой - рестрикции. Следует подчеркнуть, что рассматриваемьй зффвкт наблюдается только - яр» ^литиевой* трансформации клеток' ппазмидной ЙНК * в .присутствии ДНК-иоситедя Чгетеродогичнад ДНК,, подвергнутая обработке v ультразвуком)."' ■■i'..'.

Изложенное ~ >вьще позволило v разработать способ количественной оценки эффективности ре*омбинаццояноя . репарави» . ДНР плазмилной ' ДНк, ■ , - Также 1 • оценить соотновение рекомбинационного: нерекомбияйционяого пууей ■' репарации^ и лаз миды.'; Под иерекомбинационным ' Лутем репарации-, здесь

понимается рениклизалия линеаризованной плазмилы 'с иоможь» лигирования липких>концов или незаконной рекомбинации.: -

Показано, что; в/случае' Трансформации плазмидой , pixi2, линеаризованной' ло Xhoi-свйту, дол» - плазмиа. ре парированных .. не ре комбинацией ним путем : (среди общего числа „ ре парированных молекул) для штаммов разных генотипов можно приближенно оценить из соотновения: * ! - -1' ; ■*

' v v ь - Px/<PR^ Pl> - VW '«V

где t0,. flift - частоты трансформации клеток кольцевой ■ и линеаризованной плазмидой! Рд, р^-еероятностй рекомбинационной и нерекомбинвционной репарации плазмиды. . /

. ; Относительная эффективность •' ре комбинационной репарации'. (ОЭРР) . ; плазмидной - ДНК определяется .в напей . системе нз соотновения t .■,■' " ■ *

- pr -ч^ оэрр - (fun/f0 - 1) ' • " (2> •

Более ; строго соотношение v рекомбинационного,- .и нерекомбинационного пути репарации можно оценить для .плазмиды, имевшей / два уникальных . сайта рестрикции(в нашем 1 .случае PLL12-Bx>t' один - в участке гомологии с хромосомной ., ДИК (Xhoi-саит, в гене,,, LYS2), другой -■ в участке, не имевшем гомологии с хромосомной ДНК {BaœHl-саят в гене tetR рвшаг). В этом случав для величин ь и ОЭРР справедливы соотношенияt .

■ . у . . . ь - pr/îpr + pL) .- wW . <э> V .

: •• ОЭРР - (WfBa»- Х> . <4> •

где *хьо' fBà* Г частогы 1Ранс*0Рмаоии клеток плазмидой, . линеаризованной в участке, имеющем . и не. имевшем гомологии с хромосомной ДНК, соответственно.

Показано, что в , Rad+-Kлетках около .90% . трансформантов содержат плазмиды,: репарированныв /путем рекомбинации с гомологичной хромосомой. Следовательно,можно сделать вывод о . том, что нерекомбинационная репарация ДНР плазмидной ДНК на . порядок менее . ; эффективна, ' нежели ■■.."■ рекомбинационней путь' .репарации/';-. /-;.'.'„■/'/.■/:■■'/.■: ; '-.',:?-,■ -.'/.';

. Используя приведенные способы оценки. . эффективности репарации,/ изучен генетический контроль ¿репарации ДНР плазмидной ДНК. Оказалось, что мутации.rad52, rads4 полностью блокируют репарацию ДНР плазмидной ДНК. , Мутации ■ га«з, таазэ

осуществляют неполный блок репарации. Мутация гай53. не влияет иа1 эффективность рекомбинационной репарации ДНР .. плазмидной ДНК. Таким 'образом, генетический- контроль' репарации ДНР. плаэмидяой ДНК совладает с таковым для хромосомной ДНК^

Представленная выше система была использована для изучения, детальны*'механизмов репарации ДНР ллаэмндвояДНК.- , ■

Одним из важных, ка.наж взгляд, вопросов: в клеточной радиобиологии является 'роль плоидностн, в радиорезистентности клеток. В предыдущей главе показано, что быстрая, репарация ,ДНР ДНК- в',;, значительной ' мере 'обусловливает ' повышен ну» радиорезистентность диплоидов по сравнению с гаплоидами. в »-Фазв-клеточного цикла. С другой стороны, известно, что гаплоидные'дрожжевые клетки ви'сг -фазе клеточного цикла способны к эффективной репарации ДНР ДНК. г ' ' ,

Возникает, однако, вопрос, влияет ли сама по себе диплоид-ность на эффективность репарации ДНР ДНК, или же'их. способность' репарировать обсуждаемып вид повреждений а «1-*азе,в отличие от гаплоидов, ".обусловлена- исключительно наличием второй копии генома. Для ответа на поставленной вопрос необходимо корректно провести сравнение эффективности репарации;ДНР ДНК у гаплоидных и'диплоидных клеток, например, в логарифмической фазе роста культуры. Очевидно, ' что используя традиционные подходы сделать подобное сравнение очень сложно. Разработанная. здесь 'система позволяет в известной мере решить'эту задачу."

,* Оказалось,что' эффективность рекомбинационной репарации плазмилной ДНК пропорциональна отношению. количества копий последовательности хромосомной ДНК; гомологичной плазмидной ДНК в районе ДНР, к общему количеству ДНК в клетке.' Таким образом,' можно сделать предварительный вьвод,что . в -отношений рекомбинационной репарации ДНР ДНК'■ ' гаплоиды ■'■■ и диплоиды 5.сегеу1в1ае практически не ', отличаются, а ; эффективность репарации " у этих клеток - определяется ' только'У; наличием неповрежденной последовательности ДНК, гомологичной участку ' в районе ДНР. V "'

' Используя термочувствительный мутант ЬС54 ' (гай54-з);' мы изучили, кинетику репарции ' ДНР "плазмидной ДНК .(рис.8). Оказалось, .что ~кинетикарепарации линеаризованной лпазмиды

' V Л / Рис.3. 'Частоте трансформации

': . : - • ' "'-V .7 клеток ~ S.cereviaiae DC54 :. > ' . ■ ьтц }* • s. (rad54-3> ■ линееризованной' '■ но

.iV, - XhoI-СвйТУ плаэмилой рЬЫ2-ВХ- в

; ; ' : ■'. г зависимости' от времени

выдерживания трансформационной Д—|—t Л , * смеси • . при' - оермиссиеной

температуре 23°С. По оси абцисс

го

.-'о ■ в

в «

1 ■ - ••.'.'■. . . • - время; по оси, ординат., -

- .0 1 2 3 и " ;

•V частота трансформации,

. ■ / г относительные единицы..:

рила-ВХ. имеет двухфазный ¡. характер: ' первая фаза -быстрая-:-завершается, по крайней мере, за 1 ч ' выдерживания клеток в _ пермиссиваых; условиях! вторая - медленная. - за 14718 ч ' выдерживания. быстры»; компонент репарации ДНР плазмидной ЛНК-;удалось также выявить. . высевая; трансформационную смесь на. селективную среду, ' "содержащую \ -'повышенные: .концентрации хлористого 'калия. Таким образом, быстрый компонент репарации ллазмиды обусловлен. механизмами; .'лежащими в основе быстрой , репарации ДНР хромосомной ДНК.

Важньм У в. молекулярной .радиобиологии является об эффективности репарации- "прнмых"; ' И ."косых" . ДНР ДНК. : Традиционная:точка зрения ' состоит в том, что~ "косой" ДНР, ; возникавший 'путем .' накопления однонитевьк разрывов ДНК,; репарируется клеткой более ' эффективно, нежели "прямой" ДНР, возникающий . при разрыве .. обеих?, нитей ; ДНК в результате -прохождения ., трека' /ионизирующей - частицы. ; Использование предложенной системы дает . основание для . пересмотра - подобной' точки зрения,!-по крайней мере, в отновении дрожжевых клеток. '

Показано, что рекомбинационная репарация ллазмид с "косыми* ДНР (липкие концы) и "тупыми" ДНР (липкие концы, обработанные нуклеазой £1) осуществляется с . одинаковой ■ эффективностью.;■".. - ... ■ ■*' •'.■■■ ¡.. .'- у.

^ Эффективность нерекомбинационной репарации плазмиды' с "тупыми<Г концами резко снижена по сравнению с соответствующей величиной для;плазмиды с липкими концами•. у ' >- '■;

Показано, что двунитевые бреши плазмидной ДНК размером до-2,з т.п.н. репарируются*посредством рекомбинации с. гомологичной

хромосомоной ДНК приблизительно с той же эффективностью, что и ДНР.. Причем 'удаление примерно г/з ллазмидного гена ьуз2 (центрального участка размером-4 т*л.н>) снижает< эффективность-репарации ДНБ в 3-3,5 раза -(по сравнению с соответствующей величиной для ДНР), которая тем не менее остается довольно высокой (ОЭРР «. з). •'

: , Последние результаты представляются важными для понимания, детальных механизмов репарации ДНР ДНК в клетках. .:

4. 06та5,Е1емз.5уче|рд.ииаг1ив§5ии_|5ле15!! . , . : Как - итог экспериментальных исследований, в . главе

Рис. 9. Схема лучевой инактивации диплоидной дрожжевой клетки. . Условные обозначения; ОНР,ДНР - однонитееые и ■ двунитевые

разрывы ДНКгр - /р0, где оо, о^ - наклон экспоненциального , участка кривой выживания до и после завврвения репарации ДНР; р - скорость репарации, ч"1;» БАИ50 -'КАС55;- гены; контролирую-вие репарацию ДНР. ' ;;',•'■■'■ . ■

сформулирована качественная : модель' лучевой инактивации дрожжевых клеток. Основным исходным постулатом данной модели является определяющая роль ДНР ДНК и репарации повреждений * этого типа в формировании реакции дрожжевой клетки на облучение-ионизирующей радиацией. - '

Локазано.чтоисходяиз представленных здесь и* известных ранее данных можно в значительной степени преодолеть

количественный дисбаланс между выходом ДНР и числом потенциально летальных повреждений.

Показано, что вклад летальных по Д.Франкенбергу ДНР. ДНК (двух ДНР. индуцированных а, соответствуем* участках гомологичных хромосом) в лучевую инактивацию клеток мал.

На рис. Э представлена схема лучевой инактивации клеток. ' Излучение индуцирует в клетках ДНР ДНК', либо непосредственно при прохождении трека ¿-электрона через обе нити ДНК (прямой ' ДНР), либо косвенным образом. Второй механизм образования ДНР предполагает их' образование в результате' накопления однони-тевых разрывов ДНК.

Индуцированные излучением (вне зависимости от механизма их образования) ДНР ДНК являются субстратом для быстрой репарации.

По нашим оценкам, быстрая репарация залечивает примерно 50-70* от общего числа ДНР, индуцированных в. клетке. Скорость этого процесса составляет 2 - s h"1 (число ДНР, приходявихся в ' среднем на одну клетку, убывает.со временем по экспоненциальному закону с показателем экспоненты 2 - 5 ч"1).

■. „ На данном этапе возможен также нерекомбинационны* путь репарации ДНР , однако он. как показывают , наши данные, для дрожжей не : вносит сколь-нибудь заметного! вклада . в радиорезистетность клеток. Оценки, приведенные в диссертации, показывают, что нерекомбинационным путем а дрожжевых' клетках репарируется не более ю* от общего числа ДНР ДНК (а скорее всего, много меньше этой величины).

В диплоидных клетках, высеянных на полноценный питательный агар сразу после облучения (стандартные условия опыта i для определения величины выживаемости), быстрая репарация- ДНР ДНК полностью завершается.' до первого пострадиационного деления клетки, когда ДНР фиксируются. Вклад быстрой репарации в регистрируемую радиорезистентность клеток дикого типа, (в качестве меры радиорезистентности обычно берут величину oQ) составляет примерно sot, т.е. в результате быстрого восстановления величина D0 увеличивается приблизительно в 2 раза (см." выве). ' . 4' .' ;

Часть из облученной популяции ' клеток содержит нерепарированиые ДНР, которые приводят к образованию клонов с летальными секторами (эффект дораставия). Предложен механизм

образования летальных секторов, предположительно возникающих/ в результате/неправильной: рекомбинации между . поврежденной ; и> / неповрежденной хромосомой. Г '■■-*;■

t Выдерживание в непитательной среде после облучения дает' возможность клетках осуществить. .. в .полном ' объеме медленную репарацию ДНР ДНК.' Скорость этого процесса 0,02-0,12 (см.выже). Вклад этого процесса' в < радиорезистентность для ¡ клеток дикого типа . составляет : в среднем 50-70*, т.е. в. / результате медленного пострадиационного восстановления величина: Ч t>Q увеличивается е 2-3 раза ■ (для отдельных иггаммов дрожжей этот

вклад может достигать во*). л /'Проведена количественная проверка следствий из рассматри-ваемыхгипотез. Расчеты не'противоречат экспериментальным данным

^'ЛСоролев В.Г.,Грачева Л.М./Денвтика;-1Э72.-Т.в.-С.1И. ,/VResnicK H.A.//J.Theor.Blol.-1976.-Vol.57.-P.97 -/3/mchnik, A.K.', Glaser, V.M. and Stiestakov S.V. -

//Molec.Bio^.Repa.-1977.-Vol.3.-P,437. t .

^4^Корогодин В.И.// Проблемы пострадиационного восстановления¿ ■'.' М.:Атомиздат.19бб. '•*'■''.

^5/,Пвтин В.Г .//Радиобиология.-т.9.-C.421; *:> "•■■

..: /с/ . .

Маниатис I., Фрич Э., Сэмбрук Дж. //Методы генетической / инженерии: Молекулярное клонирование i Пер с англ .- M.t ' Мир 11985. -.О/'-'' :„ ■. *■'■''■ ' ■:■

VVAltherr M.R., Queen ii.а., Kode C.I., Rodrogueo R.b. , , ' , -//Lurquin P.FÍ .Kllenhof» A. (Eds) Cenetlo engineering

in eukaryotea.-plenun:publ.corp. Washington,19B3.-Р.ЭЗ. . ^8^Тейлор Д. Введениев теорию ошибок. М .:Мир. 1982. -272 с. ^'Лсабакова Н.М./ Капульцевич В-Г,//Радиобиология.-1969.-Т. э. -С.вэг. ■ ■.'.-.' ■* ■'-- - .///. .-•■■..>■".- ',;;:■■/

. /10/Orr-Me»V*r T.L., Ssoatak j.H.//Proc.t)ati:Acad. Sei. USA. ■' . ./. • —1983.—Vol.ВО.—P.4417. ";''-,'■, ;

'вьводы '.■ '-''

i, На основании полученных' в данной ' работе ^ результатов -: сделаны следующие основные вьводы! ".. Л-

1) Обнаруженное« данной работе быстрое "..' пострадиационное восстановление .дрожжей является, «актором, взначительной степени определяющим радиорезистентность клеток. Вклад быстрого пострадиационного восстановления в радиорезистентность 'дрожжей можвт достигать з -з,5 по фактору изменения дозы.

2J- Быстрое пострадиационное восстановление в значительной степени обеспечивает повышенную радиорезистентность диплоидных дрожжей 1 по сравнению ' с- гаплоидньми, а 'также ' почкующихся гаплоидных дрожжей по сравнению с непочкующимися.

3) В основе быстрого пострадиационного восстановления жизнеспособности клеток лежит быстрая репарация ДНР ДНК. '

4) Быстрая репарация ДНР 'ДНК осукествляется по ре к омбин а ционному механизму. • * ,

3) Быстрая и известная ранее медленная репарация ; ДНР ДНК являются отдельными путями репарации ДНР ДНК при выдерживании облученных, в Gi-вазе клеточного цикла диплоидных дрожжей в непитательной среде.

«) ДНР плазмидной ДНК репарируются ^ посредством тех же механизмов, что и хромосомная ДНК.

7) Кинетика репарации ДНР ллаэмидной ДНК имеет быстрый и медленный - компоненты, . соответствующие ■■■ быстрой и медленной репарации ДНР хромосомной ДНК.

8). Эффективность, нерекомбинационной репарации ДНР плазкианой ДНК в клетках'дрожжей примерно на порядок меньже соответствующей величины для рекомбинационной репарации.

9) Лучевую инактивацию дрожжевых / клеток можно непротиворечиво описать: в предположении о решающей роли индукции и репарации ДНР ДНК как Факторов, . обусловливающих радиочувствительность клеток.

Спи£дк_рабдул_опх&ли5ов§|(ны|(_]1$_тем§_ диссертации i

1. Глазунов A.B., Капульцевич Ю.Г., Лобачевский П.К. Влияние плоидностн дрожжевых клеток на относительную биологическую эффективность плотноионизирующих частиц. //Радиобиология.-1382. -Т.22.- Bui.l.C.54-61.

2. Глазунов A.B., Капульцевич Ю.Г. Ковш тип пострадиационного восстановления жизнеспособности у диплоидных дрожжей saccha-romyces cerevisiae.//Радиобиология.-1982.-Т.22.-Вып.1.- .

С.62-69.

3. Глазунов A.B., Капульцевич Ю.Г. Закономерности быстрой репарации у радиочувствительных мутантов дрожжей saccharonyc«« ccrevislaa.//Радиобиология.-19В2.-Г.32.-Вып.S.-С.633-636.

4. Глазунов A.B. Быстрое пострадиационное восстановление у-дрожжевых клеток.//хЧ« Всесоюзный биофизический съезд.

Тез; ДОКЛ. Т.2. М. 1982,- С. 263-264.

5. Glaevmov A.V., Kapulteevlch .Yu.G. Fest liquid ■ holding recovery ofyeast exposed to Ionizing radiation.//11-th Int. conf. Yeast Genet. Molec.Biol.:. Abstracts. P.37. Plenum' Press. Montpelier.1982. • ' !

6. Глазунов A.B., Капульиевич Ю.Г. Изучение радиочувствительности диплоидных дрожжей Saccharonyces cerevisiae при .; -облучении в. растворе хлористого натрия.

//РаДИОбИОЛОГИЯ.-1983.-Т.аз.-Вып. 1.- С.«3-69. ■ 1 ^

7. Глазунов . A.B., Лобачевский П.Н. Пострадиационное восстановление. дрожжевых; клеток ; Pichia pinus. //Радиобиология. : .. -1983.-т.23.-Вып.3,- С.409-411. ,- . v - ;

е. Глазунов A.B.,: Капульцевич Ю.Г. О- механизме быстрого пострадиационного . восстановления у дрожжей, saccha ronyces cerevisiae.// Радиобиология.-1983.-Т.23.-Вып.з - С.з*4-34В.

9. Глазунов A.B., Борейко A.B. Восстановление дрожжевых клеток Saccharonyces cerevisiae от летальных последствий воздействия гипертермии.//Препринт ОИЯИ. Р19-83-890. Дубна.1983.-7 с.

10. Борейко A.B., Насонова1 Е.А., Глазунов A.B. Быстрое пострадиационное восстановление у дрожжей: подавление на -питательных средах, содержащих. повышенные концентрации солей калия.// Радиобиология.-1984.-Т.24.-С.543-545. <

11. Глазунов . A.B.,- Борейко A.B. Сравнительны* анализ восстановления дрожжевых ". клеток от летальных последствий воздействия гипертермии и радиации.//14-ая Ежегодная конференция Европейского общества по мутагенам внешней среды. Тез. докл. М.1984.-С.193. '■.■■/. Л.,;. : 1 i

12. Глазунов . A.B., Борейко A.B. 1 Постгипертермическое вое- 4 становление дрожжевых клеток SacOtaronyces cerevisiae. //Цитология.-1985,- 1.25.-Hl.-С.88-93.

13. Глазунов A.B., Борейко A.B. Восстановление дрожжевых клеток после комбинированного воздействия гипертермии и ионизирующей

радиации.//Радиобиология.-1985.-Т.25.-Вот.1.-С.37-42.j

14. Глазунов A.B., Борейко А.В, Влияние мутации \ rads4 , на способность дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae восстанавливаться от радиационных и термических повреждений .//Ра диобио лог ия .-1985.-Т.25.- Вш .5.-С.612-616. is. Глазунов A.B., Борейко A.B. 0 связи процессов восстановления дрожжевых клеток от термических и' радиационных

повреждений..//ЦИТОЛОГИЯ.-198S.-N9.-С. 993-999. - V

16. Оводков П.В., Фоменкова Т.Е., Глазунов A.B. Восстановление клеток млекопитающих от термических повреждений, фиксируемых

обработкой к пористым натрнем;//Цитология.-1987.-Т.29.-Н7.- ^ >. л С.851-853.'* " \\ * ' ■'■'•■■ .Л • • • *' •• •••• -••: . '-■', .■ -*"-

17. Глазунов 'A.B., Борейко' А.В . Анализ' процессов восстановления ■ дрожжевых''клеток ' от- повреждений, -образующихся' в 'результате комбинированного воздействия- ^гипертермии ■ и ¿ радиации.//9-ая Всесоюзная 'конференция: "Восстановительные1' и компенсаторные > процессы при лучевых ' поражениях > Тез-' докл.*, Изд.11НИИРРИ. '-' л. 1986." С. 24-25. ■ -'■''. ''.;■-■ V - -■ - - -'ti'.. - .. > *■'..■'. ib.' Глазунов A.B./' Пере pa - Д.Р.; -Глазер В. М.у. Борейко A.B. ; Модельная'система для изучения репарации двунитевых . разрывов ДНК ■ Уг.: Дрожжей ■ Saccharonycea .: * cerevÍaÍae.//MoneK.reHeT. микробиол.' ВИруС0Л.-1987.-КВ.-С.19-25.г' . . , .'.'»' J.'-

19. Глазунов A.B., Борейко A.B. Пострадиационное,-и. постгипер-термическое восстановление дро жже й:.формапь кый анализ:взаимо- ". связи двух - процессов.//Иванов В.И., Филюнкин И.В . (Ред.) , , Микродозиметрия -и ее применение в - радиобиологии. . М. г Изд. . Мя-та биофизики №нздрава СССР. 1988. С.56-66. . -.■'./.'¿у i-

20. Глазунов. A.B.» .Борейко A.B., ,äccep А.X. Быстрое . - > пострадиационное восстановление дрожжей: связь .с рецилрокной' митотической.рекомбинацией и генной конверсией./Денетика.■ --1988.-T.24.-N3. -С.428-435. ' ' ;"'■

:_2i, IIepepa'* Д.Р.,- .Глазунов A.B., Глазер В.М. , Изучение

рекомбинационной репарации двунитевш разрывов плазмидяой ДНК ■ : У радиочувствительных ' мутантов дрожжей saccharomyсея. cerevislae.// 5-ый Съезд ВОГИС.Тез докл. Т.2. М. 1988 .С. 211. : ■ 22..Глазунов A.B.,, Глазер В.М. * Быстрая ■ репарация г двунитевш - разрывов .ДНК . при , выдерживании , r-облученных " дрожжей ''в.--' непитательной ,среде.//Молек. генет.микробиол.вирусол. *• V. -1986.-Ы8.-С.36-41. ' ■■ : - ". '■,'.-

23. Насонова Е.А., Глазунов. A.B. Восстановление клеток китайского хомячка после комбинированного : воздействия гипертермии и радиации.//0итология.-198в.-Т.эо.-м ю. -С.1273-1276. --.J ',:'-■.'''■'■ .

, 24..Cerera D.В., , Glasunov A.V., . Glaser V.M., . Boreiko A.V. Repair of double ctrand breaks in - plasmid OKA in. the yeast Saccharonyces cerev1вtae.//Molec.Gen.Genet.-1988.-Vol.213. -P. 421-424. , ; - '/■/■■■' ■'■■■.'.'■ • >■...'"■■■'.■'

25.'Глазунов A.B., Борейко ; A.B., Эссер А.Х.' Относительная конкурентоспособность гаплоидных к диплоидных- дрожжей при : росте в смешанных популяциях './/Препринт ;ОИЯИ. Pi9-ss-«72. .. ■ Дубна. 1988. - 18 с. ' . „:г,'.\ '," '!.'■.■?'.■■".■.. ,''■■.'

• :'л- " ■ ■- "-'г'' . ss ' ■ ;. ■.'■:■•-.■-."

. 36. Глазунов A.St Механизмы лучевой инактивации! дипдоидных.

дрожжей.//Сообщения 0ИЯИ.-Р19-вв-в43. Дубне.19вв.-14 с. . 37. Глазунов А'.В.» Лобачевский П.Н. Роль' плондностив. ' устойчивости дрожжевых: «лето* Saccharoayce» car«vJ«Ja» к об- V ~ лучению ионизирующей радиацией.//Эврнстичкость радиобиологии. -Киевt Наукооа думка. 1эва.-С.4в-бо. >»-,..:

Зв. siaaunov A.V., Glaser V.K., Kapultcavlch yu.q. tvio pathways • -: ■" ot DNA doubla-atrand break repair In Ol calls of .. fiaccharonycea -; c»r«vi«iae.//y»eet.-l9e9.-Vol■9.-K2.-P.131-139.

з». Глазунов A.B.t Еорейко A.B. Закономерности пост; гипертермического восствновления гаплоидных и диплоидных F - ...

дрожжей 6each*гояуca« cereviala* и Pichl« plnua.// ЦИТОЛОГИЯ. . -1989.-Т.31.-И7.-С.765-790.

• зо. Глазунов1 A.B. Репарация двуммгевш. разрывов ДНК и радиочувствительность клеток^//Труды рабочего совещания, по

■'■ генетическому действию корпускулярных излучений. Д19-89-1«э. ' ИЗД.ОИЯИ. Дубна. 1989. С. 120-137. '„•

• ' 31. Борепко А.ц.( - Глазунов A.B. Индукция митотичвской

рекомбинации в дрожжевых - клетках с " помощью . комбинированного

воздействия гипертермии и радиации.// Тем'же. С.»е-И4.

зз. Глазунов Л. В. Роль' репарации ; двуннтеви» разрывов ДНК . в _

• радиорезистентности дрожжевых клеток.//l-ш Всесоюзный радио--;1 : ~ биологический съезд. Твз. докладов. -Т. 1. Иукино. 1989. - - - * ' с.loi-ioe. ; ■ ■

33. Глазунов A.B.. Борейко А:8., Насонова Е.А. -

. Восстановитвльньв процессы в клетках дрожжей' и млекопитающих . ; посла сочатанкого воздействия гипертермии и - ионизирующей ' радиации.//Там же.' «Т. 3.-С. 1181-1182. :

1>копись поступил» ,в иэдите»ьский отце« 10 октября 1S8». годи.

Макет Н.А.Киселевой.

Подписано в печать 13.10.89. Формат 60x90/16. Офсетная печать. Уч.-иэдлистов 2,77. Тираж 100. Заказ 42654. Издательский отдел Объединенного института вдеркьис исследований. Дубна Московской области.