Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
РОЛЬ СПОНТАННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГЕНОМА В РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология
Автореферат диссертации по теме "РОЛЬ СПОНТАННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГЕНОМА В РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК"
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИ
На правах рукописи АЛФЕРОВА ТАТЬЯНА МИХАЙЛОВНА
УДК 577.391:612.112.94
РОЛЬ СПОНТАННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГЕНОМА В РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК
03.00.01 — радиобиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандиаата биологических наук
Москва 1989
/ - , • • „J ^ jr р ^- • р *
ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ ПРИ СОВЕТЕ МИНИСТРОВ СССР
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-КССЛЕДОМТМЬСМЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОШ1 ■ ;,
На правах рдгкописи
■АЛФЕРОВА . ; Татьяна Михайловна
УДК 577.391:612.112.94
:РОЛЬ СПОНТАННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГЕНОМА В РАДИОЧУБСТВИТЕЛЬНОСта даШОЩЩЫХ КЛЕГОК
03.00.01 - радиобиология
автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 1989
!}-29Ч2-!
Ц£НТ?ЙПЬИДВ МЛУЧНЛЙ
. -ся:■
и о:1 гсс* еещиагм&шеа« шйейкэ к.1. на, 1.в,е;ииз
Работа выполнена в ордена Ленина Институте биофизики МЗ СССР
Научные руководители - доктор биологическиt наук Филиппович И.Б.
кандидат биологических наук Солдатенков В.А.
Официальные оппоненты - доктор биологических наук Пелевина и.и.
кандидат биологических наук,старший науч-■ ный сотрудник Шевченко a.c.
Ведущее учреждение - Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологич еский институт МЗ СССР. ,
Защита диссертации состоится 1989 г.
в часов на заседании специализированного совета Д.12О.81.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии ( г.Москва, Волков переулок, д.4 ).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной радиологии
Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 249020, Калужская обл.♦г.Обнинск,ЕКИИСХР,Спецсовет.
Автореферат разоолан " " _ 1989 г.
Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук
Санжарова Н.И.
ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАШШ
Актуальность'проблемы.; Пострадиационная гибель лимфоцитов приводит к нарушению функционирования систем кроветворения я иммунитета, тем самым во многом определяя основные проявления лучевой болезни млекопитающих и человека /Поверенный и др., 1978 Петров и др., 1981; Хансон, Комар, 1985/. Поэтому, изучение причин радиочувствительности лпмфоидных клеток является несомненно ; актуальной задачей современных радаобяодошчэских исследований.
Успехи, достигнутые в области молекулярной и клеточной радиобиологии* позволяет считать, что ведущую роль в формировании радиорезистентности клеток играют факторы, определяющие стабильность генома. Повреждения ДНК, вызываемые действием ионизирующей радиации, устраняются в результате функционирования системы репарации, направленной на поддержание стабильности генома /Жестяников, 1979; Рябченко. 1979; Хесин, 1980; Папонов, 1987/. С другой стороны, запуск генетической программы, постулированной для обду-. ченных лиш^оидных клеток /Уманский, 1982; Хансон, Комар, 1985/ реализуется через дестабилизацию генома, приведя к распаду адер-ной ДНК по. межнуклеосомным сайтам / ЗкаИса , Ма-^уавоу» , 1966 Водолаз екая, 1974/. ..■■.■■ ■
В связи с этим при исследовании механизмов цатотоксическо го действия ионизирующей радиации следует учитывать, что в геноме клеток уже существует определенный уровень повреждений. Действительно, в ДНК нормально функционирующих клеток"постоянно -возникают различные дефекты структуры, количество которых определяется ввдовыми особенностями, функциональным состоянием клетки, а также действием факторов внешней среды / Хесин, 1980*. _ :
Федоров, 1982; Бреслер и,др.,1984; Филиппович и др.,1985; Папонов, 1987/* Уровень таких повреждений является интегральным показателем стабильности клеточного генома я определяется балансом активностей . систем генеридуших дефекты в ДНК и их устраняющих. В совокупности такие дефекта структуры ДНК составляют определенный ' . фон "спонтанных повреждений" (СП) генома /Жестяников, 1979; Виленчик," 1977, 1985; Gr»«r ,K»pl«n ., 1983/. Известно, что скорость образования выявленных СП ДНК, связанная с процессами функционирования генома, довольна значительна и составляет приблизительно 5.I03 в час на клетку /Виленчик, 1987/. Вместе с тем работ, посвященных оценке уровня СП в клетках эукариотов сравни- . : только немного, а подученные данные часто противоречива /Бреслер . и Др., 1984; RySberg» 1975; Dikoamy, -l$82; Greer ,
Kaplan, 193?♦ . Johnstone, 1984/.
Как известно, популяции лимфоцитов тимуса представлены диФ-.; ференцирушшмися клетками, различающимися по радиочувствительности /Сорокина и др., I98X; Филиппович и др., 1985/. Кроме того димфоидаыэ клетки характеризуются повшеннын уровнем дефектов в ДНК, что отражает постоянно протекающие процессы перестройки генома, связанные со спецификой их Функционирования / . Greer, Kaplan , 1983; Johnstone i 1984; Бреслер И др., 1984/.- -
: Поэтому сравнительное изучение исходного уровня СП генома в популяциях тимоцнтов может иметь большое значение для понимания при-• чин различной радиочувствительности этих клеток, а также других клеток млекопитающих.
Цель и задачи исследования. Изложенные соображения определила основное направление наших исследований: выяснение вклада пред существующие (спонтанны^ дефектов генома в радиочуэстштель-
ность лимфоидных клеток. Объектом исследования являлись популяции лшк&оцатов тимуса мышей, различающиеся до радиочувствительности, ■'■..■■.'■.'.
В задачи исследования входили:
1. Сравнительное изучение количества предсуиестьующях СП в ДНК изолированных попудявдй тимоцатов,
2. Характеристика интенсивности процессов репарации индуцированных у -облучением повреждений ДНК а активности ДНК-поли-нуклеотидлигаз в этих клетках/
3. Характеристика гибели различных фракций лимфовдтов тимуса при накоплении СП генома в условиях блока их репарации и после у-облучения. ' . ■
4. Выяснение возможности модификация радиочувствительности тимощтов при изменении уровня СП генома.
/Научная новизна и практическая ценность работы. В работа V впервые проведена сравнительная оценка уровня СП в геноме популяций тимоцитов, различающихся по радиочувствительности. Показа- ;. во, что радиочувствительные тимоциты характеризуются более высо- . ким уровнем СП в ДНК* Продемонстрирована взаимосвязь ыедду способностью клеток репарировать индуцировашше £-облучением повреждения ДНХ и уровнем СП генома.
Установлено, что снижение уровня СП в ДЙК лиъфоцитов различ-: ннми соединениями, в том числе и радиопротекторами, приводит к увеличению радиорезистентности клеток. Эти данные дозволяют конкретизировать механизм действия радиозащитных соединений. ■■Впервые показано,. что накопление разрывов в ДНК клеток при действии ингибиторов репарации СП вызывает гибель тимоцатов,
сходку» по основным проявлениям с пострадиационной. При этом увеличение дефектов в ДНК клеток, индуцированных Ц -облучением, а также пря действии арабинофуранозилцитозина (АраЦ) и оксимоче-вики {ОМ) не увеличивает чувствительность хроматина к действию : эндогенной Са2+, Мд2+-завасимой эцдонуклеазы (КМЭ)* ;
Теоретическоезначение диссертации определяется полученными данными о важной роди уровня предсушествухщих СП генома в радао-. резистетности клеток вдекопитавщнх. Основные положения работы могут быть использована в дальнейших исследованиях пусковых механизмов пострадиационной интерфазной гибели лиьфждкых клеток.
, Практическая ценность работы состоит в том, что подученные результаты свидетельствуют, о возможности использования химических соединений, активирующие систему репарации ДНК и снижающих уровень СП генома, в качестве потенциальных радиопротекторов.
Апууч^дп^пд работа. Материалы диссертации доложены на IX Всесоюзной конференции "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях',' Ленинград, 1986; на Всесоюзном совещании "Механизмы радиационной гибели клеток и ее пострадиационной модификации", Дущино, 198?; на секции Московского отделения Всесоюзного биохимического общества, 1987; на научном семинаре Инсти тута химической физики АН СССР, 1987; на научных конференциях молодых ученых Института биофизики Минздрава СССР, 1987, 1988, 1989.- ' .'■' .■;. ,
Диссертационная работа апробирована на межлабораторной конференции Института биофизики Минздрава СССР 2 июня 1989 г. и на научной конференции отдела растениеводства ВНИИ сельскохозяйственной радиологии (г.Обнинск) 25 сентября 1989 г.
Публикация результатов исследования. Основное содержание диссертации изложено в 7 научных работах.
Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы , описания материалов и методов исследования, результатов собственных экспериментальных исследование, обсуждения полученных результатов и выводов. Она изложена ва 115 страницах машинописного -текста, содержит IS рисунков и б таблиц. Список литературы включает 190 работ отечественных л зарубежных авторов. • -
: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ '
Выделение и Фракционирование лимфоцитов тимуса. Условия ; инкубации. Критерии жизнеспособности.,'
Дня получения тиыоцитов использовали 4-5 недельных мышей-самцов (CBAxC57BI)ij. Тимоциты получали измельчением тимуса в среде Игла при кошатной тешюратуре с последующим фильтрованием через нейлоновую ткань. Суспензию тимоцитов дважды отмывали центрифугированием (3 мин»320 в среде выделения.
Тимоциты фракционировали в ступенчатом градиенте плотности -сывороточного альбумина человека (" . Re anal. - Венгрия) как описано Сорокиной с соавторами /1981/. Шсле фракционирования количество погибших клеток составляло не более 7-8$» для клеток большого размера и ва более 4-5$ для малых тимоцитов. Выход клеток составлял 40-5СЙ от общего количества, нанесенного на гра-:
L ■■'■:.' rj ' L
даент. Длительную инкубацию клеток (I.X0 кл/мл) доводили во . тайной атмосфере с 5% COg при 37°С в среде Игла с добавлением 20ES сыворотки крупного рогатого скота. В среду инкубации добавляли глутамин (0,03£)» пенициллин (2000 ДД/мл) а стрептомицин .
(30 мкг/ыл).
Количество погибших клеток оценивали, как правило, по двум"'. критериям: по Teciy прокрашивания 0,2$ раствором эозина в камере Горяева, и по выходу фрагментов хроматина (1ЩЙ). Б течение 24 часов инкубации количество клеток.в суспензии как интакяшх, так -и облученных тимоцятов практически но менялось.
Выделение ядер ив тимуса. Тймоциты суспендировали в буфере 0,25 М сахароза; 10 мМ трис.НС1, pH 7,5; I мМ ß-меркаптоэтанол; I мМ ЭДТА в 3 ull M^CIg . гомогенизировали и центрифугировали 5 мин при 800 д. Затем ядра тгря^трт прсмывали буфером 0,147 М ЛаС1, 10 мМ трис.НСХ, pH 7,5, I мМ ЭДТА, 1,5 мМ ^^меркаптоэтанол, 3 мМ f^CIg и использовали для автолитического расщепления хроматина.
i /-облучение. Облучение тамоцитов f-лучами е0Со проводили в среде Игла во льду на установке "Игур" с мощностью дозы -0,88-мА/кг в концентрации I07 клеток/мл, В ряде экспериментов нуклеоиды облучали в лизирующем растворе на поверхности сахарозного градиента на установке ЭГО-2 с мощностью дозы 0,45 ыА/кг.
рдттп'трдгтсм и яяализ продуктов деградации хроматина. Дегра- ■ даадпо хребтина тимоцитов оценивали до количеству образующихся полидезоксинуклеотидов (ЩЩ) , экстрагированных 0,15 М фосфатным буфером рн 7,2 по ыетодуЕрыодаевой и Водолазской /1970/. Цри этом содержание ДНК определяв флуорометрически с 3,5-даамино-бензойной кислотой / Klassne, Robina , 1958/. Количество ЩЩ в пробах рассчитывали в процентах от общего количества ДНК. Электрофорез депротеинизованных препаратов ЦЕН (IC-I5 мкг ДНК на дорожку) проводили в 25£-геле агарозы. ДНК окрашивали бромистым этидаем ОБ) - (0,5-1 мкг/мл).
Определение седиментационных характеристик нуклеоидов тамо-цитов : проводили по методу Cook, Breaell /1975/ е модификациями. Тимоциты лизировали в 1,95 Ш31, 10 м.М трио.HCl, pH 8,0, 0,1 М - ЭДТА, 0,Ь% тритон Х-100 15 мин при 4°С В КОЛИЧеСТ-
^е ' .■'.''
во 3,5-5,10 клеток. Лизированные клетки центрифугировали в 15-30^ градиенте сахарозы, содержащей 1,95 М Я«С1, 10 мМ ЭДТА и 10 иМ трас. HCl, pH 8,0, • при 37000 oö/шш в роторе 50.1 на ультрацентрифуге Splaco l42-65 при 4°С 15-20 мин. Подвижность нуклеоидов определяли по расстоянию от пика до мениска при регистрации пика по поглощению цря 260 ни. Относительную; подвижность ( Er ) рассчитывали как отношение расстояния, пройденного нуклеоидом в опыте (облучение), к расстоянию, пройденно- ' му нуклеоидами контрольных клеток.
Активность- ШК-лигазы в грубых экстрактах клеток определяли по приобретению устойчивости ДНК с концевыми б'-^^Р-грушамя к . щелочной фосфатазе / Weiss *t al. , 1968/. Реакционная смесь включала S-I5 мкг 5'—33Р—ДНК» 25 мкг бычьего сывороточного альбумина, 50 мМ трис.НС!, pH 7,6, 10 мМ UjGIo, 0,03 мМ ЭДТА, 5 мМ Р -меркадтоэтанол, 0,2 мМ АТФ, 0,1 М H3I, 0,1-0,5 мкг белка -экстракта в объеме 0,3 мл. После инкубации 20 мин при 30°С пробирки помещали в лед, добавляли 0,4 М н аС1 до конечной концентра-, ции 0,2 М в объеме I мл, выдерживали 10 мин при 100°С, добавляли по 10 мкг щелочной фосфатазы и инкубировали 30 мин при 65°С. Затем пробы охлаждали и добавляли 0,4 мл 0,1 М Ыа^Р^Оу. 10 Н2О и 1,4 мл 1Ь% ТХУ. Осадок собирали на нитроцеллюлозные фильтры и просчитывали радиоактивность. Активность выражали в моль"*2 ^^Р/ мг белха/млн. * ■ . .
Оценка уровня спонтанных повреждений ДНК. Уровень спонтанных повреждений ДНК оценивали двумя методами /Ереслер и др. , 1984; , 1981/.
По методу ^еслера и др. /1984/ уровень спонтанных повреждений ДНК определяли по изменения количества погибших тимоцитов, ' инкубированных с I- р - Я> -арабиноэидцитозином (АраЦ) и оксимо- -чевиной (Ш), по отношении к контролю. ОМ а АраЦ были взяты в концентрациях, обеспечивающих ингибирование ресиятеза брешей ДНК, 4 мМ и ОД мМ соответственно. Еиэнеспособность клеток определяли по прокрашиванию эозином. '..-■■
' Второй способ оценки уровня спонтанных повреждений ДНК -
заключался в определении количества разрывов в ДНК с помощью мэ- . тода щелочного распле тения ДНК о последующим флуориме трическшл определением доли дауспиральных молекул /в1гпЬо1т,автс»к * 1981/. 5 качестве фдуорозонда использовали бромистый этидай. Флуоресценции регистрировали на 590 ни при длине волш возбуждающего света 520 ш. Долю дауспиральной ДИК определяли по формуле: - .-
' р „ х ХОСЙ.1 где
1—В
Р - флуоресдащщя опытной цробы, .
В и Т - интенсивность флуоресценции проб« содержащих полностью одно- и двуспиральную ДНК соответственно.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ .
I. Спонтанные повреждения генома и активность системы репарации ДНК в популяциях лимфоцитов тимуса, различающихся по радиочувствительности
Уровень СП в ДНК определяется соотношением скоростей их образования в результате функционирования генома и элиминации, зависящей от состояния репаратввнтс систем клетки. Поэтому первоначальной нашей задачей было сопоставление интенсивности указанных процессов в клетках, различающихся по радиочувствительности.
: Относительный уровень СП оценивали , по темпу гибели , и сшше-^ нею процентного содержания двуспиральной дак в лимфоцитах тему- ■ са в условиях ингибирования полимеразной стадии эксцазионной ре- -парации АраЦ и ОМ. При этом бреши, возникащие на противополож- . " ных цепях ДЙК трансформируются в даунитевые разрывы (ДР), вызы-ваящие гибель клеток - /Е£>е слер и др.,. 1984/.
. Инвубацня нефракционированныг тимоцитов с ингибиторами ре-парапгвного синтеза (АраЦ и Ш) вызывает прогрессивно нарастающую во времени гибель клеток и снижение дели двуспиральной ДНК, что согласно уравнению Ридберга / НуЛЬвге , 1975/ еввдетель-ствует о накоплении одаонитевых разрывов (ОР) в ДВК (рис. I).
Полученные результаты показали, что оптимальное время инку-. : бации клеток с АраЦ и. ОМ при определении.уровня СП генома состав'' ляет 19-24 часа. . ■-у ■ / > -'■-'
Следуший этап работы заключался в выяснении вклада предсу-. шествующих (СП) дефектов генома в радиочувотвительность субцопу-ляций тимоцитов! полученных при фракционнрованш в ступенчатом градиенте сывороточного альбумина человека /Сорокина и др., 1981;
аьоПамш ■ ■'.' 196В/. в работе бадш использованы I, Ш и У1 фракции лимфоцитов тимуса. Известно, что I фракция клеток, обогащенная поздними . предшественниками Т-лимфоцитов, оказывает- ■ ся наиболее устойчивой к действию глюкокортикешдов (ГК>, химических индукторов дифференцировки (ХШО и, наконец, к действию
'S
19 13 20 25
Рис.1. Влияние АраЦ и СМ V на выживаемость (А) и содержание двуспиральной ДНК (Б) в лимфоцитах тиму: са.
* I - контрольные клетки 2 - клетки, инкубированные с АраЦ и ОМ. ■ Шо оси абсцисс - время ин-.кубащи, ч; по оси орди- ,
■ ват - доля жизнеспособных клеток CA),. доля дву-спиралъной ДНК в xrpode
■ (логарифм.масштаб) (Б).
3 £ 9 « 16 19
радиации / РШрроу1сИ в* а1. ,1582/. Ш и У1 фракции клеток представлены, в основном, кортикальными тимоцитада, чувствительными к действа» различных датотоксаческих агентов /Сорокина и' др., 1987/. Результата, полученные при инкубации различных фракций тлмоцитов с АраЦ и ОМ, представлены в табл. I.
. : ; - .- Таблица I.
Влияние инкубации фракций тимоцитов (I, Ш и У1) с АраЦ и ОМ на гибель клеток а содержание дауспиральной
'-:щк ""
Время Количество вопабших клеток
инкубации ; (АраЯ + Щ) - К, (%)
: - ■ Ф Р а к ц в и _I Ш У1 "
20 12,6+1.5 22,7+0,9* 14,6+1,8
. 21,5 . 13,5+1,6 29,3+1,9* 18,5+1,8*
23 ' 16,6+2,6 32,5+1,5* : 21,8+1,2*
' ■■,"■,. Содержание двусяиральной ДНК
V, К - (АраЦ + ом)..-:«?
Фракции ,••'
■.' •..• ■".' I у : . ' Ш . У1 ... •"■
19 8,2+4,0 18,2+3,0* 15,6^5,1
К - контрольные клетки,; инкубированные в отсутствие АраЦ
'и ОМ.:. ■: Г. . /Д .■
* - Достоверное отличие Ш и ЗТ фракций тимоцитов от I фрак. ции (р < 0,С5).
, Как видно из табл. I, гибель клеток и накопление ОР (величина обратно пропорциональная содержанию дау стиральной ДНК / ' НуйЬеге , 1975/)прогрессивно.нарастают во времени. Наибольшая чувствительность к действию ингибиторов репаративного синтеза
(АраЦ и OfJ) характернадля, радиочувствительных Ш и УХ фракций тимоцатов ( 5Эо = 1,75 и 2,25 Гр, соответственно). В радаорези-стентной I фракция ( Я?о = 4,75 Гр) этот показатель изменяется в меньшей степени. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о тем, что более дифференцированные клетки Ш и У1 фракций тимоцитов ( по сравнению о I0® )' характеризуются повышенной скоростью накопления разрывов в ДНК. Накопление эндогенно продуцируемых разрывов в ДНК при терминальной дифференцировке,: продемонстрировано также и для ряда других клеток. Так, показано, что образование разрывов в ДНК является необходимым событием при дифференцяровкб клвток зритролейкемшз Френд / seter «t »i. , 1983/и миобластов цыплят / Farzancti *t »l. ' , 1982/. Повышенный уровень ОР обнаруживается в ДНК лимфоцитов периферической крови человека / Jobnstoae, William« , 1982/.-.
Следует иметь в виду, что накопление ОР, определяемое в условиях блока их ресинтеза, не может однозначно свидетельствовать . о количестве дефектов i» eitu , Действительно, уровень СП генома в конечном счете определяется соотношением активностей -• систем, генерирующих образование дефектов в ДНК и их устраняющих. Так, например, для ряда клеток больных наследственными заболеваниями и при старении продемонстрировано снижение активности системы репарации ДИК Аестяшиков, 1979/, принтом уровень СП в геноме возрастает /Носкин : j , 1985/. С другой стороны, активация процессов репарация ДНК, происходящая при обработке лимфоцитов ыитогенами, приводит к выраженному снижению уровня ОР в ДНК/ Oceer, Kaplan , 1983; * Johnstoae , 1984/. Поэтому для более корректной оценки уровня СП, полученные результаты необходимо было сравнить с активностью систем репарации повреж-
доний ДНК в этих клетках.
Результаты исследования кинетики репарации ¿'-индуцированных поврездений суперетаральной ДНК (сс ДНК) представлены на рис. 2.
Рис. 2. Репарация ядерной ссДНК фракций тимопдтов,\
; облученных в дозе 2,5 £р. ::
I - I фракция,
3 - Ш фракция, .. . ' .
6 - У1 фракция.
По оса абсцисс - время" инкубации клеток после облучения, иин;■,'■
по оси ординат - относительная седиментационная подвижность нуклеоидоэ облученных клеток.
' Использование чувствительного метода седиментации нуклеоида ■■ . / Cook, Brezftll , 19?5/ позволяло нам выбрать сравнительно
невысокую дозу - 2,5 IJ>, при которой гибель тимоцитов оказывает-■ ся пряыопропорцаональной дозе облучения /Жавотова и др., 1975/. Цри этом мы смогли отдиффарввщров&ть события, происходящие в: оставшихся живыми к данноцу моменту времени клетках от происхо-
дящих в погибших, поскольку в тшнотичэских клетках ядерная ДНК не сохраняет суперепиралиэовадаой конформавди
в* >1* * , 1982/. - Сравнивая результаты, полученные нами при исследовании репарация сс ДНК Ш фракции клеток с данными, полученными ранее при идентичных условиях на X и УХ фракциях / Р111рро-?юь «ъ а1> , 1982/, можно заключить, что интенсивность этого процесса максимальна в радиорезистентной I фракции . к минимальна в наиболее радиочувствительной И фракции лимфоца-тов тимуса (рис. 2).
Наблвдаеиые отличия в интенсивности элиминации повреждений сс ДНК во фракциях тимоцнтов могут быть обусловлены как структурными особенностями организации генсыа, так и различной активностью ферментов репарационного комплекса этих клеток. Роль структурной организации хроматина для регуляции процессов репарации ДНК продемонстрирована в многочисленных исследованиях на различных объектах /Хаясон, 1979/. В частности, для "лим$свдйых . клеток выявлена зависимость скорости репарации Ц -индуцированных повреждений от величины суперсдярализовандах доменов ДНК / ЕШррйл^сЬ «-6 «X. 1982/. Вместе с тем, сравнительные . данные об активности ферментов репарации в популяциях лимфоцн- л тол, различающихся по радиочувствительности, в литературе практически отсутствуют, Шэтому.мы оценшмсушарну» активность- л ДНК-дигаз (I и П форла) в экстрактах фракций тимоцитов (рис.3).
Для оценки активности дзгазы был выбран широко используемый метод определения устойчивости ДНК, содержащей 5' /33Р/ - З'-ОН-концевые группы к действию щелочкой фосфатазы /ие±вз ее а1. » 19вв/, согласно полученным результатам активность лигаз в I -фракции тимоцитов оказывается максимальной, а более дд<|ференЩ1-
Рис. 3, Суммарная активность ДНК лигаз во фраюзип . лимфоцитов тимуса, г-По оси абсцисс - номера фрак* ций тимодатов; по оси орди- .
нат - активность ЩК-шгаа, [ %. Активность фермента в Ш • фракции клеток принята за
1с<#. -
I йф
. рованные клетки (Ш и ЗТ фрающй) характеризуются низким уровнем активности даК-днгаз. Следовательно, наиболее дифференцированные клетки тимуса (Ш и У1 фракции) характеризуются сравнительно высоким темпом образования спонтанных дефектов в ДИК (табл.1) я сниженной активностью системы их репарации (рис. 2 я 3). Результатом такого дисбаланса макет являться повышенный уровень црадсушествущих СП в ДНК,.- определяющий высокую радиочувствительность з тих клеток. ;;
-. 2. Ш/шФйкаиия радиочувствительности лимфоцитов той . у изменении уровня спонтанных повреждений генома.'
Модификация - уровня СП генома мовет быть достигнута в результате направленного изменения активности либо процессов образования дефектов в ДНК, либо системы их репарации. 5 качестве.
% 300
200 100
гН
И1
соединения, активирующего репарацию повреждений ДНК, , был использован митоген коиканавалин А (КоА) / Gr««r, К»plan ,1983;.
«TotLCLston« ,: IS84/. как следует из представленных в табл. 2 данных, предай нкубация фракций тимоцитов с КоА практически полностью снимает различия в уровне СП ДНК этих клеток. Так, максимальное снижение уровня СП под влиянием КоА наблюдается в Ш фракции тимоцитов, характеризующейся наиболее высоким уровнем СП генома и медленно протекающей репарацией ¿'.-повреаде-' ний дак.
Кроме того, было показано, что КоА, активируя репарацию СП : ДНК и тем самым снижая их уровень, приводит к возрастанию радиорезистентности тимоцитов (ЩД s 1,83+0,06) (рис. 4).
; Рис. 4. Зависимость выли-j : : ааемости лимфоцитов.тиму-
f^t+v*^ . са от дозы облучения в
"7 —-f—.;: присутствии (I) и отсутст--— ф—s i—2 вот (2) КоА. Но оси абс-
tf Ц
м
ад
<15 <52Л
! цисс - доза облучения, Гр; ;¡ по оси ординат - доля вы; живших клеток. Тимоцпты. ' : прединкубировали с КоА в ... течение 1ч."
В пользу предположения о важной роли уровня предсуществувщих, узнаваемых эндонуклеазами, СП генома в радиочувствительности лимфоцитов свидетельствуют также результаты, полученные при cono- : ставлении радиомодифацирующего действия разных классов химических соединений с их способностью изменять уровень спонтанной
. : . Таблица 2.
Влияние преданкубации фракций тимоцатов с КоА на цито-токсический эффект АраЦ и ОМ
Фпакиия Время Количество погибших клеток, %
-i™-1*"" инкубации с .. I и— I .-I I
: АраЦ и ОМ, без применения КоА с применением КоА ч (2 мкг/ил) s
без АраЦ с АраЦ без АраЦ с АраЦ и СМ и СИ и ОМ — и ОМ
20 2S,9iI,5 39,5i0j 34,7+0,2 29,6*0,7
I 21,5; 29,5+1,7 43,0+0,8 28,5+0,5 30,5+0,4
23 28,8+1,2 45,5+1,3 29.5+0.8 31,7+1,2
20 23,8+0,6 46,5+0,9 24,2+0,2 26,2+0,7
Ш 21,5 . 24,5+1,3 52,7+0,1 23,4+1,6 24,8+1,4
23 30,2+1,2 61,5+1,5 29,5+2.5 28,5±I,5
20 29,2+0,9 43,9+1,7 29,0+1,5 28,3±0,9
У1 ■■,. 21,5 27,5+1,7 46,0+1,5 28,6+3,4 29,2+1,7 23 ; 30,1+2,0 52,0+1,2 29,4+1,1 29,3+0,5
" * - Достоверное отличие количества нежизнеспособных кле-
: ток в пробах не преданкубированннх с КоА -' от проб , прединкублронанных с КоА ( р<0,05 )
повреаденности генома лимфоцитов тимуса (табл. 3, рис. 5). .
- Показано, что соединения, обладавшие радиозащитнш действием на тимоцятн in.vitro (5ИД>1,0) снижают темп накопления CP в ДНК и чувствительность клеток к АраЦ и ОМ. Незффектив-
Таблица 3.
Радншодифицирущее действие хишгсескях соединений и их влияние на цитотоксивдскиЛ эффект АраЦ в ОМ 1а тИа-о.
^ , Химическое Концентрация, Условия прединну- Количество Фактор
■ т соединение Н ..■:.' бащш - ■ погибших изменения
■■ ■ ' ■ п —." "^„о— ' клеток . дозы
время. отиывка ¿А^М)- ( ад )
I. Цистеамин 5. КГ3 V; . ' 20 ' ' 14,2+2,4* ; 1,8+0,С5*
" гг 160 . +1 26,3*1,2 ; . 0,9+0,09
2; Щстеин . 5.10"®..'. 20 ■■;.-. ' 15,7+3,4* ' 1.710,10*
" . 160 23,3+1,9 " 1,0+0,05
3. Йзоцпстеин ■ " 5Л0"3 : 20 + " 26,2+1,5 1,0+0,05
и ; ■ 160 26,1+1,3 1,0+0,06
4. Мексамш 1.1С"3 •• бс 13,6+3,4* ' 1,7+0,8*.
5. Двэтилфосфат- 8 - 1.НГ2 15 X . + ■ 26,4+1,5 , 1,0+0,10
-этилизотиурония II : 60 . 26,1+1,1 '.: ■ 1,0+0,12
6. Налидаксовая к-та . 5Л0"4 60 17,7+1,6* ' 1,6+0,0?*
7. : Ншсотинамид ' 4.КГ4 60 + 18,0+2,1* .1,4+0,06*
8. Без 'протектора : - ■ 26,0+0,6 '
Время инкубации с /раЦ + ОМ - 23 часа. .Инкубация в среде Игла,;
х - Достоверные изменения по отношению к контролю (клетки не прединкубировалисъ с исследуемые веществами) (р < 0,05). , , .
Рис. 5, Влияние радаомоди-фидаторов на содержание двуспиральной ДНК в лимфоцитах тимуса, инкубированных
■ с АраЦ и ОМ. По оси абсцисс ■. - время шщубации клеток с ,.
■ АраЦ и ОМ, ч; по оси ординат - доля двусшральной ДНК в пробе, Тимоодты
. инкубировали с АраЦ и Ш (4) или без ингибиторов (I). Дистеамнн <3), цистеин (2) -иди изоцистеин (5) добавля-- ли за 20 мин, затем клетки ' отмывали от соединения и продолжали инкубацию с АраЦ и ОМ. Доля двуспиральной . ДНК в контроле принята за :
..-у;-. • ■ 1ос0. .. ■
ные соединения ($ИД<1,0) такой способностью \ не обладает.
Совокупность полученных данных позволяет заключить, что снижение уровня спонтанной повредценностя генома клеток млекош-ташлх может быть одной из сторон механизма действия радиозащитных средств, а сам уровень СП- важным критерием, определяшим радиочувствительность клеток, в частности, лимфоцитов. Чем он выше, тем более радиочувствительными оказываются клетки.
3, Деградация хроматина ви лимфоцитах тимуса при ингибировании репарации сионтанншс повреждений генома
С целью выяснения роли СП генома в судьбе облученной клетка был охарактеризован процесс деградации ДНК, наступающий при
гибели тимо дат о», ил ну би роЕД! ш ы.ч о ЛраЦиОЫ (рас» 6).
/ ■ Рис. 6. Влияние АраЦ и ОМ
10 а
б >
2
10 3
6 *
г
на выживаемость (I) и деградацию хроматина тимоци-тов (2). По оси абсцисс -время инкубации, ч; по оси ординат - пороет погибших клеток,(слева) и количество ЩЩ за вычетом контроля, % (справа)* '. :
, Как следует из рис. 6,гибель клеток совпадает с началом выхода 1ЩН. Эти результаты согласуются с данными других авторов о том, что при инкубации нелимфоидных клеток с АраЦ и ОМ момент начала деградации ДНК (образование первого ¿ЕР) совпадает с началом клеточной гибели /Ереслер и др., 1984/. ■ '
Кроме того, анализ методом электрофореза в агарозном геле показал идентичность продуктов деградации хроматина в тимоцитах.ин-кубированных. в точение ? часов с АраЦ и ОМ, и фрагментов,выделенных из тимоцитов через 4 часа после облучения в дозе 30 Гр. Эти продукты представляют собой нуклеосомы и их олмгомеры.Известно, что межнуклеосомная деградация хроматина после у- облучения подавляется ингибиторами белкового синтеза - цнклогексиыидом (ЦТ) и адрошцином ./ Иван ни к и др., 1976/, Оказалось, что ЦГ и вдро-мицин также предотвращают и токсическое действие АраЦ и ОЫ
на лимфоциты тимуса (табл. 4).
Таким образом, гибель лимфоцитов тимуса ори действии АраЦ и ОМ по феноменологии оказывается сходной с пострадиационной гибелью этих клеток. - - * - " Таблица 4. .'■ Влияние ингибиторов синтеза белка на токсический .:■■ эффект АраЦ и ОМ ..
Количество погибших клеток, %
беа применения с применением
АраЦи ОМ : АраЦ и ОМ
Ингибитор
Цуромицин 20,8+1,2 20,8+1,5 :■
Циклогексимид : 23,7+0,9 '.: 21,5+1,0 -
Без ингибитора - . , 26,4+0,6 52,1+1,8*
(контроль)
* - Достоверные отличия от контроля (р ^.0,05).
Время инкубации - 23 часа. Цурсдацин и циклогексимид добавляли од новременно с АраЦ и Ш в концентрациях 20 мкг/ил и 200 мкг/мл соответственно.
Предполагается, что межнунлеосомная деградация в облученных клетках осуществляется с участием КЮ / ЯИсом^а «ь »1. ■"
, 1982/. Можно поэтому полагать, что накопление дефектов , в ДНК (СР или одноцёпочечных участков) будет способствовать увеличению чувствительности хроматина к действию КМЭ. . Однако,', накопление дефектов в ДНК лимфодатов (индуцированных ^-облучением или эндогенно-продуцируемых в условиях блока их репарации) не увеличивает чувствительность хроматина к КМЭ. Полученные данные ставят под сомнение возможность инициации деградации хромата-
на,■ а также гибели клеток только вследствие накопления GP в ДОК с последующим их узнаванием и трансформацией в ДР эндогенными нуклеазами, нормально функционирующими в клетке.
■ Альтернативным предположением о роли СП генома в радиочувствительности лимфоцитов является возможность индукции генетической программы гибели клеток в ответ на накопление повышенного (или критического) уровня повреждений в ДНК. Существование такой программы постулировано для пострадиационной гибели лим-фоидаыг клеток /Хансен, 1979: Уманский, 1982; Sellins, Cob#n , 1987/. Подтверждением высказанного предположения могут являться данные, полученные ; нами при оценке влияния индукторов дифференцирован на уровень СП генома лимфоцитов тимуса. Как следует из таблицы 5, прединкубация клеток с индукторами вызывает увеличение их чувствительности к АраД и ОМ, являющееся следствием накопления СП в ДНК /Бреслер и др., 1984/ (табл. 5).
Таблица 5.
Влияние прединкубацяи тимоцятов с ХИД (Г ч) на ■ . вдгтотоксический эффект АраЦ и ОМ
Индуктор
Количество погибших клеток, %
дпфференцировки без применения с применением
. АраЦиОМ АраЦ и СМ ■
Еутират Ка 23,6+1,7 ; 47,1+1,5* '
Этионин 25,8+0,8 ; 49,Э£1,2*
Дйметнлсульфоксид 25,2+1,4 .44,3+1,1*
Без индуктора 23,2+1,1 39,6+1,6
. * - Достоверные изменения по отношению к контролю (клетки не прединкубировались с 2ИД) (р < 0,05). Время инкубации клеток с АраЦ и СМ - 23 часа.
Таким образом увеличение уровня дефектов в ДИК лимфоцитов, . »фипшсодмщйв при действии АраД и или облучения индуци-
рует клеточную табель, характеризующуюся сходной феноменологической картиной /Хансон, Комар, 1935; Сслдатенков и др., 1985; Сорокина и др., 1985/. Не исключено; что сигналом запуска программы гибели является накопление повреждений в ДНК выше' оцре- , деленного уровня. В этом случае критический уровень повреждений быстрее достигается в клетках с более высоким уровнем СП генома, что, в конечном счате, и определяет их высокую чувствительность к действию того или иного агента.
ВЫВОДЫ
I. Более радиочувствительные популяции лимфоцитов тимуса, характеризуются повышенным уровнем СП генома.
, 2. Более радаорезистентнке клетки тимуса мышей - (X фракция) характеризуются высокой интенсивностью репарации ивдуциро^ ваннах / -облучением повреждений ДНК и повышенной активностью ДНК-полинуклеотидлигаз по. сравнению с радиочувствитедвщши тимо— цитами (Ш и Л фракции). V1'
3. Снижение уровня СП генома при инкубации клеток с рада озащитными соединениями, а также с митогеном, сопровождается увеличением радиорезистентности лимфоцитов тимуса. Соединения,' не оказывающие радиомодифицирующего действия, не влияют на уровень СП генома тимовдтов. .
4. Накопление дефектов в геноме клеток при действии АраЦ
и ОМ вызывает гибель тимоцитов, сходную по основным проявлениям; с пострадиационной. Для реализации гибели клеток в данном случае, как и после % -облучения необходим синтез белков <1е пото.
5. Накопление в ДНК лимфоцитов тимуса дефектов, индуцировавшее ¿'-облучением или при действии АраЦ и GM не увеличивает
о*
чувствительность хроматина к -зависимой эндонуклеазе.
6, Высокий уровень СП генома лимфоцитов может определять-ел дисбалансом активностей систем, образующих и устраняющих дефекты в структуре ДНК. В большей степени такой дисбаланс вара- , жен в более радиочувствительных популяциях тимоплтов. Дополнительное увеличение уровня повреждений в результате воздействий, повреждающих ДНК (ионизирующая радиация, ИД, АраЦ и ОМ) может способствовать запуску генетической программы гибели лимфоидных
. клеток." / ;. .'.
СПИСОК" РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШБ ДОССНТАОДМ ■
I. Сорокина Н.и., Алферова Т.М.', Солдатенков В.А., Фи- ; липпович И.В. Роль спонтанных повреждений ДНК в радиочувствительности лимфоштов .тимуса. - Радиобиология, 1986, т.26, в.2, с.158-161. ,.- -.
Алферова Т.Ц., Сорокина Н.И., Фалшшович И.В. Роль/, спонтанных повреждений ДНК в радиозаиитном действии радиопротекторов различите классов на тимоциты мышей.' - В кн.: Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях. Тез. докл. ix Всесоюзной конф. -Д., 1986, с.6. ■ -
3. Сорокина Н.И., Алферова Т.М., Филиппович И.В. Влия-.ние модификации репаративных цроцессов на радиочувствительность тимоцатов мышей. - Там же, с.223. _
4. Алферова Т.М., Сорокина Н.И., Соддатенков В.А., Филиппович И.В. Деградация хроматина в лимфоцитах тимуса.при ингиби
реванш! репарации спонтанных повреждений. - Радиобиология, 1987, т.2?, в.4, с.472-475.
5. Алферова Т.К., Тронов В.А., Солдатенков В.А., Денисенко М.Ф., Филиппович й.В. Спонтанные повреждения ДНК и активность ДНК-полвнуклеотидошгаа в популяциях тимоцвтов, различающихся по радиочувствитедьности. - Радиобиология, 1988, т. 26, В.4, с.441-447.
6. Fllippovlch I.V., SoГОkin* tf.I., S0l4»t»nk0v V.A., Alfuwrov» Т.К., ТгеЪеао* 2.A. affect of ttw Loduoer» of cellular AifferAatietioa *nd of iouLzing r«dietloo of tbymus lyapbo-oyte в»chromatin d»gr»4*ticm »nd psogr«m*d cell 4**tb. - lot.
J.H»di»t.Biol., 1Э08, v.53, no.4, p.617-628.
7. Беловская Л.Н., Зайцев В.A., Алферова Т.Н., Тронов В.А Зотов A.B. Ирогремвированная гибйль облученннх тимоиитов. - В кн I Всесоюзный радиобиологический съезд. Тез.докл. - Пущине, 1989, с.134-135.
Л - 32857 от 18.10.89. Сдано в печать 31.10.89 Формат 60x84/16. Печ.л. 1,56. Уч.-издл. 1,39
Заказ 52. Тираж 100__-
ВНИИГеофиэика. Полиграфпредприятие Москва, Фрунзенская наб., 46
- Алферова, Татьяна Михайловна
- кандидата биологических наук
- Обнинск, 1989
- ВАК 03.00.01
- Исследование поврежденности ДНК индивидуальных клеток млекопитающих методом гель-микроэлектрофореза
- Цитогенетическое действие протонного терапевтического пучка с энергией 170 МЭВ на клетки человека
- ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ К ДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ЛПЭ, И ФАКТОР ПЛОИДНОСТИ
- Изучение проявлений мутаций мутагенной чувствительности в эмбриогенезе и оогенезе Drosophila melanogaster
- Радиочувствительность Т-лимфоцитов периферической крови у потомков первого поколения, отцы которых подверглись хроническому радиационному воздействию