Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение проявлений мутаций мутагенной чувствительности в эмбриогенезе и оогенезе Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Саранцева, Светлана Владимировна, Санкт-Петербург

'.•■99

/

петербургский институт ядерной физики

им. б!п. константинова ран

На правах рукописи УДК 575.1.773.4

Саранцева Светлана Владимировна

Изучение проявлений мутаций мутагенчувствительности в эмбриогенезе и оогенезе ОгоБорЬПа те1апо§аз1ег

Специальность 03.00.15. - Генетика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Хромых Ю.М.

санкт-петербург - 1999-

оглавление

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................9

1.1. Первичные характеристики мутагенчувствительных мутантов

дрозофилы.........................................................................9

1.2 Нарушение целостности митотических хромосом в клетках мутагенчувствительных мутантов..........................................13

1.3 Репарация ДНК в клетках дрозофилы.....................................15

1.4. Гены мутагенчувствительности и контроль клеточного цикла в ответ на повреждения ДНК (checkpoin control)..........................24

1.5. Радиационные эффекты в эмбриогенезе

дрозофилы........................................................................27

1.5.1. Особенности биологии эмбрионального развития.......................27

1.5.2. Возрастной паттерн эмбриональной радиочувствительности........................................................32

1.6. Радиочувствительность оогенеза дрозофилы.............................34

1.6.1. Особенности биологии оогенеза дрозофилы и мейотическая рекомбинация....................................................................34

1.6.2. Стадиеспецифический характер радиочувствительности в оогенезе...........................................................................42.

Глава 2. Материал и методы.........................................................46

Глава 3. Результаты исследований..................................................51

3.1. Сравнительный анализ эффектов мутаций rad201Gl и mei-41D5 в эмбриогенезе дрозофилы при действии гамма-

лучей................................................................................51

3.2. Анализ проявлений мутаций rad202Gl, mei-9a и mei-41D5 в эмбриогенезе при действии УФ-света.......................................59

3.3. Изучение радиочувствительности различных стадий оогенеза у самок мутантов rad201Gl, mei-9a и mei-41D5......................................71

3.4. Исследование взаимодействия мутаций генов мутагенчувствительности mei-41, mei-9 и rad201 в половых клетках самок дрозофилы................................................................82

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................87

4.1. Избирательное действие мутаций rad201Gl и mei-41D5 в эмбриональных клетках после воздействия гамма-лучей...............87

4.2. УФ-чувствительность эмбрионов дрозофилы в линиях с различной репарационной способностью..................................................93

4.3. Влияние генов репарации на индуцированный апоптоз в эмбриогенезе........................................................................99

4.4. Эффекты гамма-лучей в оогенезе мутантов дрозофилы, дефектных по репарации и мейотической рекомбинации................................. 101

4.5. Взаимодействие мутаций генов мутагенчувствительности mei-41D5, mei-9a и rad201Gl в половых клетках самок дрозофилы при действии ионизирующей радиации.......................................................109

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................111

ВЫВОДЫ................................................................................114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................115

Введение

Актуальность проблемы. В современных исследованиях проблемы поддержания стабильности эукариотического генома широко используются мутагенчувствительные мутанты, полученные у различных представителей высших эукариотических организмов. Генетический контроль этой стабильности на уровне межлинейных и межпопуляционных различий у высших эукариот установлен уже давно (Волчков, Воробцова, 1964; Parsons, 1973). Применение мутантов позволяет исследовать молекулярную природу действия различных генов мутагенчувствительности, и их клеточные и организменные эффекты на протяжении всего цикла индивидуального развития многоклеточного организма. Онтогенетический аспект последних представляет большой интерес, поскольку процесс развития многоклеточных сопровождается предусмотренными генетической программой развития модификациями клеточных циклов, перестройкой структуры клеточного генома и регуляцией активности многих генов, возникновением специализированных типов клеток, переходом отдельных типов клеток от диплоидного к полиплоидному состоянию и т.д. При осуществлении такого комплекса событий роль, а возможно, и регуляция различных генов мутагенчувствительности может претерпевать изменения. На их возможное существование косвенно указывают установленный классической генетикой феномен дифференциальной

радиочувствительности развивающихся половых клеток (Sankaranarayanan, Sobéis, 1976), наличие критических периодов или "узких мест" в процессе развития (Светлов, 1965; Тимофеев-Ресовский, 1968) и зависимость радиочувствительности многоклеточных систем от степени детерминации и дифференцировки составляющих их клеток (Уоддингтон, 1961; Фриц-Ниггли, 1961; Оленов, 1967). В работах последних лет появились также

первые прямые данные о тканеспецифическом характере экспрессии некоторых генов, контролирующих стабильность генетических структур в клетках высших эукариот (Todo et.al., 1996; Armin, 1999).

При использовании мутантов об изменениях роли таких генов можно судить, анализируя фенотипические проявления их мутаций на последовательных стадиях развития отдельных клеток или организма в целом.

Drosophila melanogaster является уникальным модельным объектом высших эукариот, на котором исследование указаннго аспекта значительно облегчено. Благодаря значительному прогрессу исследования ее биологии развития во многом стала известна генетическая программа последнего и выяснен каскад событий, происходящих в эмбриогенезе и постэмбриогенезе, а осуществление этих событий при заданной температуре культивирования изучено с точностью до минуты (Campos-Ortega, Hartenstein, 1985).

Данная работа является частью проводимых в лаборатории генетики эукариот исследований свойств генов радиочувствительности, идентифицированных ранее в нашей лаборатории - rad201 и rad202 и в зарубежных лабораториях - mei-9 и mei-41, контролирующих репарацию генетических повреждений, возникающих в половых и соматических клетках дрозофилы под действием мутагенов. Эти гены составляют специфический ряд в отношении вызываемой их мутациями перекрестной чувствительности дрозофилы к летальному действию различных видов радиации и химических мутагенов: rad201 контролирует чувствительность только к ионизирующей радиации, rad202 - к УФ-лучам и метилметансульфонату, mei-9 и mei-41 - ко всем перечисленным агентам. При выборе мутаций генов для данной работы учитывался тот факт, что, с одной стороны мутации mei-41 D5 и rad201Gl нарушают репарацию

генетических повреждений и контроль клеточного цикла в соматических клетках в ответ на. воздействие гамма-лучей, а мутации теь9а и гас120201 вызывают дефектность начальнго этапа эксцизионной репарации ДНК. С другой стороны, у мутантов теь9а, теь4 Ш5 и гаё20Ш1 нарушена спонтанная мейотическая рекомбинация в половых клетках самок.

Проводимые ранее в нашей лаборатории исследования указанных мутаций, касались их эффектов на постэмбриональных стадиях развития дрозофилы.

Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось исследование особенностей функционирования генов теь9, теь41, гас1201 и гас!202 на таких стадиях индивидуального развития, как эмбриогенез и оогенез. В конкретные задачи исследования входило:

1. Провести сравнительный анализ эффектов мутаций гас120Ю1, гас120201, теь9а и теь4Ш5 в эмбриогенезе БгозорЫ1а те1аш^а$1ег при действии гамма- и УФ-лучей.

2. Изучить радиочувствительность различных стадий оогенеза у самок мутантов гас120Ш1, теь9а и теь4Ш5, используя совместный анализ таких показателей, как плодовитость облученных самок, частота доминантных летальных мутаций (ДЛМ) в их ооцитах, а также цитологических показателей яичников, характеризующих состав и физиологическое состояние последних, в различные сроки после облучения.

3. Исследовать взаимодействие мутации гас120Ш1 с мутациями теь4Ш5 и теь9а в половых клетках самок дрозофилы по признаку чувствительности ооцитов к возникновению в них ДЛМ.

Научная новизна и значимость работы.

В настоящей работе впервые был проведен сранительный анализ чувствительности эмбрионов линий гас!20Щ1, гас!202С1, шеь4Ш5 и теь

9а к действию гамма- и УФ-лучей. Данные анализа летальности эмбрионов названных линий были сопоставлены с особенностями протекания митотических циклов в эмбриогенезе, что позволило выявить связь между возрастными изменениями радиочувствительности эмбрионов, свойственные каждой мутантной линии, и модификациями эмбриональных клеточных циклов. Установлено также, что в случае перекрестной гиперчувствительности мутантов к УФ- и гамма-лучам указанные возрастные изменения радиочувствительности зависят как от гена так и от специфики действия применяемого мутагена.

Отмечено, что мутации генов га<3201, га<1202, теь9 и теь41 увеличивают интенсивность апоптоза в эмбриогенезе, но не имеют специфического влияния на запуск и кинетику его протекания в эмбриогенезе. Показано, что эти характеристики индуцированной апоптотической гибели эмбриональных клеток определяются видом излучения.

Исследована радиочувствительность различных стадий оогенеза у самок мутантов гас120Ш1, теь9а и теь 4Ш5. Показано, что эффекты мутаций этих генов проявляются в оогенезе только на превителлогенетических стадиях развития, совпадающих по времени с осуществлением мейотической рекомбинации в ооцитах.

Проведенное исследование взаимодействия мутации гаё20Ю1 с мутациями теь4Ш5 и теь9а в половых клетках самок дрозофилы показало, что данная мутация эпистатирует мутации теь9а и теь4Ш в оогенезе по признаку чувствительности ооцитов самок дрозофилы к возникновению доминантных летальных мутаций гамма-лучами. Научно-практическая ценность работы.

Мутагенчувствительные мутанты дрозофилы находят свое применение в качестве тест-систем при оценки мутагенности факторов окружающей

среды. Полученные сведения об онтогенетических характеристиках таких мутантов, будут использованы, чтобы более точно определять условия использования таких тест-систем с целью увеличения их чувствительности.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Первичные характеристики мутагенчувствительных мутантов

дрозофилы

Первые мутанты, проявляющие чувствительность к мутагенам, были выделены в семидесятых годах сразу в нескольких лабораториях (Варенцова, Захаров, 1976; Baker et.al., 1976а; Boyd et.al.,1976а; Smith, 1976; Graf, Wurgler, 1978; Graf et.al., 1979b). При этом использовался подход, основанный на изоляции мутантных линий, которые проявляли повышенную чувствительность к летальному действию физических и химических мутагенных факторов внешней среды. Первоначально в качестве таких факторов использовали метилметансульфонат (ММС) и гамма-лучи (Smith, 1973; Сечкина, 1973). К настоящему времени в геноме дрозофилы выявлено более 30 генов мутагенчувствительности, распределенных между Х-хромосомой и большими аутосомами 2 и 3. В таблице 1 мы приводим данные о локализации и перекрестной чувствительности мутаций мутагенчувствительности дрозофилы к наиболее часто используемым мутагенам. Надо отметить, что при выделении мутаций по признаку чувствительности к мутагенам, было принято обозначать их преимущественно символом mus (mutagen sensitiv). Мутации mei-9 и mei-41, первоначально были выделены, как мейотические, поэтому сохранили свои прежние названия. Генетический анализ признака мутагенчувствительности показал, что в подавляющем большинстве он является рецессивным. Исключение составляет мутация mei-41, некоторые аллели которой проявляют полу-доминантность (Nguen et.al, 1976; Boyd et.al.,1976). Чтобы не усложнять таблицу, в ней не

Таблица 1. Чувствительность мутагенчувствительных мутантов к физическим и химическим факторам.

Мутации Локали- MMC nh2 Гамма- УФ ДЭБ Литературный

зация лучи источник

1 2 3 4 5 6 7 8

mei-9 1 : 6,0 + + + + +

mei-41 1 : 53,8 + + + + + 5Ï5SMJ99Z0D

mus(l)101 1 44,8 + + + + + 63, ¿01

mus(l)102 1 0,5 + — + — + S% (>9101

mus(l)103 1 36-44 + — — -- « 69JL01

mus(l)105 1 14,8 + — + / Щ ¿01

mus(l)106 1 36-44 ■ + — + —

mus(l)108 1 10,8 +

mus(l)109 1 30,2 + + + + loi

mus(l)lll 1 27,0 + + M

mus(l)120 1 65,6 + + +

mus(l)121 1 30,3 + + + + + Л, &

rad(2) 201G1 2 59,3 — + —

mus(2)201Gl 2 73,8 + — + Vf, fa

1 2 3 4 5 6 7 8

пш8(2)20 Ю1 2 : 23,0 + + — + + ¿01, ¿03

тад(2)202 2 + + + + ¿01, /м

тиз(2)203 2 + + + + ЛО/ ¿03

ти8(2)204 2 + — — + ¿01, ¿03

ти8(2)205 2 + — — + ¿01 ¿03

ти8(2)206 2 + + — + ЛО/, ¿03

тив(2)207 2 + + + + ¿0/^03

тш5(2)209 2 /¿6

тиз(3)301 3 23 + + - У/

тив(3)302 3 45 + + я

тиз(3)304 3 46 + + //

т1в(3)305 3 44 + + //

ти8(3)306 3 56 + — * //

тиз(3)307 3 59 + + я

тшДООЗ 3 55 + //

т1в(3)309 3: //

1 2 3 4 5 6 7 8

тш(3)310 3:43 + — //

тиз(3)311 3 :47 + — #

тш(3)312 3 : 16-18 + + Я

с(3)0 3: 54,7 + + ЦХАО

еЬопу г\ + +

ти2 1- + //У

Примечание: "+" - чувствительность изменена по сравнению с диким типом; "—" - нет изменений по отношению к дикому типу; " пробел" - не исследовано; мутации тш(2)20Ш1 и тш(2)20Ш1 не аллельны; номера литературных источников представлены в соответствии со списком литературы.

приведено число аллелей каждого гена. Так, например, для гена mei-41 известно более 50 аллелей (Mason et.al., 1989).

Перекрестная чувствительность к различным мутагенным факторам является одной из важнейших фенотипических характеристик мутаций мутагенчувствительности. Большинство из этих мутаций проявляют (как видно из таблицы) чувствительность ко многим агентам. Мутация rad201Gl является уникальной, поскольку повышает чувствительность только к ионизирующей радиации (Хромых и др., 1977). Мутация mus 308 обуславливает чувствительность особей только к агентам, вызывающим поперечные сшивки ДНК (Boyd et.al., 1990).

1.2. Нарушение целостности митотических хромосом в клетках

мутагенчувствительных мутантов.

Повышенная чувствительность мутантов к летальному действию мутагенов, как правило, сопровождается нарушением целостности хромосом. Изучение клеточных проявлений мутаций мутагенчувствительности показало, что они вызывают различные дефекты хромосомного метаболизма в половых и соматических клетках дрозофилы. Аллели 6 локусов (mei-9, mei-41, muslOl, mus 102, musl05, mus 109) повышают частоту спонтанного соматического мозаицизма, связанного в данном случае не с митотическим кроссинговером, как у мух нормального генотипа, а в основном, с потерями и перестройками хромосом (Baker at.al., 1978; Baker and Smith, 1979).

Усиление хромосомной нестабильности мутациями

мутагенчувствительности также было выявлено цитологически в митотически активных нейробластах личинок. У мутантов 12 локусов (mei-9, mei-41, muslOl, musl02, musl05, musl09, mus301, mus304,

mus305, mus308, mus309, mus312) показано значительное увеличение частоты хромосомных аберраций в необлученных клетках нервных ганглиев (Gatti,1979; Baker at.al., 1982; Gatti at.al., 1984). При этом характер выявленных нарушений неодинаков. Мутация mei-9 вызывает почти исключительно хроматидные делеции, тогда как у мутанта mei-41 в равной степени повышена частота хроматидных и изохроматидных разрывов. Мутации mus 105 и mus 109 вызывают хроматидные и изохроматидные разрывы, но распределение этих разрывов по хромосоме изменено. У мутанта mus 105 80% разрывов приходится на эухроматиновые районы, в то время как в mus 109 85% разрывов фиксировалось на границе эу- и гетерохроматиновых областей (Gatti, 1979).

У мутантов mei-9 и mei-41 изучена также чувствительность соматических клеток к индукции хромосомных аберраций рентгеновскими лучами. Хотя их спектр не изменился по сравнению с таковым в необлученных клетках, но частота хромосомных перестроек возрастала намного больше, чем в линии дрозофилы нормального генотипа (Gatti et.al., 1980). В то же время установлено, что клетки мутанта mei-9 наиболее чувствительны при облучении в S и G2 периодах клеточного цикла и почти не чувствительны в Gl фазе, а клетки мутанта mei-41 - радиочувствительны в Gl и S фазах цикла (Schweizer 1989).

Три локуса: muslOl, mus 105 и mus 109 оказались жизненно-важными (Baker et.al., 1982; Gatti et.al., 1983). Личинки, несущие летальные аллели musí05 и musí09, погибают на стадии куколки вследствии гибели клеток имагинальных дисков, причиной которой, как полагают, является высокая частота хромосомных перестроек (Baker et.al., 1982). На основе изучения температурно-чувствительных аллелей musí01 было высказано

предположение, что этот локус контролирует конденсацию хроматина (ваШ е!а1.Д983).

Мутации гас!20Ш1 и гас1202С1 проявляются в соматических клетках главным образом в ответ на воздействие мутагенов. Личиночные нейробласты мутанта гас120Ш1 отличает высокая чувствительность к индукции хромосомных перестроек гамма-лучами, при этом их спектр, в отличие от те1-9 и теь41, остается тем же, что и в клетках нормального генотипа. Сублетальные дозы облучения вызывают у мутанта гас120Ш1 повышенную частоту мозаичных пятен и множественные радиационные морфозы. В экспериментах с фракционированием дозы установлено, что в нейробластах личинок гас!20Ш1 частота хромосомных перестроек обменного типа достоверно ниже, чем при остром облучении, тогда как встречаемость делеций остается одной и той же в обоих вариантах воздействия. Это свидетельствует о нарушении в клетках мутанта тех процессов репарации, конечным результатом которых является возникнове