Радиочувствительность Т-лимфоцитов периферической крови у потомков первого поколения, отцы которых подверглись хроническому радиационному воздействию

Ахмадуллина, Юлия Рафисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Радиочувствительность Т-лимфоцитов периферической крови у потомков первого поколения, отцы которых подверглись хроническому радиационному воздействию
ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Радиочувствительность Т-лимфоцитов периферической крови у потомков первого поколения, отцы которых подверглись хроническому радиационному воздействию"

На правах рукописи

Ахмадуллина Юлия Рафисовна

РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ПОТОМКОВ ПЕРВОГО ПОКОЛЕНИЯ, ОТЦЫ КОТОРЫХ ПОДВЕРГЛИСЬ ХРОНИЧЕСКОМУ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ

03.01.01 — радиобиология

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 ИЮЛ 2014

Москва-2014

005550576

Работа выполнена на базе Федерального государственного учреждения науки «Уральского научно-практического центра радиационной медицины» Федерального медико-биологического агентства Российской Федерации.

Научный руководитель:

Аклеев Александр Васильевич, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, директор ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА РФ

Официальные оппоненты:

Серебряный Александр Маркович, доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией физико-химических основ устойчивости растительных систем Института биохимической физики РАН;

Гераськин Станислав Алексеевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией радиобиологии и экотоксикологии растений ВНИИСХРАЭ

Ведущая организация: Северский биофизический научный центр ФМБА России, г. Серерск-13

Защита диссертации состоится «2» октября 2014 г. в _ на заседании

диссертационного совета Д501.001.65 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова, Ломоносовский пр. 27, сектор А, к. 812. Отзывы просим присылать Веселовой Т.В. по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ им. М.В. Ломоносова, кафедра биофизики биологического факультета.

Автореферат разослан « $ » ИЮА$ 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Веселова Татьяна Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Как показывают события прошлых десятилетий, облучению в малых дозах и с малой мощностью дозы могут подвергаться многочисленные группы персонала и населения (аварии на ядерных реакторах в Англии в 1957 г., в США в 1979 г., на Чернобыльской АЭС в 1986г., в Японии на Факусиме-1 в 2011 г., авария на ПО «Маяк» в 1957 г., сбросы радиоактивных отходов в реку Теча и др.). Помимо этого воздействию низкоинтенсивного ионизирующего излучения подвергаются жители регионов с повышенным естественным радиационным фоном (штат Керала в Индии, г. Посус-ди-Калдас в Бразилии, г. Рамсер в Иране и др.). К настоящему времени проведено много исследований, которые свидетельствуют о возможности индукции нестабильности генома при воздействии ионизирующей радиацией в малых дозах [Mothersill С. et al., 1998; Литтл Д.Б., 2007; Воробцова И.Е., 2006; Любимова Н.Е. и др, 2007; Пелевина И.И. и др., 2003].

Радиационно-индуцированная нестабильность генома может быть одним из проявлений отдаленных последствий облучения человека. Так у жителей прибрежных сел р. Теча в отдаленные сроки после облучения наблюдаются повышенные частоты нестабильных хромосомных аберраций [Vozilova A.V. et al., 2013], мутаций в гене Т-клеточного рецептора и клеток с блоком клеточного цикла [Маркина Т.Н. и др., 2011]. У них также отмечается повышенный риск развития злокачественных опухолей и лейкозов [Krestinina L.Yu. et al., 2005].

Предполагается, что изменение состояния здоровья потомства облученных родителей может быть обусловлено не только генетическими эффектами, связанными с мутациями в половых клетках родителей в результате прямого и свободнорадикального механизма действия ионизирующего излучения, но и с развитием радиационно-индуцированной нестабильности генома [Сусков И.И. и др, 2008]. Многочисленные эксперименты на животных показывают, что облучение мужских особей приводит к различным генотипическим последствиям, включая увеличение частоты мутаций и повышение частоты хромосомных аберраций, образование микроядер, изменение экспрессии генов и другие признаки нестабильности генома [Dubrova Y.E., 2003; Hoyes R.P. et al., 2001; Rübe C.E. et al., 2011; Фоменко Л.А., 2006]. Такие генотипические изменения могут предрасполагать потомство облученных родителей к повышенным рискам генетических заболеваний, бесплодию и раку [Dubrova Y.E., 2003]. Однако до сих пор вопрос о трансгенерационной радиационно-индуцированной нестабильности генома в популяциях человека остается открытым. В одних работах, исследования частоты мутаций в минисателлитных локусах, хромосомных транслокаций в лимфоцитах, а также биохимические тесты у потомков облученных мужчин не

позволили выявить отличий по сравнению с контрольной группой [Rodaira М. et al„ 2004, Salomaa S. et al., 2002]. В других исследованиях у потомков облученных мужчин наблюдали достоверное повышение частоты аббераций хромосом и генных мутаций [Сусков И.И. и др., 2008].

Цель исследования: изучить радиочувствительность и способность к адаптивному ответу Т-лимфоцитов периферической крови у потомков первого поколения отцов, подвергшихся хроническому радиационному воздействию.

Задачи исследования:

1) оценить спонтанную частоту Т-лимфоцитов с микроядрами у облученных отцов и их необлученных потомков первого поколения;

2) оценить радиочувствительность Т-лимфоцитов после in vitro облучения в дозе 1 Гр у облученных отцов и их необлученных потомков первого поколения;

3) исследовать способность к адаптивному ответу лимфоцитов у облученных отцов и их необлученных потомков первого поколения после дополнительного облучения в дозе 5 сГр с последующим облучением в дозе 1 Гр;

4) изучить влияние радиационного и нерадиационных факторов на частоту Т-лимфоцитов с микроядрами у облученных лиц и их потомков первого поколения.

Научная новизна.

Впервые в исследованиях населения, проживавшего у р. Теча был применен подход в изучении радиационной нестабильности генома в семейных ячейках: облученный отец - необлученный потомок первого поколения. Впервые проведена оценка частоты Т-лимфоцитов периферической крови с микроядрами у необлученных потомков первого поколения, отцы которых подверглись хроническому радиационному воздействию вследствие проживания в прибрежных селах р. Теча. Было показано, что средняя спонтанная частота Т-лимфоцитов периферической крови с микроядрами в группе необлученных потомков первого поколения не отличается от средних значений данного показателя в группе их отцов и в контрольной группе. Впервые проведен анализ влияния факторов радиационной и нерадиационной природы на частоту лимфоцитов с микроядрами у потомков первого поколения, отцы которых подверглись хроническому радиационному воздействию. Не было показано влияния дозы на гонады отца на год зачатия (средняя доза составила 0,11 ±0,11 Гр, диапазон индивидуальных доз - 0,003 — 0,5 Гр) на частоту лимфоцитов с микроядрами у их детей. Было выявлено повышение спонтанной частоты лимфоцитов с микроядрами в группе потомков в зависимости от дозы и мощности дозы на ККМ их отцов (в дозовом диапазоне 1,50-2,45 Гр и в диапазоне мощности доз 0,50-0,64 Гр/год). Показано, что пол, национальность, возраст на момент обследования, возраст отца в год зачатия, курение и употребление спиртных

напитков не оказывают влияния на частоту лимфоцитов с микроядрами у потомков облученных отцов.

Положения, выносимые на защиту.

1. У необлученных потомков первого поколения, отцы которых подверглись хроническому радиационному воздействию вследствие проживания в прибрежных селах р. Теча (дозы облучения гонад отцов на время зачатия составили 0,003 - 0,5 Гр, среднее значение 0,11±0,11 Гр) не отмечено повышения радиочувствительности Т-лимфоцитов относительно потомков необлученных лиц.

2. У необлученных потомков первого поколения частота лимфоцитов с микроядрами не зависит от гонадной дозы отцов на год зачатия и от таких факторов нерадиационной природы как пол, национальность, возраст, возраст отца в год зачатия ребенка, курение, употребление алкоголя.

3. В группе облученных отцов отмечено влияние возраста и комбинированного влияния факта облучения и курения на частоту лимфоцитов с микроядрами после in vitro облучения в дозе 1 Гр.

Теоретическая и практическая значимость результатов.

Результаты данной работы дополняют имеющиеся в радиобиологии данные о цитогенетических эффектах в клетках необлученных потомков, чьи родители подверглись влиянию хронического ионизирующего излучения с низкой ЛПЭ и могут быть использованы в дальнейших исследованиях при изучении нестабильности генома человека. Полученные данные могут быть использованы для прогноза радиационно-индуцированных генетических эффектов у потомков людей, подвергшихся облучению, а также для организации медицинского наблюдения за ними. Материалы работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе подготовки студентов-радиобиологов Челябинского государственного университета.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на конференции, посвященной 15-летию биологического факультета Челябинского государственного университета (Челябинск, 2012 г.), V международной научно-практической конференции «Безопасность жизнедеятельности в третьем тысячелетии» (Челябинск, 2012 г.), на 57th Annual Meeting of the Health Physics Society (Sacramento, USA, 2012), на международной конференции «Опыт минимизации последствий аварии 1957 года» (Челябинск 2012).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Российской Федерации.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 33 таблицы, 14 рисунков. Список литературы включает 209 источников, из них 48 отечественных и 161 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных лиц

В группу облученных отцов были отобраны лица, подвергшиеся хроническому неравномерному радиационному воздействию, вследствие проживания на прибрежной территории р. Теча в период с 1950 по 1956 годы. Группу потомков первого поколения (далее потомки) составили биологические дети облученных на р. Теча отцов. Основными критериями включения пациентов в группы обследования были:

1. Отцы потомков проживали в одном из населенных пунктов, расположенных на побережье р. Теча в период с 1950 по 1959 годы.

2. Биологические матери потомков облученных отцов не проживали на загрязненных радионуклидами территориях и не подвергались воздействию ионизирующего излучения на р. Теча и ВУРСе.

3. Потомки облученных отцов родились и проживали на незагрязненных радионуклидами территориях, а, следовательно, не подвергались хроническому радиационному воздействию.

Отсутствие аварийного облучения матерей исключает участие облученной ядерной и цитоплазматической ДНК в формировании нестабильности генома потомков. Также этот критерий исключает возможность опосредованного влияния облученного материнского организма на развитие зародыша и плода, внутриутробное и постнатальное облучение ребенка. В группы сравнения (контроль-отцы и контроль-потомки) вошли лица, проживавшие на незагрязненных территориях Челябинской области в близких социально-экономических условиях и имеющих одинаковый характер медицинского обслуживания.

В группу облученных отцов вошли 33 человека, в группу потомков - 52 человека. Средний возраст отцов составил 69 лет (63-76 лет), средний возраст в группе потомков приближался к 40 годам (27-52 года). В группе контрольных отцов было обследовано 28 человек, средний возраст которых составил 69,8 лет (61 - 80 лет). В группе контрольных потомков - 50 человек, средний возраст составил 38 лет (24-55 лет). Средний возраст облученных отцов в год зачатия составил 28 лет (18-47 года) и был сопоставим с возрастом контрольных отцов в год зачатия - 29 лет (19-44 года). Как среди облученных

отцов и их детей, так и в контрольных группах отцов и потомков представлены две этнические группы - славяне и тюркиты

Дозовые характеристики группы облученных отцов. В данной работе проводили исследование частоты лимфоцитов периферической крови с микроядрами у потомков первого поколения, которые не подвергались радиационному воздействию и их отцов, которые были облучены вследствие проживания у р. Теча. Река Теча была загрязнена сточными водами, содержащие радиоактивные отходы, в результате деятельности производственного объединения «Маяк» с 1949 по1956 гг. Население прибрежных сел р. Теча подверглось комбинированному внешнему и внутреннему облучению. Доза внешнего облучения сформировалась за счет у-излучающих радионуклидов (главным образом, l37Cs, 85Zr, 85Nb, ,03-,C6Ru). Основными источниками внутреннего облучения населения в первые годы являлись 90Sr, 89Sr, I37Cs и другие изотопы, поступившие в организм с речной водой и продуктами местного производства (молоко, рыба, овощи с поливных огородов и т.п.). Основным дозообразующим радионуклидом после проведения защитных мероприятий являлся 90Sr, из-за его способности накапливается и длительное время удерживаться в костной ткани [Дегтева М.О. и др., 1992; Аклеев A.B. и др., 2001].

Информация об индивидуальных накопленных дозах была взята из базы банных УНГЩ РМ TRDS-2009 [Tolstykh ЕЛ. et.al., 2011]. Средняя доза облучения ККМ отцов составила 1,23±0,65 Гр, диапазон индивидуальных доз составил 0,08- 2,6 Гр, средняя максимальная мощность дозы ККМ составила 0,32±0,20 Гр/год (0,02- 0,6 Гр/год), средняя доза облучения мягких тканей составила 0,12±0,12 Гр (0,001- 0,45 Гр), средняя максимальная мощность дозы облучения мягких тканей составила 0,05±0,01 Гр/год (0,005- 0,24 Гр/год).

При оценке частоты лимфоцитов с микроядрами у потомков использовали дозы на семенники, полученные отцом на год, предшествующий рождению каждого конкретного потомка (гонадная доза). Средняя доза на гонады составила 0,11±0,11 Гр (0,003- 0,5 Гр).

Принимая во внимание существенный вклад остеотропного Sr критической системой у жителей прибрежных сел являлся ККМ. Изменение гемопоэзза во многом определяло состояние здоровья облученного населения [Аклеев A.B. и др., 2001], поэтому нам представилось интересным, выяснить, имеется ли зависимость частоты клеток с микроядрами у потомков от дозы и мощности дозы на ККМ отцов. Средняя доза на ККМ отцов на год зачатия составила 1,1±0,6 (0,08-2,6) Гр.

Метод исследования. Для определения исходной поврежденности и радиочувствительности лимфоцитов периферической крови (ЛПК) проводили

микроядерный тест с использованием цитохалазина Б [Fenech М. et al., 1985; Пелевина И.И. и др., 1999].

Схема исследования. Объектом исследования был выбран Т-лимфоцит периферической крови. Подготовительные работы и постановка культуры клеток выполнялась в стерильных условиях. Забор крови производился утром, натощак из локтевой вены в шприц с гепарином. Во флакон с культуральной средой RPMI 1640 объемом 500 мл (ПанЭко, Россия) вносили 250 мг L-глутамина и 40,0 мг гентамицина. Образцы крови каждого пациента делились на три части: в культуральные флаконы добавляли по 0,7 мл крови. В каждый флакон добавляли 3,3 мл среды RPMT 1640, 20%-ную сыворотку крупного рогатого скота (РАА Laboratories, Австрия), 7 мкг/мл ФГА (ПанЭко). Флаконы с кровью инкубировали в СОг^инкубаторе (концентрация С02 5%) при 37° С.

Первая проба крови была предназначена для оценки спонтанного уровня лимфоцитов с микроядрами. Вторую пробу крови через 29 часов от начала инкубации подвергали у-облучению в дозе 1 Гр, она была предназначена для оценки радиочувствительности лимфоцитов периферической крови. Третью пробу крови через 24 часа от начала инкубации облучали в адаптирующей дозе 0,05 Гр и через 5 часов после этого подвергали у-облучению в дозе 1 Гр; третья проба была предназначена для оценки адаптивного ответа. Облучение проб производилось на установке ИГУР-1 (137Cs, мощность дозы 0,0017 Гр/с).

Через 48 часов от начала инкубации во все пробы добавляли 70 мкл рабочего раствора цитохолазина Б в DMSO (США). Через 72 часа от начала инкубации пробы фиксировались в несколько этапов. На первом этапе в пробы добавляли раствор КС1 и холодный фиксатор (этанол и ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1). На следующих этапах в пробы добавляли только холодный фиксатор. Затем готовили препараты и окрашивали по Романовскому-Гимза (ПанЭко) [Пелевина И.И. и др.,1999]. Препараты анализировали с помощью световой микроскопии; подсчет клеток проводили с использованием протокола анализа лимфоцитов с микроядрами разработанного «International Collaborative Project on Micronucleus Frequency in Human Populations (HUMN)» [Fenech M. et al., 2011]. Подсчет проводился только среди двухъядерных лимфоцитов. Оценивалось количество двухъядерных лимфоцитов с микроядрами на 1000 просчитанных двухъядерных лимфоцитов. За двухъядерные лимфоциты с микроядрами считали как клетки с одним микроядром, так и с несколькими микроядрами. Итого в пробах от каждого пациента анализировалось 3000 клеток.

Методы статистической обработки. Полученные данные на нормальность распределения проверяли с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Так как

распределение индивидуумов по частоте лимфоцитов периферической крови с микроядрами во всех исследуемых группах являлось нормальным (рГ0,05), то для описания исследуемых показателей использовались среднее (М) и стандартное отклонение (SD). Для сравнения частоты лимфоцитов с микроядрами между исследуемыми группами использовался t-критерий Стьюдента. При сравнении частоты лимфоцитов с микроядрами между дозовыми подгруппами с контролем использовался однофакторный дисперсионный анализ с поправкой Даннета. При сравнении частоты лимфоцитов с микроядрами между дозовыми и возрастными подгруппами внутри каждой исследуемой группы использовался однофакторный дисперсионный анализ с поправкой Бонферрони.

Референтный уровень частоты клеток с микроядрами рассчитывался на основании результатов измерения частоты лимфоцитов с микроядрами в контрольной группе как: M±2SD, где М — это среднее значение, SD — стандартное отклонение. Сравнение доли людей, выходящих за пределы референтных значений оценивали с помощью точного критерия Фишера.

При помощи критерия х2 оценивали достоверность различий между радиочувствительностью лимфоцитов каждого индивидуума после in vitro облучения суспензии лимфоцитов в адаптирующей (0,05 Гр) и проявляющих дозах (1 Гр) по сравнению с облучением только в ударной дозе 1 Гр. Исходя из этого всех обследуемых людей делили на 3 группы: с достоверным адаптивным ответом, с повышением радиочувствительности и без изменения в реакции лимфоцитов на адаптирующее воздействие. Сравнение доли лиц с наличием и отсутствием адаптивного ответа и повышения радиочувствительности проводили с помощью точного критерия Фишера.

Связь частоты лимфоцитов с микроядрами с радиационными и нерадиационными факторами определяли с помощью ранговой корреляции по Пирсону. Определение вида зависимости показателей частоты лимфоцитов с микроядрами от дозы, возраста людей и количества выкуренных сигарет в день проводили с использованием регрессионного анализа. Для оценки совместного влияния факторов радиационной природы и нерадиационной природы на частоту клеток с микроядрами использовали многофакторный дисперсионный анализ [Гланц С., 1999]. Статистический анализ проводили в программных пакетах SPSS Statistic 17.0, Excel 2010.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Частота лимфоцитов периферической крови с микроядрами в . обследованных группах отцов и их потомков первого поколения

В группе отцов средний спонтанный уровень частоты лимфоцитов с микроядрами составил 14,2±8,2%о при диапазоне индивидуальных значений 2-38 %о (рисунок 1). В группе потомков средняя спонтанная частота лимфоцитов с микроядрами составила

12,1±7,0%о (2-37%о). Сопоставимый уровень различий установлен в контрольных группах: средняя частота ЛПК с микроядрами у отцов составила 13,6±5,7%о (2-23%о) и 12,0±6,0%о (2-28%о) в группе потомков. Статистически значимых различий в спонтанной частоте лимфоцитов с микроядрами между исследуемыми группами отцов их потомков, а также между исследуемыми группами и соответствующим контролем не отмечено.

После дополнительного облучения in vitro в дозе 1 Гр произошло 9-13 кратное увеличение частоты лимфоцитов с микроядрами во всех четырех изучаемых группах по сравнению со спонтанным уровнем. При этом наиболее выраженное увеличение отмечено в группах контрольных отцов и контрольных потомков. При сравнении показателей, полученных для родительского поколения было установлено, что частота лимфоцитов с микроядрами после облучения in vitro в дозе 1 Гр составила 122,1± 39,4%о (58-216%о) в группе облученных отцов и 138,7±39,0%о (49-214%о) - в группе контрольных отцов (р=0,1). В группе потомков достигнуты более выраженные различия 130±41%о (40-250%о) - для группы потомков и 158,5±34,5%о (65-235%о) - для контрольных потомков (р=0,002). Различий в радиочувствительности лимфоцитов между группами облученных отцов и их потомков отмечено не было (р= 0,6).

Во всех исследуемых группах наблюдается большой разброс значений в спонтанной и в индуцированной частоте лимфоцитов с микроядрами. Поэтому был проведен анализ количества человек, у которых значения выходят за пределы референтных величин по частоте клеток с микроядрами.

Референтные значения частоты лимфоцитов с микроядрами для группы отцов составили 2-25%о - для исходной частоты и 59 - 215%о- после in vitro облучения в дозе 1 Гр (таблица 2). В результате этого сравнения было обнаружено, что в группе отцов у 12% обследованных лиц отмечено превышение референтного значения, а в группе контрольных отцов лиц с превышением референтных значений не было, но статистически значимых отличий при этом не отмечено (р=0,054). После дополнительного облучения в дозе 1 Гр количество отцов с частотой лимфоцитов с микроядрами превышающей референтное значение также не отличалось от контрольных значений.

Отцы-контроль

Группы обследуемых

Рисунок 1. Спонтанная частота клеток с микроядрами, %о (M±SD)

Таблица 1.

Частота клеток с микроядрами в обследованных группах после in vitro облучения

Группа Частота лимфоцитов с микроядрами, %о после облучения in vitro в дозе 1 Гр

M±SD разброс индивидуальных значений

Облученные отцы 122,1±39,4 58-216

(п=33)

Потомки 130,0±41,0 40-250

(п=52) р=0,002

Контроль-отцы 138,7±39,0 49-214

(п=28)

Контроль-потомки 158,5±34,5 72-254

(п=50)

Примечание: р - статистически значимые различия по сравнению с группой контроль-потомки.

Референтные значения частоты лимфоцитов с микроядрами для группы потомков составили 0-24%о - для исходной частоты и 90-228%о — после in vitro облучения в дозе 1 Гр (таблица 2). Количество потомков, у которых исходная частота лимфоцитов с микроядрами выходит за пределы референтного диапазона не отличается от контрольной группы (р=0,8), (таблица 3). При анализе частоты лимфоцитов с микроядрами после in vitro облучения, количество потомков, у которых уровень микроядер ниже референтных значений статистически значимо отличается от контрольной группы (17% потомков против 2% людей в контрольной группе, р=0,01).

Результаты нашего исследования не противоречат результатам работы [Аклеев A.B. и др., 2007], в которой показано, что спонтанная и индуцированная частота лимфоцитов с микроядрами в группе потомков облученных на р. Теча отцов (п= 18) не превышает контрольных значений.

Таблица 2.

Доля обследованных отцов, у которых средние значения частоты ЛПК с МЯ выходят за

пределы референтных значений

Уровень значения Спонтанный уровень (референтное значение 2-25%о) После дополнительного облучения в дозе 1 гР (референтное значение 61-217%о)

абс. % абс. %

Ниже 0 0 2 б

Референт 29 88 30 91

Выше 4 12 1 3

Таблица 3.

Доля потомков, у которых средние значения частоты ЛПК с МЯ выходят за пределы

референтных значений

Уровень значений Спонтанный уровень (референтное значение 0- 24%о) После дополнительного облучения в дозе 1 Гр (референтное значение 90-228%о)

абс. % абс. %

Ниже 0 0 9 17 р=0,01

Референт 49 94 42 81

Выше 3 6 1 2

Примечание: р - статистически значимые различия по сравнению с контролем

Реакция лимфоцитов на адаптирующее воздействие в дозе 0,05 Гр В группе облученных отцов у 12% индивидуумов наблюдался адаптивный ответ и у 18 % индивидуумов - повышение радиочувствительности, что не отличается от группы контрольных отцов (таблица 4).

В группе потомков адаптивный ответ был зарегистрирован у 6% индивидуумов, повышение радиочувствительности — у 15% индивидуумов. Распределение индивидуумов по характеру ответа на дополнительное адаптирующее воздействие в группе потомков не отличается от их контрольной группы и не отличается от группы их отцов.

Таблица 4.

Распределение обследованных индивидуумов по характеру ответа на адаптирующее

облучение

Группа Адаптивный ответ Повышение радиочувствительности Изменений нет

абс. % абс. % абс. %

Отцы (п=33) 4 12 6 18 23 70

Контроль-отцы (п=28) 4 13 4 13 22 74

Потомки (п=52) 3 6 8 15 41 79

Контроль-потомки п=(50) 3 6 8 16 39 78

В работах Пелевиной И.И. с соавт. (1996 г.) и Аклеева A.B. с соавт. (2011 г.) показано, что в группах облученных людей снижается доля лиц с адаптивным ответом по сравнению с лицами контрольной группы. В нашем исследовании не выявлено различий по данному показателю между группой облученных отцов и контролем. Полагают, что адаптивный ответ не является универсальным клеточным ответом на облучение в малых дозах, так как его проявление зависит от индивидуальных генетических особенностей организма, возраста и может быть модифицировано воздействиями, связанными с образом жизни, профессией, окружающей средой [Пелевина и др., 2007]. Следует отметить, что различия полученных результатов в нашей работе и в ранее проведенных работах могут быть связаны с тем, что, во-первых, группа облученных отцов малочисленна относительно численности всей когорты облученных людей на р. Теча. Во-вторых, на время взятия образцов крови отцы экспонированной и контрольных групп проживали в различных населенных пунктах на незагрязненных радионуклидами территориях. Также отличалось время взятия образцов крови: в предыдущих исследованиях образцы крови брались в 2004 - 2007 гг., в нашем исследовании - в 2009-2013 гг.

Анализ влияния радиационных факторов на частоту лимфоцитов с микроядрами

В группе облученных отцов не было найдено статистически значимых корреляций спонтанной и индуцированной частоты лимфоцитов с микроядрами от дозы облучения ККМ, мощности дозы облучения ККМ, дозы облучения мягких тканей и мощности дозы облучения мягких тканей (р>0,05).

В таблице 5 представлены результаты корреляционного анализа взаимосвязи дозы облучения гонад отцов на год зачатия и частотой образования микроядер в лимфоцитах потомков. Можно видеть, что частота лимфоцитов с микроядрами (как спонтанная, так и индуцированная) в группе потомков не зависит от гонадной дозы отца.

Таблица 5.

Корреляционная связь частоты клеток с микроядрами у потомков от гонадной дозы их

отцов в год зачатия

Частота микроядер в группе потомков Гонадная доза отцов

спонтанная г=0,01; Р = 0,9

после in vitro облучения в дозе 1 Гр г=-0,104; р = 0,5

после in vitro облучения в дозе 0,05+1 Гр г=0,034; р=0,815

На рисунке 2 отображена зависимость спонтанной и индуцированной частоты лимфоцитов с микроядрами в группе потомков от гонадной дозы отцов на год зачатия.

Корреляционный анализ зависимости спонтанной частоты лимфоцитов с микроядрами у потомков от накопленной дозы на ККМ отцов на год зачатия, а также от максимальной мощности дозы ККМ отца выявил положительную связь (таблица 6).

Таблица 6.

Корреляционная связь частоты клеток с микроядрами у потомков от дозы на ККМ отца и мощности дозы на ККМ отца

Частота микроядер у потомков Доза на ККМ отца Мощность дозы на ККМ отца

спонтанная г=0,3; г=0,3;

р= 0,01 р= 0,01

после облучения в дозе 1 Гр г=0,2; 1=0,01;

р = 0,2 р = 0,9

Е*

« зо-

= g 20" II

§ Я 10-

С =

Л) о-

Г=0,01; р=0,9

и Л 250-

о * = = 200~

— 3

-S-i-iso-1

И -.100-If V 9 О

с= 501 0J

-1-i-1-1-1-1

0,0 0.1 0,2 0.3 0.4 0.5 0.6

г=-о,1; p=o,5

—e^

Б) 0,0 0.1 0.2 о!з 0,4 0,5 0,6 Гонадная доза, Гр

Рисунок 2. Зависимость частоты лимфоцитов с микроядрами у потомков от гонадной дозы отца на год зачатия: А - спонтанная частота лимфоцитов с микроядрами, %о; Б - частота лимфоцитов с микроядрами после in vitro облучения в дозе 1 Гр

а) До" облучения КК'М отцов, Гр б) Мощность доил облучения ККМ отцоп,

Гр/год

Рисунок 3. Зависимость спонтанной частоты лимфоцитов с микроядрами у потомков первого поколения облученных отцов от: а) дозы облучения ККМ отцов в год зачатия; б) максимальной мощности дозы облучения ККМ отцов.

Далее нами был проведен регрессионный анализ связи спонтанной частоты лимфоцитов с микроядрами с дозой и мощностью дозы облучения ККМ отцов (рисунок

3).

Зависимости спонтанной частоты лимфоцитов с микроядрами от дозы облучения и мощности дозы облучения ККМ отца описываются линейными уравнениями:

у = 8,4 + 0,5-<1, (112=0,09, р=0,01) (1)

у =9,3 + 10,5-х, (Л2=0,09, р=0,01) (2)

где:

у - спонтанная частота лимфоцитов с микроядрами, %о; с! — доза облучения ККМ отца, Гр х — мощность дозы облучения отца, Гр/год

Весь спектр доз и мощностей доз на ККМ отцов был разделен на несколько диапазонов. Для каждого диапазона рассчитывались средние значения и стандартное отклонение дозы и мощности дозы на ККМ отца. Исходя из полученных данных, представленных в таблице 7, можно отметить статистически значимое увеличение исходной частоты лимфоцитов с микроядрами в дозовой подгруппе 4 (16,3±6,5%о) по сравнению с дозовой подгруппой 1 (10,0±7,1 %о) и контролем (12,0±6,0 %о).

Таблица 7.

Спонтанная частота лимфоцитов с микроядрами (М±5Э) в группе потомков в

зависимости от накопленной дозы на ККМ отцов в год зачатия

№ Дозовый диапазон, Средняя доза, Спонтанная частота ЛПК с МЯ, %о

Гр Гр

1 <0,59 0,34±0,22 10,0±7,1

(п=9) (0,07-0,54) (2-25)

2 0,6-0,99 0,83±0,12 11,0±8,1

(п=16) (0,65-0,99) (3-37)

3 1-1,49 1,26±0,14 12,41 ±3,3

(п=15) (1,0-1,46) (5-17)

4 1,5-2,45 1,8±0,34 16,3±6,5

(п=19) (1,51-2,48) (9-32)

р = 0,01

Р.=0,04

Контроль 0 12,0±6,0

(п=50) (2-28)

Примечание: р — статистически значимые отличия по сравнению с группой контроля; Р1 — статистически значимые различия по сравнению с дозовой подгруппой 1

Из таблицы 8 видно, что спонтанный уровень лимфоцитов с микроядрами в диапазоне мощности доз в подгруппе 1 и 4 статистически значимо отличаются от контроля (р<0,05). В диапазоне 1 спонтанный уровень лимфоцитов с микроядрами равен 9,0±6,4%о, в 4 - 16%о, а в контроле - 12±6,0%о. Кроме того исходный уровень лимфоцитов с микроядрами в подгруппе 1 статистически значимо снижен относительно подгруппы 4, р=0,01.

Таблица 8.

Спонтанная частота лимфоцитов с микроядрами (М±50) в группе потомков от

мощности дозы на ККМ отцов

№ Мощность дозы, Гр/год Мощность дозы, Гр/год Спонтанная частота ЛПК с МЯ, %о

1 <0,15 (п=12) 0,09±0,05 (0,02-0,13) 9,0±6,4 (2-25); р = 0,05

2 0,16-0,19 (п= 12) 0,18±0,01 (0,16-0,19) 13,3±9,6 (3-37)

3 0,2-0,49 (п=21 ) 0,35±0,07 (0,23-0,44) 12,3±6,0 (5-32)

4 >0,5 (п=7) 0,58±0,05 (0,50-0,64) 15,7±4,0 (12-22); р = 0,04; р!= 0,01

Контроль 0 12,0±6,0 (2-28)

Примечание: р - статистически значимые отличия по сравнению с группой контроля; Р1 - статистически значимые различия по сравнению с дозовой подгруппой № 1.

Влияние нерадиационных факторов на частоту лимфоцитов с микроядрами

Статистически значимая отрицательная корреляция возраста обследуемых лиц и частоты лимфоцитов с микроядрами после облучения в дозе 1 Гр была обнаружена только в группе отцов (г= -0,4; р=0,03) (табл1ща 9).

Таблица 9 - Корреляционная связь частоты клеток с микроядрами и возраста обследуемых отцов

Группа Частота микроядер Возраст отцов

Отцы (п=33) спонтанная r=0,03; р = 0,8

после in vitro облучения в дозе 1 Гр г= -0,4; р = 0,03

Контроль-отцы (п=28) спонтанная г=0,2; р = 0,3

после in vitro облучения в дозе I Гр 1=0,1; р = 0,5

отцы + контроль- отцы (п=61) спонтанная г=0,07;р = 0,6

после in vitro облучения в дозе 1 Гр г=-0,1;р = 0,4

На рисунке 4 представлена графическая зависимость частоты лимфоцитов с микроядрами после in vitro облучения в дозе 1 Гр от возраста облученных отцов. Модель описывается линейным уравнением. Уравнение регрессии для индуцированной частоты лимфоцитов с микроядрами у облученных лиц имеет вид:

у = 393,1-3,8-х, (R =0,16, р=0,03)

(3)

где:

у — индуцированная частота лимфоцитов с микроядрами, %о; х —возраст обследуемых отцов, лет.

250-

50-

г = -0,4; р=0,03

65 70 75

Вотраст облученных отцов, лет

Рисунок 4. Зависимость частоты лимфоцитов с микроядрами после in vitro облучения в

дозе 1 Гр от возраста отцов

Понижение числа лимфоцитов с микроядрами с возрастом можно объяснить тем, что после in vitro облучения в дозе 1 Гр суспензии лимфоцитов происходит увеличение частоты клеток с блоком клеточного цикла в G2 периоде, вследствие чего на препаратах фиксируется меньшее число клеток с повреждениями. В литературе описано, что данная тенденция растет с возрастом [Staiano-Coico L. et al.,1983],

В группе потомков, не было обнаружено статистически значимых корреляций как спонтанного уровня клеток с микроядрами, так и после дополнительного облучения in vitro: 1) с их возрастом на момент обследования, 2) с возрастом их отцов в год зачатия.

Как известно, курение является мощным генотоксическим фактором, который способствуют дестабилизации генома и приводят к формированию рака [Fenech М. et al., 2012]. Однако во многих работах курение пациента не оказывало влияния на частоту образования клеток с микроядрами [McHugh M.R. et al., 2010; Milosevic-Djordjevic О. et al., 2010]. В работе [Bonassi S. et al., 2012] было показано, что значительное увеличение частоты клеток с микроядрами наблюдается у тех людей, которые выкуривают более 30 сигарет в день (в нашем исследовании более 30 сигарет в день выкуривали 3 человека).

В нашей работе при сравнении спонтанной частоты лимфоцитов с микроядрами относительно курящих и некурящих лиц внутри каждой группы не было выявлено статистически значимых различий. Для группы потомков не было выявлено различий и в индуцированной in vitro облучением частоты клеток с микроядрами у курящих и некурящих людей.

После in vitro облучения суспензии лимфоцитов в дозе 1 Гр в группе курящих отцов частота микроядер была выше, чем в группе некурящих отцов (137,1±38,6%о против 111,4±36,1%о) (таблица 10). В группе контрольных отцов, наоборот, частота лимфоцитов с микроядрами выше в группе некурящих отцов по сравнению с курящими (142,00±36,1%о против 119,00±46,2%о). Но эти различия, как в группе отцов, так и в группе контрольных отцов не достигают статистической значимости. При попарном сравнении некурящих отцов, частота клеток с микроядрами после in vitro облучения в дозе 1 Гр в группе облученных была равна 111,4±36,1%о, что статистически значимо ниже средних значений контрольных отцов 142,00±36,1%о (р=0,014). С помощью двухфакторного дисперсионного анализа, нами было показано, что на частоту лимфоцитов с микроядрами после in vitro облучения в дозе 1 Гр оказывает совместное взаимодействие курения и радиационного воздействия (F= 5; р=0,03). Наши результаты согласуются с литературными данными, в которых показано, что воздействие излучения и табачного дыма обнаруживает аддитивные эффекты [Петин В.Г. и др., 2001]. Также для группы облученных отцов было установлено, что частота лимфоцитов с микроядрами коррелирует с количеством выкуриваемых сигарет за один день (г=0,38, р=0,03).

Таблица 10.

Частота лимфоцитов с микроядрами в зависимости от курения

Группа Частота лимфоцитов с микроядрами, %о

спонтанная после in vitro облучения в дозе 1 Гр

Отцы:

курящие (п=17) 14,0± 8,0 137,1±38,6

некурящие (п=16) 14,4±8,7 111,4±36,1

р=0,014

Отцы-контроль:

курящие (п=6) 11,2±7,4 119,00±46,2

некурящие (22) 13,6±4,8 142,00±36,1

Примечание: р- статистически значимые различия по сравнению с группой контроля;

По литературным данным повышенные частоты клеток с микроядрами наблюдаются у лиц, которые злоупотребляют алкоголем [Саз1еШ Е. с! а1., 1999; Maffei Р. е1 а1., 2002; Ынга\уа Н. е1 а1., 2007]. В нашем исследование лица с диагнозом

«алкоголизм» не вошли. При исследовании частоты лимфоцитов с микроядрами (как спонтанной, так и после in vitro облучения в дозе 1 Гр) в зависимости от употребления алкоголя статистически значимых различий между людьми, которые редко и умеренно употребляют спиртные напитки выявлено не было ни в одной из исследуемых групп.

Также не было выявлено статистически значимых различий по частоте лимфоцитов с микроядрами в обследуемых группах в зависимости от принадлежности к славянской или тюркитской группе и от пола. В таблице 11 представлены результаты многофакторного дисперсионного анализа.

Таблица 11.

Зависимость частоты лимфоцитов с микроядрами от факторов радиационной и нерадиационной природы в группе отцов

Частота лимфоцитов с микроядрами

Факторы спонтанный уровень после in vitro облучения в дозе

1Гр 0,5+1 Гр

Группа отцов

Национальность F=0,5 F=1,0 F=l,l

р=0,5 р=0,3 р=0,3

Употребление алкоголя F=0,1 F=l,3 F=0,8

р=0,9 Р=0,3 Р=0,4

Группа потомков

Пол F=0,2 F=0,06 F=0,2

р=0,6 р=0,8 Р=0,7

Национальность F=l,3 F=0,1 F=0,02

р=0,35 р=0,7 р=0,9

Курение F=0,2 F=0,07 F=0,1

р=0,6 р=0,8 Р=0,7

Употребление алкоголя F=l,4 F=0,8 F=0,8

р=0,27 р=0,4 р=0,5

Примечание: F - коэффициент дисперсии

Таким образом, в результате нашей работы не получено убедительных доказательств трансгенерационного феномена передачи нестабильности генома в семейных парах облученный отец - потомок первого поколения при средней дозе облучения гонад на год зачатия потомка 0,11±0,11 Гр. Нами было показано, что средняя спонтанная частота лимфоцитов с микроядрами и радиочувствительность лимфоцитов в группе потомков не превышают средних значений в группе их отцов и у контрольных потомков. Также было показано, что частота лиц с адаптивным ответом и повышением радиочувствительности лимфоцитов в группе потомков не отличаются от данных

показателей в группе их отцов и контрольных потомков. Ни спонтанная частота лимфоцитов с микроядрами, ни радиочувствительность лимфоцитов потомков не зависит от гонадной дозы отцов. Отмечена зависимость спонтанной частоты лимфоцитов с микроядрами в группе потомков от дозы и мощности дозы на ККМ их отцов. При детальном изучении этой зависимости было отмечено что спонтанная частота лимфоцитов с микроядрами была повышена лишь у отцов с дозой облучения ККМ на год зачатия в диапазоне от 1,5 -1,99 Гр и максимальной мощностью дозы ККМ от 0,5 - 0,64 Гр/год.

ВЫВОДЫ

1. В группе облученных отцов, проживавших в бассейне р. Теча, частота Т-лимфоцитов с микроядрами статистически значимо не отличалась от контрольной группы. При этом не наблюдалось статистически значимых зависимостей как спонтанной, так и индуцированной частоты лимфоцитов с микроядрами от дозы (диапазон индивидуальных значений составил 0,08-2,6 Гр) и мощности дозы (0,02-0,6 Гр/год) на красный костный мозг, а также дозы (0,001-0,45 Гр) и мощности дозы (0,005-0,24 Гр/год) на мягкие ткани.

2. В группе потомков первого поколения не было отмечено зависимости спонтанной и индуцированной частоты Т-лимфоцитов с микроядрами от гонадной дозы отцов в год зачатия ребенка (диапазон индивидуальных доз облучения гонад составил 0,003-0,5 Гр). Спонтанная частота Т-лимфоцитов с микроядрами была повышена у тех потомков, дозы облучения ККМ отцов которых составили от 1,5 до 2,45 Гр (р=0,03), а мощность дозы облучения ККМ составила от 0,5 до 0,64 Гр/год (Р=0,01).

3. Радиочувствительность Т-лимфоцитов в группах облученных отцов и их потомков не различалась. Частота Т-лимфоцитов с микроядрами у потомков облученных отцов после облучения in vitro в дозе 1 Гр была статистически значимо ниже (р=0,002) по сравнению с группой контроля.

4. Доля лиц с положительным адаптивным ответом и с повышением радиочувствительности лимфоцитов в группе потомков облученных отцов не отличалась от таковой в группе отцов и от контрольных значений.

5. В группе облученных отцов отмечена зависимость индуцированной частоты Т-лимфоцитов с микроядрами от возраста людей во время обследования и от курения. Не было обнаружено влияния нерадиационных факторов, таких как пол, национальность, возраст в момент обследования, возраст отцов в год зачатия ребенка, курение и употребление алкоголя на частоту Т-лимфоцитов с микроядрами у потомков первого поколения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Ахмадуллина Ю.Р. , Аклеев A.B., Шалагинов С.А. , Веремеева Г.А. , Худякова О.И. Влияние факторов радиационной и нерадиационной природы на уровень микроядер в лимфоцитах периферической крови у потомков первого поколения, отцы которых были облучены // Вопросы радиационной безопасности. -2013. -№4. -С. 62- 71.

2. Ахмадуллина Ю.Р., Аклеев A.B. Радиочувствительность Т-лимфоцитов у потомков, отцы которых подверглись хроническому радиационному воздействию // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 6; URL: http://www.science-education.ru/113-l 1529 (дата публикации: 12.01.2014).

3. Ахмадуллина Ю.Р., Аклеев A.B. Адаптивный ответ у потомков первого поколения, отцы которых подверглись хроническому радиационному воздействию // Вестник Челябинского государственного педагогического университета,-2013.-№ 12. -С. 174-182.

Другие публикации

4. Ахмадуллина Ю.Р. Аклеев A.B. Влияние хронического низкоинтенсивного облучения на радиочувствительность и адаптивный ответ у потомков 1-го поколения облученных отцов // Безопасность жизнедеятельности в третьем тысячелетии: сборник материалов V-й Международной научно-практической конференции: в 2 т. - 2012. - Т.2. - С.246-249.

5. Ахмадуллина Ю.Р. Аклеев A.B. Оценка уровня лимфоцитов периферической крови с микроядрами у потомков первого поколения облученных отцов // Вестник Челябинского государственного университета. - 2013. - № 7. - С. 97-98.

6. Ахмадуллина Ю.Р. Аклеев A.B. Радиочувствительность и адаптивный ответ у потомков 1-го поколения облученных отцов // Опыт минимизации последствий аварии 1957 года: Материалы Международной конференции, 2-3 октября 2012 г. — 2012.-С. 24.

Отпечатано в типографии «Активист» Подписано к печати 30.06.2014г. Объем 1 п.л. Формат 64x84 Гарнитура «Times New Roman». Бумага для офисной техники, 80 гр/м2

Тираж 100 экз. г. Челябинск, проспект Ленина, 74 б Тел. 238-01-02, 777-83-04

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ахмадуллина, Юлия Рафисовна, Москва

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова биологический факультет

На правах рукописи

04201460542

Ахмадуллина Юлия Рафисовна

03.01.01 — радиобиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор A.B. Аклеев

Москва-2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................5

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................10

1.1 Влияние ионизирующего излучения на мужские половые клетки.......10

1.2 Радиационно-индуцированная нестабильность генома.............................18

1.2.1 Механизмы формирования радиационно-индуцированной нестабильности генома.....................................................................................20

1.2.2 Выявление радиационно-индуцированной нестабильности генома ..25

1.2.3 Дозовые характеристики индукции РИНГ............................................32

1.2.4 Трансгенерационный феномен радиационно-индуцированной нестабильности генома.....................................................................................34

1.3 Здоровье потомков облученных людей....................................................43

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................50

2.1. Характеристика обследованных групп.......................................................50

2.2 Методы исследования....................................................................................62

2.2.1 Описание микроядерного анализа..........................................................62

2.2.2 Схема метода............................................................................................65

2.2.3 Методы статистической обработки........................................................67

ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................................69

3.1 Частота лимфоцитов периферической крови с микроядрами в обследованных группах отцов и их потомков первого поколения.................69

3.2 Реакция лимфоцитов на адаптирующее воздействие в дозе 0,05 Гр........74

3.3 Анализ влияния радиационных и нерадиационных факторов на частоту лимфоцитов периферической крови с микроядрами........................................77

3.3.1 Анализ влияния радиационных факторов на частоту лимфоцитов с микроядрами......................................................................................................77

3.3.2 Анализ влияния нерадиационных факторов на частоту лимфоцитов с микроядрами......................................................................................................84

3.3.3 Анализ сочетанного влияния факторов радиационной и нерадиационной природы на частоту лимфоцитов с микроядрами...........97

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.........................................................................100

ВЫВОДЫ................................................................................................................Ill

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:............................................113

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ ESTR - Expanded shot tandem repeats TRDS - Techa river dose system ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИИ - ионизирующее излучение ККМ - красный костный мозг ЛПК - лимфоциты периферической крови ЛПЭ - линейная передача энергии МЯ - микроядра

НКДАР ООН - Научнй комитет ООН по действию атомной радиации

ОБЭ - относительная биологическая эффективность

РИНГ - радиационное индуцированная нестабильность генома

ФГБУН УНПЦ РМ - Уральский научно-практический центр радиационной медицины

ЦХБ - цитохалазин-Б

ЧАЭС - Чернобыльская атомная электростанция

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Как показывают события прошлых десятилетий, облучению в малых дозах и с малой мощностью дозы могут подвергаться многочисленные группы персонала и населения (аварии на ядерных реакторах в Англии в 1957 г., в США в 1979 г., на Чернобыльской АЭС в 1986г., в Японии на Факусиме-1 в 2011 г., авария на ПО «Маяк» в 1957 г., сбросы радиоактивных отходов в реку Теча и др.). Помимо этого воздействию низкоинтенсивного ионизирующего излучения подвергаются жители регионов с повышенным естественным радиационным фоном (штат Керала в Индии, г. Посус-ди-Калдас в Бразилии, г. Рамсер в Иране и др.). К настоящему времени проведено много исследований, которые свидетельствуют о возможности индукции нестабильности генома при воздействии ионизирующей радиацией в малых дозах [МоШегеШ С. ег а1., 1998; Литгл Д.Б., 2007; Воробцова И.Е., 2006; Любимова Н.Е. и др, 2007; Пелевина И.И. и др., 2003].

Радиационно-индуцированная нестабильность генома может быть одним из проявлений отдаленных последствий облучения человека. Так у жителей прибрежных сел р. Теча в отдаленные сроки после облучения наблюдаются повышенные частоты нестабильных хромосомных аберраций [УогПоуа А.У. е1 а1., 2013], мутаций в гене Т-клеточного рецептора и клеток с блоком клеточного цикла [Маркина Т.Н. и др., 2011]. У них также отмечается повышенный риск развития злокачественных опухолей и лейкозов [Кгезйшпа Ь.Уи. & а1., 2005].

Предполагается, что изменение состояния здоровья потомства

облученных родителей может быть обусловлено не только генетическими

эффектами, связанными с мутациями в половых клетках родителей в

результате прямого и свободнорадикального механизма действия

ионизирующего излучения, но и с развитием радиационно-индуцированной

нестабильности генома [Сусков И.И. и др]. Многочисленные эксперименты на

животных показывают, что облучение мужских особей приводит к различным

генотипическим последствиям, включая увеличение частоты мутаций и повышение частоты хромосомных аберраций, образование микроядер, изменение экспрессии генов и другие признаки нестабильности генома [Dubrova Y.E., 2003; Hoyes R.P. et al., 2001; Rübe C.E. et al., 2011; Фоменко Л. A., 2006]. Такие генотипические изменения могут предрасполагать потомство облученных родителей к повышенным рискам генетических заболеваний, бесплодию и раку [Dubrova Y.E., 2003]. Однако до сих пор вопрос о трансгенерационной радиационно-индуцированной нестабильности генома в популяциях человека остается открытым. В одних работах, исследования частоты мутаций в минисателлитных локусах, хромосомных транслокаций в лимфоцитах, а также биохимические тесты у потомков облученных мужчин не позволили выявить отличий по сравнению с контрольной группой [Rodaira М. et al., 2004, Salomaa S. et al., 2002]. В других исследованиях у потомков облучённых мужчин наблюдали достоверное повышение частоты аббераций хромосом и генных мутаций [Сусков И.И. и др., 2008].

Задачи исследования:

1) оценить спонтанную частоту Т-лимфоцитов с микроядрами у облучённых отцов и их необлучённых потомков первого поколения

2) оценить радиочувствительность Т-лимфоцитов после in vitro облучения в дозе 1 Гр у облучённых отцов и их необлучённых потомков первого поколения

3) исследовать способность к адаптивному ответу лимфоцитов у облучённых отцов и их необлучённых потомков первого поколения после дополнительного облучения в дозе 5 сГр с последующим облучением в дозе 1 Гр.

Научная новизна.

Впервые в исследованиях населения, проживавшего у р. Теча был применен подход в изучении радиационной нестабильности генома в семейных ячейках: облучённый отец - необлучённый потомок первого поколения. Впервые проведена оценка частоты Т-лимфоцитов периферической крови с микроядрами у необлучённых потомков первого поколения, отцы которых подверглись хроническому радиационному воздействию вследствие проживания в прибрежных селах р. Теча. Было показано, что средняя спонтанная частота Т-лимфоцитов периферической крови с микроядрами в группе необлученных потомков первого поколения не отличается от средних значений данного показателя в группе их отцов и в контрольной группе. Впервые проведен анализ влияния факторов радиационной и нерадиационной природы на частоту лимфоцитов с микроядрами у потомков первого поколения, отцы которых подверглись хроническому радиационному воздействию. Не было показано влияния дозы на гонады отца на год зачатия (средняя доза составила 0,11±0,11 Гр, диапазон индивидуальных доз - 0,003 - 0,5 Гр) на частоту лимфоцитов с микроядрами у их детей. Было выявлено повышение спонтанной частоты лимфоцитов с микроядрами в группе потомков в зависимости от дозы и мощности дозы на ККМ их отцов (в дозовом диапазоне 1,50-2,45 Гр и в диапазоне мощности доз

0.50-0,64 Гр/год). Показано, что пол, национальность, возраст на момент обследования, возраст отца в год зачатия, курение и употребление спиртных напитков не оказывают влияния на частоту лимфоцитов с микроядрами у потомков облучённых отцов.

Положения, выносимые на защиту.

1. У необлученных потомков первого поколения, отцы которых

подверглись хроническому радиационному воздействию вследствие

проживания в прибрежных селах р. Теча (дозы облучения гонад отцов составили 0,003 - 0,5 Гр, среднее значение 0,11±0,11 Гр) не отмечено повышения радиочувствительности Т-лимфоцитов относительно потомков необлученных лиц.

Теоретическая и практическая значимость результатов.

Апробация работы.

международной конференции «Опыт минимизации последствий аварии 1957 года» (Челябинск 2012).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 33 таблицы, 14 рисунков. Список литературы включает 209 источников, из них 48 отечественных и 161 зарубежных.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Влияние ионизирующего излучения на мужские половые

клетки

Нестабильность генома у потомков облученных людей является следствием возникновения повреждений в половых клетках их родителей. Так как в нашей работе объектом исследования стали потомки первого поколения облучённых отцов, то необходимо рассмотреть вопросы, связанные с влиянием ионизирующего излучения на мужские половые клетки.

Высокая радиочувствительность гонад известна очень давно. Еще в 1903 г. Альберс-Шонберг показал возможность радиационной стерилизации яичек кроликов и морских свинок, а И. Бергонье и Л. Трибондо, изучая радиационные повреждения семенников, смогли сформулировать зависимость радиочувствительности клеток от интенсивности деления и степени дифференцировки [Ярмоненко С.П. и др., 2004].

Радиочувствительность половых клеток зависит от интенсивности их пролиферации, стадии клеточного цикла и степени дифференцировки в момент облучения и характеристики ионизирующего излучения.

В ряде работ [Верещако Г.Г. и др., 1998; Конопля Е.Ф. и др., 1994] , выявлено, что радиочувствительными являются сперматогонии на стадии синтеза ДНК и прелептонемные сперматоциты. Было показано, что популяция сперматогониев наиболее радиочувствительна, когда они находятся в стадии покоя, наиболее радиорезистентна, когда клетки готовятся к пролиферации и промежуточная радиочувствительность наблюдаются в период активной пролиферации.

Облучение половых клеток можно идентифицировать по гибели клеток,

детектированию разрывов ДНК, возникновению точковых и хромосомных

мутаций. Хромосомные аберрации или потери целых хромосом влияют на

фертильность половой клетки и здоровье потомства. В тоже время, ИИ может

вызывать более тонкие изменения в структуре хромосом: потери небольших

фрагментов хромосом - микроделеции, потерю или амплификацию

повторяющихся последовательностей ДНК, а также изменение в экспрессии генов. Эти изменения могут вызвать дестабилизацию генома половых клеток и при оплодотворении вызвать нестабильность в соматических клетках потомства [Dubrova Y.E., 2003]

В ряду дифференцирующихся клеток по критерию выживаемости наиболее радиочувствительными считаются дифференцирующиеся сперматогонии, наиболее радиорезистентными - сперматозоиды (Верещако, 1998). Так, например, при дозах 0,5—1 Гр острого воздействия ИИ у большинства животных, как и человека, происходит массивное клеточное опустошение семенников, а при дозах выше 2—4 Гр наступает стерильность. В опытах на мышах, крысах и кроликах показано, что число сперматозоидов, их морфология, подвижность и способность к оплодотворению после острого однократного облучения при дозах до 1 кГр не меняются [Ярмоненко С.П. и др., 2004].

В работе [Шведов B.JI. и др., 2001.] были проанализированы морфологические изменения в семенниках при общем облучении мышей в дозах 10, 25, 50, 100, 400, 600, 800 и 1000 сГр. При этом было установлено, что доза, равная 25 сГр является минимальной, которая приводила к снижению > количества сперматогоний в канальцах семенников. Восстановление сперматогенеза наблюдалось через 30-45 суток после облучения в дозах не выше 600 сГр. Дозы 800 и 1000 сГр приводили к гибели животных раньше, чем могли проявиться лучевые повреждения семенников. Хотя другие исследования показывают, что при локальном воздействии в области семенников рентгеновским излучением в дозе 10 Гр самцы становятся фертильными через 22 месяца (Rüssel L.B. et al., 1950).

С другой стороны, непосредственно после облучения мутации в половой

линии регистрируются во всех типах клеток с различной частотой. Также

отмечено, что в одном дифференцирующемся ряду половых клеток от

сперматогоний до сперматозоидов частота мутаций уменьшается, и как

правило, по истечении времени после облучения частота мутаций в

сперматозоидах снижается или восстанавливается до контрольных уровней [Aitke RJ. et aL, 2010].

В ряде работ [Hamer G. et aL, 2003; Forand A. et al., 2004; Paul C. et al., 2008] было показано, что острое однократное воздействие у-излучением приводит к двунитевым разрывам хромосом в спермотогониях, которые регистрируются с меньшей частотой в клетках на стадии роста и созревания. В исследовании Hamer G. et al. при облучении семенников мышей рентгеновским излучением в дозе 4 Гр (200 кВ, 20 мА), было отмечено, что частота локусов у-2НАХ повышалась уже после 1,5-2 часов с момента облучения. Причем в ряду дифференцирующихся клеток наибольшая частота фосфорилированных локусов 2НАХ была в сперматогониях, наименьшая — в сперматидах.

Многочисленные эксперименты, направленные на выявление нестабильности генома в половых клетках, проводились с помощью^

определения мутаций в минисателлитных локусах у животных, подвергшихся

воздействию острого у-излучения и их потомков [Dubrova Y.E., 2003, Fan Y.J.^. et al., 1995, Sadamoto S. et al.,1994]. В результате этих работ был сделан вывод

о том, что различные стадии сперматогенеза отличаются по,

i ?

радиочувствительности, и максимальной чувствительностью к радиационному воздействию обладает премейотическая стадия созревания гамет. Помимо этого в данных работах не было обнаружено линейной зависимости частоты минисателлитных мутаций от дозы облучения. Так, в работе Safeer R. et al. было показано достоверное повышение частоты мутаций в локусе MS6 ESTR-последовательности, выделенных из спермы облученных BALB/C мышей-самцов после острого у-облучения в дозах не превышающих 100 сГр. В работе Somers СМ. сообщается, что мутации в ESTR последовательностях, индуцированные ИИ обнаруживаются в основном в премейотических и стволовых клет

Информация о работе

Ахмадуллина, Юлия Рафисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2014
ВАК 03.01.01

Диссертация

Радиочувствительность Т-лимфоцитов периферической крови у потомков первого поколения, отцы которых подверглись хроническому радиационному воздействию - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы