Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование поврежденности ДНК индивидуальных клеток млекопитающих методом гель-микроэлектрофореза

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование поврежденности ДНК индивидуальных клеток млекопитающих методом гель-микроэлектрофореза"

р - .-» Г "

государственный наычныя центр рф - институт биофизики

На правах рукописи

ГРИНЬКО Евгений Валентинович

ил 577.301

исстдозпш ПОЭРПЛЕНИОСТИ дик индивидуальных клеток шмогштайшх нетодон гель-никрозлеитро'ореза

03.00.01. - Радксбко^опм

автореферат

диссертации на соискание ученой степокя Кондрата биогогичасяих иау.т

КОСИНА - 1935

Работа выполнена в Г сударственном Научной Центре РФ -Институт биофизики.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник В. А. Тронов

г \

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация - Институт Химической Физики РАН.

Защита диссертации состоится 1395 г. в

часов на заседании диссертационного совета Д 074. 30. 02 при Государственной Научном Центре РФ - Институт биофизики С123182, Носква, ул. Живописная, д. 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ -Институт биофизики.

Автореферат разослан " 2.

В. К. Мазурик Д. И. Спитковский

1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

П. В. Ижевский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Многочисленные исследования убедительно показали, что ДНК является критической мишенью при действии ионизирующей радиации на клетку. Кроне того, дефекты ДНК являются не только результатом действия патогенетических Факторов, но и процессов, связанных с нормальный функционированием генома С Cook, Brazell, 1975,1976; Filippovich et al., 1988). Поэтому, одной из актуальных задач современной радиобиологии является расшифровка механизмов, связывающих первичные повреждения ДНК с конечным эффектом действия радиации на клетку - с гибелью клетки,

С помощью различных физико-химических методов, продемонстрирована прямая корреляция между эффективностью репара-тивной системы клеток и их выживаемостью после облучения (Хестяников, 1986). Обычно репарация повреждений ДНК изучается усредненной по большому количеству клеток, что не позволяет наблюдать какую либо разницу между индивидуальными клетками в популяции. Можно предположить, что нерепариро-ванные повреждения не случайно распределены в популяции, а главным образом локализованы в некоторых клетках. Это делает необходимым проведение количественного определения репарации и уровня поврежденности ДНК в индивидуальных клетках.

Большинство информативных и широко используемых методов, с помощью которых изучают дефекты ДНК, позволяют получать лишь интегральные характеристики поврежденности клеточной популяции СОстерман, 1983). Наиболее чувствительные из них, неизбежно связаны с формированием надмолекулярного геля, в свойствах которого отражаются особенности структурной организации хроматина в клетках перед их лизисом (Olive et al., 1992). Это затрудняет интерпретацию получаемых результатов. Сравнительно недавно в литературе появились первые сообщения об использовании методов, связанных с наблюдением нуклеоидов и ДНК индивидуальных клеток (Vogelstein et al., 1980; Ostling, Johanson, 1984; Rôti Roti, Wright, 1937; Gedik et al., 1992). Помимо высокой чувствительности, эти методы предоставляют уникальную возможность поклеточной регистрации повреждений ДНК, и тем самым оценивать гетероген-

'кость клеточных популяций.

Ранее в работах посвященных изучению феномена интерфазной радиационной гибели лимфоцитов тимуса мышей СППрроу1сЬ е1 а1. , 1982, 1983) было показано, что они характеризуются еысокой гетерогенностью по радиочувствительности, и высказано предположение о корреляции их радиочувствительности с уровней спонтанных повреждений ДНК в клеточных Фракциях. Дополнительное количество фоновых дефектов приводит к добавочной релаксации структуры хроматина, что делает геном более ранимым и изменяет условия функционирования репэративных ферментов СЕуэпэ е1 а1., 198?; ЗсГша^г, Уац|Ьэп, 1989). Кроме того, возрастание фонового уровня дефектов может способствовать запуску механизма интерфазной гибели клеток, поскольку известно, что один из механизмов запуска апоптоза связан с индукцией разрывов ДНК (Сорокина и др., ' 1988; Йоу е1 а1., 1992).

Поэтому цель» работы: явилось выяснение сзязи различной радиочувствительности ликфоидных клеток с уроЕнем спонтанной поЕрежденности (СП) ДНК и гетерогенностью популяции по этому показателю.

Для достижения сформулированной цели необходимо было решить следут.'^пе задачи:

1) Разработать вариант метода оценки поврежденности ДНК в одиночных клетках. Оценить воспроизводимость и информативность метода.

2) Исследовать гетерогенность, поврежденность и репарацию ДИК в лимфоцитах тимуса мыцей - неделяшпхея радиочувствительных клетках, погибающих главным образом в интэрфазе (по кехзнизпу апоптоза),

3) Исследовать особенности структурной организации нук-леоидов, спонтанную поврежденность ДНК, пострадиационную репарацию и гетерогенность по этим показателям двух линий мышиной ликфомы Ь5178У, различающихся по радиочувствительности.

Научная новизна и практическая ценность работы.

8 работе представлены данные по Феноменологии злектро-Форбтическоп миграции сверхполимерной ДНК одиночных клеток.

Впервые исследована повреждаемость и репарация индивидуального клеточного генома тиноиитоа мышей и двух линий

клеток лимФомы Ь5178У, различающихся по радиочувствительности. Охарактеризована гетерогенность этих клеток по спонтанной и индуцированной поврежденности генома.

Показано, что уровень спонтанных дефектов генома, двух линий клеток мышиной лимФомы Ь5178У-Р и 151?8У-3, прямо соответствует их радиочувствительности: чем выше уровень СП, тем выше радиочувствительность клеток. Это является прямым экспериментальным подтверждением гипотезы о роли предсущес-твующих разрывов в радиочувствительности клеток.

Теоретическое значение диссертации определяется полученными данными о роли спонтанной поврежденности ДНК и гетерогенности популяции по этому показателю в различной радиочувствительности лимфоидных клеток. Основные положения работы позволяют обосновать поклегочный подход, при изучении повреждающего воздействия на популяцию в целом.

Практическая ценность работы состоит в том, что разработана новая методика анализа повреждений и репарации ДНК в индивидуальных клетках. Методика характеризуется простотой, точностью, воспроизводимостью, отсутствием радиоактивной метки и требует черезвычайно . малого количества клеточного материала. Ее выгодно отличает использование ЭВМ для автоматического анализа проб. Методика позволяет оценивать гетерогенность клеточной популяции по поврежденности и репарации ДНК, и выявлять в клетках субпопуляции с высокой радиоустойчивостью/радиочувствительностью. Это дает возможность использовать ее для оценки эффективности лучевой и химической терапии опухолей, обнаруживать сравнительно небольшую часть поврежденных клеток в органах, т. е. оценивать токсическую нагрузку со стороны окружающей среды обитания (в том числе малых доз радиации).

йпробация работы. Материалы диссертации апробированы на 28 конференции" Биохимического общества, Варшава, Польша, 1992; на 3-м конгрессе Международного общества радиационной защиты С1ЙРА8), Монреаль, Канада, 1992; на 2-м Радиобиологическом съезде, Киев, Украина, 1993; на радиобиологическом семинаре НХФ РАН, Москва, 1994; на иежлабораторной конференции ГНЦ РФ - Институт биофизики, Москва, 1995.

Публикации. 'По материалам"диссертации опубликовано 8 работ.

• Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных экспериментальных исследований, обсуждения, полученных результатов и выводов. Она изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков и 6 таблиц.;'. Список литературы включает 146 работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки. Клетки тимуса мышей суспендировали в среде 199 с добавлением НЕРЕ5 до 20 мМ. Клетки мышинной линфомы Ь5178У радиочувствительной ЬУ-Э и радиоустойчивой ЬУ-!? линии культивировали в виде суспензии в среде Фишера ШВСО) с добавлением 8У. телячьей сыворотки и антибиотиков в увлажненной атмосфере 57. СОг при 37° С.

Облучение. После доведения концентрации клеток до 0. 5-0. 7 10е в 1 мл их облучали при температуре таящего льда. Мощность дозы источников Со60 установки "Игур" составляла 1.6 Гр/мин. Клетки исследовали сразу после облучения или спустя 60-90 пин после инкубации.

Микроэлектро-Форез ДНК. Суспензию интактных или гэк-ма-облученных клеток смешивали при 37° С с равным объемом 1/-ного раствора легкоплавкой агарозьг (ЬКВ) в среде 199. После тщательного перемешивания 30 мкл смеси наносили на предметное стекло, поверхность которого была предварительно покрыта 0.1/!-ным раствором обычной агарозы в воде и высушена. Тонкий слайд накрывали покровным стеклом и помещали в холодильник ¡¡а 5 мин для полимеризации-агарози. После удаления покровного стекла слайд представлял собой пластину геля толщиной 0.1-0.2 мм, прикрепленную к предметному стеклу. Его помещали в лизирующий раствор, содержащий 1 М НаС1, 0.2 М ЭДТА-Наг, 0.2 М Трис-НС1, рН 8.0, 0.5'/. Тритона Х-100, 0.5'/. саркозила и протеинззу К. Лизис проводили в темноте при комнатной температуре в течение 1-24 ч. После ополаскивания дистеллированной водой слайды помещали в электрофоретичес-кую ванну, заполненную буфером (25 пМ ЗДТА-Наг, 25пМ Трис-НС1, рИ 8.0), в котором выдерживали слайды в течение 1 ч

для выравнивания электролита в порах геля. Электрофорез проводили в том же буфере при напряженности поля 1-6 В/см в течение 2-20 мин, после чего на каждую пластину геля наносили несколько капель раствора бромистого этидия (2 мкг/мл) и накрывали покровным стеклом. Измерения проводили в тот же день.

Анализ микрофореграим. Детекцию треков ДНК отдельных клеток (ДНК-комет) осуществляли на сканирующем; флуоресцентном микроскопе (ЛЖИ. Для возбуждения флуоресценции использовали Фильтр 516-560 нм, для визуализации и детекции -барьерный фильтр 590 нм. Выбор обьекга осуществлялся визуально при увеличении 400х, после чего прямоугольная зондирующая щель, имеющая оптический размер 6x15 мкм, устанавливалась на некотором расстоянии от измеряемого объекта по его оси. Микроскоп был соединен "в-линию" с мини-ЗВМ PDP11/73 (DEC), что позволило нам реализовать один из эффективных методов количественной микроскопии, когда автоматическое управление процессом сканирования сочетается с машинным анализом результатов измерений. Были разработаны специальные алгоритмы сканирования, реализованные в виде программ для 3BI1 Одномерное сканирование ДНК-коиег проводили с тагом 1 мкм, регистрируя интенсивность флуоресценции в площади зонда. Фоновая флуоресценция, которую автоматически измеряли для каждого сканируемого объекта, всякий раз вычиталась. Длину трека миграции ДНК находили как полную длину сканограммы на высоте, превышающей максимальное значение Фона для каждой кометы. Поскольку зонд практически полностью перекрывает комету в поперечнике, то содержание ДНК в ней находили суммированием интенсивностей Флуоресценции в пределах длины сканограммы. В случае частиц без электрофореза (ДНК-сфер), которые зондирующая щель из-за их значительного размера полностью не перекрывает, диаметры объектов находили из сканог-рамм, а количество ДНК вычисляли, переводя суммарную Флуоресценцию вырезаемого зондом экваториального диска во Флуоресценцию его тела вращения. Для детекции миграции малого количества ДНК использовали метод реперной последовательности, когда из усредненной сканограммы интактных клеток (репера) поточечно вычитали сканограммы исследуемых клеток, а по-

■лученную разницу суммировали. Распределение ДИК в микрообъекте исследовали используя фазовый анализ, выделяя на кривой амплитудного распределения области (Фазы) с различной интенсивностью флуоресценции. Полученные в результате поклеточного сканирования параметры накапливались в памяти компьютера. Для каждого слайда строилось распределение, для которого вычислялось среднее значение длины трека и количества материала в нем. Для получения истинного распределения такие измерения проводились последовательно на нескольких идентичных слайдах. В качестве показателя гетерогенности распределения использовали коэффициент вариации (Vaг), равный отношению дисперсии распределения к среднему значению. Для сравнения двух распределений использовался показатель Cdf), являющийся разницей распределений, пронормированных по числу просчитанных клеток. Достоверность различий оценивали используя непараметрическую статистику Викоксона-Мана-Уитни и t-критерий Стьюдента.

Седиментация нуклеоидов. Нуклеоиды исследовали, визируя клетки (3-7 105 в 0.1-ил среды) в лизирующем растворе (0.25 мл), содержащем 2 И НаС1, 0.5/ Тритона Х-100, 0.2 И ЭДТА-Паг, 0.2 И Трис, pH 8.0, на поверхности нейтрального сахарозного градиента. Через 40 мин после добавления клеток к лизируюцему раствору пробирки центрифугировали (Beckman) при 20° С, 15000 об/иин в течение 60 минут.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Факторы, Рлип;оиц;е на. злектрофорстическую подвижность ДНК индивидуальных клеток.

Конечным результатом лизиса клетки является частица, содержащая центральное ядро, окаймленное ярким гало, формируемым нитями релаксированной хрокосомальной ДНК. Центральное ядро представляет собой сферическую полость в геле оставшуюся после лизиса клетки, оно заполнено нитями перепутавшейся ДНК. Электрофорез в постоянном электрическом поле сначала деформирует гало, смещает его относительно центральной полости, затем вытягивает в сторону анода. При этом

- ? -

часть материала, находящегося в центральной .полости, может мигрировать в хвост. Таким образом, из симметричных ДНК-сфер образуются ДНК-кометы. Для интактных клеток процесс формирования комет, в зависимости от прикладываемого напряжения, занимает несколько минут и имеет насыщение, т.е., предельную длину кометы, не изменяемую в широком диапазоне времени (рис. 1, А).

Рис. 1. Зависимость относительной длины миграции ДНК (А) и количества мигрировавшего материала ДНК (Б) клеток мышиных лимФобластов от времени электрофореза и напряженности электрического поля.

По осям абсцисс - время электрофореза, мин; по осям ординат: А - относительная длина миграции ДНК, отн. ед. , Б - доля мигрировавшей ДНК, 7..

Исследовав зависимость -количества мигрирующего материала ДНК от времени электрофореза и.напряженности электрического поля (рис. 1,Б), ми пришли к выводу, что точки насыщения параметров миграции примерно совпадают, и не зависят от типа клеток. Очевидно, что наличие дефектов в ДНК, увеличивающих ее гибкость и способность к миграции будет не только ускорять процесс формирования кометы, но и увеличивать степень максимальной вытянутости ДНК. Последнее," очевидно, будет проявляться в условиях электрофореза, обеспечивающих достижение стационарного режима. Также, существенным здесь является полнота разрушения ядерного матрикса, препятствующего выходу ДНК в агарозный гель. Действительно, рост времени лизиса и дополнительная обработка протеинэзой К увеличивают длину миграции ДНК. В этих условиях, показатель гетеро-

4 3 2 1

О 00 7П

60 50

0-бВ/сн з-Ю/сн

о—¡3—

0 5 10 15 20 25

генности миграции СУагСЬ)), после старта возрастает и остается постоянный с ростои времени электрофореза, что говорит об его независимости от погрешностей вносимых экспериментальными Факторами и следовательно информативности для описания гетерогенности клеток по поврежденности ДНК.

Анализ значений амплитуд Флуоресценции в гало ДНК-сФер и области "хвоста" комет, позволяет сделать вывод о высокой плотности ДНК. в момент старта,_ и ее последующем уменьшении в процессе дальнейшей миграции. В ходе электрофореза происходит потеря части ДНК, которая в максимуме не превышает 18'/.. По-видимому, эти потери связаны с миграцией низкополимерных фрагментов ДНК и РНК за пределы сканирования.

Степень перепутанности и доля мигрирующей ДНК определяется количеством ДНК в клетке и ее объемом. Это может приводить к зависимости длины кометы от объема ДНК-сферы, из которой она Формируется. Для проверки такой зависимости мы использовали нестимулированные лимфоциты периферической крови человека, основная масса которых находится в Фазе СО, и имеет узкое распределение по содержанию ДНК, но заметно варьирует по объему Формируемых ДНК-сФер (табл.1).

Таблица 1.

Влияние обьема ДНК-сФер лимфоцитов на длину формируемых из них ДНК-комет.

I 1 1 1 I I

|Содержание ДНК (усл. ед) ¡120-1501150-1801 210-240| 240-2?0|

!-1-1-1-1-1

¡Объем ДНК-сФер (мкм3) |3. 4*10л-|7. 6*104|10. 3*1041и. 8*1 о*|

[-1---1--1------1---1

|Длина ДНК-коиет Сики) [92+/-35137+/-321 94+/-31| 90+/-25|

I_I_I_I_I_I

Как видно из табл.1, для всех выделенных областей, содержащих ДНК сферы различного объема, средние значения длин коиет примерно одинаковы, что говорит об отсутствии явной зависимости длины кометы от объема клетки и от объема Формируемой из нее ДНК-сФеры.

Для проверки зависимости длины кометы от фазы клеточного цикла км исследовали линию клеток мышиных лнмФобластов

Ь51?8У-!?. Распределение комет по содержанию ДНК было разбито на диапазоны, которые приблизительно соответствуют клеткам, находящимся в СО/(П Фазе (357.), СО/СЯ+З С40/Л и 3+Й2+М С25У.) Фазах клеточного цикла. В табл. 2 ' представлены результаты измерений длин ДНК-комет, входящих в данные области.

Таблица 2.

Влияние содержания ДНК в клетках (фазы клеточного цикла) на длину ДНК-комет, формируемых из ДНК-сфер этих клеток.

1 |Фазы цикла ... Содержание ДНК (усл. ед. ) Длина ДНК 1 -комет (мкм)|

| (GO/G1) 80- 120 64+/- 23 |

| CG0/G1+S) 16С -240 65+/- 20 |

| (S+G2+M) I > 240 68+/- 23 | i

Ранее было показано, что ДНК клеток китайского хомячка, находящихся в Фазе 3, при электрофорезе проявляет минимальную подвижность (Iliakis et al., 1991; Olive et al.,

1991). Авторы связывают это с наличием в реплицирующейся ДНК необычных конформаций типа "крест" и Т-образная структура, увеличивающих перепутанность ДНК. Влияние на миграцию высокополимерной ДНК остаточного белка, сохраняющегося после интенсивного лизиса, считается маловероятно (Olive et al.,

1992). Однако, как видно из табл.2, для исследованных нами клеток средние значения длин ДНК-комет в каждом из интервалов примерно равны, что свидетельствует об отсутствии связи длины кометы с фазой клеточного цикла.

Таким образом, на двух типах клеток - покоящиеся лимфоциты и делящиеся лимфобласты - нам не удалось обнаружить корреляцию длины комет с диаметром ДНК-сфер и фазами клеточного цикла, что говорит о возможности использования этого параметра для характеристики повреждения ДНК в отдельной клетке и гетерогенности популяции по этому показателю.

■ 2. Исследование методом микрозлектроФореза ДНК индивидуальных интактных и гзмма-облученных тимоцитов.

Облучение клеток приводит к формированию в ДНК разрывов, увеличивающих гибкость цепи, ускоряет ее миграцию в электрическом поле и увеличивает длину ДНК-кометы (Рис.2).

10 0 [л- Б Г ""! - О-Гр

10 0 ГЬ—п 1-ГР

10 о . и п т— З-Гр

10 п ■ р 5-Гр

0 50 100 150 200

0.6 0.9 1.2

Рис.2. Зависимость относительной длины миграции ДНК тимоцитов мышей от дозы облучения С А,В) и гистограммы распределения 20 клеток по длине миграции сразу после их облучения (Б). А, В: по осям абсцисс - доза облучения, Гр; по осям ординат - относительная длина миграции. Б: по оси абсцисс -длина миграции ДНК, нки; по оси ординат - количество клеток. А, Б-электрофорез 2 В/см, 5 мин. Клетки лизировзны в присутствии протеиназы К (25 пкг/мл). В - электрофорез 5 В/см,5пин.

Линейная зависимость этого параметра от дозы облучения свидетельствует о прямой пропорциональности длины миграции ДНК количеству разрывов в ДНК, которые, как известно, линейно накапливаются с дозой облучения. В пользу этого заключения говорит также линейная зависимость количества мигрирующей при электрофорезе ДНК от дозы облучения клеток.

Ранее с помощью фракционирования в градиенте концентрации альбумина были выделены 4 фракции тимоцитов, которые

- И -

различались по радиочувствительности CFilippovich et al.,1982, 1988). Было высказано предположение о том, что эти фракции различаются также по количеству предсуществующих в них разрывов ДНК (Сорокина и др., 1986).

Полученные нами данные подтверждают это предположение. В результате лизиса мышиных тимоцитов без протеиназы формируются компактные частицы нуклеоида диаметром 30-40 мкм. При седиментации такого'нуклеоида возникающего гидродинамического сдвига-достаточно, чтобы привести к выпетливанию наружу части ДНК (Cook, Brazell, 1977). Профиль распределения таких частиц по длине миграции ДНК представлен на рис.3,А.

so

40 20

О

20 10 О

О ÎQ 80 120 160 200

JfrfK.

Рис. 3. Профили распределения 160 клеток мышиных тиноцитов по длине миграции ДНК после лизиса в присутствии протеиназы К: О (А), 100 (Б) мкг/мл. По осям абсцисс - длина миграции ДНК, мкм; по осям ординат - количество клеток. Электрофорез 5 В/см, 5 мин.

а 40 00 120 ISO 200

Протеиназная обработка разрушает ядерный матрикс, а так-

же сайты заякоривания петельных доиенов ДНК. электрического поля ДНК двигается к аноду со порционалыюй ее гибкости, которая связана разрывов. В результате поклеточных измерений ции формируется профиль распределения клеток ДИК (рис.3,Б), форма которого определяется разрывов ДНК по отдельным клеткам или группам клеток. Как видно, для тимоцитов профиль имеет 4-5 максимумов, соответствующих 4-5 субпопуляциям, различающимся по количеству разрывов в их ДНК. Можно полагать, что в условиях исчерпывающе-

Под действием скоростью, про-с количеством треков мигра-по подвижности распределением

го лизиса профиль распределения клеток по подвижности ДНК является, очевидно, характеристическим показателен гетерогенности интактных клеток по количеству разрывов в геноме.

Обращает на себя внимание высокая гетерогенность тимоци-тов по подвижности ДНК сразу после облучения С рис. 4,Б,2).

Рис. 4. Кинетика репарации облученных тимоцитов in vitro в дозе 3 Гр.

А - изменение во времени относительной длины миграции ДНК для 20 клеток. По оси абсцисс - время инкубации, - мин; по оси ординат - относительная'длина миграции. 1-необлученные клетки; 2-облученные в дозе 3 Гр. Б - гистограммы распределения клеток: необлученных (1), облученных в дозе 3 Гр спустя 0(2), 10(3) и 60(4) мин. По оси абсцисс - длина миграции ДНК, мкм; по оси ординат - количество клеток.

Не исключено, что это свойство может объясняться дисперсией скорости быстрой компоненты репарации ДНК в облученных тимоцигах, протекающей во время процедуры впаивания клеток в агарозу. Нельзя исключить и различную поражаемость ДНК в клетках за счет структурных различий хроматина в субпопуляциях тимоцитов.

Как видно, процесс репарации завершается через 30 минут (рис.4,А), однако полного восстановления профиля за это время не происходит (рис. 4,Б,3). Ранее с помощью метода щелочного расплетания ДНК (Алферова и др., 1933), было показано, что через 1 ч после почти полной репарации разрывов ДНК в облученных тимоцитах in vitro, с большой скоростью вновь

происходит стохастическое образование однонитевых разрывов. Аналогичный процесс прослеживается и на рис. 4, А. По-видимому, эти разрывы, а также нерепарированные двунитевые разрывы служат сайтами инициации межнуклеосомной деградации хроматина, сопровождающей интерфазную гибель облученных тимоци-тов CSoldatenkov et al., 1989). На сегодня, известно, что деградация ДНК на самых ранних этапа апоптоза также связана с индукцией разрывов (Walker et al.;"1994). :

Таким образом, метод ДНК-комет дает возможность определения ранних этапов пострадиационной деградации ДНК отдельных апоптотических клеток. Следует отметить, что значительная гетерогенность тимоцитов по радиочувствительности сочетается с их высокой гетерогенностью г.о спонтанной пов-реждениости ДНК. В ряде работ, таое прослеживалась связь между уровнем спонтанных разрывов ДНК и радиочувстЕителънос-тью клеток (Johanson et al.,-1932; Schwartz, Vaughan, 1989; Schuartz et al., 1991).

3. Характеристика поврежденности ДНК в двух линиях клеток мышиной лииФомы различающихся по радиочувствительности.

Две линии клеток мышиной лимфомы L5178Y-R и L5173Y-5 различаются почти в 1.5 раза по радиочувствительности, определяемой по клоногенной способности (Beer et al., 1983), и имеют близкие линейные размеры клеток: 11.6+/-1.6 мкм и 12. 9+/-3 мкм соответственно. Седиментация нуклеоидоЕ, формирующимся в результате мягкого лизиса клеток, обнаруживает разницу между ними (табл. 3).

Таблица 3

Отношение скоростей седиментации нуклеоидов необлученных LY-R и LY-S клеток (Sr/Ss).

1 ¡Количество клеток 1 1 1 1' 1 1 1

¡в градиенте х- ю5 10. 5 1 0.7 ¡1.0 1 1.5 |3 _ 0 1 1

¡Отношение скоростей 1 |1. 17 1 1. 1.011. 31 Г^ 1 1. 22 ¡1 1 24| Среднее

1 SR/DS 1 ... 1 ....... 1 1 | ¡1. 20+/-0. 08 1

Относительная седиментация нуклеоидов радиоустойчивых клеток (1,У-(? нуклеоидов) на 207. выше, чей седиметация нук-леоидов радиочувствительных клеток (ЬУ-Э нуклеоидов). Можно предположить, что это связано с большей релаксацией. ЬУ-Э нуклеоидов по сравнению с нуклеоидами клеток ЬУ-1? линии.

Результаты седиментационного титрования нуклеоидов- ин-. теркалирущим красителем ЕЬВг (рис.5) обнаруживают пониже-'ние способности ДНК • ЬУ-Б клеток суперспирализоваться при возрастающих концентрациях интеркалятора.

Это согласуется с выводами Капишевской и соавторов СКар1Бгеы5ка е1 а1., 1989), измерявших диаметр гало нуклеоидов при титровании ДНК интернирующим красителем Р1.

Таким образом, можно сказать, что клетки радиочувствительной линии ЬУ-Э содержат более релаксированный нуклеоид по сравнению с клетками линии ЬУ-Р>; эта релаксация может достигаться как за счет информационных изменений (увеличение размера петель и снижение числа точек прикрепления их к матриксу), так и за счет структурных нарушений ДНК (разрывы).

Глубокий лизис клеток в агарозе, разрушающий структуры высиего порядка организации ДНК (рис.6), приводит к 1.5-кратному возростанию диаметра формируемых частиц за счет полной релаксации ДНК.

Рис. 5. Кривые титрования бро мистыи этидием нуклеоидов из радиоустойчивой (1) и радиочувствительной (2) линий клеток мышиной лимФомы Ь51?8У.

По оси абсцисс - концентрация красителя, мкг/мл.; по оси

О 10 20 30 40

ординат - относительная скорость седиментации нуклеоидов.

Рис. 6. Влияние условий лизиса на распределение по размеру 60 ДНК-частиц радиоустойчивой С А,Б) и радиочувствительной (В,Г) линий клеток мышиной лимфомы. По оси абсцисс - длина миграции,ДНК мкм; по оси" ординат - количество клеток. Клетки были вплавлены в агарозу и лизированы в течение 1 ч С А,В) и 20 ч с добавлением в лидирующий раствор протеиназы (Б,П.

Факторами, ограничивающими этот процесс, являются размер агарозных пор и жесткость двойной спирали ДНК. Последняя существенно зависит от наличия дефектов в цепи Св частности, разрывов), поэтому- можно предположить в качестве объяснения различного поведения нуклеоидных частиц ЬУ-З и ЬУ-Э клеток различное содержание в них разрывов ДКК: большая релаксация ДНК ЬУ-5 нуклеоияоз обусловлена большим содержанием в ней разрывов.

Убедительным свидетельством в пользу этого являются результаты микроэлектрофореза ДНК таких частиц Срис.7).

я

Г- 1,

1! в г

1 :

010 2030 2033 4050

.4

а

а

(

О 50 103 159 203 0 50 100 153 200

Рис. 7. Гистограммы ДНК-комет из клеток (А, Б) и из клеток 1Л-5 (С, Г).

По оси абсцисс - д.шна ДНК-кометы, мкм: по ос;: ораин.гг -доля ДНК-комет данной длины,/.. Электрофорез в течение 5 мин при 5 (А, Б) и 6, 5 (В, Г) В/см. Гистограммы построены после разбиения на 10 (А, о) и 5 (В, Г) мкм интервалы. В, Г - клетки предварительно облучены в дозе 1П Гр, и инкубированы в сг-зде лги 57° С в течение 30 ммл.

Как видно из рис.? и табл.4, средние длины ДНК-комет ЬУ-Э клеток на 20/. выше, чем для клеток ЬУ-Й линии.

Таблица 4

Параметры ДНК-коиет из ЬУ-Й и ЬУ-Э клеток, полученных при трех напряжениях электрофореза в течение 5 минут.

Напряжен ность. В/см - 1 'Длина ДНК -комет , мкм ' Lr/Ls 1 df, *| 1

1 1 |lr±sd| 1 1 1 var(L) Ls±SD var(L)

0 5 6.5 8.5 1 1 |31±5 | 158± 271 |86±20| j 93± 261 I 1 0.16 0. 48 0.23 0. 28 39-i9 70±32 103±30 111±39 0.23 0. 46 0.30 0. 35 1. 25 1. 21 1.20 1.19 32 | 36 | 37 |

Средние 1 значения |0. 28±0. 08 1 0. 34±0. 09 1. 21±0. 03 35±3|

6. 5** i 1 i 186±201 i i 0. 23 113*30 0.27 1.31 53 | I

*) Гистограммы сравнивали после разбиения на 5-мкм интервалы. **) Клетки облучены в дозе 10 Гр и проинкубированы в течение

90 мин при 3?°С.

С увеличением напряженности электрического поля показатель гетерогенности распределений незначительно изменяется, что означает инвариантное смещение всего профиля распределения комет без его деформации. Это подтверждает предположение, что распределение комет по их длине является характеристическим показателем для клеток, зависящим от уровня спонтанной поврежденности ДНК.

Сравнение гистограмм LY-R и LV-3 комет (рис.7) и анализ разницы между ними (df) (табл.4) говорят о том, что спонтанная повре:*денность ДНК в клетках LY-S выше, чем в клетках линии L'i-R. Не исключено, что механизмом, формирующим более высокий базальный уровень разрывов в клетках линии LY-S, является менее эффективная репаративная система в них (Evans et al., 1987, 1939; Ulodek, Hittelrr.au, 1937).

В то время как облученные в дозе 10 Гр LY-R клетки в течение 60-90 минут инкубации полностью восстанавливают ДНК, в репарированных LY-5 клетках ДНК сохраняет более высокую по сравнению с интактными клетками подвижность (рис.7 В,Г). Более убедительно этот вывод следует из сопоставления параметра df гистограмм R- и 3-комет. .Как видно из данных табл.4, этот показатель для ингактных клеток составляет 36/. . Ясно, что после их полной репарации разность между их распределениями тоже должна остаться такой же. Однако в реальности этот показатель в репарированных клетках составляет 53'/, что говорит о заметном запаздывании репарации разрьтов в LY-5 клетках.

Из представленных результатов отчетливо видна высокая гетерогенность двух линий клеток лимфомы L51737. Эта гетерогенность проявляется как в отношении структуры ДНК интак-тних клеток, так и в отношении их способности репарировать радиационные повреждения.* Гетерогенность радиочувствительной LY-5 линии клеток выше, чем радиоустойчнвой LY-R линии (табл.4). Около 20/ клеток линии LY-3 имеют наименьшую скорость репарации Срис.7, Г). Можно предположить, что природа этой гетерогенности связана с более медленной репарацией двунитевых разрызов ДНК в LY-S клетках (Olive et al., 1991).

ВЫВОДЫ

1. В постоянном электрическом поле подвижность ДНК индивидуальной клетки (параметр длины ДНК-кометы) отражает содержание в ней дефектов разрывного типа (ОР и ДР).

2. Распределение ДНК-комет по им длине является характеристическим для данной линии клеток и отражает гетерогенность клеток по содержанию повреждений в их ДНК.

3. Тимоциты мышей характеризуются высокой гетерогенностью по спонтанной поврежденности ДНК. В них можно обнаружить несколько субпопуляций, отличающихся по уровню спонтанной поврежденное™.

4. После облучения и последующей инкубации в тимоци-гах отмечается деградация ДНК, отражающая начальный этап эг.оптоза этих клеток., что может быть обнаружено по подвиж-

ности ДНК в кометах.

5. Две линии клеток мышиной лимфоиы, различающиеся . по радиочувствительности, обнаруживают изменения ДНК, адекватные их радиочувствительности: Ca) более радиочувствительная линия клеток характеризуется повышенным уровнем СП генома; Сб) гетерогенность радиочувствительной линии клеток по СП и способности репарировать радиационные повреждения ДНК выше, чем радиоустойчивой линии. .......

6. Различия в радиочувствительности двух линий клеток мышиной лимфомы сочетаются с различиями в структурной организации хроматина, предпосылкой которых является базальный уровень дефектов ДНК в этих клетках.

7. Клетки радиочувствительной LV-S линии, после' облучения в дозе 10 Гр, сохраняют нерепарированную компоненту в виде субпопуляции нерепарировавшх клеток.

СПИСОК РАБОТ, ;ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ГЕНЕ ДИССЕРТАЦИИ '

1. Тронов В. А., Гринько Е. В., Филиппович И. В. Оценка гетерогенности клеточных популяций по способности индивидуальных клеток к репарации ДНК. Тезисы докладов Международной конференции "Биологические и радиоэкологические аспекты последствий аварии на ЧАЭС" (Украина, г. Зеленый Икс, 10-18 сентября 1990 г), П.: 1990, С. 193-194.

2. Тронов В. А., Гринько Е. В., Бериташвили Д. Р., Филиппович И. В. Микроэлектрофорез ДНК индивидуальных интактных и гам-ма-облученных тимоцитов. Цитология, 1991, Т. 33, ÍÍ2, С. 94-102.

3. Filippovich I.V., Tronov V. ft. , Denisenko К. F., Alfyerova Т.Н. and Grin'ко E.V. Possibilities of thí microelectrophoresis technique for the assessment of risk at low-dose irradiation. Eighth International Congress of the International Radiation Protection Association (IRPA8), Montreal, Canada, Hay 17-22. 1992, Vol. 1, P. 528-531

4. Afanas je v G.G., Tronov V. A., Grin'ко E.V., Vasilenko S.N. and Filippovich I.V. Pecularities in highe r-order DNA structure among mouse limphoraa cells (L5178Y) differing in radiosensitivity. XXVIII ZJasd Poiskiego TowarzysLwa Biochemicznego (16-18 wrzesnia 1992) Poland,- Lodz 1902,- P. 94.

5. Тронов В. А., Гринько Е. В., Кончаловский М. В., Данилова

H. Б., Терещенко Д. Г. и Филиппович И. В. Остаточные повреждения ДНК в периферических линфоцитах после тотального гаи-ма-облучения человека. Медицинская радиология, 1993, Т. 38, N 2, С. 39-41. ■

6. Тронов В. А., Гринько Е. В., Афанасьев Г. Г, Пелевина H.H., Филиппович И. В. Уровень спонтанных дефектов ДНК радиоустоп-чивой и радиочувствительной линий клеток пышной липфопм CL51787) и их гетерогенность по этому показателю. Радиобиологический съезд (Киев, 20-25 сентября 1993 г.). Тезисы докладов. Пущино, 1993, Т. 3, С. 1011-1012.

7. Тронов В. А., Гринько Е. В., Афанасьев Г. Г., Филиппович И. В. Исследование поврежденности ДНК и гетерогенности клоток методом гель микроэлектрофореза. Биофизика, 1934, Т. 39, N5, С. 810-819.

Tronov U.A., Grin'ко Ye.V., Afanas'ev G.G. and Filippovich

I.V. Gel-mlcroelectrophoresis study of the vulnerability of DK A and heterogeneity of the cells. Biophysics, 1334, Vol.39, H 5, P. 833-843.

8. Тронов В. А., Гринько E.B., Афанасьев Г. Г., Пелевина И. И. , Филиппович И. В. Особенности структурной организации и спонтанная поврежденность ДНК в клетках двух линий линфопн L5178Y, различающихся по радиочувствительности. Цитология, 1994, Т. 36, N 7, С. 631-641.

Заказ-402 тирая 60 тмпогра&ш ВГИК