Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование изменения количества копий и формирования делеций митохондриальной ДНК в клетках тканей мышей после воздействия ионизирующей радиации

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование изменения количества копий и формирования делеций митохондриальной ДНК в клетках тканей мышей после воздействия ионизирующей радиации"

На правах рукописи

Антипова Валерия Николаевна

4855591

ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА КОПИИ И ФОРМИРОВАНИЯ ДЕЛЕЦИЙ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК В КЛЕТКАХ ТКАНЕЙ МЫШЕЙ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ

03.01.02 -биофизика

-6 ОПТ 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино -2011

4855591

Работа выполнена в лаборатории радиационной молекулярной биол Учреждения Российской академии наук Института теоретической экспериментальной биофизики РАН

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Безлепкин Владимир Геогриевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор

Миронова Галина Дмитриевна

Доктор биологических наук, профессор

Новоселова Елена Григорьевна

Ведущее учреждение:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики РАН им. Н.М. Эмануэля

Защита диссертации состоится октября 2011г. в « в » часов « » ми на заседании диссертационного совета Д002.093.01 при Учреждении Россий академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РА адресу: 142290, г. Пущино, Московской обл., ул. Институтская, дом 3, И РАН, Диссертационный совет. Факс: 8 (49679) 33-05-53

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН: 142290 г.Пущино, Московской обл., ул. Институтская, дом 3.

Автореферат разослан 19 сентября 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат физико-математических наук Ланина Надежда Федоро

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Известно, что воздействие физических и химических факторов окружающей среды на организмы животных и человека в малых и умеренных дозах могут быть причиной изменений в геноме соматических клеток тканей, которые приводят к мутационным и канцерогенным нарушениям. В связи с тем, что в настоящее время широкое использование источников ионизирующих излучений и ядерных технологий в различных областях производственной деятельности человека приводит к облучению в низких дозах существенной доли популяции людей, изучение молекулярных механизмов формирования последствий действия ионизирующей радиации (ИР) на организм млекопитающих и создание методов биомониторинга эффектов радиации является одной из актуальных задач радиационной биофизики.

Подавляющее большинство исследований радиационно-индуцированных изменений в генетическом материале клетки основаны на анализе изменений параметров ядерной ДНК. Но, благодаря развитию методической базы исследований в области молекулярной биологии и радиационной биофизики, сформировалось общее теоретическое представление, что для процессов пострадиационного восстановления клеточного ядра и других компонентов клетки чрезвычайно значимы процессы, контролируемые митохондриями. Функционирование этих органелл обеспечивает основную часть энергопотребления клеток в виде АТФ. Нуклеотидная последовательность митохондриальной ДНК кодирует полипептиды системы «дыхательной цепи» митохондрий.

Некоторые особенности делают митохондриальный геном более чувствительной мишенью не только для активных форм кислорода (АФК), генерируемых в самих митохондриях, но и для внешних повреждающих агентов. Все это способствует формированию в мтДНК нарушений с более высокой частотой, чем в яДНК. Когда количество мутантных молекул мтДНК превышает определенный порог, это влечет за собой нарушение множества энергозависимых

путей клеточного метаболизма. Возникает состояние «митохондриальной дисфункции», с которой связаны активация клеточной гибели и ослабление функций тканей, развитие дегенеративных процессов, «митохондриальных» патологий, включая нейродегенеративные, нейромышечные и ишемические заболевания. Как показывают результаты исследований, в культивируемых клетках после воздействия окислительных агентов, наряду с повреждением мтДНК наблюдается активация биогенеза митохондрий и увеличение числа копий мтДНК. Возможно, с репликацией копий мтДНК, содержащих повреждения, связано возникновение в митохондриальном геноме делеций разного размера и закрепление в нем точечных мутаций. Формирование больших делеций приводит к утрате некоторых генов и, как следствие, к определенному дефициту белков цепи переноса электронов. Вместе с тем сведения о формировании таких нарушений мтДНК как делеции в клетках тканей человека или животных, подвергшихся радиационному воздействию на уровне целого организма, в литературных источниках ограничены, хотя проблема является чрезвычайно актуальной.

Цель и основные задачи исследования.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось исследование изменения общего количества копий и содержания копий мтДНК с делениями в клетках тканей и плазме крови мышей после воздействия ионизирующей радиации.

Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать изменение общего количества копий митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках митотически активной ткани (селезенки) и постмитотической ткани (головного мозга) мышей, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации.

2. Определить уровень копийности мтДНК с большими делециями в клетках тканей мышей в пострадиационный период.

3. Изучить динамику изменения содержания копий внеклеточных мтДНК с делециями в плазме крови мышей в пострадиационный период.

Научная новизна и практическое значение работы.

Впервые в исследованиях на уровне целого организма получены прямые данные по радиационной активации репликации мтДНК. Выяснено, что такие параметры как доля животных с делециями и доля копий мтДНК с делециями в тканях облученных животных зависят от дозы облучения. К концу месячного пострадиационного срока происходит снижение уровня делегированных копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных животных. Показано, что ИР вызывает увеличение количества копий мтДНК с делециями в плазме крови облученных животных, и это увеличение совпадает по времени с уменьшением количества делегированной мтДНК в тканях. В митохондриальном геноме мышей выявлена делеция размером 5914 п.о.

Результаты исследования изменения копийности мтДНК и формирования делеций в клетках тканей облученных в экспериментах животных дополняют знания о механизмах развития лучевой реакции организма в разные пострадиционные сроки. Использованные методические подходы могут быть применены для разработки тест-систем для оценки поврежденности тканей организма у профессионалов предприятий ядерно-энергетического комплекса, подвергшихся облучению в радиационных авариях, у населения загрязненных радионуклидами районов, а также в клинической практике при использовании радиотерапии.

Основные положения, выносимые на защиту. В пострадиационный период в клетках тканей головного мозга и селезенки мышей, подвергнутых воздействию ИИ наблюдается активация репликации мтДНК, которую можно рассматривать как развитие компенсаторной реакции на дефицит энергии, возникшей в результате разрушения целых молекул мтДНК. Облучение мышей в дозах 2 и 5 Гр сопровождается зависимым от дозы повышением содержания копий мтДНК с делециями. Увеличение их количества в плазме крови облученных животных позволяют предполагать, что такие копии мтДНК элиминируются из тканей облученных животных в пострадиационный период.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции «Радиобиологические основы лучевой терапии» (Москва, 2005 г.), на 11-й школе конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2007), н 3-й Всероссийской научно-технической Интернет-конференции «Современны проблемы экологии и безопасности» (Тула,2007) и на VI Съезде по радиационны. исследованиям (Москва, 2010 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 5 статей в журналах из списка ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 3_ таблицы и/^рисупков. Библиография включаеъЗДисточников литературы.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1. Материалы и методы

Животные. Радиационная обработка. В работе использовали самцов мышей линии ВАЬВ/с в возрасте двух месяцев (питомник экспериментальных животных ФИБХ РАН, Пущино), содержащихся в стандартных условиях. Для проведения исследований по изменению количества копий мтДНК животных подвергали облучению (всего тела), группами по 5-6 штук, в пластиковых контейнерах, на гамма-установке «Гупос» ('"Се) при мощности дозы 1,5 Гр/мин. Мышей забивали смещением шейных позвонков. Для анализов брали полушария головного мозга и селезёнку. Для исследования индукции делеций митохондриальной ДНК мышей облучали (также все тело) группами по 5 штук в дозах 2 и 5 Гр (1 Гр/мин) на рентгеновской установке РУТ-250-15-1 (200 кВ, 20 мА) с фильтрами 1 мм А1 и 1 мм Си. В качестве контроля использовали необлученных мышей соответствующего возраста. Через различные сроки после облучения мышей забивали. Для анализов брали ткани

головного мозга (полушария), селезенки и ушной раковины. Кровь собирали в пластиковые микропробирки типа Eppendorf.

Выделение ДНК. Общую ДНК из образцов тканей получали стандартным методом с использованием фенола и хлороформа. ДНК из плазмы крови мышей выделяли с помощью магнитных сорбентов с использованием набора реагентов Magnet DNA MegaPrepl (000"Лаборатория Изоген", Россия) в соответствии с рекомендациями производителя.

Праймеры. Синтез праймеров и зондов был заказан у фирмы «Синтол» (Россия). Анализируемые фрагменты ДНК и последовательности праймеров, использованных для их амплификации, указаны в таблице 1.

Таблица 1. Праймеры, использованные в работе

Фрагменты ДНК Размер, п.о. Название праймеров, ссылка 5'-3' последовательность

МтДНК мыши 15983 MSFIFor MSFIRev [Melov et al., 1997]. -tttata ggc tac gtc ctt cca tga gg --ggc agg tag gtc aat gaa tga gtg g-

МтДНК мыши 8080 Fl[Ikushimaetal., 2002] R2 [Takeda et al., 2000] - aacagtaacatcaaaccgaccagg- - tgactgtatggtgtatgtcagat-

МтДНК мыши 6162 Fl [Ikushima et al., 2002] R1 [Евдокимовский и ДР., 20071 - aacagtaacatcaaaccgaccagg- - gatggtttgggagattggttgatgt -

Ген ß-лобина мыши 8739 21582 30345 [Gong et al., 1998]. -ttg aga ctg tga ttg gca atg cct--cct tta atg ccc ate ccg gac t-

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), электрофорез.

Реакционная смесь (одинаковая для всех пар праймеров) для проведения ПЦР объемом 25 мкл содержала: 67 мМ Трис-НС1 рН 8,8; 16 мМ (N114)2804; 0,01% Твин-20; 2,5 мМ Мб2+; 0,2 мМ дНТФ. Использовали 0,5 единиц Тац-полимеразы или 0,5 суммарной единицы смеси Тац-Рй! полимераз в отношении 16:1. Праймеры добавлялись до концентрации 0,2мкМ каждого.

Реакции амплификации проводились на амплификаторе «Терцик» в условиях: денатурация при 94°С в течение 30 с; отжиг и элонгация при 68°С 12 или 8 или 1 минуту, в зависимости от длины фрагмента. Предварительная

денатурация при 94°С - 4 минуты, завершающий синтез 10 минут при 72°С. Количество циклов реакции зависело от задачи, от 27 до 35.

Условия проведения ПЦР варьировались в зависимости от длины фрагмента и температуры отжига праймеров.

Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1 или 2 %-ном агарозном геле с бромистым этидием (0,5 мг/л) и визуализировали на УФ-трансиллюминаторе Firstlight (UVP, Inc., США). Определение интенсивности флуоресценции полос ДНК на гелях и количественная обработка этих данных осуществлялись с помощью гель-документирующей системы, включающей камеру «М1400С» с термостабилизированной ПЗС-матрицей и программное обеспечение Setup М 1400.exe («ДельтаТех», Россия).

Изменение количества копий митохондриальной ДНК оценивалась по соотношению количества продуктов ПЦР фрагмента мтДНК к количеству продукта ПЦР ядерного гена. Количество продуктов ПЦР этих фрагментов оценивали по интегральной интенсивности их флуоресценции (в относительных единицах).

Долю мтДНК с делениями в клетках тканей вычисляли по соотношению суммарной флуоресценции «минорных» полос (продуктов амплификации молекул мтДНК с делециями) и интегральной интенсивности полос полноразмерной мтДНК на дорожке геля, индивидуально для каждого образца.

Для оценки изменения уровня копий внеклеточной мтДНК с делециями в плазме крови облученных мышей применяли полуколичественный анализ. Для этого проводили ПЦР-амплификацию фрагмента, формирующегося в результате делеции, при внесении в реакцию одинаковых объемов образцов ДНК плазмы после их многократных (до 50 раз) последовательных разведений.

Секвенирование ДНК.

• Автоматическое секвенирование проводили с использованием набора реагентов представленных фирмой BigDye® Terminator vl.l Cycle Sequencing kit и прибора ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer, следуя инструкциям

производителя. Пробирки помещали в амплификатор «Progene»; 20 циклов амплификации проводили в режиме 90°С - 30 е., 45° - 30 е., 72°С - 30 с. По окончании реакции в пробирки добавляли по 3 мкл «стоп-раствора».

Статистическая обработка.

Результаты, полученные при анализах числа копий мтДНК, обрабатывались с использованием статистики Стьюдента с вычислением средних величин и средних квадратичных отклонений (М±т). Достоверность различий определяли по i-критерию Стьюдента.

При анализе делеций принадлежность групп полученных данных к нормальному распределению проверяли критерием Шапиро-Уилка (Wn). Однородность групп данных определяли по критериям Смирнова (Ds), Ван дер Вардена (X), Вилкоксона (IV). Для малых выборок (п=3, п=5) значения статистик сравнивались с табличными критическими значениями (Большев, Смирнов, 1983). Выбранный уровень значимости р<0,05. Для количественного анализа и графического представления результатов использовали статистические программные пакеты: Origin 7.0 (OriginLab Corp., http://www.originlab.com), Statistica 6.0 (StatSoft Inc., http://www.statsoft.ru), STADIA 7.0 (НПО «Информатика и компьютеры», МГУ, http://statsoft.msu.ru), SPSS 14.0 (SPSS Inc., http://www.spss.ru). На рисунках, представляющих результы анализа делеций показаны стандартные ошибки (SE) средних значений, рассчитанных по группам из 10 животных на каждую временную точку.

2.2. Результаты и их обсуждение.

2.2.1. Исследование изменения общего количества копий митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках тканей облученных мышей

Как показывают результаты исследований [Murphy et al., 2005; Lee et.al., 2000], в культивируемых клетках в условиях повышенного окислительного стресса наряду с повреждением мтДНК и формированием в ней структурных перестроек, наблюдается индукция биогенеза митохондрий и/или активация репликативного синтеза мтДНК. Активация биогенеза митохондрий и

репликации мтДНК в клетках, при воздействии на них окислительного стресса или других ДНК-повреждающих агентов, рассматривается как результат развития компенсаторной реакции в этих клетках, связанной с возникновением дефицита энергии. Полагают, что в этом процессе могут участвовать продукты большого количества ядерных генов [из обзора Газиев, Шайхаев, 2008]. Поэтому исследование изменения количества копий мтДНК в тканях млекопитающих после их облучения на уровне целого организма представляет значительный интерес.

Для проведения такого исследования нами использовался специальный вариант метода ПЦР - полимеразная цепная реакция протяженных фрагментов (ПЦР-ПФ) с анализом продуктов реакции по флуоресценции. Основой для его использования служит тот факт, что некоторые типы повреждений на ДНК-матрицах (разрывы цепей, аддукты, димеры, сшивки и др.) могут блокировать синтез цепи ДНК, в результате чего наблюдается снижение продукта амплификации анализируемых образцов. Метод также позволяет оценивать изменения относительного количество копий фрагментов ДНК-матриц с одинаковой последовательностью [из обзора Meyer, 2010].

Результаты ПЦР-ПФ анализа оцениваются как количественные только на линейном участке кривой зависимости уровня амплификации от количества ДНК-матрицы вносимой в реакционную смесь. Поэтому предварительно были определены условия (масса общей ДНК и число циклов), необходимые для того, чтобы с достаточной воспроизводимостью получать линейную зависимость выхода продуктов ПЦР от концентрации ДНК-матрицы в реакционной смеси.

Бьио установлено, что при внесении в реакционную смесь для ПЦР от 0,5 до 5,0 нг общей ДНК и 27 циклах реакции можно количественно (в относительных единицах) характеризовать наработку продуктов амплификации мтДНК (15983 п.о., праймеры MSFIFor и MSFIRev) и гена fi-глобина (8739 п.о., праймеры 21582 и 30345) и определить их соотношение. В указанных условиях проведения реакции, при использовании образцов у-

облученной ДНК, уровень регистрируемого продукта ПЦР будет определяться только количеством неповрежденных копий ДНК-матриц, содержащихся в этих препаратах ДНК. По снижению или увеличению продукта ПЦР при введении в реакционную смесь одинакового количества ДНК, можно судить об изменении количества неповрежденных копий амплифицируемых последовательностей ДНК. С другой стороны, если рассматривать фрагмент ядерного гена р-глобина как внутренний нормировочный стандарт при его одновременной (в одной пробирке) амплификации с мтДНК, то увеличение продукта амплификации мтДНК относительно продукта ПЦР фрагмента гена Р-глобина будет свидетельствовать об увеличении числа копий мтДНК.

На рис. 1 представлена электрофореграмма продуктов ПЦР мтДНК и фрагмента р-глобина в составе общей ДНК, изолированной из ткани головного мозга мышей в разные сроки после их облучения в дозе 8 Гр. Видно, что при введении в реакционную смесь для ПЦР образцов общей ДНК из тканей у-облученных животных образуется существенно меньше продуктов амплификации мтДНК по сравнению с продуктами гена р-глобина. Это свидетельствует о более высокой чувствительности мтДНК к действию ИР по сравнению с яДНК в тканях животных. Представленные на рис. 1 данные также показывают, что мтДНК тканей облученных мышей не только содержит больше повреждений, но и репарируется с чрезвычайно низкой скоростью по сравнению с фрагментом Р-глобина. Количество амплифицируемых копий мтДНК остаются на низком уровне в селезенке мышей в течение 90 мин пострадиационного времени. За этот же период, как можно видеть на электрофореграмме продуктов ПЦР, снижается количество повреждений во фрагменте гена р-глобина в составе яДНК из этой же ткани. Аналогичные результаты получены с образцами ДНК из селезенки облученных мышей. Повышенный уровень повреждений в мтДНК, по сравнению с яДНК облученных клеток, возможно, обусловлен сочетанным действием АФК, генерируемых в самых митохондриях и индуцируемых воздействием ИР.

М 1 2 3 4 5

мтДНК р-глобин

Рис. 1. ПЦР-амплификация мтДНК (15983 п.о.) и фрагмента гена (5-глобина (8738 п.о.) в составе общей ДНК, выделенной из тканей головного мозга облученных (8 Гр) мышей. (1) -необлученная, (2) - сразу после облучения, (3) - через 15 мин, (4) -через 30 мин и (5) - через 90 мин после облучения.

При проведении ПЦР с общей ДНК. выделенной из тканей мозга и селезенки мышей сразу после их облучения в дозе 3 Гр, мы не обнаруживаем существенного уменьшения отношения количества продуктов амплификации мтДНК к таковым гена ¡3-глобина (рис.2). Возможно, это обусловлено небольшим количеством первичных повреждений в мтДНК, возникающих при облучении животных в дозе 3 Гр. Тем не менее, в последующие сроки анализов после облучения мышей (через 24-96 часов), мы наблюдаем значительное повышение уровня продуктов амплификации мтДНК, по сравнению с таковым фрагмента ядерного гена (рис.2). Увеличение отношения количества продуктов ПЦР мтДНК к количеству продуктов фрагмента гена (3-глобина, получаемых при их одновременной амплификации в одной и той же пробирке, указывает на увеличение количества копий мтДНК относительно фрагментов гена (З-глобина в составе общей ДНК. Следует отметить, что к указанному времени (24-96 часов) после облучения мышей подавляющее большинство повреждений яДНК репарируются. Поэтому фрагмент гена ¡3-глобина можно рассматривать как стабильный нормировочный внутренний стандарт при его одновременной ПЦР-амплификации вместе с мтДНК в составе общей ДНК, изолированной из тканей контрольных и облученных мышей.

М ! 2 3 4 5 6

М 1 2 3 4 5 6

|М8

—гиг- ШшШ ЩЩЬ ЙШ'д' щит

?йГ

. ■ •

мтДНК (З-глобин

а

Рис. 2. Продукты амплификации мтДНК и фрагмента р-глобина в составе общей ДНК головного мозга (а) и селезенки (б) у- облученных (3 Гр) мышей. (1) - необлученные, (2) -сразу после облучения, (3-6) - через 24,48, 72 и 96 часов после облучения.

Результаты анализов, выполненных с использованием образцов общей ДНК, из тканей групп мышей (по 5 мышей в группе, 3 повтора) суммированы и представлены на рис.3. Полученные данные свидетельствуют об увеличении количества копий мтДНК в постмитотической ткани (головной мозг) и в митотически активной ткани (селезенка) облученных животных (рис. 3). На основании фактического материала этих экспериментов можно заключить, что в пострадиационный период в клетках тканей головного мозга и селезенки мышей, подвергнутых воздействию у-излучения в дозе 3 Гр количество копий мтДНК относительно яДНК возрастает, что, возможно, обусловлено радиационной активацией репликации мтДНК в клетках тканей этих животных.

Радиационная активация репликации мтДНК в клетках тканей этих животных, скорее всего, направлена на компенсацию энергетического дефицита, возникшего в результате радиационного повреждения части копий мтДНК. Можно также предположить, что при низкой эффективности функционирования систем репарации в митохондриях, важнейшим механизмом сохранения митохондриального генома, в условиях его постоянного повреждения эндогенными АФК, и при воздействии ИР, как и других экзогенных генотоксических агентов, является амплификация

неповрежденных или мало поврежденных копий мтДНК.

II

I: .

■ Ж шъ* ИШШШШШШЯЯ

б

3

ш < 2

1

О

К 1 2 3 4 5

Рис. 3. Изменение количества копий мтДНК относительно фрагмента гена р-глобина в тканях мышей, подвергнутых воздействию у-облучения в дозе 3 Гр. Темные столбцы -головной мозг, заштрихованные столбцы - селезенка. По оси абцисс - сроки забоя животных после их облучения. (К) - контроль, (1) - сразу после облучения, (2-5) - через 24, 4В, 72 и часов после облучения. По оси ординат - отношение количеств продукта ПЦР мтДНК (А) и1 фрагмента гена Р-глобина(Б). Количество продуктов ПЦР этих фрагментов определялось по, интегральной интенсивности их флуоресценции.

2.2.2. Определение уровня копийности мтДНК с большими делециями в клетках тканей облученных мышей

Как было показано, в тканях мышей в течение 72-96 часов после их облучения ИР наблюдается активация репликативного синтеза мтДНК. Поскольку в отличие от ядерной ДНК репликативный синтез мтДНК в облученных клетках не блокируется, возможно, что индуцируемый в клетках тканей облученных животных синтез мтДНК сопровождается формированием в ней больших делеций [из обзора Газиев и Шайхаев, 2008]. Поэтому с помощью метода ПЦР-ПФ мы исследовали наличие копий мтДНК с большими делециями в тканях головного мозга и селезенки облученных животных. При проведении электрофореза продукта ПЦР образца мтДНК, содержащего копии с делециями, наряду с «основным» (заданным праймерами фрагментом на полноразмерной матрице мтДНК) регистрируются дополнительные

низкомолекулярные фрагменты. Типичная электрофореграмма продуктов ГЩР-ПФ представлена на рис. 4, на примере образцов мтДНК из клеток селезенки контрольных и облученных мышей. Можно видеть, что при амплификации образцов мтДНК из тканей селезенки контрольных животных (рис. 4а) синтезируется только «основной» фрагмент длиной 8080 п.о. (праймеры Fl и R2). На образцах мтДНК из тканей облученных животных (рис. 46) синтезируются дополнительные низкомолекулярные фрагменты в диапазоне 260 - 880 п.о. (на рисунке 46 указаны как «мтДНК с делениями»). Это свидетельствует о том, что амплифицируются копии мтДНК с множественными делениями размером приблизительно от 7200 до 7820 п.о.

Рис. 4. Электрофореграммы продуктов ПЦР-ПФ образцов мтДНК из клеток селезенки контрольных (а) и облученных (б) мышей. На электрофореграмме (б): дорожки 1-6 через 4 дня после облучения в дозе 5 Гр; дорожки 7-12 - через 8 дней. Маркеры размеров фрагментов ДНК: М1- рВЮ22/В8иЮ, от 587 до 80 п.о.; М2 - X ОКА/ЕсоМ+НЫШ, от 21226 до 564 п.о.

Результаты ПЦР анализов образцов мтДНК мозга и селезенки мышей контрольной и облученных в разных дозах групп представлены на рис. 5. Можно видеть, что после воздействия ИР доля животных с делениями мтДНК в тканях головного мозга и селезенки значительно возрастает. Причем копии с делениями чаще выявляются в спленоцитах. Можно полагать, что такое увеличение является результатом радиационного повреждения мтДНК, так

как в норме у молодых мышей делеции мтДНК встречаются достаточно редко [ТагЛашег, Ьа1р18,1995].

Рис.5. Доля животных с делециями мтДНК в клетках тканей селезенки и головного

мозга.

После облучения в дозе 2 Гр доля животных с делециями мтДНК возрастает как в клетках головного мозга, так и в клетках селезенки на 8 день пострадиационного периода (до 30% и 70%, соответственно). В последующие дни происходит заметное снижение доли таких мышей в группах. На 28 день после облучения в клетках мозга копии мтДНК с делециями уже не регистрируются. После облучения в дозе 5 Гр максимальное количество мышей с делециями в клетках головного мозга наблюдается на 4 день. Доля животных с делециями мтДНК в спленоцитах к этому времени достигает уже 100%. В группе животных, забитых через 8 дней, количество мышей с делециями, как в клетках мозга, так и в клетках селезенки, снижается по сравнению с четвертым днем пострадиационного срока. На 14 и 28 дни после облучения количество мышей с делециями в клетках мозга постепенно возрастает. В отличие от клеток мозга, в спленоцитах на 14 день регистрируется падение этого показателя, но довольно существенно он возрастает еще через две недели пострадиационного периода.

Мозг

Доза облучения —«— Контроль ~®—2 Гр ^А-^Гр_

Селезенка

Дни после облучения

Дни после облучения

Рис. 6. Доля копий мтДНК с делециями относительно общего количества мтДНК в тканях головного мозга и селезенки мышей, облученных в дозах 2 и 5 Гр. На каждую точку приходилось 10 животных.

На рисунке 6 представлены данные, показывающие долю копий мтДНК с делециями в тканях тех же облученных и контрольных животных. Результаты показывают, что больше копий мтДНК с делециями содержится в образцах, выделенных из тканей мышей на 8 день после облучения в дозе 2 Гр и на 4 день после облучения в дозе 5 Гр. В тканях мышей на 14 и 28 день после облучения содержание копий мтДНК с делециями в клетках тканей снижается. Это характерно как для клеток мозга, так и для клеток селезенки. Уменьшение доли копий мтДНК с делециями, определяемое в наших экспериментах в последующие дни пострадиационного периода (14 и 28), можно объяснить их элиминикацией из тканей.

После облучения мышей в дозе 5 Гр максимум копий мтДНК с большими делециями и максимум животных с такими копиями в тканях выявлено на 4 день после облучения. При дозе в 2 Гр максимальные значения этих параметров приходятся на 8 день. Видимо, динамика изменений определяется величиной дозы, поскольку она одинакова как в тканях мозга, так и селезенки

Доза облучения —Контроль —2 Гр —5 Гр__

(очень разных по содержанию мтДНК и митотической активности). Возможно, что после облучения животных в дозе 2 Гр клетки способны более эффективно репарировать поврежденные молекулы мтДНК и/или элиминировать возникшие молекулы мтДНК с делениями. В клетках животных, облученных в дозе 5 Гр, образуется больше повреждений, менее эффективны системы жизнеобеспечения и репарации, что приводит к увеличению количества поврежденных молекул мтДНК. Они и служат матрицами для производства копий мтДНК с делениями.

В наших экспериментах выявлено, что у облученных животных копии мтДНК с делениями чаще встречаются в клетках селезенки, но не в клетках головного мозга. Возможно, это обусловлено тем, что делящиеся клетки селезенки менее защищены от индукции делений (ошибки репликации, в частности) по сравнению с неделящимися клетками головного мозга.

Таким образом, из представленных данных можно сделать вывод, что воздействие ИР в дозах 2 Гр и 5 Гр (при значении 1Л)50ло = 6 Гр для мышей) эффективно индуцирует большие делении в мтДНК клеток тканей облученных мышей. Такие параметры как доля животных с делениями и доля мтДНК с делециями в тканях облученных животных зависят от дозы облучения. Их значения изменяются в раннем пострадиационном периоде.

В настоящей работе мы также исследовали индукцию больших делений мтДНК у одних и тех же животных, облученных в дозах 2 и 5 Гр. Пострадиационные сроки были 4, 8, 14 дней, а также 4 месяца. Для исследования мы выбрали одиночную делецию размером 5823 п.о., ранее описанную в работе [ПавЫта е1 а1., 2002] и использовали минимальное количество материала из тканей ушной раковины мышей. С нашей комбинацией праймеров (П и Ш, длина фрагмента 6162 п.о.) вместо ожидаемого дополнительного фрагмента ПЦР размером 339 п.о., указывающего на присутствие делеции 5823 п.о., мы получили фрагмент размером 248 п.о. (рис. 7а). Секвенирование этого фрагмента показало, что он является следствием делециии мтДНК размером 5914 п.о. По нашим данным,

ранее в литературе она охарактеризована не была. Точки разрывов данной делении расположены рядом с прямыми повторами длиной 10 и.о., один из которых (5') при образовании делении сохраняется, а другой (З1) теряется (рис. 7г). Согласно систематике, предложенной [Mita et al., 1990], данную делению можно отнести к первому классу. Используя ПЦР с укороченным временем элонгации для получения фрагментов, образующихся только на копиях мтДНК с делецией 5914 п.о. (6162-5914= 248 п.о.), мы анализировали образцы мтДНК у каждого животного до облучения и спустя 4, 8, 14 дней и 4 месяца. На рис.7 представлены примеры электрофореграмм (рис. 76 - мышь, облученная в дозе 2 Гр, рис.7в - 5 Гр). Можно видеть, что при облучении животных в дозе 2 Гр копии мтДНК с делециями выявляются на 8 день после облучения и сохраняются в ткани до 14 дня. После облучения в дозе 5 Гр они выявляются уже на 4 день и также сохраняются до 14 дня. Это наблюдается у всех облученных животных. До облучения делеция была выявлена только у 1 из 10 мышей. Ни у одного животного спустя 4 месяца после облучения как в дозе 2 Гр, так и в дозе 5 Гр делецию 5914 п.о. в клетках ткани ушной раковины выявить не удалось. Возможно, копии мтДНК с таким повреждением были элиминированы из ткани в последующие дни пострадиационного периода.

1 2 3 1 2 3 4 5 6

г

//65 I* 1Ш

atgccacaactagatacatcaaCíatgatttatcac---5914 п.о.— tcatacatcaac] Caalctcccaaacc

удаленный (делегированный) участок

Рис. 7. Делеция мтДНК 5914 п.о. (а) Маркеры: 1 - pUC Mix Marker, 2-Х DNA/EcoRI+HindIII (UAB Fermentas, Литва), 3 - наличие дополнительного низкомолекулярного фрагмента размером 248 п.о., наряду с полноразмерным фрагментом длиной 6162 п.о., указывает, что в части копий мтДНК данного образца (животное до облучения) сформировалась делеция 5914 п.о. (6162-248 = 5914); (б) Выявление делеции мтДНК 5914 п.о. в ткани ушной раковины мыши, облученной в дозе 2 Гр; (в) - облученной в дозе 5 Гр: 1 - до облучения, 2 - через 4 дня, 3 - через 8 дней, 4 - через 14 дней и 5 - через 4 месяца после облучения, 6 - ДНК-ладдер (ООО «СибЭнзим-М», Россия), от 1000 до 100 п.о.; (г) Возможная локализация точек разрывов при формировании делеции обозначена заглавным шрифтом; размер делегированного участка 5914 п.о., повторяющиеся последовательности выделены подчеркиванием.

2.2.3. Изучение динамики изменения содержания копий внеклеточных мтДНК с делениями в плазме крови мышей после облучения

Выявленное нами снижение количества копий мтДНК с делециями в тканях облученных мышей в пострадиационный период, возможно, связано с элиминацией этих поврежденных молекул мтДНК в результате митофагии органелл [Skulachev et al.,2004; Mijaljica et al., 2007] или гибели клеток, содержащих их [Wang et al., 2007]. С учетом убедительных результатов работ, свидетельствующих о выходе фрагментов деградированной клеточной ДНК (в том числе и мтДНК) в кровяное русло [Тамкович и др., 2008], логичным представлялось исследовать изменение содержания внеклеточной мтДНК с делециями в плазме крови облученных в дозе 5 Гр мышей в те же пострадиационные сроки, что и при анализе делеций в тканях. В плане постановки экспериментов удобнее регистрировать одиночные делеции, и мы выбрали для анализа изменения копийности делецию размером 5914 п.о. При проведении рутинных экспериментов применяли метод ПЦР с укороченным временем элонгации для получения фрагмента, образующегося только из копий мтДНК с делециями (248 п.о.). Как показано на рис.8а внеклеточные мтДНК с делециями регистрируются в плазме крови как контрольных, так и облученных животных. Их наличие в плазме крови контрольных животных

можно объяснить фоновым уровнем апоптоза в тканях в норме. Облучение мышей привело к возрастанию количества мтДНК с делециями в плазме: если из трех контрольных образцов делегированные мтДНК встречаются в одном (каждый образец содержит смесь ДНК из плазмы 3-4 мышей), то через 4, 8 и 14 дней копии мтДНК с делециями обнаруживаются уже в 2-х образцах из трех. К 28 дню после облучения животных наблюдается возвращение величины показателя к контрольному уровню.

11 12 13 14 15 ;248 п о.

контроль 4 дня 8 дней

14 дней 28 дней

Рис. 8. (а) Определение количества копий мтДНК с делеиией 5914 п.о. в плазме крови контрольных (1-3) и облученных (4-15) в дозе 5 Гр мышей. Дорожки 4-6 - через 4 дня; 7-9 - через 8 дней; 10-12 - через 14 дней и 13-15 - через 28 дней после облучения. М - маркер размеров фрагментов ДНК GeneRuler Low Range DNA Ladder (DAB Fermentes, Литва), от 700 до 25 п.о. (6) Разведение ДНК перед внесением в реакционную смесь для ПЦР: I- без разведения; 2,3,4, 5, 6 - разведение в 2, 5, 10, 25 и 50 раз соответственно.

Для полуколичественной оценки изменения содержания копий делетированной мтДНК в плазме крови как контрольных, так и облученных животных применяли известный методический подход - сравнение наработки продукта ПЦР-амллификации в серии реакций с многократным последовательным (в 2, 5, 10, 25 и 50 раз) разведением вносимой в реакцию

19

общей циркулирующей ДНК из плазмы мышей. В реакционные смеси для ПЦР добавляли одинаковые объемы общей циркулирующей ДНК плазмы. Результаты этих анализов представлены на рис. 86. Видно, что в контрольном образце уже при разведении в 2 раза не амплифицируется анализируемый митохондриальный фрагмент. В то же время, в образце, полученном из плазмы крови через 4 дня после облучения, амплификация митохондриального фрагмента наблюдается при разведении и в 10, и в 50 раз, что указывает на многократное увеличение количества копий фрагментов мтДНК с делецией 5914 п.о. в плазме крови облученных мышей. В образцах общей циркулирующей ДНК из плазмы крови мышей, полученных на 8 и 14 дни после их облучения, продукты ПЦР мтДНК регистрируются при разбавлении вносимой ДНК в 25 раз. Полученные результаты свидетельствуют о повышенном содержании делегированной мтДНК в общей циркулирующей ДНК плазмы крови мышей через 4 дня после облучения и постепенном снижении на 8 и 14 дни. К концу месячного пострадиационного срока доля мтДНК с делениями в составе общей циркулирующей ДНК плазмы облученных мышей снижается до значений, регистрируемых у контрольных животных.

Таким образом, ИР вызывает увеличение делегированных фрагментов мтДНК в плазме крови облученных животных, и это увеличение совпадает по времени с уменьшением количества делегированной мтДНК в тканях.

ВЫВОДЫ:

1. Впервые в исследованиях на уровне целого организма показано, что в клетках головного мозга (постмитотическая ткань) и селезенки (митотически активная ткань) мышей в течение первых дней после облучения наблюдается возрастание количества копий мтДНК. Это возрастание, возможно, обусловлено радиационной активацией репликации мтДНК.

2. Установлено, что облучение мышей в дозах 2 и 5 Гр повышает содержание копий мтДНК с большими делециями в тканях головного мозга и селезенки. Уровень копий мтДНК с делециями в клетках тканей в пострадиационный период зависит от дозы и времени после облучения.

3. Уровень копий мтДНК с делециями в тканях головного мозга и селезенки облученных животных повышен в течение 8 дней и снижается к концу месячного срока. Это снижение позволяет предполагать, что мутантные копии мтДНК элиминируются из тканей.

4. Показано увеличение уровня копий внеклеточной мтДНК с делециями в плазме крови облученных животных, которое может быть связано с гибелью клеток в соматических тканях и с элиминацией деградированных

фрагментов в кровь.

5. В митохондриальном геноме мышей обнаружена новая крупная делеция размером 5914 п.о. Содержание копий мтДНК с данной делецией повышено у облученных мышей.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Антипова В.Н., Малахова JI.B., Ушакова Т.Е., Сирота Н.П., Фоменко J1.A., Безлепкин В.Г., Газиев А.И. Увеличение количества копий мтДНК при низкой эффективности ее репарации в клетках тканей у-облученных мышей // Радиационная биология. Радиоэкология. 2005, Т.45, №4, С.389-396.

2. Малахова JI.B., Антипова В.Н., Гуляева H.A., Безлепкин В.Г. Газиев А.И. Исследование изменения количества копий и формирования делеций митохондриальной ДНК в клетках крови больных раком молочной железы в процессе радиохимиотерапии. // Вопросы онкологии. 2006, Т.52, № 4, С.398-403.

3. Malakhova L.V., Bezlepkin V.G., Antipova V.N., Ushakova Т.Е., Fomenko L.A., Sirota N.P., Gaziev A.I. The increase in mitochondrial DNA copy number in tissues of y-irradiated mice. // Cellular & Molecular Biology Letters. 2005, V.10, No.4, P.721-732.

4. Антипова B.H., Малахова JI.B., Безлепкин В.Г. Выявление делеций мтДНК в тканях мышей, подвергнутых воздействию рентгеновского излучения // Биофизика, 2011, Т.56, Вып.З, С.439-445.

5. Антипова В.Н., Ломаева М.Г. Исследование делеции мтДНК у мышей линии Balb/c, облученных ионизирующей радиацией.// Генетика, 2011, Т. 56, № 3, С.425-427.

6. Антипова В.Н., Безлепкин В.Г., Газиев А.И. Возникновение делеций митохондриальной ДНК в клетках крови пациентов в процессе радио- и химиотерапии опухолей // Тезисы докладов Всероссийской конференции «Радиобиологические основы лучевой терапии». М., Издательство Российского Университета дружбы народов, 2005. С.58.

7. Абдуллаев С.А., Гуляева H.A., Антипова В.Н. Исследование уровня гетероплазмии митохондриальной ДНК в клетках тканей мышей, подвергшихся радиационному воздействию И Тезисы 11-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2007, с.66.

8. Абдуллаев С.А., Гуляева H.A., Антипова В.Н. Гетероплазмия митохондриальной ДНК в клетках тканей мышей, подвергшихся радиационному воздействию. // Материалы 3-й Всероссийской научно-технической Интернет -конференции «Современные проблемы экологии и безопасности». Тульский Государственный Университет. Тула, 2007.

9. Безлепкин В.Г., Захарова М.Л., Кириллова E.H., Ломаева М.Г., Антипова В.Н., Стрелкова И.Ю., Фоменко Л.А., Малахова Л.В., Муксинова К.Н. Генетическая изменчивость соматических клеток потомков родителей, подвергшихся пролонгированному воздействию ионизирующей радиации // Тезисы докладов VI Съезда по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность). Москва 25-28 октября 2010г. М. РУДН, 2010. Том I, С. 54.

Подписано в печать:

16.09.2011

Заказ № 5910 Тираж - 90 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское щ., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Антипова, Валерия Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Особенности митохондриального генома.

1.1. Структура митохондриальной ДНК.

1.2. Восприимчивость мтДНК к повреждению.

1.3. Материнская наследственность.

1.4. Гетероплазмия.

1.5. Митотическая сегрегация.

1.6. Пороговый эффект доли мутантных копий мтДНК.

Глава 2. Компенсаторная репликация'мтДНК.

Глава 3. Факторы регуляции активации репликации мтДНК и биогенеза митохондрий.

Глава 4. Делеции мтДНК.

4.1. Делеции мтДНК - возможная причина митохондриальных заболеваний и старения организма.

4.2. Общие особенности делеций мтДНК.

4.3. Механизм формирования делеций мтДНК.

4.4. Делеции как маркер поврежденности митохондриального генома.

Глава 5. Некоторые методы, применяемые для анализа количества копий и выявления делеций мтДНК.

5.1. Полимеразная цепная реакция.

5.2. Полимеразная цепная реакция протяженных фрагментов.

5.3. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.

5.4. Саузерн-блот.

5.5. Локус-специфическая ПЦР.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Оборудование.

Компьютерные программы.

Маркеры.

Наборы реагентов.

Химические реактивы.

Ферменты.

Лабораторные животные.

Радиационная обработка.

Выделение ДНК.

Определение концентрации ДНК.

Праймеры и условия ГТЦР.

Электрофорез в агарозном геле.

Определение интенсивности флуоресценции.

Очистка фрагментов ДНК.

Секвенирование ДНК.

Статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование изменения общего количества копий мтДНК в клетках тканей селезенки и мозга мышей, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации.

2. Определение уровня копийности мтДНК с большими делециями в клетках тканей мышей в пострадиационный период.

3. Изучение динамики изменения содержания копий внеклеточных мтДНК с делециями в плазме крови мышей в пострадиационный период.

4. Исследование изменения количества копий и формирования делеций мтДНК в клетках крови онкологических пациентов в процессе РХТ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование изменения количества копий и формирования делеций митохондриальной ДНК в клетках тканей мышей после воздействия ионизирующей радиации"

Известно, что воздействие физических и химических факторов окружающей среды на организмы животных и человека в малых и умеренных дозах могут быть причиной изменений в геноме соматических клеток тканей, которые приводят к мутационным и канцерогенным нарушениям. В связи с тем, что в настоящее время широкое использование источников ионизирующих излучений и ядерных технологий в различных областях производственной деятельности человека приводит к облучению в низких дозах существенной доли популяции, людей, изучение молекулярных механизмов формирования последствий действия* ионизирующей радиации (ИР) на организм млекопитающих и создание методов биомониторинга эффектов радиации является одной из актуальных задач радиационной^ биофизики.

Подавляющее большинство исследований радиационно-индуцированных изменений в генетическом материале клетки основаны на анализе изменений параметров ядерной ДНК. Но, благодаря развитию методической базы исследований в области молекулярной биологии и радиационной биофизики, сформировалось общее теоретическое представление, что для процессов пострадиационного восстановления клеточного ядра и других компонентов клетки чрезвычайно значимы процессы, контролируемые митохондриями. Функционирование этих органелл обеспечивает основную часть энергопотребления клеток в виде АТФ. Нуклеотидная последовательность митохондриалыгой ДНК кодирует полипептиды системы «дыхательной цепи» митохондрий.

Некоторые особенности делают митохондриальный геном более чувствительной мишенью не только для активных форм кислорода (АФК), генерируемых в самих митохондриях, но и для внешних повреждающих агентов. Все это способствует формированию в мтДНК нарушений с более высокой частотой, чем в яДНК. Когда количество мутантных молекул мтДНК превышает определенный- порог, это влечет за собой нарушение множества энергозависимых путей клеточного метаболизма. Возникает состояние «митохондриальной дисфункции», с которой связаны активация клеточной гибели и ослабление функций тканей, развитие дегенеративных процессов, «митохондриальных» патологий, включая нейродегенеративные, нейромышечные и ишемические заболевания [из обзора Газиев, Шайхаев, 2008]. Как показывают результаты исследований [Murphy et al., 2005; Lee et.al., 2000], в культивируемых клетках после воздействия окислительных агентов, наряду с повреждением мтДНК наблюдается активация биогенеза митохондрий и увеличение числа копии мтДНК. Возможно, с репликацией копий мтДНК, содержащих повреждения, связано возникновение в митохондриальном геноме делеций разного размера и закрепление в нем точечных мутаций. Формирование больших делеций приводит к утрате некоторых генов и, как следствие, к определенному дефициту белков цепи переноса электронов. Вместе с тем сведения о формировании таких нарушений мтДНК как делеции в клетках тканей человека или животных, подвергшихся радиационному воздействию на уровне целого организма, в литературных источниках ограничены, хотя проблема является чрезвычайно актуальной.

Цель и основные задачи исследования.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось исследование изменения общего количества копий и содержания копий мтДНК с делециями в клетках тканей и плазме крови мышей после воздействия ионизирующей радиации.

Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать изменение общего количества копий митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках митотически активной ткани (селезенки) и постмитотической ткани (головного мозга) мышей, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации.

2. Определить уровень копийности мтДНК с большими делециями в клетках тканей мышей в пострадиационный период.

3. Изучить динамику изменения содержания копий внеклеточных мтДНК с делециями в плазме крови мышей в пострадиационный период.

Обзор литературы.