Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адаптивный ответ в клетках человека с различной способностью репарировать повреждения ДНК

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каминская, Инесса Алексеевна, Москва

,-./ ' * \ чг "1

Ы ' ^ "У Л 7 (< ~ f

Российская Академия Наук

Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова, РАН

Каминская Инесса Алексеевна

Адаптивный ответ в клетках человека с различной способностью репарировать повреждения ДНК.

03.00.15.-генетика

Научный руководитель: профессор, доктор медицинских наук Галина Дмитриевна Засухина

Москва, 1999

Оглавление

Содержание Страницы

Список сокращений 4

Актуальность работы 5-6

Цели и задачи исследования 7

Научная новизна 8

Научно-практическое значение работы 9

Обзор литературы 10-30

Общие понятия об адаптивном ответе 11 -13

Гипотезы о механизмах адаптивного ответа

в клетках человека 14-17

Перекрестный адаптивный ответ в клетках

человека 18-21

Адаптивный ответ в репарационно -дефектных клетках человека 22 - 24

Адаптивный ответ в лимфоцитах людей, проживающих в регионах с повышенным

фоном радиации, в результате аварии на 25 - 30 ЧАЭС

Экспериментальная часть 31-76

Глава 1. Материалы и методы 32-38

2.1. Объекты исследования 32

2.1.1. Культура лимфоцитов периферической крови человека 32

2.1.2. Перевиваемые культуры клеток 32 - 33

2.1.3. Культура куриных фибробластов 33

2.2. Мутагены и их действие 33-34

2.3. Методы исследования 35-38 2.3.1. Определение возникновения одно-

нитевых разрывов ДНК 35

2.3.1.1. Получение клеточных лизатов 3 6

2.3.1.2. Хроматография клеточных лизатов 36-37

2.3.2. Реактивация и индуцированный мутагенез вируса осповакцины

37-38

Глава 2. Адаптивный ответ в репарационно дефектных клетках человека

а) Пигментная ксеродерма

б) Гомоцистинурия Заключение

39-60

40-53 54-58 59-60

Глава 3. Радиоадаптивный ответ (РАО) в лимфоцитах детей, проживающих на территории с повышенным фоном радиации 61-70

а) РАО в лимфоцитах детей, проживающих на загрязненной территории, в зависимости от плотности загрязнения 62 - 64

б) Сравнение РАО у детей с умственной отсталостью, проживающих на контрольных территориях и территориях с повышенным фоном радиации

Заключение

Глава 4. АО при воздействии хлорида кадмия в клетках человека

Сравнение АО при использовании в качестве адаптирующих факторов ^ - радиации и хлорида кадмия

Заключение

Обсуждение результатов

Выводы

Список литературы

65-68

69-70

71-76

71-75 76

77-87 88-89 90 - 100

Список сокращений

АО- адаптивный ответ

АТ- атаксия телеангиэктазия

ГАП- гидроксиапатит

ГЦН- гомоцистинурия

ГР- грэй

ИМГ- Институт медицинской генетики

К3- коэффициент защиты

ММС- метилметансульфонат

мнм- мелилнитрозомочевина

4-НХО- 4-нитрохинолин - 1 - оксид

НГ- Ы-метил-К-нитро-М-нитрозогуанидин

ПК (Хр)- пигментная ксеродерма

РАО- радиоадаптивный ответ

СХО- сестринские хроматидные обмены

ФГА- фитогемагглютинин

ХА- хромосомные аберрации

ЧАЭС- Чернобыльская атомная электростанция

Актуальность работы

Адаптивный ответ (АО)- одна из форм защиты клеток от внешних факторов, в частности, мутагенов. Адаптирующим фактором могут служить малые дозы радиации, некоторых химических мутагенов, тепловой шок, и др. Для проявления феномена адаптации необходим латентный период -не менее 3-х часов. В течение этого времени происходит индукция белков, о чем говорит отсутствие АО при обработке клеток ингибиторами белкового синтеза. Индуцируемые белки обеспечивают повышенную устойчивость клеток к последующему воздействию больших доз мутагенов (радиация, химические мутагены). Адаптивный ответ регистрируется по критериям хромосомных аберраций, СХО, генных мутаций, выживаемости клеток, индукции разрывов ДНК. Однако, несмотря на более чем пятнадцатилетний период изучения АО, механизм его формирования совершенно неясен. Большинство исследователей полагают, что для проявления АО необходимо функционирование репаративной системы. Эта точка зрения основывается на том, что в некоторых радиочувствительных клетках человека, например, в клетках больных синдромом Дауна, РАО отсутствует (Хандогина и др., 1991).

РАО не был выявлен также у людей, проживающих в зонах с повышенным фоном радиации в результате аварии на ЧАЭС (Пелевина и др.,1996). Вместе с тем, показано, что репарация

индуцированных повреждений ДНК в клетках этого контингента людей не отличается от контрольного уровня.

Следовательно, можно предполагать, что эти процессы, осуществляющие защиту клеток от мутагенов, могут быть не связаны.

Неясность механизма, формирующего АО, и имеющиеся противоречивые данные по этому вопросу и послужили предпосылкой к проведению данного экспериментального исследования для решения вопроса о связи или отсутствии таковой между репарацией ДНК и адаптивным ответом.

Цели и задачи исследования

Для определения возможной связи между двумя защитными системами клетки - репарацией ДНК и адаптивным ответом были изучены уровни РАО в репарационно-дефектных клетках человека; в лимфоцитах детей, проживающих в регионах с повышенным фоном ионизирующей радиации; в клетках человека, предобработанных тяжелым металлом, вызывающим нерепарабельные повреждения ДНК.

Таким образом, была исследована способность формировать адаптивный ответ в разных системах, различающихся по характеру репарации ДНК.

В процессе работы решались следующие конкретные задачи:

1. Изучение возможной связи между репарацией ДНК и формированием РАО в репарационно-дефектных клетках человека.

2. Исследование уровней РАО в лимфоцитах детей, проживающих в регионах с повышенным фоном ионизирующей радиаци.

3. Определение возможности индукции адаптивного ответа в клетках человека при воздействии тяжелых металлов, индуцирующих нерепарабельные повреждения ДНК.

Научная новизна

Впервые в экспериментах изучена связь между репарацией ДНК и способностью клеток человека формировать адаптивный ответ. С этой целью исследованы 3 системы, различающиеся по репарации ДНК:

1. Впервые в прямых экспериментах изучена связь между репарацией ДНК и способностью клеток человека формировать адаптивный ответ.

2. Выявлено, что в репарационно - дефектных клетках пигментной ксеродермы и гомоцистинурии не наблюдалась корреляция между формированием АО и способностью к репарации индуцированных повреждений ДНК.

В лимфоцитах детей, проживающих в регионах с повышенным фоном радиации, не отличающихся повышенной радиочувствительностью, обнаружена выраженная гетерогенность по формированию РАО.

Впервые доказано, что хлористый кадмий, индуцирующий нерепарабельные повреждения ДНК, способен формировать АО в клетках человека, предобработанных малыми концентрациями этого мутагена.

3. Впервые получены доказательства независимости двух защитных систем в клетках человека: системы репарации ДНК и способности формировать адаптивный ответ в 3-х модельных системах.

Научно - практическое значение работы

Различия в адаптивном ответе среди детей с наследственными заболеваниями соединительной ткани позволяет проводить диагностику и дифференциальную диагностику между исследуемыми синдромами.

Выявлена гетерогенность по радиоадаптивному ответу (РАО) у детей, проживающих в регионах с повышенным фоном радиации в результате аварии на ЧАЭС.

Опубликовано пособие для врачей «Определение адаптивного ответа в лимфоцитах детей, подвергшихся воздействию малых доз ионизирующей радиации», М., 1998).

Возможно, что РАО может быть отнесен к показателям повышенного риска у детей.

Способность невысоких концентраций хлористого кадмия инициировать адаптивный ответ развивает новый подход к повышению устойчивости клеток человека к мутагенам окружающей среды, в том числе тяжелым металлам.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Общие понятия об адаптивном ответе.

Адаптивный ответ (АО) является одной из форм защиты клеток от воздействия мутагенов.

АО проявляется в том, что предварительное воздействие на клетки малых доз некоторых физических или химических мутагенов, практически не вызывающих повреждений, увеличивает их устойчивость к повторному воздействию этого же, а иногда и другого мутагена в повреждающих дозах после определенного интервала времени. В качестве критериев повреждения клетки обычно используют:

1) формирование хромосомных аберраций (ХА),

2) сестринские хроматидные обмены (СХО),

3) микроядерный тест,

4) выживаемость клеток,

5) количество повреждений в ДНК,

6) генные мутации,

7) разрывы ДНК.

Характерной особенностью адаптивного ответа клеток на воздействие ионизирующей радиации является более чем 100 - кратное различие в величинах адаптирующей и повреждающей доз. Само по себе облучение малой дозой вообще не вызывает каких-либо изменений (ХА, СХО и т.д.), однако, при повторном облучении в высокой дозе регистрируемый эффект оказывается существенно ниже, чем таковой, наблюдаемый при однократном облучении.

Феномен адаптивного ответа был обнаружен Самсоном и Кернсом в 1977 г. на клетках Е. coli. (L. Samson, J. Cairns, 1977). Это явление выражалось в индукции низкими концентрациями

и

алкилирующих соединений (М-метил-М-нитро-Ы-нитрозогуани-дин) устойчивости клеток к последующему воздействию высоких концентраций того же мутагена, что приводило к уменьшению мутаций.

В дальнейшем адаптивный ответ был обнаружен у различных представителей эукариотов: растений, животных, человека. При этом АО описан не только в системе in vitro, но и in vivo (Morales-Kamiuz et al.,1996).

Кроме того, АО формируется при хроническом облучении малыми дозами радиации (Дубинин, 1994, Wolff, 1996, Mitchel, 1996 и др.).

Индукторами адаптивного ответа могут служить не только радиация, химические мутагены, но и инкорпорированный

л

Н -тимидин, перекись водорода (Wolff et al., 1990, Zhang, 1995 и др.). Однако, перекись водорода менее эффективный индуктор устойчивости клеток, по сравнению с низкими дозами х-лучей (Cortes et al., 1994).

Для низших эукариот (дрожжей) адаптация к радиации может быть стимулирована также стрессами, такими как тепловой шок или голодание. Тепловой шок (40°С,15 мин.) как адаптирующий фактор был эффективен также для фибробластов человека, когда наблюдалась стимуляция репарации двойных разрывов ДНК (Mitchel, 1996).

Большинство работ по АО выполнено на лимфоцитах человека. При этом оптимальными условиями для формирования адаптивного ответа считают Gi, S и G2 фазы клеточного цикла (Wolff, 1996 и др.). Однако некоторые авторы сообщили о возможности АО и в фазе G0 (Cortes et. al., 1994). По этому вопросу в литературе имеются противоречивые сведения. Так, еще в 1980 г. Tuschl et al. обнаружили в нестимулированных

лимфоцитах (Go) повышение внепланового синтеза ДНК и пониженный уровень СХО у людей, работающих на реакторе, после УФ-облучения.

Другие авторы (Moquet et al. Д 989) показали отсутствие АО в Go облученных лимфоцитах, когда в качестве повреждающего фактора использовали митомицин С. Эти работы сложно сравнивать, т.к. в первом случае объектом служили лимфоциты облученных людей, тогда как во втором - опыты проводили in vitro. Вместе с тем, по критерию хромосомных аберраций также наблюдали адаптивный ответ в нестимулированных лимфоцитах человека (Cai, Liu, 1990).

Гипотезы о механизмах адаптивного ответа в клетках человека.

Несмотря на то, что АО известен более десяти лет, механизм его остается неясным. По этому вопросу в литературе существуют противоречивые сведения.

Многие исследователи полагают, что для АО необходима репарация ДНК (Wojcik et al.,1996, Shadley & Wolff, 1987, Wolff et al., 1989, Gazievet al., 1992 и др.). Это предположение основывалось на ряде фактов. Так, наблюдался повышенный УФ-индуцированный внеплановый синтез ДНК в адаптированных клетках. Было показано, что 3-аминобензамид - ингибитор поли (АДФ-рибозы)-полимеразы, циклогексимид - ингибитор белкового синтеза-подавляют формирование АО. Кроме того, необходимость, приблизительно, 4-х часовой экспозиции после адаптирующей дозы для развития устойчивости клеток является также доказательством индукции каких-то ферментных систем. Кстати, новые белки при использовании 2-Д гелевого электрофореза были обнаружены в клетках после адаптирующей дозы (Ikushima,1992).

Была определена индукция после низкой дозы Х-лучей двух новых белков 14 кДа и 35 кДа в лимфоцитах человека, которые, возможно, и обеспечивают развитие последующей устойчивости клеток (Wolff, 1996). Однако, следует отметить, что клетки некоторых людей не способны к АО, что демонстрирует генетическую вариабельность людей.

Была также определена повышенная активность ДНК-полимера-зы в клетках мышей, хронически облучаемых низкими дозами лучей.

Однако адаптивный ответ был одинаковым в ооцитах как нормальной, так и репаративно-дефектной дрозофилы (Бгйг-М^Н ег а1.,1991).

Авторы объясняют этот феномен как доказательство индукции репаративных процессов в репаративно-дефектной линии.

Рядом авторов приведены доказательства существования различных субпопуляций клеток (ДД-^ак е1 а1.,1996). В таком случае повышенная репаративная активность объяснялась существованием медленно репарирующихся клеток в субпопуляции клеток после повреждающей дозы и отсутствии ее в субпопуляции клеток, получивших адаптирующую, плюс повреждающую дозу.

Авторы предполагают, что слабо репарирующими клетками были Оо лимфоциты, которые элиминировались из популяции клеток, получивших адаптирующую, плюс повреждающую дозу. Т.е. авторы полагают, что адаптирующая доза приводит к селективной элиминации слабо репарирующих клеток. Этими авторами было исключено предположение об изменениях в клеточном цикле: не было обнаружено различий в адаптированных и не адаптированных лимфоцитах. Эти авторы полагают, что цитогенетический АО не является единственным феноменом. В клетке происходит комплекс феноменов, индуцированных низкими дозами радиации. Д.М.Спитковский (1992) высказал предположение о гетерогенности клеточной популяции по критерию радиочувствительности.

Автор считает, что радиочувствительные клетки погибают при первом адаптирующем облучении малыми дозами ионизирующей радиации, а оставшиеся клетки создают картину повышенной радиоустойчивости.

Г.Д.Засухина (1999) полагает, что в таком случае трудно объяснить перекрестный АО, когда адаптирующим к радиации фактором используют не радиацию, а перекиси, тепловой шок, алкилирующие мутагены. Чувствительность к этим факторам детерминируется разными генами, и отбор, например, не мог бы сопровождаться отбором радиочувствительных клеток. В таком случае РАО должен был бы отсутствовать, но перекрестный АО известен и трудно объясним с этих позиций. Вместе с тем, другие авторы считают, что в механизме адаптивного ответа большую роль играет удлинение клеточного цикла (если адаптирующая доза дается в во фазе). В этом случае увеличивается период времени, необходимый для репаративных процессов (Мйс11е1,1996).

В этой работе интересной представляется также оценка РАО не только по критерию одного из традиционных методов -микроядерному тесту, но и РАО по критерию двойных разрывов ДНК. Кроме того, показано, что РАО распространяется на другие клеточные феномены - в том числе, клеточную трансформацию.

В клетках грызунов СЗН ЮТ/2 после хронического облучения как адаптирующего фактора (ЮсГр) образовывалось вдвое меньше фокусов трансформации при последующем облучении высокой дозой радиации. Эти данные автор считает доказательством безошибочности процесса адаптации.

Другими авторами был изучен после низкой дозы Х-лучей арсенал транскриптов (с- fos, c-mic, циклин 13, тимидинкиназа, плазминогенный активатор, р 53 и др.), уровень которых не изменялся на фоне двухкратного понижения выживаемости клеток (нормальные фибробласты, Нер-2 и др.), тогда как уровень некоторых других транскриптов (циклин А, и др.) был повышен. Повышенная выживаемость снижалась, если после 1-го облучения проводили обработку клеток циклогексимидом или актиномицином Д (Meyers et al.,1996).

Таким образом, в литературе имеются противоречивые сведения о механизмах АО. Одни авторы связывают этот феномен с изменениями клеточного цикла, усилением репарации ДНК, другие - не подтверждают этих данных.

Перекрестный адаптивный ответ в клетках

человека

АО индуцируется в клетках человека малыми дозами X - радиации, "¡f - радиации, обработкой Н2О2 или Н -тимидином (Zhang, 1995; Cortes et al.,1994; Wojewodzka et al., 1994 и др.).

Последующая обработка высокими дозами ионизирующей радиации (через несколько часов после первичного воздействия) формирует в клетках повышенную устойчивость к этому воздействию.

Критериями оценки АО, как правило, служат хромосомные абберации (ХА), сестринские хроматидные обмены (СХО), микроядра, генные мутации, клеточная выживаемость (J.D Wolff et. al., 1990, Vijayalaxmi et. al., 1995, Kleczkowska et. al., 1996 и ДР-)

Однако, оценкой АО может служить также объем разрывов ДНК, формирующихся после воздействия мутагеном. Так, было показано, что объем разрывов ДНК в клетках, обработанных низкими дозами облучения, был ниже, чем в необлученных клетках (Ahnstrom, Edwardsson, 1978).

АО формируется в клетках человека не только по отношению к индуцирующему фактору, т.е. Х- облучение к Х- облучению,

- облучение к "jf-облучению, но и по отношению к некоторым химичес