Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение новой сигнальной функции оксида азота - регуляции экспрессии гена aidB Ada-регулона Escherichia coli

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение новой сигнальной функции оксида азота - регуляции экспрессии гена aidB Ada-регулона Escherichia coli"

На правах рукописи

Стрельцова Дарья Александровна

ИЗУЧЕНИЕ НОВОЙ СИГНАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ОКСИДА АЗОТА -РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА aid В Ada-РЕГУЛОНА Escherichia coli

03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 п zoU

Москва — 2013

005544593

005544593

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Васильева Светлана Васильевна

доктор биологических наук, профессор Ланкин Вадим Зиновьевич,

руководитель лаборатории биохимии

свободнорадикальных процессов Института кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «РКНГЖ» Минздрава РФ

доктор биологических наук, профессор Осипов Анатолий Николаевич,

заведующий кафедрой общей и медицинской биофизики МБФ ГБОУ ВПО Российского национального исследовательского медицинского университета имени Н.И.Пирогова

Ведущая организация:

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится "19" февраля 2014 г. в 12-00 на заседании диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте химической физики им. Н.Н.Семенова Российской академии наук.

Автореферат разослан " января 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 002.039.01

кандидат химических наук

Л.И.Мазалецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Явление химического мутагенеза, связанное с открытием мутагенной активности у химических соединений и совершенное одновременно советским и немецким исследователями И.А. Рапопортом и TII. Ауэрбах, привело к развитию нового направления в исследованиях репарации ДНК с использованием химических мутагенов различной природы (Рапопорт, 1946; Auerbach and Robson, 1946). Значительную группу соединений с высокой мутагенной активностью, составляют алкилирующие агенты, способные интенсивно взаимодействовать со структурами клеточной ДНК, вызывая токсические, мутагенные и тератогенные эффекты. Учитывая указанные характеристики, алкилирующие соединения стали основой создания нового класса клинических лекарственных препаратов, высокоэффективных в химиотерапии злокачественных новообразований. Приоритетные работы по синтезу ряда алкилирующих «супермутагенов» из класса нитрозоалкилмочевин, изучению молекулярных механизмов их активности и разработке методов их применения в клинике, в селекции микроорганизмов и высших растений, а также в экологических исследованиях были инициированы и выполнены в Институте химической физики АН СССР (Рапопорт, 1962; Островская и др., 1964; Эмануэль и др., 1978) и продолжаются в ИБХФ РАН. Эти работы важны и актуальны и в настоящее время.

В Escherichia coli системы защиты ДНК от алкилированных повреждений включают гены ogt и tag, экспрессирующиеся конститутивно, и acia, alkB, alkA и aid В, экспрессия которых, в основном, индуцибельна и связана с развитием в клетке так называемого «адаптивного ответа». Феномен ДНК-репарационного «адаптивного ответа» (АО), был впервые описан в E.coli (Samson and Cairns, 1977), и он выражается в ингибировании цитотоксического и мутагенного эффектов алкилирующих агентов при их воздействии на клетки, предварительно обработанные сублетальными дозами этих же соединений.

Было установлено, что развитие АО в E.coli контролируется белком Ada, который регулирует экспрессию 4-х генов: ada, alkB, alkA и aidB (Ada-регулон) (Sedgwick and Lindahl, 2002). В литературе описаны механизмы регуляции экспрессии генов ada, alkB, alkA, их продукты и функции (Volkert, 1988; Landini and Volkert, 2000; Drablos et al., 2004; O'Brien and Ellenberger, 2004). Однако, очень долгое время оставался нерешенным вопрос о гене aidB, механизм регуляции которого уникален и значительно отличается от механизмов регуляции остальных генов Ada-регулона. В аэробных условиях активация транскрипции aidB контролируется метилированным белком Ada (meAda), однако в стационарной фазе роста и в анаэробных условиях экспрессия aidB позитивно регулируется как meAda, так и РНК-полимеразой os (продукт гена rpoS) (Volkert et al., 1989; Volkert et al., 1994; Taverna and Sedgwick, 1996). Структурный анализ белка AidB выявил его гомологию с белками семейства

ацил-СоА-дегидрогеназ человека (Landini et al., 1994). Были получены доказательства функционирования гена aidB в качестве «гена опасности», который включается в процесс репарации при очень высоком уровне алкилирования ДНК, когда экспрессии остальных генов Ada-регулона недостаточно для сохранения жизнеспособности клеток. Это важно учитывать при работе с известными высокоэффективными в онкотерапии бифункциональными хлорнитрозоалкилмочевинами - ACNU, BCNU (Васильева и Мошковская, 2005).

В 2007 г. в работе (Crack et al., 2007) была опубликована структурная модель белка Fnr- единственного регулятора анаэробного метаболизма E.coli. Установлено, что активная форма этого белка содержит железо-серный кластер [4Fe-4S]2+, обладающий функциями сенсора. При анаэробном метаболизме железо-серные белковые кластеры составляют основную мишень для оксида азота (NO), накопление которого в этих условиях было установлены в работе (Corker and Poole, 2003).

Суммируя вышеизложенное, в лаб. теоретической генетики ИБХФ РАН было выдвинуто предположение о белке Fnr как NO-сенсоре и регуляторе экспрессии гена aidB при анаэробном культивировании, и развернуты исследования для его экспериментального обоснования. В настоящей работе содержится теоретическое и экспериментальное обоснование новой сигнальной функции NO - регуляции экспрессии уникального гена aidB Ada-регулона у факультативного анаэроба E.coli. Развитие этого направления внесет вклад в понимание механизмов сигнальных функций NO и связанных с ними путей метаболизма в условиях анаэробиоза.

Целью работы является получение теоретических и экспериментальных доказательств новой сигнальной функции оксида азота, как регулятора активности гена aidB Ada-регулона E.coli в анаэробных условиях, и выявление молекулярно-генетических механизмов процесса регуляции.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучение кинетики экспрессии гена aidB Ada-регулона E.coli при культивировании в анаэробных условиях и получение молекулярно-генетических и биохимических доказательств регуляции процесса белком Fnr [4Fe^S]2+.

2. Сравнительное изучение кинетики экспрессии гена aidB при обработке клеток различными донорами оксида азота и выявление зависимости процесса от структуры NO-доноров;

3. Изучение интенсивности и формы сигналов ЭПР-спектров клеток E.coli, обработанных различными NO-донорами и корреляции этих параметров с уровнем экспрессии гена aidB. Определение структуры NO-сигнальной молекулы.

4. Изучение роли клеточного железа в трансдукции сигнала оксидом азота.

5. Получение доказательств обратимости процессов распада и сборки [4Fe-4S]2+ кластера белка-регулятора Fnr E.coli при нитрозилировании: идентификация in vivo продуктов распада кластера [4Fe^4S]2', изучение вклада белков IscA и SufA в процесс сборки кластеров. Определение источников серы (S) для процесса сборки [Fe-S] кластеров in vivo и in vitro.

Научная новизна диссертации. Впервые доказана новая научная гипотеза и изучен молекулярно-генетический механизм регуляции экспрессии гена aidB Ada-регулона E.coli. В основе механизма регуляции - обратимая конверсия кластера белка анаэробиоза Fnr [4Fe-4S]2+, который является - NO-мишенью, сенсором и регулятором экспрессии гена E.coli aidB.

Установлена позитивная корреляция между параметрами анизотропного ЭПР спектра с g-фактором 2,03, формирующегося в клетках при обработке NO-донорами, и уровнем ингибирования экспрессии aidB в клетках. Выявлены механизмы и закономерности формирования «широкого» тиосульфатного и «узкого» дисульфидного сигналов ЭПР g=2,03 в клетке, связанных с внутриклеточным формированием сигнальных молекул динитрозильных комплексов железа с тиоловыми либо персульфидными лигандами, соответственно. Впервые in vivo изучен механизм распада [Fe-S] кластеров в белке Fnr[4Fe-4S]2+ E.coli и рассмотрена гипотеза о функции фермента цистеин-десульфуразы IscS в реконструкции [Fe-S] кластеров. Впервые в экспериментах in vivo показано, что в качестве источников серы в процессе реконструкии [Fe-S] белковых кластеров в E.coli используется наряду с органическими источниками и неорганическая сера.

Практическая значимость работы. Представленные в диссертации собственные экспериментальные данные позволяют расширить понимание роли оксида азота в процессах клеточного метаболизма и репарации ДНК. На основе описанных ранее в литературе фактов о 1) структурной и функциональной гомологии белка AidB с СоА-дегидрогеназами животных и человека; 2) аналогии димерных структур и функций у универсальных регуляторов анаэробного метаболизма в клетках E.coli и млекопитающих - белков Fnr[4Fe-4S]2+ и фактора HIF-la; и 3) функции продукта гена aidB в повышении клеточной резистентности к генотоксической активности алкилирующих соединений - полученные нами результаты целесообразно использовать для оптимизации применения препаратов бифункциональных алкилирующих агентов (ACNU, BCNU) в клинике для лечения онкозаболеваний.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Селективное ингибирование NO экспрессии гена aidB Ada-регулона E.coli в анаэробных условиях культивирования клеток.

2. Зависимость экспрессии гена aidB Ada-регулона E.coli в анаэробных условиях культивирования от активной димерной структуры белка-регулятора Fnr[4Fe-4S]2+: избыток/недостаток внутриклеточного Fe2+, как фактор железо-серного кластера [4Fe-

4S]2+, приводил, соответственно, к стимуляции/ингибированию экспрессии гена aidB.

3. Изучение in vivo продуктов распада кластера [4Fe-4S]2+ белка Fnr E.coli при его взаимодействии с NO.

4. Экспериментальное доказательство возможности использования клеткой E.coli, наряду с L-цистеином, других органических соединений (1,4-ДТТ, Ы-ацстил-Ь-цистеин) и неорганического Na2S в качестве источников серы при реконструкции белковых железо-серных кластеров.

5. Изучение механизмов формирования «широкого» тиосульфатного и «узкого» дисульфидного сигналов ЭПР ДНКЖ g=2,03 в клетке, как показателей распада либо реконструкции железо-серных белковых кластеров, соответственно.

6. Экспериментальное подтверждение гипотезы о [Fe-SJ-кластерах железо-серных белков как основном субстрате при внутриклеточном формировании сигнальной молекулы ДНКЖ.

Апробация результатов. Основные положения и результаты проведенных исследований были представлены автором на VIII Международной Молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Россия, г. Москва, 2009, 2013); V- VI- VII- VIII- IX- Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, г. Москва, 2009-2013); Конференции молодых ученых с международным участием «Симбиоз Россия» (Россия, г. Пермь,

2009); Международном симпозиуме «Биология — наука XXI века» (Россия, г. Пущино,

2010); XVII и XX Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Россия, г. Моска, 2010, 2013); VI Съезде по радиационным исследованиям (Россия, г. Москва, 2010); Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Россия, г. Пущино, 2011, 2013); 5th European Young Investigator Conference (Germany/Poland, Frankfurt-Oder/Slubice, 2011); Summer school of the Society for Free Radical Research - Europe (Greece, Spetses, 2012); V International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology «BioMicroWorld» (Spain, Madrid, 2013).

В рамках конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» работа отмечена дипломом 2-ой степени (2009) и присуждением медалей (2009-2012) за лучшую исследовательскую работу; работа отмечена дипломом 1-ой степени за лучшую исследовательскую работу в рамках симпозиума «Симбиоз Россия» (2009), а также грамотой за лучшую исследовательскую работу на конференции «Ломоносов» (2013).

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ 08-04-00228-а, 11 -04-00399-а и Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» 01 -РАН-21.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 24 работы, из них 13 статей в журналах и сборниках научных трудов (в том числе 8 в изданиях, рекомендованных ВАК) и 11 тезисов докладов в сборниках материалов

международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 106 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы, включающего 174 источника. Диссертация иллюстрирована 25 рисунками и 6 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использована коллекция штаммов Грам(-) бактерии, факультативного анаэроба Escherichia coli, имеющаяся в лаб. теоретической генетики ИБХФ РАН:

1. E.coli MV2176 [aidB::lacZ] - для количественного изучения индуцированной экспрессии гена aidB и характеристики транскрипционной активности белка Fnr[4Fe-4S]2+ (Volkert, 1988).

2. E.coli MC4100 wt [soxS::lacZ\\ E.coli MC4100 AiscA; E.coli MC4100 AsufA; E.coli MC4100 AiscA/AsufA [soxS::lacZ\ - для изучения роли активности систем доставки железа для сборки железо-серных кластеров (Tan et al., 2009).

3. E.coli TN530 [soxS::lacZ]; E.coli TN531 soxR [soxS::lacZ\ - для изучения экспрессии .TOx/i.S'-peiyjiOHa в зависимости от активности регулятора SoxR[2Fe-2S] (Nunoshiba et al., 1993).

4. E. coli PQ37 \sfiA::lacZ\ - для изучения SOS-ДНК-репарационной активности доноров NO (Quillardet and Hofnung, 1988).

Преимуществом использования указанных штаммов является наличие в геноме конструкции со слитым опероном [***::lacZ] и возможность количественного изучения экспрессии генов-репортеров. В таком опероне структурный ген ß-галактозидазы - lacZ — находится под контролем промотора изучаемого гена-репортера, а в геноме имеется делеция хромосомного Ьас-оперона. Таким образом, экспрессия гена-репортера регистрируется спектрофотометрически, опосредованно по активности фермента ß-галактозидазы в колориметрическом тесте. Клеточный рост оценивался спектрофотометрически по показателю оптической плотности при /-=600 нм (OD6oo) на цифровом УФ-спекгрофотометре PD-303UV (Apel Co. Ltd, Япония).

Для создания анаэробных условий культивирования E.coli использовали либо систему GasPak с палладиевым катализатором (Becton Dickinson, США), либо инкубацию клеточных суспензий в герметично закрытых пробирках. Экспрессия генов-репортеров

Количественное изучение экспрессии гена aidB в штамме MV2176 [aidB::lacZ] была изучена по (Васильева и др., 1999) с использованием о-нитрофенил-ß-D-галактопиранозида (ОНФГ, Sigma Aldrich, США) - хромогена для ß-галактозидазы.

Состав буфера указан в (Миллер, 1976). Уровень экспрессии гена aidB оценивали по величине активности [5-галактозидазы, которая регистрировалась по показателю оптической плотности при >.=420 нм (OD420) на цифровом УФ-спектрофотометре PD-303UV (Apel Co. Ltd, Япония). Количество единиц фермента рассчитывали в соответствии с (Миллер, 1976) по уравнению E=1000xOD420/t, где t - время инкубации клеточной суспензии с хромогеном (мин). Как правило, OD42o относили к OD6oo для получения удельного показателя генетической экспрессии.

Изучение экспрессии гена aidB в анаэробных условиях. 18-часовую культуру E.coli MV2176 [aidB::lacZ] (OD60o=0,6) разбавляли в 1,5 раза свежей LB-средой (OD600=0,4), в опытные варианты вносили аликвоты исследуемых соединений, в контрольные варианты - растворитель. Образцы помещали в анаэробные/аэробные условия культивирования при 37°С. Оценку экспрессии гена aidB в образцах проводили в соответствии с протоколом.

Изучение зависимости экспрессии гена aidB от структуры железо-серного кластера Fnr[4Fe-4S]'h. Для создания недостатка внутриклеточного железа использовали хелатор Fe2+ 1,10-о-фенантролин (ОФ, 0,1-0,5 мМ) (Sigma Aldrich, США). Для создания избытка свободного железа использован цитрат железа (0,5 мМ), полученный смешением растворов сульфата железа и цитрата натрия [1:5] (Sigma Aldrich, США).

Сравнение экспрессии гена soxS в изогенных штаммах E.coli МС4100 wt и E.coli МС4100 Д iscA/sufA. Ночные культуры E.coli были разбавлены до OD6oo=0,01-0,02 и далее инкубированы при 37 °С в течение 2-3 час до OD6oo=0,1-0,2. В опытные/контрольные образцы добавляли аликвоты исследуемых соединений/растворителя (Tan et al., 2009). Уровень экспрессии гена soxS определяли по величине активности (З-галактозидазы согласно методу (Nunoshiba et al., 1993). Экспрессия гена soxS в штаммах E.coli TN530 и E.coli TN531 изучена по методу (Nunoshiba et al., 1993).

NO-доноры с природными лигандами - S-нитрозоглутатион ("GSNQ1 и динитрозильные комплексы железа (ДНЮЮ с глутатионовыми либо фосфатными лигандами синтезированы по методике проф. Ванина А.Ф. (Vanin et al., 2002). Их получали добавлением раствора 300 мМ NaNOz к 200 мМ восстановленного глутатиона в кислой среде или растворов FeS04 и глутатиона в молярном соотношении [1:2] в сосуде Тунберга в атмосфере NO, соответственно. В работе использовались реактивы фирмы Sigma Aldrich, США.

Кристаллические железо-серо-нитрозильные комплексы с алифатическими

лигандами нистеамином ШисА) и пеницилламином (ПенА) получены в лаб.

структурной химии Института проблем химической физики РАН (Черноголовка)

методом (Rudneva et al., 2009).

ЦисА - [Fe2(S(CH2)2NH3)2(N0)4]S04 • 2.5Н20

ПенА - [Fe2(S(C(CH3)2CH(NH3)C00H))2(N0)4]S04 ■ 5Н20

Цнтотоксическая активность исследованных соединений изучена на клетках E.coli методом серийных разведений с последующим высевом на чашки Петри с полноценной агаризованной средой.

Измерение NO-донируюшей активности NO-доноров ЦисА и ПенА в водных растворах было проведено в совместных исследованиях на базе Института проблем химической физики РАН (ИПХФ РАН, Черноголовка) с использованием сенсорного электрода "amiNO-700" системы "inNO Nitric Oxide Measuring System" (Innovative Instruments, Inc., Tampa, FL, USA). Концентрацию NO фиксировали в течение -200250 секунд (с шагом 0.2 сек.) в 1% водном растворе диметилсульфоксида (ДМСО) с концентрацией донора NO (0,4-10"6 М/л).

Для калибровки электрохимического сенсора использовали стандартный водный раствор NaNOi (0.01 М), который добавляли в смесь из 18 мл 0.12М KJ (Aldrich) и 2 мл IM H2S04 (марки «хч», ГОСТ 4204-77). Все эксперименты проводили в аэробных либо анаэробных условиях при температуре 23°С; pH растворов измеряли с помощью мембранного рН-метра «HI-8314» ("HANNA Instruments", Германия). ЭПР-исследовання проводили на клетках Е. coli, полученных центрифугированием 40 мл клеточной суспензии в течение 10 мин при скорости 4000 об/мин с последующим разведением осадка до 0,5 мл свежей LB-средой и последующим замораживанием полученных клеток в жидком азоте (t = 77 К). Образцы клеток помещали в стеклянные капилляры. Регистрацию ЭПР спектров проводили на модифицированном радиоспектрометре фирмы "Радиопан" при 77 К, амплитуде высокочастотной модуляции магнитного поля 0.2 мТ и мощности СВЧ поля 5 мВт. Относительное содержание парамагнитных центров, ответственных за наблюдаемые сигналы ЭПР, оценивали путем сопоставления результатов двойного интегрирования этих сигналов.

Определение продуктов распада железо-серных кластеров [4Fe-4Sl2* в клеточных образцах проведено по (Sutton et al., 2004) с использованием индикаторов для Fe2+ -5,5'(3-(2-пиридил)-1,2,4-триазин-5,6-диил)-бис-2-фурансульфонат (ферен), для S2- -5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота) (реактив Эллмана, ДТНБ). Равные объемы 18-час. культуры E.coli MV2176 распределяли в соответствующие емкости для аэробной и анаэробной инкубации при 37°С в течение 3 час. В опытные варианты добавляли NO-донор в сублетальной концентрации.

После инкубации проводили центрифугирование в течение 10 мин (4000 об/мин), удаляли супернатант и вносили 0,5 мл свежей LB-среды. К 0,5 мл клеточной суспензии добавили 0,4 мл 1 мМ/2 мМ раствора ферена/ДТНБ и 3,1 мл А-буфера, состав которого содержится в работе (Sutton et al., 2004). Таким образом, общий объем окрашиваемого образца составлял 4 мл с концентрацией индикатора - 100/200 мкМ . Время окрашивания образцов составило 1,5-2 час. при 37°С. Измерения показателей поглощения растворов на спектрофотометре проводили при А.=593 нм (для ферена) и >.=412 нм (для ДТНБ).

Изучение избирательности к источникам серы для сборки кластера [4Fe-4S]K в клетках E.coli MV2176 было проведено с использованием L-цистеина, 10 ммоль/л (Sigma Aldrich, США), N-ацетил-Ь-цистеина, 10 ммоль/л (Sigma Aldrich, США), 1,4-дитиотреитола, 1 ммоль/л (Sigma Aldrich, США) и сульфида натрия Na2S, 10 ммоль/л (Sigma Aldrich, США).

Статистический анализ экспериментальных результатов проведен с помощью пакета программ OriginPro 7.0. Результаты представлены как средние значения с указанием доверительных интервалов (Р=0,95).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Взаимосвязь NO-донирующей и биологической активности изученных доноров оксида азота. В представленной работе были изучены природные доноры NO: низкомолекулярные динитрозильные комплексы железа с тиолсодержащими лигандами (ДНКЖглу) и S-нитрозоглутатион (GSNO) (Vanin et al., 2002), а также впервые синтезированные в лаб. структурной химии ИПХФ РАН (Черноголовка) высокомолекулярные водорастворимые нитрозильные комплексы железа с серосодержащими алифатическими лигандами (ЦисА и ПенА). Ранее в совместных исследованиях ученых ИБХФ РАН и ИХФ РАН с использованием метода количественной оценки экспрессии гена sfiA SOS-регулона по индукции галактозидазы была впервые установлена высокая генетическая активность доноров NO ДНКЖглу и GSNO (рис.1) (Lobysheva et al., 1999). Результаты изучения индукции NO-донорами ЦисА и ПенА ДНК-808-репарационного ответа также свидетельствовали об их выдающейся генетической активности, сопоставимой (для ЦисА) либо превышающей (для ПенА) показатели природных комплексов ДНКЖглу и GSNO, при этом оптимальные концентрации ЦисА и ПенА (80-90% выживших для SOS-хромотеста) оказались на порядок ниже таковых для природных комплексов (рис. 1). Результаты ЭПР- и Масс-спектрометрии растворов комплексов ПенА и ЦисА, а также данные электрохимического анализа NO, подтвердили образование моноядерных динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) и генерацию ими молекул NO (Rudneva et al., 2009). Из данных литературы известно, что биологическая активность S-нитрозоглутатиона опосредована формированием ДНКЖ при наличии клеточного железа (Severina et al., 2003), что подтверждалось ЭПР-спектроскопией растворов GSNO и Fc2", регистрирующей типичные сигналы низкомолекулярных ДНКЖ с g=2,03 (Vanin, 2009). Таким образом, на этом основании было сделано предположение, что генетическая активность использованных в работе NO-доноров определялась их способностью генерировать низкомолекулярные ДНКЖ, которые являются переносчиками оксида азота к биологическим мишеням и обусловливают активность NO в наших экспериментах.

2.8

•а

Rue. I. Цитотоксическая (слева) и .•енотоксическая <справа) активности \0-доноров.

Была проведена количественная опенка NO, генерируемого комплексами оксида аэота в аэробной и анаэробной ереле и при использовании различных растворителей (табл. 1). Методика опыта с использованной системой "inNO Nilric Oxide Measuring Syslem" не предусматривав анализа некристаллических соединений GSNO и ДНКЖглу, в связи с чем данные по локированию NO этими соединениями не приводятся. Наиболее высокие пока июли допирования NO зарегистрированы у ПснА. При растворении в Н.О Пен А генерирует NO несколько выше в анаэробных условиях (в 1,6 раз в сравнении с аэробными условиями), однако растворение NO-комплекса в среде с 1% водным ДМСО приводило к значительному увеличению NO-.зонирующей активности ПенА, селективно в аэробных условиях. Противоположные результаты получены для ЦисА, его NO-донируютая активность максимальна в анаэробных условиях, хотя в целом ЦисА оказался намного более стабильным в сравнении с ПснА (показатели NO-донировання ниже в 10-100 раз). По-видимому, такие высокие показатели допирования NO ПснА обусловливают его выдающуюся ДНК-SOS-индуцирующую активность, а пролонгированное) ь NO-доннрующсй активности НисА выражается в более высоких показателях цитотоксичности (рис. I).

Кинетика экспрессии гена Е.соН aidH в и »ровных и аншробных условии« кул минировании. Ьыло проведено сравнение динамики роста культуры E.coli в зависимости от условий аэрации и выявлено отсутствие различий в количественных показателях роста культуры при инкубации и аэробных анаэробных условиях. При изучении количественных показателей экспрессии гена aidB было обнаружено превышение уровня экспрессии ieiia aidB в анаэробных условиях культивирования в 1.7 раза нал спонтанным уровнем. Уровни экспрессии гена aidB в поздней стационарной фазе роста в 1,5 раза превосходили показатели экспрессии в клетках в логарифмической фазе роста. Подкисление среды до рН=6.0 приводило к увеличению показателя экспрессии ieiia aidB (в 1,5 раза относительно рН=7.0). Таким образом, на

экспериментальной модели — клетках Е.соЧ МУ2176 [а1(1В::1ас2\ - была установлена зависимость экспрессии юна аиШ от условий инкубации.

Тайшиа I. Количество \'0, генерируемого numpoiu.ibnu.uu iMun.it-xru.uu же./ею (0.4-10' MZ.it с течение 250секунд вра иичны.х условиях

МО-донор

Концентрация N0 в присутствии кислорода. нМ Растворитель 1% водный 1% водный

ДМСО

ЦисА ПенЛ

89.4 155705.3

ДМСО+ 0.1 М \1gSO, 25455.3 215904.3

Вода

107.4 22554.4

Концентрация КО при отсутствии кислорода. нМ Растворитель \% водный 1% водный Вода ДМСО ДМСО+ 0.1 м МвЯО,

651,6 16766,9 41.9

34084.5 232002.6 36083.7

Избирательное ишнбнрованне »кспресснн тепа Е.соЧак1Н оксидом иои в анаэробных условиях культивирования. Экспериментально показано, что уровень экспрессии гена аи1В Е.соЧ при анаэробном культивировании значительно снижается при инкубации клеток с МО-донорами (рис. 2, А). Уровень экспрессии при 5-час. анаэробной инкубации клеток составил 75 ед. Миллера (рис. 2, А, /), а в клетках, обработанных ДНКЖглу, - 39 ед. Миллера, что в 1,5 раза превышает спотанную экспрессию в аэробных условиях (рис. 2, А, 2. 4). Напротив, в аэробных условиях инкубации ДНКЖглу не изменял уровни экспрессии аиШ (рис. 2. А.

Аналотнчные результаты были получены при использовании N0-доноров НенА и ЦисА. При обработке клеток этими соединениями наблюдалось избирательное 2-кратное интибирование экспрессии а1с1В в условиях ограниченною доступа кислорода (рис. 2. В. I, 2). Поскольку ранее были получены результаты, свидетельствующие о значительном «ускорении» допирования N0 комплексами при использовании растворителя, содержащего 0.1 М Ч^ЪО^ была изу чена зависимость экспрессия гена ак1В от наличия М££0< в составе растворителя. Добавление в среду инкубации 0.1 М \lgSO. избирательно снижало экспрессию гена а1сШ до уровней, сопоставимых со спонтанным фоном в аэробных условиях (рис. 2, Б, 3). По-видимому, возросшая активность МО-донора связана с увеличением количества МО в среде, содержащей О, I М \1gSO., в 15 раз относительно контроля (1 % ДМСО, табл. I).

Таким образом, результаты сравнительного анализа экспрессии гена аШВ при анаэробной инкубании интактных клеток Е.соЧ и ее селективного ингибировання при обработке N0-донорами свидетельствовали в пользу предположения о регуляторной и сенсорной роли универсального белка-реплятора анаэробиоза Рпг[4Ре-48]:".

Рис. 2. Кинетика жспрессии sena aidtt в клейках E.coti МУЗ176, обработанных .ЧНКЖ'му (Л). чию Пен А (К).

Обработка клеток NO-донорами приводила к селективному 60-70% снижению экспрессии aidfí. а увеличение скорости локирования исследуемых соединений позволяло достигать 100% ингибируммцего (ффекта. Принимая во внимание структурные особенности белка Fnr|4Fe-4S]3* (Melville and Gunsalus, 19%) -транскрипционно-акшвного днмера в анаэробных условиях и неактивного мономера в аэробных, а также модель механизма олиоэлсктроимого окисления кластера этого железо- серного белка (Crack et al.. 200?), было выдвинуто предположение, что избирательное шн ибирование экспрессии гена aidfí в анаэробных условиях связано с атакой оксидом азота активного железо-серного центра белка Fnr|4Fe-4S]r и его последующим разрушением.

Изучение 1ЛВИСНМОС1И ж-спресснн сена aidfí от структуры жс.юо-ссрного кластера Fnr|4Fe-4S|" н E.col¡. Для доказательства гипотезы о том. что железо-зависимый белок Exal i Fnr|4Fc- 4S]2' регулирует экспрессию гена aidfí были проведены эксперименты с созданием избытка (рис. 3, А) либо недостатка (рис.3, Ь) клеточного железа Fe . Избыток железа при моно- и совместной с ПенА обработке клеток не изменял экспрессию гена aidB и даже наоборот, несколько усиливал et' от 0 до 4 час инкубации (рис. 3. А. 5. 4). Обработка клеток хслатором железа о-феиантролином. связывающим свободное ге:\ снижала уровни экспрессии, и этот эффект был дозозанисимым (рис. 3. Б).

Совокупность полученных результатов свидетельствует о стабилизирующей роли железа Fe как компонента жслсзо-ссрного кластера белка I nr^Fe^S)1'. По-видимому, избыток железа способствует стабилизации транскрипционно-активной димерной структуры белка Fnr|4Fc-4S]2', препятствуя его распаду на транскрипционно-инсртиые мономерные структуры Fnr(2Fe-2SJ3', которые не способны связаться с промотором гена aidfí на ДНК и не влияют на его экспрессию.

Рис. 3. Кинетика twnpeccuu sena aidH в тетках E.coU MV2I76: швисичость от доступа Fe*.

И (учение механизма конверсии |4Fe-4S|J' кластера при взаимодействии с

NO. Согласно работе (Crack el al.. 2006). конверсия K.iacrcpa|4Fe-4S): при ею окислении m vitro происходит в две стадии, с высвобождением Fe5*, окисляющегося в дальнейшем до Fe1-, и сульфидных ионов

[4Fe-4S]J* + О- + 2Н — (3Fe-4Sl" + FeJ* ► H-0¡ — (2Fe-2SlJ' + Fe" + 2SJ

Таким образом, реакция между 0< н кластером протекает через окисление металла в составе кластера, и такой ме>анизм одноэлектронной активации кластера обеспечивает сенсорную функцию белка-регулятора Fnr к сигнальным молекулам. Ранее в работах (Justino et al., 2005: Pulían ct al.. 2007) было высказано предположение о том. что наряду с О*', преимущества структуры кластера белка Гпг как мишени в анаэробной регуляции могут быть широко «использованы» также оксидом азота. Для подтверждения гипотезы о нитрознлтровании |4Fe-4S):' кластера бедка Fnr, приводящего к инактивации его регуляторной функции, было проведено исследование по определению продуктов распада, образующихся в результате конверсии кластера. Изучение продуктов распада железо-серного кластера белка Fnr в клетках, обработанных NO-донорами. было выполнено с использованием индикаторных реагентов фереиа и реактива Эллмана для определения содержания Fe;' и S;\ соответственно. При инкубации клеток с NO-донорами в анаэробных условиях количество свободного Fe:\ способного связаться с Fc;'-xc.iaropoM ференом, в 2 раза превосходило этот показатель для аэробных условий. Аналогичные результаты получены в экспериментах с реактивом Эллмана: количество серы, связавшейся с индикатором в анаэробных условиях, 2-кратно превышало этот

показатель в аэробных условиях. С другой стороны, об аккумуляции в клетках ионов Fe3+, источником которых, предположительно, служат железо-серные кластеры, свидетельствовало формирование характерного сигнала в области g= 4,3 ЭПР спектра образцов клеток, обработанных NO-донорами.

Таким образом, полученные нами данные согласуются с моделью, представленной (Crack et al., 2006), и свидетельствуют о распаде [4Fe-4S]2+-iuiacTepa белка Fnr при обработке клеток NO-донором с появлением в качестве продуктов распада Fe27Fe3*" и S2".

ЭПР-исследование механизмов нитрозилировання и реконструкции железо-серного кластера Fnr[4Fe-4S]2+ в E.coli. Используя метод ЭПР-спектроскопии, был проведен анализ величины и формы специфического анизотропного сигнала g=2,03 динитрозильных комплексов железа, формирующихся при взаимодействии белков-мишеней с NO-донорами (рис. 4, а, б). Ингибирование экспрессии гена aidB в анаэробных условиях сопровождалось появлением в клетках сигнала ЭПР g=2,03 (рис. 4, б), отсутствующего в необработанных клетках (рис. 4, е). По своим параметрам - полуширине (4.0 мТ) и значениям фактора g_L = 2.04, g¡| = 2.014 и gcp = 2.03 сигнал полностью совпадал с сигналом ЭПР, характерным для динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) с тиолсодержащими лигандами (формула {(RS-)2Fe+(NO+)2}+). Указанный сигнал g=2.03 обнаруживался только в клетках, но не в супернатанте после центрифугирования клеточной суспензии.

Установлено, что ДНКЖ в клетках могут образовываться на тиоловых группах и железо-серных кластерах, т.к. последние связываются с апо-белком через тиоловые группы (Vanin, 2009). Наиболее вероятным механизмом образования белок -связанных ДНКЖ в клетках E.coli представляется перенос Fe(NO)2-rpynn из экзогенных низкомолекулярных биядерных комплексов ДНКЖ с различными лигандами на тиоловые группы белков. Не исключается и второй вариант, а именно, образование ДНКЖ при участии NO, высвобождающегося из NO-доноров, и эндогенного негемового железа, связывающегося с NO. Далее нитрозилированное железо образует комплекс с тиоловыми группами белков - ДНКЖ. Оба варианта механизма образования белок-связанных ДНКЖ могут реализоваться при контакте NO-доноров с железосерными кластерами в белках, включая транскрипционный регулятор Fnr[4Fe-4S]2+. Это приводит к распаду и конверсии кластеров с димерной структурой и к блокаде экспрессии гена aidB. Принципиально, что в отсутствие низкомолекулярных ДНКЖ молекулы NO сами по себе не способны инициировать распад железосерных кластеров (Васильева и др., 2001; Vanin, 2009).

Сигнал ЭПР с фактором gcp=2.03 был зарегистрирован также и в аэробно культивируемых клетках после их обработки NO-донорами. При этом интенсивность сигнала ЭПР с фактором g=2,03, характеризующая уровень ДНКЖ-комплексов, была в 3 раза ниже, чем в анаэробно культивируемых клетках (рис. 4, а, б), что прямо коррелировало с разницей в показателях свободного Fe2+, способного связаться с Fe2+-

хелатором ференом. Возможно, более низкое содержание белковых ДНКЖ в аэробных условиях объясняется окислением совокупности тиоловых групп, не характерным для анаэробиоза.

Рис. 4. Спектры ЭПР клеток E.coli MV2176 [aidB::lacZ], инкубированных в жидкой среде после соответствующих предобработок и 3-час. инкубации в аэробных (а, д) и анаэробных (б, в, г, е) условиях: а, б - 0,05 мМ ПенА; в — контроль; г, д - 0,05 мМ ПенА + 1 мМ 1,4-ДТТ; е-1 мМ 1,4-ДТТ.

Для ответа на вопрос, имеют ли отношение образующиеся в анаэробных условиях белок-связанные ДНКЖ к процессу инактивации именно железо-серного белка Fnr[4Fe-4S]2+, были проведены эксперименты с использованием 1,4-ДТТ - мощного восстановителя, предотвращающего окисление тиолов до сульфидов и, таким образом, способного поддерживать активную димерную структуру Fnr. Было выдвинуто предположение, что в присутствии 1,4-ДТТ, стабилизирующего активный центр [4Fe-4S]2+, содержание регистрируемых в клетках ДНКЖ существенно снизится. Действительно, добавление к анаэробно культивируемым клеткам 1,4-ДТТ полностью супрессировало экспрессию гена aidB, которая ранее была ингибирована NO-донором, и не оказывало влияния на клетки в аэробных условиях (рис. 5, A, J). Однако, в присутствии 1,4-ДТТ интенсивность сигнала ЭПР комплексов ДНКЖ в аэробно культивируемых клетках не снижалась, а возрастала более, чем в 4 раза (рис. 4, А, д ср. с я), а в анаэробно культивируемых клетках - в 2,3 раза. При этом в присутствии 1,4-ДТТ форма сигнала ЭПР ДНКЖ в клетках существенно отличается от «обычного» широкого сигнала ЭПР, характеризующегося значениями g± = 2.04, gll=2.014 и полушириной 4,0 мТ. Это «узкий» сигнал ДНКЖ с значениями g±= 2.032, glp2.02 и полушириной 1,8 мТ, в котором в качестве серных лигандов выступают персульфиды, а ДНКЖ характеризуется формулой {(RS-S~)2fe'(NO')2} * (Фролов и Ванин, 1973). Превращение тиолов в персульфиды происходит в результате присоединения к ним сульфидов неорганической серы. Появление в биосистеме ионов неорганической серы может быть свидетельством активации L-цистеин-десульфуразы IscS - одного из компонентов синтеза [Fe-S] кластеров системой ISC (Ayala-Castro et al., 2008). Таким образом, в анаэробных условиях добавление 1,4-ДТТ к клеткам, по-видимому, инициирует ресинтез [4Fe-4S]2+ кластеров в Fnr, что

сопровождается восстановлением экспрессии гена aidB до контрольных значений. В аэробных условиях эффект не наблюдался, что отражает присутствие исключительно неактивной апо-формы Fnr. В целом, результаты наших экспериментов свидетельствуют о прямой модификации Fnr[4Fe-4S]2+ кластеров донорами NO с образованием Fnr-связанных ДНКЖ, и этот феномен служит функциональным переключателем в контролируемой NO негативной регуляции экспрессии гена aidB (down-regulation).

ДНКЖ с персульфидными лигандамн и реконструкция [4Fe-4S]2+ кластеров в Fnr E.coli. Источники железа и серы в механизме реконструкции FeS кластеров E.coli in vivo. Было выдвинуто предположение, что наряду с избытком клеточного железа, поддерживающего активную димерную структуру белка Fnr[4Fe-4S]2+, индуцирующего экспрессию aidB, органический источник серы, как субстрат для цистеин-десульфуразы IscS — L-цистеин (Smith et al., 2001) - также должен определить функционально активную структуру белка Fnr и экспрессию гена aidB. Для проверки этого предположения было проведено изучение экспрессии гена aidB и ЭПР-спектроскопические исследования в образцах клеток, обработанных NO-донором и культивируемых с альтернативными источниками серы: L-Cys, N-ацетил-Ь-Cys, 1-4-ДТТ, а также неорганическим Na2S (рис. 5, Б).

1)К[-02]

2) + N0 [-02]

3J + NO +L-Cys [-О2]

4) + NO + N-A-l-Cys[-02]

5) + NO + 1,4-ДТТ [-02]

6) + NO + Na2S [-02]

7) К [+02]

0123456789 Продолжительность инкубации, час

330 335 340

Рис. 5. А. Экспрессия гена Ш11В в клетках Е.соИ МУ2176, обработанных МО-донорам и источниками серы, добавленными к 6 часу инкубации; Б. ЭПР-спектры сигналов ¿,'=2.03, зарегистрированные в этих клетках (Б): 1 - анаэробный контроль; 2 - ПенА; 3 - ПенА 1.-Суь; 4 - ПснА Л'-Л-Ь-Суа; 5 - ПеиЛ 1,4- ДТТ; 6 - ПенА -> Лад 7-аэробный контроль.

При внесении в среду инкубации указанных источников серы в клетках наблюдалось частичное или полное восстановление экспрессии гена aidB (рис. 5, А) и, так же, как в случае с 1,4-ДТТ, усиление сигнала ЭПР - спектра с £ср = 2.03 за счет наложения на него более «узкого» сигнала со значениями g-фaктopa g±= 2.032 и =

2.02, соответствующего ДНКЖ с персульфидными лигандами (рис. 5, Б). Ранее было впервые зарегистрировано появление таких «узких» ЭПР - сигналов в экспериментах in vivo в живых клетках при изучении регуляции оксидом азота ДНК-SOS-репарационного ответа E.coli (Lobysheva et al., 1999). По-видимому, узкая форма сигнала ЭПР - спектра с gcp = 2.03 была вызвана аккумуляцией в обработанных NO клетках ионов неорганической серы S*\ Однако, поскольку данные о зависимости экспрессии SOS-регулона от какого-либо железо-серного белка-регулятора в литературе отсутствуют, эти сигналы и соответствующий им ДНКЖ описаны не были. «Узкие» сигналы были зарегистрированы и при взаимодействии белка Fnr с NO in vitro в работах (Cruz Ramiroz et al., 2002; Crack et al., 2011), однако обоснования их появления также представлено не было.

Итак, восстановление экспрессии гена aidB, супрессированной ПенА либо ЦисА, при внесении альтернативных источников серы сопровождалось появлением ДНКЖ с персульфидными лигандами и, по-видимому, свидетельствовало о накоплении в клетках значительного количества сульфидной серы, необходимой для реконструкции [4Fe-4S]2+ кластера в Fnr. Обратимость конверсии кластера - димера наблюдаемая в клетках при обработке 1,4-ДТТ, могла быть также связана со способностью 1,4-ДТТ восстанавливать дисульфиды до тиолов, в частности, цистина до цистеина.

Однако, неожиданным оказался результат с использованием в качестве экзогенного источника ионов неорганической серы - сульфида натрия Na2S: практически все ДНКЖ с тиол-содержащими лигандами превращались в ДНКЖ с персульфидными лигандами. В этом случае уровень восстановления экспрессии гена aidB - при накоплении в клетках E.coli ДНКЖ с персульфидными лигандами был максимальным. Мы предположили, что появляющаяся в клетках неорганическая сера не только обеспечивала реконструкцию железо-серных кластеров в белке Fnr, но и обеспечивала превращение белок-связанных ДНКЖ в ДНКЖ с персульфидными лигандами. Для подтверждения полученных данных о возможности включения неорганической серы из Na2S в ДНКЖ с персульфидными лигандами были проведены эксперименты in vitro на белке бычьего сывороточного альбумина (БСА) с использованием низкомолекулярных ДНКЖ с фосфатными лигандами (ДНКЖ-Р04). При проведении ЭПР спектроскопии образца, содержащего /ЩКЖ-Р04 и БСА, был зарегистрирован ЭПР-сигнал, характерный для белковых ДНКЖ. Комплекс БСА-ДНКЖ связан с двумя лигандами, которыми служат остатки цистеина (цистеин 34) и гистидина в структуре белка. При добавлении к раствору БСА ДНКЖ-Р04 и Na2S - в качестве потенциального источника неорганической серы - был зарегистрирован узкий сигнал ЭПР, характерный для белковых ДНКЖ с персульфидными лигандами. Этот спектр был идентичен ЭПР-сигналу, описанному ранее. По-видимому, неорганическая сера из Na2S связывается с тиоловой группой цистеинового остатка на альбумине, приводя к появлению R-S-S " лигандов в

нитрозильных комплексах белка.

Таким образом, была доказана возможность формирования нитрозильных комплексов негемового железа, включающих неорганическую серу, как в системе in vivo (железо-серные белки в живых клетках E.coli), так и in vitro (альбумин). Образование нитрозильных комплексов негемового железа, включающих неорганическую серу (с персульфидными лигандами R-S-S-), можно рассматривать как одну из стадий реконструкции Fe-S кластеров.

Для определения роли системы сборки iscRSUA-hscBA-fdx при нитрозилировании [Fe-S] белковых кластеров с их последующей обратимой деструкцией, нами были изучены изогенные штаммы E.coli, полученные из «родительского» E.coli МС4100 с мутациями в генах-паралогах доставки железа на платформу для сборки [Fe-S] кластеров (Tan et al., 2009). Преимуществом изучения этих штаммов является возможность количественной оценки экспрессии soxS гена, регуляция которого связана с нативной структурой регуляторного белка SoxR[2Fe-2S],

Были изучены особенности роста на селективной среде М9 единичных мутантов E.coli с делециями генов iscA или stifA, а также двойного мутанта- паралога iscA/sufA, в сравнении с диким типом. Штаммы с одиночными мутациями стабильно росли на чашках Петри, независимо от условий аэрации, а исследование клеточного роста спектрофотометрически показало лишь незначительное снижение показателя ODóOO мутантных штаммов в сравнении с диким типом, что свидетельствовало о взаимозаменяемости функций генов доставки железа iscA, sufA. С другой стороны, функция этих генов для нормальной жизнедеятельности клеток в аэробных условиях абсолютно необходима: рост двойного мутанта-паралога был снижен в LB-среде и полностью ингибирован на чашках Петри со средой М9 при аэробной инкубации.

При изучении индукции .s'ox/íS-pcry.iona в двух штаммах E.coli МС4100 было обнаружено, что инактивация альтернативных путей сборки Fe-S кластеров в мутантном штамме-паралоге МС4100 iscA/sufA, наряду с ингибированием роста в аэробных условиях, приводила к 2-кратному увеличению спонтанного фона экспрессии soxRS-регулона в сравнении с уровнями экспрессии гена soxS в диком типе (рис. 6, А, Б, контрольные варианты). Установленный механизм индукции soxRS-регулона связан с взаимодействием железо-серного кластера сенсорного белка SoxR[2Fe-2S] с супероксид радикалом 02~ или иным редокс-агентом для активации регуляторной функции SoxR и последующей индукцией ферментов защиты от окислительного стресса, включая супероксиддисмутазу, транскрипционным регулятором SoxS (Greenberg et al., 1990; Hidalgo and Demple, 1994). Инкубация клеток с ингибитором белкового синтеза у прокариот хлорамфениколом значительно снижала уровни экспрессии soxS (рис. 6, А), и эти результаты подтверждают индуцибельный характер экспрессии гена soxS.

ltv«M Kl-м

Рис. Л. Уровни экспрессии fsoxS::lacZ/ в E. coli MC4I00 wt (а) и мутанте-пира.юге МС4Ю0 AiscA/sufA (б) при обработке SO-Аоиорами (Л) ЦисА либо <Ь) GSNO.

Таб. ! и на 2. ЭПР-спсктроскопия обращав меток Ii. coli МС4100 wt и У. coli MC4IC0 AistA/Asu/A. обработанных \()-д<тора.чи GSNO и ЦисА

Вариант Интенсивность сигналов ЭПР-снсктров. усл. ед.

обработки клеток E-coli MC4IOOwt fsoxS.locZ] Ecoli МС4100 AixA/AsufA

[soxSr.tocZ]

g-2.03 g 4.3 g-2.03 g=4,3

Контроль 2 2$ 2 30

GSNO 0,5 mM 30 30 10 30

GSNOSMM 30 30 7 30

HiicAO.OI mM 340 (наложение 30 180 30

«VJKCHV»

сигнала)

2-кратные рапичня в уровнях спонтанного фона экспрессии дох&$-рсгулона в штаммах дикого тиза и мутаитном паралоге. по-видимому, являются свидетельством развития окислительного стресса в мутантном штамме-паралогс в сравнении с дзкнм типом. Возможно, это явление обусловлено реакцией Фенгона. в которой принимает участие Ре:\ не используемое в сборке (Гс-И) кластеров. Роль железа в усилении окислительного стресса в штамме-паралоге доказана также результатами, полученными с использованием различных хелаторов Ь'е5" - ферена и о-фемангролша: хелатирование железа избирательно приводило к снижению уровня окенлатикного стресса - по покашелям спонтанной экспрессии хох8- в штамме-паралоге: в штамме дикого типа это явление не обнаружено. С другой стороны, анализ образцов этих же клеток методом ЭГР-спектроскопин показал, что интенсивность сигналов спектров с фактором £=4.3. характерных для лабильного Ре'*, несколько выше в контрольном

варианте со штаммом-паралогом (табл. 2). По-видимому, дефекты с системе сборки Isc в штамме-паралоге E.coïi МС4100 iscA/su/A приводят к накоплению свободного клеточного железа до уровней, превышающих «нормальные» в штамме дикого типа, и к индукции окислительного стресса, например, по механизму реакции Фентона.

При изучении soxS экспрессии при обработке культур донорами NO GSNO и ЦисА был отмечен дозозависимый эффект индукции [soxS::lacZ] в штамме дикого типа, а в мутантном iscA/sufA при повышенном спонтанном фоне индуктором оказался только ЦисА (рис. 6, А, Б). Обработка клеток GSNO (независимо от концентрации) приводит к формированию ДНКЖ и в штамме дикого типа и в штамме-паралоге, однако количество парамагнитных центров было в 3 раза выше в штамме дикого типа. Это согласуется с предположением, что именно железо-серные кластеры белков являются основными источниками ДНКЖ в клетке (Landry et al., 2011), поскольку в штамме-паралоге количество этих кластеров снижено вследствие дефектов системы сборки (iscA/sufA) и меньшего количества [Fe-S]-кластеров.

Было отмечено, что обработка клеток ЦисА индуцирует 50х5-экспрессию в обоих штаммах, независимо от активности систем сборки Fe-S кластеров (рис. 6, А). При этом в клетке регистрируются очень высокие сигналы ДНКЖ g=2,03 (табл. 2), однако в штамме дикого типа по-прежнему эти уровни выше (в 1,33 раза) и полученный сигнал является «смешанным», т.е. результатом наложения узкого сигнала на типичный «широкий» g=2,03. Мы полагаем, что «узкий» сигнал, как свидетельство процесса реконструкции [2Fe-2S] кластеров в SoxR белке, отражает «нормальную» работу всей системы сборки ISC в штамме дикого типа. Отсутствие этих сигналов в штамме-паралоге и, в целом, более низкое содержание [Fe-S] кластеров (по сравнению с диким типом) может быть фактором повышенной экспрессии гена soxS.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Адаптивный ответ E.coli к алкилирующим агентам (Ada-ответ) есть индуцибельный молекулярно-генетический механизм восстановления нативной структуры алкилированной ДНК. Функции гена aidB E.coli в составе Ada-регулона и его белка AidB остаются до конца не изученными. Усиление экспрессии гена aidB способствует снижению частоты мутаций, индуцированных МННГ и другими алкилирующими агентами, а индукция экспрессии этого гена зависит не только от структуры мутагена, но и от условий культивирования и физиологического состояния клетки (Landini et al., 1994; Bowles et al., 2008). Гомологи всех белковых компонентов Ada-ответа E.coli идентифицированы в клетках млекопитающих и человека (Sedgwick and Lindahl, 2002). В химиотерапии именно активация этих белков способствует развитию резистентности раковых клеток к алкилирующим противоопухолевым препаратам, и на этом основании изучение механизмов регуляции генов Ada-ответа актуально как в научном, так и прикладном аспектах (Горбачева и Кукушкина, 1979).

В проведенной работе впервые суммируются результаты фундаментальных исследований генетических механизмов регуляции экспрессии гена aidB Ada-регулона E.coli в анаэробных условиях культивирования.

На основании приоритетной гипотезы молекулярно-генетического механизма регуляции экспрессии гена E.coli aidB оксидом азота при анаэробном культивировании клеток и её экспериментальном подтверждении был впервые доказан механизм ингибирования экспрессии гена aidB донорами NO. Этот механизм учитывает взаимодействие NO-доноров с железо-серным белком-сенсором Fnr[4Fe-4S]2+, которое приводит к обратимой конверсии железо-серного кластера-димера в мономер Fnr[2Fe-2S] с утратой регуляторной функции этим уникальным белком-регулятором анаэробного метаболизма в клетках E.coli.

Методом ЭПР-спектрометрии были изучены характеристики специфических анизотропных сигналов ДНЮК с фактором g=2,03, формирующихся в клетках E.coli при их обработке NO-донорами. Установлена позитивная корреляция между величиной ЭПР сигнала g=2,03 и уровнем ингибирования экспрессии aidB анаэробным регулятором белком Fnr[4Fe-4S]2+. На основании этих данных сделано заключение о том, что именно ДНКЖ, формирующиеся внутриклеточно при действии NO, являются сигнальными молекулами в процессах регуляции оксидом азота экспрессии гена aidB в анаэробных условиях.

Установлена взаимосвязь между активностью системы ISC реконструкции железо-серных кластеров и интенсивностью сигналов ЭПР-спектров с фактором g=2,03, как показателей уровня внутриклеточных ДНКЖ. В обработанных NO клетках E.coli с дефектами системы ISC интенсивность сигналов ЭПР с фактором g=2,03 была в несколько раз ниже по сравнению с клетками с активной системой ISC и не зависела от концентрации использованных NO-доноров. Эти данные являются экспериментальным подтверждением ранее высказанного предположения о том, что именно железо-серные кластеры белков служат основными источниками железа при формировании сигнальных молекул ДНКЖ в клетке (Landry et al., 2011).

Впервые в экспериментах in vivo в клетках E.coli, обработанных донорами NO, зарегистрировано накопление ионов Fe2+, Fe3+ и свободной неорганической серы в результате разрушения железо-серного кластера [4Fe-4S]2+ селективно в анаэробных условиях культивирования. Таким образом, получены экспериментальные доказательства прямого взаимодействия NO-доноров с белком-регулятором Fnr [4Fe-4S]2+ E.coli.

Впервые in vivo проведено изучение механизмов реконструкции кластера железо-серного белка-регулятора Fnr[4Fe-4S]2+ E.coli с участием системы сборки ISC и сделано заключение об использовании клеткой разнообразных серо-содержащих органических и неорганических соединений (1,4-ДТТ, ^ацетил-Ь-цистеин, Na2S) в качестве источников серы - как компонента железо-серного кластера [4Fe-4S]2+. Эти данные абсолютно приоритетны, поскольку в настоящее время принято считать, что

именно L-цистеин используется клеткой в процессах сборки железо-серных белковых кластеров в качестве единственного источника серы (Dean et al., 1993). Свидетельством включения серы из изученных источников в [Fe-S] кластеры и активации прямо связанной с этим процессом системы реконструкции железо-серных белковых кластеров ISC после их взаимодействия с NO явилось формирование в клетках специфичных «узких» сигналов ЭПР-спектров с фактором g=2,03, характерных для ДНКЖ с персульфидными лигандами.

Итак, в работе впервые установлена новая сигнальная функция оксида азота -регуляция экспрессии гена aidB E.coli, который является составной частью важнейшего ДНК-репарационного процесса - адаптивного ответа в E.coli. Ингибирование этого репарационного процесса - источник генетической нестабильности клеток в условиях гипоксии.

Гипоксия и связанные с нею аккумуляция в клетках NO, генетическая нестабильность и опухолевая прогрессия являются общей отличительной характеристикой солидных опухолей. ПЦР-исследования клеток человека установили экспрессию по крайней мере 84 генов, включенных в сигнальные пути, связанные с гипоксией. Среди них - димерный транскрипционный фактор HIF-la (hypoxia inducible factor), который функционирует как ключевой регулятор клеточного ответа млекопитающих на гипоксию (Wang et al., 1995; Semenza, 2000). Его присутствие наблюдали в различных типах опухолей и имеется ряд свидетельств, что именно HIF-la связан с малигнизацией и резистентностью клеток к препаратам химиотерапии. В 2006 г. С. Монкада признал оксид азота фактором стабилизации HIF-la в гипоксигенированных раковых клетках (Quintero et al., 2006). Важно отметить, что оксид азота избирательно аккумулируется в клетках E.coli при анаэробном культивировании в процессе, который не связан с денитрификацией и зависит от ряда клеточных структур и метаболитов, включая белок анаэробиоза Fnr и флавогемоглобин Нтр.

Универсальная модель генетики - E.coli - является факультативным анаэробом, а ген aidB - «геном опасности», обеспечивающим в условиях анаэробного культивирования резистентность клеток к бифункциональным алкилирующим агентам, в т.ч. известным в онкотерапии хлорнитрозоалкилмочевинам ACNU и BCNU (Spiro et al., 1990). Мы полагаем, что на основе сходства димерных структур и функций универсальных регуляторов анаэробного метаболизма - белков Fnr[4Fe-4S]2+ и фактора HIF-la - эти модели могут быть использованы для поиска новых средств лекарственной онкотерапии и изучения молекулярных механизмов их активности.

выводы

1. Выдвинута гипотеза и изучен механизм генетической регуляции экспрессии гена a id В Аёа-регулона E.coli в условиях анаэробного культивирования (двойная генетическая регуляция).

2. Установлен механизм негативной регуляции (down-регуляция) гена aidB белком анаэробиоза Fnr[4Fe-4S]2+.

3. Изучен молекулярный механизм регуляции экспрессии гена aidB, включающий взаимодействие белка-димера Fnr[4Fe-4S]2+ с NO и его последующий распад до неактивного мономера Fnr[2Fe-2S]2+.

4. Идентифицированы продукты распада кластера [4Fe-4S]2+ in vivo.

5. Установлены новая сигнальная функция NO — регуляция экспрессии гена aidB Ada-регулонэ - и структура сигнальной молекулы NO - ДНКЖ с тиоловыми лигандами.

6. В экспериментах in vivo установлено, что наряду с L-цистеином источниками серы в процессах реконструкции [Fe-S] кластера железо-серного белка Fnr[4Fe-4S]2+ с участием фермента L-цистеин-десульфуразы могут быть другие органические соединения (1,4-ДТТ, М-ацетил-Ь-нистеин) и неорганический Na2S.

7. Экспериментально подтверждено, что именно [Fe-SJ-кластсры железо-серных белков являются основными источниками Fe2+ при внутриклеточном формировании сигнальной молекулы ДНКЖ. Основой заключения стало сопоставление количественных результатов экспрессии гена soxS системы SoxRS[2Fe-2S]2+ E.coli и формы сигналов ЭПР этих клеток («широкого»-тиолового RS" и «узкого»-персульфидного RSS ).

Список работ, опубликованных по материалам диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Васильева, С.В. Сенсибилизация оксидом азота клеток E.coli к УФ -излучению в условиях гипоксии / С.В. Васильева, Е.Ю. Мошковская, Д.А. Стрельцова, Н.В. Андреева, Н.А. Санина, Т.Н. Руднева, С.М. Алдошин // Доклады Академии наук. - 2009. - Т. 425. - № 5. - С. 1-4.

2. Васильева, С.В. Белок Fnr - [4Fe-4S]2+ - регулятор экспрессии гена aidB Escherichia coli при анаэробном культивировании / С.В. Васильева, Д.А. Стрельцова, Е.Ю. Мошковская, Н.А. Санина, С.М. Алдошин // Доклады Академии наук.-2010,- Т. 433. -№3.- С. 1-4.

3. Васильева, С.В. Обратимая NO-катализируемая деструкция железо-серного кластера фактора транскрипции белка Fnr[4Fe-4S]2+ - один из путей регуляции активности гена aidB при анаэробном культивировании Escherichia coli / С.В. Васильева, Д.А. Стрельцова, Е.Ю. Мошковская, А.Ф. Ванин, В.Д. Микоян, Н.А.

Санина, С.М. Алдошин // Доклады Академии наук. - 2010. - Т. 435. -№ 1. - С. 112116.

4. Васильева, С.В. ДНК - репарационный SOS-ответ и генетическая нестабильность клеток в условиях гипоксии / С.В. Васильева, Д.А. Стрельцова // Радиационная биология. Радиоэкология. -2011. -Т. 56. -№ 3. -С. 1-7.

5. Васильева, С.В. Источники неорганической серы в процессе реконструкции кластера белка FNR[4Fe-4S]2+ в клетках E.coli, культивируемых с NO-донорами / С.В. Васильева, Д.А. Стрельцова, А.В. Власкина, В.Д. Микоян, А.Ф. Ванин // Биофизика. - 2012. - Т. 57. - № 2. - С. 247-252.

6. Васильева, С.В. Реконструкция Fe-S кластеров белков в Escherichia coli и формирование биопленок / С.В. Васильева, Д.А. Стрельцова // Доклады Академии наук. - 2013. - Т. 448. - № 4. - С. 1-6.

7. Васильева, С.В. Оксид азота участвует в регуляции сборки Fe-S кластеров белков и формировании биопленок клетками Escherichia coli / С.В. Васильева, Д.А. Стрельцова, И.А. Старостина, Н.А. Санина // Известия Российской Академии наук. Серия биологическая. — 2013. —№ 4. — С. 1-7.

8. Васильева, С.В. Использование достижений фундаментальной науки в разработке методов биологической дозиметрии оксида азота (обзор) / С.В. Васильева, Д.А. Стрельцова // Гигиена и санитария. - 2013. - № 2. - С. 79-83.

Другие издания:

1. Стрельцова, Д.А. Усиление SOS-репарационного ответа E.coli комплексом экологических факторов — NO и УФ- излучения / Д.А. Стрельцова, С.В. Васильева // Вестник новых информационных технологий. -2010. - Т. 2.-С. 135-137.

2. Васильева, С.В. Новые сигнальные функции оксида азота (NO) в адаптивном ответе к алкилирующим соединениям / С.В. Васильева, Д.А. Стрельцова // Сборник статей Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация». М.: ООО «ИД В. Ема», 2011. - Т. 2. - С. 763-768.

3. Vasilieva, S. V. Transcriptional Regulation of the Escherichia coli Adaptive Response aidB Gene- an "Emergency Gene" / S.V. Vasilieva, D.A. Strel'tsova // J. Characterization and Development of Novel Materials. - 2012. - V. 3. -№ 3-4. -pp.273-281.

4. Романова, Ю.М. Влияние нитрозоглутатиона (GSNO) и гаютатиона (GSH) на процессы формирования биопленок энтеробактериями / Ю.М. Романова, Н.В. Алексеева, Т.В. Степанова, И.Г. Тиганова, Э.Р. Толордава, Д.А. Стрельцова, В.Д. Микоян, С.В. Васильева // Медицинский алфавит. Больница — все для ЛПУ. - 2013. -№ 2. - С. 10-15.

5. Васильева, С.В. Изучение механизмов формирования биопленок - одного из суммарных ответов клетки на нитрозативный стресс / С.В. Васильева, Д.А. Стрельцова, И.А. Старостина // Сборник статей Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация». - М.: ООО «ИД В. Ема», 2013. - Т. 2. - С. 753-758.

Подписано в печать. Формат А4 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 150 экз. Заказ № 153 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Стрельцова, Дарья Александровна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

На правах рукописи

042(11455192

Стрельцова Дарья Александровна

ИЗУЧЕНИЕ НОВОЙ СИГНАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ОКСИДА АЗОТА -РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА анШ Ас1а-РЕГУЛОНА Е.соП

03.01.02- Биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, Васильева Светлана Васильевна

Москва-2013

Содержание

Введение...................................................................................................................4

Глава 1. Обзор литературы.....................................................................................11

1.1. Алкилирование в биологии...................................................................11

1.1.1 .Типы алкилирующих агентов.....................................................12

1.1.2. Бифункциональные и монофункиональные агенты................12

1.1.3. SnI Sn2 нуклеофильные замещения........................................13

1.1.4. Мишени и биологические последствия

алкилирования ДНК.............................................................................14

1.2. Защита клетки E.coli от алкилированных

повреждений ДНК. Адаптивный ответ........................................................17

1.3. Сигнальные функции оксида азота

в E.coli и динитрозильные комплексы железа...........................................24

1.4. Основной механизм регуляции анаэробного метаболизма

в E.coli. Белок Fnr[4Fe-4S]2+.......................................................................27

1.4.1. Модели сборки

[4Fe-4S]2+ кластера белка Fnr in vitro................................................30

Глава 2. Материалы и методы исследования.......................................................32

2.1. Бактериальные штаммы и питательные среды...................................32

2.2. Оценка клеточного роста......................................................................34

2.3. Анаэробная инкубация E.coli...............................................................34

2.4. Экспрессия генов-репортеров..............................................................36

2.5. Синтез NO-доноров...............................................................................37

2.6. Измерение NO-донирующей активности NO-доноров.................37

2.7. Определение цитотоксической активности NO-доноров..............38

2.8. Электронный парамагнитный резонанс...........................................38

2.9. Определение продуктов распада железо-серных кластеров

[4Fe-4S]2+ в клеточных образцах...............................................................39

2.10. Изучение избирательности к источникам серы для

сборки кластера [4Fe-4S]2+ в клетках E.coli............................................39

Глава 3. Результаты и обсуждение......................................................................41

3.1. Взаимосвязь NO-донирующей и биологической активности изученных доноров оксида азота...........................................................41

3.2. Кинетика экспрессии гена Е.coli aidB в аэробных и анаэробных условиях культивирования...................................................45

3.3. Избирательное ингибирование экспрессии гена E.coli aidB оксидом азота в анаэробных

условиях культивирования..................................................................48

3.4. Изучение зависимости экспрессии гена aidB от структуры железо-серного кластера

Fnr[4Fe-4S]2+ в E.coli..................................................................................52

3.5. Изучение механизма конверсии [4Fe-4S]2+ кластера

при взаимодействии с N0........................................................................54

3.6. ЭПР-исследование механизмов нитрозилирования и реконструкции железо-серного кластера

Fnr[4Fe-4S]2+ в E.coli.................................................................................56

3.7. ДНКЖ с персульфидными лигандами и реконструкция [4Fe-4S]2+ кластеров в Fnr E.coli. Источники железа и серы в механизме реконструкции Fe-S кластеров E.coli in vivo...........................................61

Глава 4. Заключение............................................................................................75

Выводы.................................................................................................................79

Список сокращений............................................................................................80

Список литературы.............................................................................................83

Введение

Актуальность работы. ДНК-репарационные системы - основные защитные механизмы клеток, сформировавшиеся в ходе эволюции и сохранившиеся общими, либо подобными для разных биосистем. История изучения репарации ДНК берет начало в пионерских работах середины XX века с использованием бактериальной клетки, а в качестве агентов воздействия на клеточную ДНК - факторов физической природы (УФ- и ионизирующее излучение) [1, 2]. Первым изученным механизмом репарации ДНК стал феномен ферментативной фотореактивации — процесс, в котором фермент ДНК-фотолиаза напрямую восстанавливает индуцированные УФ-излучением тиминовые димеры в ходе фотохимической реакции [3]. В середине 1960-ых американскими исследователями была описана независимая от видимого света эксцизионная репарация (контролируемая опероном UvrABC) в клетках Escherichia coli, экспонированных УФ-облучению [4, 5]. Практически одновременно это открытие было повторено на клетках млекопитающих [6]. Исследования, проведенные в последующее десятилетие, позволили сделать вывод о наличии в клетке альтернативных систем эксцизионной репарации нуклеотидов и эксцизионной репарации оснований ДНК [7-10]. Вместе с фундаментальными открытиями расширялось представление о роли адекватной работы ДНК-репарационных систем в поддержании целостности генотипа, а также опухолевой трансформации клеток [11, 12]. К концу 1970-х научное знание о механизмах репарации ДНК основывалось на двух принципах: эксцизия повреждения ДНК либо прямой возврат к незамещенной форме основания. Прогрессом в этой области исследований стало открытие систем пострепликативной репарации ДНК для преодоления повреждений, остающихся в ДНК [13]. Важнейшим вкладом в изучение репарации ДНК стала сформированная М. Радманом гипотеза о

функционировании в бактериальной клетке так называемого SOS-ответа -индуцибельного УФ-излучением мутагенного («error-prone») ДНК-репарационного механизма, предусматривающего возможность репликации поврежденной ДНК [14]. Предположительно, подобный механизм функционирует и в клетках млекопитающих, однако эти исследования требуют дальнейшего развития [15].

Открытие феномена мутагенной активности у химических соединений, совершенное одновременно советским и немецким исследователями И.А. Рапопортом и Ш. Ауэрбах привело к появлению нового направления в исследованиях репарации ДНК с использованием химических мутагенов различной природы — химического мутагенеза [16, 17]. Значительную группу соединений, обладающих высокой мутагенной активностью, составляют алкилирующие агенты, способные интенсивно взаимодействовать с структурами клеточной ДНК, вызывая токсическое, мутагенное, тератогенное и карциногенное действие. С другой стороны, алкилирующие соединения стали основой нового класса клинических лекарственных препаратов, высокоэффективных в химиотерапии злокачественных новообразований. Приоритетные работы по созданию ряда алкилирующих «супермутагенов» из класса нитрозоалкилмочевин и разработке методов их применения в клинике и в селекции микроорганизмов, а также сельскохозяйственных культур были инициированы и выполнены в Институте химической физики АН СССР [18-20]. Поскольку генетическая активность алкилирующих агентов абсолютно зависит от способности клетки репарировать поврежденную ДНК, были развернуты исследования по выявлению механизмов клеточного ответа на алкилирующие повреждения. Эти работы важны и актуальны и в настоящее время.

В E.coli системы защиты от алкилированных повреждений включают гены ogt и tag, экспрессирующиеся конститутивно, и ada, alkB, alkA и aidB, экспрессия которых, в основном, индуцибельна и связана с развитием в клетке так

называемого «адаптивного ответа». Феномен ДНК-репарационного «адаптивного ответа» (АО), был впервые описан в Е. coli [21]. АО выражается в ингибировании цитотоксического и мутагенного эффектов алкилирующих агентов при воздействии на клетки, предварительно обработанные сублетальными концентрациями этих же соединений.

Было установлено, что развитие АО контролируется белком Ada, который регулирует экспрессию 4-х генов Ada-регул она: ada, alkB, alkA и aidB [22]. В литературе описаны механизмы регуляции экспрессии генов ada, alkB, alkA, их продукты и функции [23-26]. Однако, очень долгое время оставался нерешенным вопрос о механизмах регуляции гена aidB, который значительно отличается от остальных механизмов регуляции генов Ada-регулона, и по-своему уникален. В аэробных условиях активация транскрипции aidB контролируется метилированным белком Ada (meAda), однако в стационарной фазе роста и в анаэробных условиях экспрессия aidB позитивно регулируется как meAda, так и РНК-полимеразой os (продукт гена rpoS) [27-29]. Структурный анализ белка AidB выявил его гомологию с белками семейства ацил-СоА-дегидрогеназ человека [30]. Были получены доказательства функционирования гена aidB в качестве «гена опасности», который включается в процесс репарации при очень высоком уровне алкилирования ДНК, когда экспрессия остальных генов Ada-регулона недостаточна для сохранения жизнеспособности клеток. Это важно при работе с известными высокоэффективными в онкотерапии бифункциональными хлорнитрозоалкилмочевинами - ACNU, BCNU [31].

В 2007 г. в работе [32] была опубликована структурная модель белка Fnr -единственного регулятора анаэробного метаболизма E.coli. Установлено, что активная форма этого белка содержит железо-серный кластер [4Fe-4S]2+, обладающий функциями сенсора. При анаэробном метаболизме железо-серные белковые кластеры составляют основную мишень для оксида азота (N0), накопление которого в этих условиях было установлены в работе [33].

Суммируя вышеизложенное, в лаб. теоретической генетики ИБХФ РАН было выдвинуто предположение о белке Бпг как МО-сенсоре и регуляторе экспрессии гена тс1В при анаэробном культивировании, и развернуты исследования для его экспериментального обоснования. В работе содержится теоретическое и экспериментальное обоснование новой сигнальной функции N0 - регуляции экспрессии уникального гена тйВ Ас1а-регулона факультативного анаэроба Е.соИ. Развитие работ этого направления внесет вклад и расширит понимание механизмов сигнальных функций N0 и связанных с ними путей метаболизма в условиях анаэробиоза.

Целью работы является получение теоретических и экспериментальных доказательств новой сигнальной функции оксида азота, как регулятора активности гена шс1В Аёа-регулона Е.соИ в анаэробных условиях, и выявление молекулярно-генетических механизмов процесса регуляции.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучение кинетики экспрессии гена шйВ Аёа-регулона Е.соИ при культивировании в анаэробных условиях и получение молекулярно-генетических и биохимических доказательств регуляции процесса белком ¥пг [4Ре^8]2+.

2. Сравнительное изучение кинетики экспрессии гена тйВ при обработке клеток различными донорами оксида азота и выявление зависимости процесса от структуры N0-доноров;

3. Изучение интенсивности и формы сигналов ЭПР-спектров клеток Е.соИ, обработанных различными ]МО-донорами и корреляции этих параметров с уровнем экспрессии гена агс1В. Определение структуры ЫО-сигнальной молекулы.

4. Изучение роли клеточного железа в трансдукции сигнала оксидом азота.

5. Получение доказательств обратимости процессов распада и сборки [4Бе-4Б]2+ кластера белка-регулятора Бпг Е.соИ при нитрозилировании:

идентификация in vivo продуктов распада кластера [4Fe-4S]2+, изучение вклада белков IscA и SufA в процесс сборки кластеров. Определение источников серы (S) для процесса сборки [Fe-S] кластеров in vivo и in vitro. Научная новизна диссертации. Впервые выдвинута научная гипотеза и изучен молекулярно-генетический механизм регуляции экспрессии гена aidB Ada-регулона E.coli. В основе механизма регуляции - обратимая конверсия кластера белка анаэробиоза Fnr [4Fe-4S]2+, который является - NO-мишенью, сенсором и регулятором экспрессии гена E.coli aidB.

Установлена позитивная корреляция между параметрами анизотропного ЭПР спектра с g-фактором 2,03, формирующегося в клетках при обработке NO-донорами, и уровнем ингибирования экспрессии aidB в клетках. Выявлены механизмы и закономерности формирования «широкого» тиосульфатного и «узкого» дисульфидного сигналов ЭПР g=2,03 в клетке, связанные с внутриклеточным формированием сигнальных молекул динитрозильных комплексов железа с тиоловыми либо персульфидными лигандами, соответственно. Впервые in vivo изучен механизм распада [Fe-S] кластеров в белке Fnr[4Fe-4S]2+ E.coli и рассмотрена гипотеза о функции фермента цистеин-десульфуразы IcsS в реконструкции [Fe-S] кластеров. Впервые в экспериментах in vivo показано, что в качестве источников серы в процессе реконструкии [Fe-S] белковых кластеров в E.coli, наряду с органическими источниками, используется и неорганическая сера.

Практическая значимость работы. Представленные в диссертации собственные экспериментальные данные позволяют расширить понимание роли оксида азота и его доноров в процессах клеточного метаболизма и репарации ДНК. На основе описанных ранее в литературе фактов о 1) структурной и функциональной гомологии белка AidB с СоА-дегидрогеназами животных и человека; 2) аналогии димерных структур и функций у универсальных регуляторов анаэробного метаболизма в клетках E.coli и млекопитающих - белков Fnr[4Fe-4S]2+ и фактора HIF-la; и 3) функции продукта гена aidB в повышении

клеточной резистентности к генотоксической активности алкилирующих соединений (МННГ) - полученные нами результаты целесообразно использовать для оптимизации применения препаратов бифункциональных алкилирующих агентов (ACNU, BCNU) в клинике для лечения онкозаболеваний.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Селективное ингибирование N0 экспрессии гена aidB Ada-регулона E.coli в

анаэробных условиях культивирования клеток.

2. Зависимость экспрессии гена aidB Ada-регулона E.coli в анаэробных условиях культивирования от активной димерной структуры белка-регулятора Fnr[4Fe-4S]2+: избыток/недостаток внутриклеточного Fe2+, как фактор железо-серного кластера [4Fe-4S]2+, приводил, соответственно, к стимуляции/ингибированию экспрессии гена aidB.

3. Изучение in vivo продуктов распада кластера [4Fe-4S]2+ белка Fnr E.coli при его взаимодействии с N0.

4. Экспериментальное доказательство возможности использования клеткой E.coli, наряду с L-цистеином, других органических соединений (1,4-ДТТ, N-ацетил-Ь-цистеин) и неорганического Na2S в качестве источников серы при реконструкции белковых железо-серных кластеров.

5. Изучение механизмов формирования «широкого» тиосульфатного и «узкого» дисульфидного сигналов ЭПР ДНКЖ g=2,03 в клетке, как показателей распада либо реконструкции железо-серных белковых кластеров, соответственно.

6. Экспериментальное подтверждение гипотезы о [Fe-Sj-кластерах железо-серных белков как основном субстрате при внутриклеточном формировании сигнальной молекулы ДНКЖ.

Апробация работы и публикации по теме исследования. Основные положения и результаты проведенных исследований были представлены на VIII Международной Молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Россия, г. Москва, 2009); V- VI- VII- VIII- IX- Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития»

(Россия, г. Москва, 2009-2013); Конференции молодых ученых с международным участием «Симбиоз Россия» (Россия, г. Пермь, 2009); Международном симпозиуме «Биология - наука XXI века» (Россия, г. Пущино, 2010); XVII и XX Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Россия, г. Моска, 2010, 2013); VI Съезде по радиационным исследованиям (Россия, г. Москва, 2010); Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Россия, г. Пущино, 2011, 2013); 5th European Young Investigator Conference on Free Radical Chemistry, Radiation Chemistry, Photochemistry, Radiobiology, and Spectroscopy (Germany/Poland, Frankfurt-Oder/Slubice, 2011); Summer school of the Society for Free Radical Research - Europe (Greece, Spetses, 2012); V International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology «BioMicroWorld» (Spain, Madrid, 2013).

В рамках конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» работа отмечена дипломом 2-ой степени (2009) и присуждением медалей (20092012) за лучшую исследовательскую работу; работа отмечена дипломом 1-ой степени за лучшую исследовательскую работу в рамках симпозиума «Симбиоз Россия» (2009), а также грамотой за лучшую исследовательскую работу на конференции «Ломоносов» (2013).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 24 работы, из них 13 статей в журналах и сборниках научных трудов (в том числе 8 в изданиях, рекомендованных ВАК) и 11 тезисов докладов в сборниках материалов международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы, включающего источников.

Диссертация иллюстрирована 25 рисунками и 6 таблицами. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ 08-04-00228-а, 11-04-00399-а и Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» 01-РАН-21.

Глава 1. Обзор литературы 1.1. Алкилирование в биологии

Алкилирующие агенты широко распространены в окружаю�