Молекулярно-генетические особенности Quorum Sensing систем грамотрицательных бактерий (на модели Serratia) и изучение их роли в регуляции клеточных процессов

Зайцева, Юлия Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические особенности Quorum Sensing систем грамотрицательных бактерий (на модели Serratia) и изучение их роли в регуляции клеточных процессов
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические особенности Quorum Sensing систем грамотрицательных бактерий (на модели Serratia) и изучение их роли в регуляции клеточных процессов"

На правах рукописи

Wjtc^fL.

Зайцева Юлия Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ QUORUM SENSING СИСТЕМ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ "(НА МОДЕЛИ SERRATIA) И ИЗУЧЕНИЕ ИХ РОЛИ В РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ

03.02.07-генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 ЯКЗ 2013

Москва-2012

005047865

Работа выполнена в Лаборатории регуляции экспрессии генов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждении науки Института молекулярной генетики РАН, г. Москва.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Хмель Инесса Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Миронов Александр Сергеевич,

профессор ФГУП Государственный научно-

исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, заведующий лабораторией.

доктор биологических наук, Прозоров Александр Александрович,

профессор Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, главный научный сотрудник.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится "/ ""(JUCipfilCL 2013г. в 12:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.214.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул. Губкина, дом 3. Факс: (499) 132-89-62, e-mail: asnirantura@vigg.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Автореферат разослан декабря 2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Синелыцикова Татьяна Аркадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследования.

В последние 10-15 лет внимание многочисленных исследователей, работающих с микроорганизмами в различных областях биологии и медицины, как в фундаментальных, так и в прикладных направлениях, было обращено на феномен, получивший название Quorum Sensing.

Quorum Sensing (QS) - это особый тип регуляции экспрессии генов бактерий, зависящей от плотности их популяции. QS системы включают низкомолекулярные сигнальные молекулы (аутоиндукторы), легко диффундирующие из клеток в среду и обратно, и рецепторные регуляторные белки, с которыми взаимодействуют сигнальные молекулы. По мере того, как популяция бактерий увеличивается и достигает критического уровня, аутоиндукторы накапливаются до необходимого порогового значения и связываются с соответствующими рецепторными белками, что приводит к резкой активации (иногда - репрессии) транскрипции определенных наборов генов. С помощью сигнальных молекул QS систем происходит межклеточная коммуникация бактерий в популяциях, обеспечивающая скоординированный ответ бактерий на изменение условий среды.

Изучение биологической значимости регуляторных систем типа QS показало, что эти системы играют ключевую роль в регуляции большого количества процессов бактериальной клетки. Они участвуют во взаимодействии многих бактерий с высшими организмами, животными и растениями, в регуляции вирулентности бактерий, формировании биопленок, регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом различных экзоферментов, токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов, конъюгации, опухолеобразовании у растений, вызванном агробактериями, споруляции у бактерий и др. Использование в последние годы методов транскриптомного и протеомного анализа показало, что QS системы функционируют как глобальные факторы регуляции, т.е. они участвуют в контроле большого количества клеточных процессов, относящихся к различным сторонам метаболизма бактерий.

Исследование QS систем регуляции, их роли в метаболизме и взаимодействии бактерий определяет совершенно новый подход к изучению поведения бактерий в природных условиях; эти исследования могут иметь огромное прикладное значение.

перспективная стратегия антимикробной терапии. В большом количестве лабораторий проводится поиск и изучение веществ, подавляющих QS.

Таким образом, изучение QS регуляции относится к числу актуальных направлений современной молекулярной биологии, генетики и микробиологии, чрезвычайно важных в фундаментальном и прикладном отношении.

Цель работы и задачи исследования.

Данная работа посвящена детальному изучению QS систем грамотрицательных бактерий на примере бактерий рода Serratia - исследованию общих принципов организации и экспрессии генов QS систем этих бактерий, природы сигнальных молекул этих систем, роли QS систем в регуляции ряда метаболических процессов, существенных для жизнедеятельности бактерий.

В соответствии с этим в работе были поставлены следующие задачи.

1. Исследовать гены QS систем и сигнальные молекулы, участвующие в их функционировании, у бактерий рода Serratia.

2. Выяснить принципы организации и особенности регуляции экспрессии генов QS систем Serratia.

3. Определить роль этих систем в регуляции различных клеточных процессов.

4. Исследовать действие антибактериальных веществ, производных нитрофурана, доноров NO и растительных веществ фенольной природы на образование биопленок и QS регуляцию.

Научная новизна и практическая значимость.

Результаты, полученные в работе Зайцевой Ю.В., содержат новую информацию о QS системах грамотрицательных бактерий - о генах, участвующих в функционировании QS систем, регуляции их экспрессии и роли в контроле клеточных процессов.

У исследуемого штамма Serratia proteamaculans 94 идентифицированы QS системы двух типов, использующие в качестве аутоиндукторов N-ацилгомосеринлактоны (АГЛ) и АИ-2. Впервые у бактерий рода Serratia был проведен точный количественный масспектрометрический анализ АГЛ.

В ходе работы были идентифицированы, клонированы и секвенированы гены двух типов QS систем S. proteamaculans-. ген синтазы АГЛ sprl, ген регуляторного рецепторного белка sprR и ген luxS, кодирующий синтазу АИ-2 — сигнальную молекулу QS систем второго типа; получены мутации, инактивирующие эти гены. Было показано, что указанные гены QS систем первого типа кластеризованы, они

транскрибируются конвергентно и перекрываются в терминальных областях.

С помощью Нозерн-гибридизации впервые изучена транскрипция генов системы I типа в штамме ргогеатаси1ат дикого типа и инсерционных мутантах с нокаутированными генами зрг! и зргК. Установлены тонкие механизмы регуляции транскрипции генов С>Я системы. Предложена модель экспрессии генов системы первого типа & рпЯеатасикта. Согласно этой модели, белок йргЯ связывается с ДНК в зрг-боксе и репрессирует собственную транскрипцию; связывание его с АГЛ приводит к дерепрессии транскрипции; белок ЭргК не обязателен для синтеза АГЛ.

Проведен сравнительный протеомный анализ клеток исходного штамма и мутантов. Показано, что экспрессия более 30 белков находится под влиянием БргЖ (^-системы. Эти данные свидетельствуют о глобальной роли системы в регуляции клеточных процессов. Впервые проведена идентификация белков 5". рго1еатаси1аю, у которых наблюдаются отличия в уровне экспрессии в штамме дикого типа и мутантах. Предполагаемые функции этих белков рассмотрены в свете их клеточных функций и участия в метаболических путях.

Получены данные о роли <33 систем двух типов в регуляции клеточных процессов, относящихся к различным сторонам метаболизма 51. рШеатаси1апз (синтез внеклеточных протеаз, хитиназ, липаз, гемолизинов, жирных кислот, летучих органических соединений, образование биопленок и др.).

В ходе работы было исследовано действие различных лекарственных веществ и соединений растительного происхождения на <38 и зависящий от этого типа регуляции процесс формирования биопленок. Впервые было показано, что производные нитрофурана, доноры оксида азота и фенольные соединения растительного происхождения в субингибиторных концентрациях увеличивают образование биопленок у бактерий.

Результаты работы могут найти применение в последующих фундаментальных исследованиях молекулярных механизмов коммуникации бактерий.

Полученные в работе данные могут быть использованы в дальнейшем в прикладных целях, в частности, для разработки новых подходов для борьбы с бактериальными инфекциями в медицине и сельском хозяйстве, а также в биотехнологии для получения важных для человека штаммов бактерий на основе конструкций, использующих новые принципы регуляции. Установленные закономерности влияния препаратов нитрофурановой и фенольной природы могут представлять интерес для медицинской практики при разработке рациональной антибактериальной терапии.

Апробация работы и публикации.

Результаты работы неоднократно представлены на крупных российских и международных научных конференциях и симпозиумах. В частности, материалы диссертационной работы были представлены автором на IV Международной конференции «БиоМикроМир 2011» (Торремолинос, Испания, 2011), на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), Всероссийской конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, Россия, 2009), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, Россия, 2006). Диссертационная работа была апробирована на заседании ученого совета Института молекулярной генетики РАН 22 июня 2012г.

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рецензируемых ВАК и 11 работ в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов.

Декларация личного участия автора.

Основная экспериментальная часть работы (идентификация и клонирование генов QS систем двух типов у штамма S. proteamaculans 94, получение инсерционных мутантов, анализ транскрипции этих генов, эксперименты по изучению роли QS систем в регуляции различных клеточных процессов бактерий), а также анализ и обработка результатов выполнены автором самостоятельно. Масс-спектрометрический анализ проводился совместно с сотрудниками Иерусалимского университета (Израиль), протеомные исследования проводились совместно с сотрудниками ИБМХ РАН (Москва).

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, содержит 47 рисунков и 18 таблиц. Библиография включает 288 названий, в том числе 7 русских и 281 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

В качестве основного, модельного объекта был выбран штамм S. proteamaculans 94, выделенный из испорченного в холодильной камере мясокомбината мяса. Штамм способен гидролизовать коллаген при низкой температуре, является продуцентом нескольких внеклеточных протеиназ. В рамках данной работы было уточнено таксономическое положение этого штамма с помощью секвенирования генов 16S рРНК.

1. QS система типа LuxI-LuxR у Serratia proteamaculans 94.

На первом этапе работы было проведено определение способности бактерий S. proteamaculans синтезировать сигнальные молекулы QS систем первого типа -N-ацил-гомосеринлактоны (АГЛ). При анализе с помощью различных биосенсоров и тонкослойной хроматографии (ТСХ) было обнаружено, что исследуемый штамм проявляет способность активно продуцировать несколько видов АГЛ. Однако, полученные результаты давали лишь предварительные сведения о видах АГЛ, синтезируемых S. proteamaculans 94.

Наиболее точным методом определения N-ацил-гомосеринлактонов в настоящее время считается метод масс-спектрометрического анализа. Впервые у бактерий рода Serratia был проведен точный количественный масс-спектрометрический анализ АГЛ (таблица 1).

Таблица 1

Анализ АГЛ методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии

АГЛ нг/мл

N-бутаноил-гомосеринлактон, (С4-ГЛ) 12.5

N-гексаноил-гомосеринлактон, (С6-ГЛ) 41

ЩЗ-оксо-гексаношО-гомосеринлактон, (3-оксо-С6-ГЛ) 2664*

Н-(3-гидрокси-гексаноил)-гомосеринлакгон, (3-гидрокси-С6-П1) 1938*

М-(3-гидрокси-октаноил)-гомосеринлактон, (3-гидрокси-С8-ГЛ) -

N-октаноил-гомосеринлактон, (С8-ГЛ) 25.5

ІЧ-(3-оксо-деканоші)-гомосеринлактон, (З-оксо-СЮ-ГЛ) 2

М-(3-оксо-додеканоил)-гомоссршілактон, (3-оксо-С12-ГЛ) -

N-додеканоил-гомосеринлактон, (С12-ГЛ) 2

N-(3 -оксо-октаноил)-гомосеринлактои, (3 -оксо-С8-ГЛ) следы

Примечание. * - концентрация слишком высока для точного определения.

Проведенный анализ АГЛ показал, что клетки S. proteamaculans 94 синтезируют и выделяют в культуральную жидкость в наибольшем количестве 3-оксо-С6-ГЛ и 3-гидрокси-С6-ГЛ. В существенно меньшем количестве клетки продуцируют С6-ГЛ, С8-ГЛ и С4-ГЛ. В культуре также обнаруживаются следовые количества З-оксо-СЮ-ГЛ, С12-ГЛ и 3-оксо-С8-ГЛ, которые, возможно, являются производными АГЛ, синтезируемых в больших количествах. Таким образом, исследуемая нами бактерия S. proteamaculans продуцировала несколько видов АГЛ, сигнальных молекул QS систем первого типа.

Гены QS системы первого типа были идентифицированы, клонированы и секвенированы: sprl, кодирующий синтазу АГЛ, и ген sprR, кодирующий рецепторный белок, с которым в других QS системах связываются сигнальные молекулы АГЛ. Проведенное сравнение генов QS первого типа S. proteamaculans 94 с функционально близкими соответствующими генами других бактерий показало высокий уровень гомологии нуклеотидных последовательностей генов QS систем этого типа у бактерий рода Serratia, Erwinia, Pantoea, Hafnia.

При анализе нуклеотидной последовательности генов QS системы первого типа S. proteamaculans 94 была определена организация этих генов (рис.1). Было показано, что sprl и sprR гены кластеризованы, они транскрибируются конвергентно и перекрываются в терминальных областях. Такое расположение генов QS системы обнаружено у других членов семейства Enterobacteriaceae, включая другие виды Serratia, Erwinia, Pantoea (Beck von Bodman, 1995) , что отличается от классической модели QS Vibriofischeri.

sprR ^

1354

Рис. 1. Организация sprl и sprR генов у S. proteamaculans 94.

Стрелками обозначено направление транскрипции генов.

Длина фрагмента ДНК, который содержит гены sprl и sprR, составляет 1354 п.н.

Область перекрывания - 23 нуклеотида, эта область богата GC-основаниями (18 GC-nap из 23 п.н.). Области перекрывания генов QS систем высоко гомологичны у Serratia', наблюдается 100% гомология с соответствующей областью у S. plymuthica HRO-C48. Можно предположить, что эти перекрывающиеся районы функционально значимы для регуляции экспрессии генов QS систем, однако биологическая роль такого перекрывания генов в настоящее время не изучена.

С помощью специализированных программ (http://molbiol-tools.ca, РРР - Prokaryotic Promoter Prediction) был проведен анализ последовательности фрагмента ДНК, несущего гены первой QS системы и небольшие прилегающие к ним нетранскрибируемые области. В результате были обнаружены наиболее вероятные -10 и -35 последовательности в промоторных областях sprl и sprR генов у 5. proteamaculans 94.

Также мы обнаружили предположительный lux-бокс перед геном рецепторного белка, lux-бокс - это сайт, с которым в других QS системах связываются регуляторные рецепторные белки LuxR-типа, палиндромная последовательность из 20 нуклеотидов. В дальнейшем мы будем называть lux-бокс 5. proteamaculans spr-боксом (рис. 2).

_spr-boK

_AA&TTGTACTTAAGTCTCiLTCGGTliCCXATAgTTAAGTTCAGGT|TCAATCACCAA(X>g

-3 5 Г^о I P..

AAA AGTC AGATC GCTACGGAGCC TGTATG...

Рис.2. Промоторная область гена sprR.

Подчеркнутые последовательности - предположительные сайты -10 и -35, звездочкой обозначен инициирующий кодон. Выделенная последовательность - сходная с fox-боксом.

Интересно, что последовательность spr-бокса перекрывается с очень вероятным сайтом -10 в промоторе гена R белка, т.е. связывание этого белка в spr-боксе может ингибировать инициацию транскрипции гена sprR.

Для изучения роли исследуемых QS систем S. proteamaculans 94 в регуляции клеточных процессов были получены методом замены генов инсерционные мутанты с инактивированными генами синтазы АГЛ и рецепторного белка. На рис. 3 (А и В) показано положение встроек кассет с геном резистентности к гентамицину в генах sprl и sprR.

Gmr

1 L sprR 4

0 в 309 Grn' 1 1354

► | ^щ¡F"

Г L_ sprR 4

1 0 1 11S8 \ 1354

Grn'

«г-^-1

| | sprR

1 9 378 1 1188 1 1354

Рис. 3. Положение инсерций кассеты с геном резистентности к гентамицину в генах

sprl и sprR.

Попытки удалить из кластера (58 генов фрагмент ДНК, содержащий части этих двух генов (рис. 3, С) оказались невыполнимыми. Делеция фрагмента ДНК, содержащего оба гена <38 системы, была детальна для рШеатаси1ат. Причина этого в настоящее время не ясна, но сам факт указывает на существенную роль (^в системы 51. рго1еатаси!аж 94 в метаболизме бактерии — ее участие в жизненно-важных для клеток процессах.

2. Изучение транскрипции генов С^ системы первого типа в штамме Я. рго1еатаси1ап$ 94 и мутантных штаммах.

С помощью Нозерн-гибридизации впервые изучена транскрипция генов <33 системы I типа у Л рго1еатаси1ат в штамме дикого типа и инсерционных мутантах с нокаутированными генами врг1 и зргЯ. Полученные результаты позволили выявить закономерности регуляции транскрипции генов (¿Б системы I типа 5. рго1еатаси1ат.

Результаты типичного опыта Нозерн-гибридизации представлены на рис. 4. Для стандартизации нанесения образцов на гель и в качестве контроля качества выделенной РНК проводили гибридизацию с 168 рРНК-зондом.

ц>г1-ч онд 1 2 3

$ргИ-ю нд I 2 3

«ссС7-я>нл(С!ю) 1 2 3

7<й> рРНК-'мшд 1 2 3

«* *

Рис. 4. Гибридизация РНК по Нозерну.

Суммарная РНК выделена из клеток: 1 - дикого типа рго1еатаси1апз 94; 2 - мутанта 5. рго(еатаси1ап5 ¡ргГ.Отг; 3 - мутанта 5. рго1еатаси1апз зргЯ:Отг. М- маркеры молекулярной массы. В качестве гибридизационных зондов использованы ПЦР-продукты генов $рг1, яргК, ассС1(вт), 163рРНК

Транскрипты гена sprR практически не обнаруживаются ни в клетках дикого типа £ proteamaculans 94, ни в мутантном штамме S. proteamaculans sprhGmr. В то же время мы видим отчетливую транскрипцию с промотора гена sprR в мутантном штамме S. proteamaculans sprR: Gmr. Эти данные согласуются с нашим предположением об ауторегуляторной функции R-белка. В штамме дикого типа и в мутантном штамме sprl: Gmr экспрессируется полноценный R-белок, который может связываться с lux-боксом и ингибировать инициацию транскрипции собственного гена. В мутанте по sprR-гену полный R-белок не синтезируется, и происходит активная транскрипция части гена sprR с промотора этого гена.

Для нас было неожиданностью фактическое отсутствие мРНК генов sprl и sprR в клетках дикого типа S. proteamaculans 94. Однако, активный синтез АГЛ в клетках дикого типа и sprR мутанта, несомненно, свидетельствует о функционировании синтазы АГЛ и образовании мРНК sprl гена. Полученные данные можно объяснить нестабильностью мРНК sprl и sprR генов. Мы предполагаем, что это может быть связано с особенностями организации генов QS системы, а именно с частичным перекрыванием генов в З'-концевых областях. Возможно, транскрипты sprl и sprR генов образуют дуплекс в области перекрывания, который распознаётся специфическими нуклеазами, что далее приводит к деградации РНК. Область перекрывания богата GC-основаниями (18 GC-nap из 23 п.н.), что может способствовать образованию прочной связи. Следует отметить, что экспрессия с промотора гена sprl многократно усиливается в мутантных штаммах sprLGm' и sprR:Gmr, где отсутствует полный транскрипт одного из генов и образование дуплекса невозможно. Однако, высказанное предположение, несомненно, нуждается в экспериментальной проверке.

3. QS система второго типа у Serratia proteamaculans 94.

Было проведено исследование синтеза сигнальных молекул QS систем второго типа (гомологи фуранозил-борат-диэфира, АИ-2) у S. proteamaculans 94. Для определения возможного синтеза АИ-2 мы использовали биосенсор Vibrio harveyi ВВ170, лишенный продукции этой сигнальной молекулы. Определяется индуцирующее действие АИ-2 на биолюминесценцию сенсора, которая регулируется с участием QS системы, включающей эту сигнальную молекулу. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что добавление супернатанта S. proteamaculans 94 активирует биолюминесценцию тестерного штамма-биосенсора V. harveyi ВВ170, как и добавление в качестве контроля супернатанта штамма V. harveyi ВВ120 дикого типа.

Следовательно, АИ-2 присутствует в культуре исследуемого штамма S. proteamaculans 94.

Таблица 2

Результаты измерения интенсивности биолюминесценции у V. ка™еу1 ВВ170 при добавлении в среду культивирования супернатантов бактерий (в мкВ/200 мкл)*

Супернатант (штамм) Рост 3 часа Рост 5 часов

V. harveyi ВВ120 (контроль) 4560 14120

S. proteamaculans 94 5700 9150

* Цифры в таблице даются за вычетом контроля - интенсивности светового потока штамма V. harveyi ВВ170, растущего в среде без добавления супернатанта исследуемого штамма. Для биосенсора V. harveyi ВВ170 интенсивность светового потока в этих условиях была равна 15 при трех часах роста и 440 при 5 часах роста.

Был идентифицирован, клонирован и секвенирован ген второй QS системы luxS, кодирующий синтазу АИ-2. Было показано, что этот ген высоко гомологичен генам luxS других видов Serratia и Е. coli. Мы получили мутант с инактивированным геном luxS, но смогли лишь частично изучить эффект этой мутации. Однако, полученный мутантный штамм был очень нестабилен, его свойства изменялись после нескольких пассажей. Поэтому мы не смогли в полном объеме исследовать влияние мутации в гене luxS на свойства клеток S. proteamaculans 94.

4. Исследование влияния мутаций в генах sprl, sprR и luxS на свойства S. proteamaculans 94.

Нас интересовала роль QS в регуляции клеточных процессов, относящихся к различным сторонам метаболизма 5. proteamaculans 94 (таблица 3).

С помощью биосенсоров С. violaceum CV026, A. tumefaciens NTl/pZLR4, которые позволяют идентифицировать все указанные выше АГЛ (Chemin, 2004), и ТСХ мы показали, что инактивация гена sprl приводила к отсутствию синтеза АГЛ. Это позволяет предположить, что sprl ген кодирует единственную синтазу АГЛ в штамме S. proteamaculans 94. Мутант S. proteamaculans sprR:Gmr не отличался от исходного штамма по типу синтезируемых АГЛ и по интенсивности их синтеза. Следовательно, мутация в гене рецепторного белка sprR на синтез АГЛ не влияет. Инактивация luxS гена не влияла на синтез АГЛ, т.е. эти две QS системы, по-видимому, не взаимодействуют в регуляции синтеза АГЛ.

Характеристика S. proteamaculans 94 и мутантных штаммов

Свойства штамма S. prot. 94 sprl:Gm sprR: Grar IuxS: Gmr

Синтез АГЛ + - + +

Протеазы + - + -

Хитиназы + - + -

Липазы + + + +

Гемолизин + + + +

Сворминг - - - -

Свимминг + - + -

Способность к образованию биоплёнок + снижена в 2 раза + н/о

Подавление роста грибов + - + -

Энтеробактерии рода Serratia являются продуцентами большого числа внеклеточных ферментов, используя их для утилизации высокомолекулярных соединений окружающей среды и в качестве факторов агрессии при инвазии и колонизации других организмов. Было исследовано влияние мутаций в генах QS системы S. proteamaculans 94 на синтез протеаз, липаз, хитиназ и гемолизина. Инактивация генов синтаз spll и IuxS приводила к снижению экзопротеазной, хитинолитической активностей, не вызывала изменения липазной и гемолитической активностей. Мутация в гене sprR не оказывала заметного влияния на изученные ферментативные активности.

Была определена роль QS в контроле некоторых других процессов, ранее не изученных или мало изученных в отношении QS регуляции. В частности, мы исследовали влияние мутаций в генах QS системы на синтез летучих органических соединений (ЛОС). В рамках данной работы мы показали, что исходный штамм продуцирует ЛОС, которые подавляют рост микроорганизмов различных таксономических групп. Масс-спектрометрический анализ смеси ЛОС выявил значительное преобладание в газовой фазе диметнлдисульфида. Было показано, что ЛОС S. proteamaculans 94 оказывают сильное ингибирующее действие на рост фитопатогенных грибов Rhizoctonia solani и Helminthosporium sativum. Мы исследовали влияние полученных мутаций в генах QS систем на синтез ЛОС, подавляющих рост фитопатогенных грибов. По данным проведенных экспериментов, мутант sprR:Gmr подавляет рост мицелия гриба и обладает ингибирующим действием, сходным с действием S. proteamaculans 94. Это значит, что мутация не затрагивает гены, ответственные за регуляцию синтеза ЛОС. В случае мутантных штаммов

эргГ.Стг и 1их5:Стг наблюдалось значительное снижение эффекта подавления роста гриба или его отсутствие. Таким образом, (^Б система играет определенную роль в синтезе ЛОС у рго1еатаси1ат 94.

Было исследовано влияние 08 системы на способность клеток 51. рго1еатаси1ат 94 к двум типам миграции по поверхности среды: свормингу и свиммингу. Мы показали, что клетки исходного и мутантных штаммов не способны к миграции по поверхности среды по типу сворминга. Однако, штамм 5. рго1еатаси1ат 94 был способен к миграции по типу свимминга, а мутанты с инактивированными генами синтаз сигнальных молекул характеризовались или резко сниженной миграцией по типу свимминга (вргр.Сгтг), или ее отсутствием (1ш8\Отг).

Способность бактерий к миграции по поверхности среды является одним из факторов вирулентности бактерий. Такое мультиклеточное поведение вовлечено в процессы формирования биопленок и процессы колонизации и патогенеза.

Представляло интерес исследовать роль мутаций в генах ярг] и эргЯ на регуляцию образования биопленок у 5. рго1еатаси1апз 94 - процесс, который у ряда бактерий зависит от ОБ регуляции. Было показано, что мутация в гене .ургК не оказывала влияния на уровень образования биопленок. В мутантном штамме по гену зрг1 образование биопленок снижалось вдвое по сравнению с уровнем биопленок в исходном штамме. При этом добавление экзогенного 3-оксо-С6-ГЛ (доминирующий тип АГЛ у рШеатасЫат 94) восстанавливало способность к формированию биопленки практически до уровня штамма дикого типа. Добавление других видов АГЛ (С4-ГЛ, Сб-ГЛ) не давало подобного эффекта (рис.5).

1,5 1,0 0,5 0,0

Рис. 5. Образование биопленок (серые столбики) и планктонный рост (белые столбики)

5. ргоГеатаси1ат 94 (1), мутантным штаммом ярИ'.Стг (2), мутантным штаммом с добавлением: 3-оксо-Сб-ГЛ (3), Сб-ГЛ (4), С4-ГЛ (5);

мутантным штаммом ,ургЛ:Отг (6), мутантным штаммом ¡ргЯ:Отг с добавлением: 3-оксо-С6-ГЛ (7), Сб-ГЛ (8), С4-ГЛ (9).

Полученные результаты показывают, что образование биопленок у S. proteamaculans 94 регулируется позитивно 3-оксо-С6-ГЛ-зависимой QS системой.

Интересно, что у второго исследованного нами вида Serratia - S. plymuthica (штамм HRO-C48) - инактивация гена синтазы АГЛ spll вызывала увеличение уровня образованных биопленок в 2 - 2,5 раза, а введение в клетки этого мутанта плазмиды с клонированными генами splUsplR снижало формирование биопленок до нормального уровня. Полученные результаты показывают, что формирование биопленок у S. plymuthica регулируется негативно SpIIR QS системой. У другого штамма этого вида, S. plymuthica 1С 1270, QS система SpIIR также оказывала негативное влияние на образование биопленок. Введение в клетки S. plymuthica 1С 1270 рекомбинантной плазмиды, несущей клонированные гены splI/splR из S. plymtithica HRO-C48, приводило к снижению вдвое формирования биопленок. Эти данные показывают, что QS-регуляция формирования биопленок у рода Serratia может быть видо-специфичной.

Успешное формирование биопленок связано со способностью бактерий к адгезии и агрегации. Мутация в гене QS системы sprl приводила к изменению характера роста клеток S. proteamaculans 94 в жидкой среде в стеклянных пробирках. Для штаммов дикого типа и мутанта по гену sprR характерно образование многоклеточных агрегатов, формирование осадка и хлопьев на стенках пробирки, а для мутанта по гену sprl характерен диффузный планктонный рост с равномерным помутнением культуральной среды. Резко менялась способность клеток адсорбироваться на поверхности стекла. По-видимому, происходило явное изменение структуры оболочек клеток.

В связи с этим, мы исследовали состав жирных кислот, многие из которых входят в состав мембран бактерий, у S. proteamaculans 94 и мутантных штаммов. Методом хромато-масс-спектрометрии был исследован состав жирных кислот у штамма S. proteamaculans 94 дикого типа и мутантных штаммов sprLGmr и sprR:Gmr. Результаты анализа представлены в таблице 4.

Сравнительный анализ показал значительные изменения состава жирных кислот мутантных штаммов по сравнению со штаммом дикого типа: содержание некоторых ЖК изменялось более чем на порядок, существенно изменилось соотношение насыщенных и ненасыщенных ЖК. Так, соотношение насыщенных и ненасыщенных ЖК в исследуемых образцах составило: 55 и 45% для дикого типа, 62 и 38% для мутанта sprl:Gmr, 69 и 31% для sprR-.Gmr.

Соотношение насыщенных и ненасыщенных ЖК в составе ЛПС влияет на физические свойства мембран бактерий. Зависимость текучести мембран от степени

ненасыщенности жирных кислот мембранных липидов — хорошо изученный феномен, показанный на клетках бактерий (Cybulski et al., 2002; Sinensky et al., 1974). Фазовое состояние жидкокристаллической структуры липидного бислоя мембраны, степень ее текучести оказывают весьма существенное влияние на вязко-эластические свойства клеток, их способность к деформации, на активность мембранно-связанных ферментов, на проницаемость мембран. Повышенное содержание ненасыщенных ЖК в составе мембран Serratia proteamaculans 94 может служить основной стратегией адаптации к действию пониженных температур. Возможно, этим объясняется высокий адаптивный потенциал этих бактерий к низким температурам, благодаря которому они широко распространены в различных климатических зонах.

Таблица 4

Состав жирных кислот Serratia proteamaculans (данные хромато-масс-спектрометрии)

Содержание ЖК,

% от суммы площадей

JVi> R.T.* Кислота всех пиков

1 2 3

1 6.983 додекановая 0,478 0,851 0,90

2 9.495 9-тетрадеценовая 0 0,186 0,40

3 9.578 11-тетрадеценовая 0 0,298 0,57

4 9.873 тетрадекановая 2,72 4,881 5,52

5 10.120 2-гидрокси-додекановая 0 0,182 0,67

6 11.305 пентадекановая 0,569 0,579 1,30

7 12.379 7-гексадеценовая 0,392 0 0

8 12.449 9-гексадеценовая 3,349 27,558 20,68

9 12.797 гексадекановая 37,208 34,562 36,13

10 12.839 3-гидрокси-тетрадекановая 0,608 6,345 8,80

11 13.570 изо-гептадекановая 0,203 0 0

12 13.694 антеизо-гептадекановая 0,299 0 0

13 13.764 гептадеценовая 0,178 0 0

14 13.888 циклопропан-гептадекановая 0,238 5,475 10,20

15 14.071 гептадекановая 0,804 3,375 1,86

16 15.144 9-октадеценовая 33,222 9,415 8,18

17 15.186 11 -октадеценовая 4,561 0,275 0,44

18 15.427 октадекановая 10,991 5,089 3,41

19 16.170 октадекадиеновая, коньюгированная 1,246 0,49 0,94

20 17.556 9-эйкозеновая 1,506 0,264 0

21 17.597 1 і-эйкозеновая 0,917 0 0

22 17.845 эйкозановая 0,511 0,175 0

Сумма 100,00 100,00 100,00

* - R-T. retention time - хроматографическое время удерживания веществ в колонке; 1 - дикий тип S. proteamaculans 94; 2 - мутант S. proteamaculans sprl:Gm; З - мутант S. proteamaculans sprR:Gmr.

По сравнению со штаммом S. proteamaculans 94 дикого типа, жирнокислотный состав мутантных штаммов характеризовался меньшей ненасыщенностью, что свидетельствует о более плотной упаковке ЛПС на клеточной поверхности. Возможно, это один из механизмов адаптации клеток в неблагоприятных условиях окружающей среды, позволяющий повысить толерантность мембран к стрессовым факторам.

Следует отметить, что состав жирных кислот клеток бактерий - устойчивая генетическая черта, которая сохраняется во многих поколениях бактерий. Следовательно, столь значительные отличия в составе ЖК мутантных штаммов также подтверждают глобальную роль QS в метаболизме S. proteamaculans.

5. Сравнение протеомных карт клеточных культур S. proteamaculans 94 и мутантов sprl:Gmr и sprR:Gmr.

Для характеристики полученных мутантов использовали метод протеомного анализа синтезируемых ими белков, сравнительно с белками исходного штамма. Растворимые белки из клеток S. proteamaculans 94 и двух мутантов {sprl:Gmr и sprR:Gmr) были проанализированы путем разделения на двумерных гелях (2-Д гелях); в первом направлении - по суммарному заряду белков в диапазоне pi 4-7, во втором направлении - по относительной молекулярной массе в районе 75-10 kDa. Более чем 600 белковых пятен выявилось на каждом из 2-Д гелей, среди которых 30 белковых пятен отличались существенными количественными изменениями между бактериями дикого типа и мутантами (в 1,5 и более раза), что было выявлено с помощью компьютерной программы Melanie III (GeneBio, Switzerland).

В случае мутанта S. proteamaculans sprl: Gmr экспрессия 20 белков изменялась по сравнению со штаммом дикого типа (в 1,5 и более раза): синтез II белков был индуцирован или их экспрессия значительно усиливалась, синтез 9 белков был репрессирован или их экспрессия была снижена (таблица 5 А).

В случае мутанта S. proteamaculans sprR:Gmr экспрессия 14 белков изменялась по сравнению со штаммом дикого типа (в 1,5 и более раза): синтез двух белков был индуцирован или их экспрессия значительно усиливалась, синтез 12 белков был репрессирован или их экспрессия была сниженной (таблица 5В).

В рамках данной работы впервые была проведена идентификация белков S. proteamaculans, у которых наблюдаются отличия в уровне экспрессии в штамме дикого типа и мутантах. В итоге удалось успешно идентифицировать 8 белков. Результаты идентификации суммированы в таблице 6.

Номера белковых пятен, демонстрирующих статистически достоверные отличия, и

их относительные интенсивности А В

№ %У

ргоС. 94 ¡ргГ. Сгаг

175 0.15±0.00 0.09±0.02

187 0.37±0.01 0.23±0.02

195 1.00±0.11 0Л6±0.17

232 0.15±0.01 0.08±0.00

304 0.06±0.00 0

477 0.59±0.07 1.05±0.07

487 0.14±0.01 0.24±0.02

495 0.46±0.08 0.69±0.02

524 0.14±0.00 0.22±0.01

540 0.31±0.08 0.69±0.06

546 0.07±0.01 0.17±0.01

560 0.11±0.03 0

595 0.15±0.01 0.43±0.01

596 0 1.97±0.11

610 о.п±о.оо 0.23±0.02

617 0.26±0.01 0.54±0.04

619 0.30±0.05 1.16±0.27

621 0.31±0.02 0.08±0.02

631 0.14±0.03 0

642 0.61±0.07 0.05±0.07

№ %У

5. рШ. 94 5/>/7?:Стг

64 0.03±0.00 0

131 0.11±0.01 0.06±0.00

142 0.41±0.06 0.18±0.02

187 0.37±0.01 0.15±0.05

190 0.31±0.00 0.06±0.01

195 1.00±0.11 0.09±0.02

237 0.08±0.01 0

376 0.06±0.00 0

391 0.04±0.01 0

406 0.20±0.01 0.09±0.01

408 0.14±0.03 0

447 0.03±0.01 0.94±0.16

596 0 1.77±0.41

635 0.04±0.01 0

Жирным шрифтом выделены белки, которые удалось идентифицировать.

Значение 0 соответствует отсутствию пятна в данных координатах на геле.

В обоих мутантах был отмечен повышенный уровень экспрессии белков, связанных с устойчивостью штаммов к антибиотикам: аминогликозид-(3)-Ы-ацетилтрансферазы (устойчивость к гентамицину) и бета-лактамазы. В мутантах яргГ.Ст' и наблюдались изменения в синтезе существенно важных для

метаболизма бактерий белков. Например, мы наблюдали значительное снижение экспрессии белка ФМН-редуктазы у обоих мутантов. У мутантного штамма ¡ргГ. Отг наблюдалась усиленная экспрессия белков, участвующих в защите клеток от окислительного стресса: тиоредоксина 2, тиоредоксин-зависимой тиолпероксидазы, белка теплового шока вгрЕ. У мутантного штамма хргК:От' наблюдалось резкое снижение уровня экспрессии двух субъединиц белка сукцинил-КоА-синтетазы.

Белки, идентифицированные в 5. ршеатасиїстя 94

N0 Название белка М.м./р1 Номер в базе данных N061

Цикл трикарбоновых кислот

406 Сукцинил-СоА-синтетаза а-субъединица 29.8/5.9 157369513

190 Сукцинил-СоА-синтетаза Ь-субъединица 41.3/5.3 157369512

Окислительно-восстановительные реакции

195 ФМН-редуктаза 26.2/5.0 157368508

Белки общего ответа на стресс

540 Белок теплового шока СгрЕ 21.4/4.9 157371919

Защита от окислительного стресса

619 Тиоредоксин 2 15.6/4.9 157371981

617 Тиоредоксин-зависимая тиолпероксидаза 17.3/5.0 157371748

Устойчивость к антибиотикам

596 Ачиногликозид-(3)-Н-ацетилтрансфераза 19.4/5.8 239721

447 Бета-лактамаза 31.7/5.7 46129905

Предполагаемые функции этих белков подробно рассмотрены в экспериментальной части диссертации в свете их участия в метаболических путях. ФМН-редуктаза является одним из компонентов дыхательной цепи бактерий. Тиоредоксин 2 и тиоредоксин-зависимая тиолпероксидаза являются важными редокс-активными белками, которые поддерживают внутриклеточный окислительно-восстановительный потенциал. Белок теплового шока ОгрЕ входит в состав системы шаперона Нзр70, которая способствует правильному фолдингу белков. Сукцинил-КоА-синтетаза - один из ключевых ферментов цикла лимонной кислоты, катализирующий обратимую реакцию образования свободного сукцината.

Таким образом, все идентифицированные белки являются компонентами важных метаболических путей и процессов, что свидетельствует о включении (ЗЭ систем в глобальные регуляторные сети. К сожалению, небольшое количество идентифицированных белков и отсутствие информации о подобных исследованиях в литературе не позволяет нам получить достаточно полное представление о роли систем в регуляции метаболизма этих бактерий. Однако, полученные данные формируют основу для последующих исследований.

6. Влияние нитрофуранов, доноров N0 и фенольных соединений растительного происхождения на образование биопленок и (ЗБ системы бактерий.

В последние годы активно проводится изучение взаимодействия различных химических соединений с (ЗБ регуляцией. Т.к. ОБ системы участвуют в регуляции вирулентности бактерий, в настоящее время развивается новое направление исследований, связанное с поиском и изучением веществ, ингибирующих (ЗБ регуляцию, с целью разработки новых препаратов для борьбы с бактериальными инфекциями. Особое внимание должно быть обращено на изучение действия лекарственных препаратов, используемых в медицинской практике, на (^Б регуляцию и зависимую от нее экспрессию генов патогенных бактерий, определяющих синтез факторов патогенности.

Одним из факторов патогенности бактерий является их способность образовывать биопленки - процесс, зависимый от ОЭ регуляции. Бактериальные клетки в составе биопленок чрезвычайно устойчивы к действию антибиотиков и других лекарственных препаратов, а также к иммунному ответу организма хозяина. Скрининг веществ, действие которых может предотвратить образование биопленок, является очень важной задачей. В этой части работы было проведено изучение действия ряда антибактериальных препаратов на образование биопленок и (ЗЭ регуляцию у нескольких бактерий.

Мы исследовали влияние антибактериальных препаратов нитрофурановой серии (рис. б) на процесс формирования биопленок.

Ма2[Ре(С1М)5МО]

Рис. 6. Нитрофураны и доноры N0.

А - фурацилин , В - нитрофурантоин, С - фурагин, О - нифуроксазид, Е - изосорбид мононитрат, Б - нитропруссид натрия.

Нигрофураны имеют широкий спектр антимикробного действия, они активны в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий, грибов и простейших. Нитрофураны являются про-лекарствами, т.е. они становятся токсичными для микроорганизмов в результате модификаций, осуществляемых специфическими ферментами. Показано, что антибактериальная активность нитрофуранов зависит от восстановительного метаболизма нитрогруппы и связана с образованием оксида азота и его производных. В связи с этим мы также исследовали действие двух известных доноров N0 (рис.6, Е, F).

Было изучено влияние фурацилина, фурагина, нитрофурантоина, нифуроксазида, нитропруссида натрия и изосорбид мононитрата на формирование биопленок двух патогенных бактерий, P. aeruginosa РА01 и В. cenocepacia 370. Было показано, что нитрофураны и доноры N0 стимулируют образование биопленок P. aeruginosa РА01 и В. cenocepacia 370 в пределах субингибиторных концентраций (рис. 7). При дальнейшем повышении концентраций этих соединений формирование биопленок снижалось.

Рис. 7. Влияние фурацилина (А), нитрофурантоина (В), нитропруссида натрия (С) и изосорбид мононитрата (D) на формирование биопленок Pseudomonas aeruginosa PAOl. Белые столбцы - планктонный рост, серые - биопленки.

Стимулирующее действие исследуемых соединений на образование биопленок могло быть вызвано повышенным функционированием в этих условиях QS систем тестируемых бактерий. Чтобы определить, связаны ли наблюдаемые эффекты непосредственно со специфическим действием исследованных веществ на QS системы, мы использовали биосенсоры, любезно присланные нами Dr. В. Ahmer (Lindsay A., Ahmer В. М., 2005). Эти биосенсоры представляют набор изогенных штаммов Е. coli, у которых отсутствует ген sdiA (кодирующий белок SdiA, гомолог белка LuxR) и содержатся или не содержатся гены, кодирующие различные рецепторные белки LuxR типа, что позволяет определить зависимость эмиссии света от этих рецепторных белков. Было показано, что в присутствии нитрофуранов и нитропруссида натрия происходила активация биолюминесценции указанных биосенсоров, однако, она была независимой от присутствия или отсутствия в репортерных плазмидах генов, кодирующих рецепторные белки типа LuxR. Таким образом, исследованные вещества не влияли специфически на QS системы.

При использовании АГЛ-биосенсора С. violaceum CV026 (McClean et al., 1997) мы не обнаружили в присутствии нитрофуранов и NO-доноров синтеза пурпурно-фиолетового пигмента виолацеина, который, как известно, индуцируется АГЛ. Было показано также, что исследованные вещества в присутствии АГЛ не ингибировали функционирование QS регуляции С. violaceum CV026.

Другой группой испытанных нами веществ были фенольные соединения растительного происхождения. Фенолы широко распространены в растительном царстве. Обнаружено их регулирующее действие на ряд физиологических и биохимических процессов в растениях, они важны для защиты растений от фитопатогенных бактерий.

Мы исследовали действие 8 фенольных соединений растительного происхождения (рис. 8) на способность Р. aeruginosa РА01 и Agrobacterium tumefaciens С58 формировать биопленки. A. tumefaciens С58 - известный патоген растений, вызывающий образование опухолей (корончатых галлов) у двудольных растений. Р. aeruginosa, известный как оппортунистический патоген человека, способен также существовать в почве, колонизировать корни растений, формировать биопленки и вызвать гибель растения. В работе принимал участие аспирант В.А. Плюта.

Было показано, что эти соединения могут иметь двойное влияние на формирование биопленок - стимулирующее или подавляющее, в зависимости от концентрации. При концентрациях, не подавляющих или слабо подавляющих рост бактерий, все исследованные соединения стимулировали формирование биопленок

P. aeruginosa PAOl и A. tumefaciens C58. При более высоких концентрациях формирование биопленок было подавлено.

Рис. 8. Фенольные соединения.

А - оксибензойная кислота, В - ванилин, С - галловая кислота, О - феруловая кислота,

Е - синаповая кислота, її - коричная кислота, в - эпикатехин, Н - хлорогеновая кислота.

При изучении действия растительных фенолов на биосенсоры, указанные выше, не было выявлено их специфического эффекта на экспрессию репортерного ¡их-оперона с промотора генов синтаз соответствующих АГЛ. Эти соединения не вызывали синтеза пурпурно-фиолетового пигмента виолацеина в АГЛ-биосенсоре С. уіоіасеит СУ026. Таким образом, данные соединения не активировали С>8 систему биосенсора СУ026. Было показано также, что исследованные вещества в присутствии АГЛ не ингибировали функционирование <38 регуляции биосенсоров на основе /мх-репортерных плазмид и биосенсора С. уіоіасешп СУ026.

Механизм стимуляции формирования биопленок при действии субингибиторных концентраций антибактериальных соединений в настоящее время не изучен. Мы показали, что исследуемые соединения нитрофурановой и фенольной природы не могут замещать АГЛ и взаимодействовать с рецепторными белками ЬихЫ типа. Однако, образование биопленки представляет собой сложный многоступенчатый процесс, и описанные эффекты исследуемых веществ могут быть результатом их влияния на различные стороны метаболизма бактерий. Например, действие фенолов на формирование биопленок может быть обусловлено, по крайней мере частично, их общей характеристикой - антиоксидантной активностью. Однако, необходимы дальнейшие исследования механизмов данного явления.

выводы

1. У штамма S. proteamaculans 94 идентифицированы Quorum Sensing (QS) системы двух типов, использующие в качестве аутоиндукторов ацилгомосеринлактоны (АГЛ) и АИ-2.

2. Штамм S. proteamaculans 94 продуцирует 2 основных типа АГЛ (N-3-оксо-гексаноил-гомосеринлактон и N-3-гидроксо-гексаноил-гомосеринлактон), а также несколько минорных типов АГЛ (N-гексаноил-гомосеринлактон, N-октаноил-гомосеринлактон и N-бутаноил-гомосеринлактон).

3. Клонированы и секвенированы гены QS системы I типа: ген синтазы АГЛ sprl и ген рецепторного регуляторного белка sprR. Эти гены транскрибируются с противоположных цепей ДНК навстречу друг другу и частично перекрываются в 3'-концевых областях. В промоторной области гена sprR обнаружен spr-бокс, гомологичный luxг-боксу Vibrio fischeri.

4. Результаты анализа транскрипции генов sprl и sprR в клетках исходного штамма и полученных инсерционных мутантов с нокаутированными генами sprl и sprR позволяют предположить, что белок R является ауторегулятором и репрессирует собственную транскрипцию; связывание его с АГЛ приводит к дерепрессии транскрипции.

5. Сравнительный протеомный анализ клеток исходного штамма и мутантов показал, что экспрессия более 30 белков находится под влиянием SprlR QS-системы.

6. Обнаружена продукция сигнальной молекулы АИ-2 у штамма 5. proteamaculans 94. Клонирован и секвенирован ген синтазы АИ-2 QS системы II типа luxS.

7. Обе QS системы участвуют в регуляции различных клеточных процессов бактерий рода Serratia (синтез ферментов, жирных кислот, летучих соединений, образование биопленок и др.).

8. Производные нитрофурана и доноры оксида азота в субингибиторных концентрациях стимулируют образование биопленок у бактерий. Фенольные соединения растительного происхождения в концентрациях, не подавляющих или слабо подавляющих рост бактерий, также оказывали стимулирующее действие на формирование биопленок. Указанные вещества не активировали экспрессию генов синтаз АГЛ в биосенсорах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1.* Хмель И.А., Белик A.C., Зайцева Ю.В. Данилова H.H. Quorum Sensing и коммуникация бактерий // Вестник МГУ, сер. 16, Биол. 2008 №1, с.28-35.

2.* Zaitseva J., Granik V., Belik A., Koksharova O., Khmel I. Effect of nitrofurans and NO generators on biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PAOl and Burkholderia cenocepacia 370 // Research in Microbiology. 2009, v. 160, 353-357.

3.* Зайцева Ю.В., Белик A.C.. Плюта В.А., Лобакова Е.С., Хмель И.А. Действие растительных веществ фенольной природы на образование биопленок и Quorum Sensing системы регуляции у бактерий // Бюлл. Моск. Общества испытателей природы, Отдел Биологический, т. 114, в. 2, приложение 1. 2009, с. 47-48.

4.* Зайцева Ю.В., Граник В.Г., Белик A.C., Кокшарова O.A., Хмель И.А. Активация биолюминесценции сенсорных штаммов Escherichia coli, используемых для определения N-ацил-гомосеринлактонов, в присутствии нитрофуранов и доноров NO// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2010 №2, с.24-28.

5.* Зайцева Ю.В., Волошина Г1. В., Лиу X., Овадис М.И., Берг Г. , Чернин Л.С., Хмель И.А. Участие глобальных регуляторов GrrS, RpoS и Quorum Sensing системы SplIR в регуляции формирования биопленок у Serratia plymuthica II Генетика, 2010, т. 46, с. 616-621.

6. Зайцева Ю.В., Громова Т.Ю., Хмель И.А. Quorum Sensing системы регуляции у Serratia proteamaculans. В Сб. «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Межд. Школа-конф., Москва-Пущино, 2006, с. 95.

7. Зайцева Ю.В., Данилова H.H. Взаимодействие Quorum Sensing систем регуляции бактерий с фенольными соединениями растительного происхождения. Тезисы докладов XX зимней Межд. Молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва 11-15 февраля 2008 г., с. 88.

8. Зайцева Ю.В.. Белик A.C., Демидюк И.В., Хмель И.А. Quorum Sensing системы у Serratia plymuthica и Serratia proteamaculans. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. С междунар. участием. Новосибирск, 11-15 мая 2008 г., с. 160, N 264.

9. Зайцева Ю.В., Лобакова Е.С., Загоскина Н.В., Хмель И.А. Влияние фенольных соединений растительного происхождения на Quorum Sensing системы регуляции бактерий и образование биопленок. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, с междунар. участием. Новосибирск, 11-15 мая 2008, с. 161, N265.

10. Хмель И.А., Зайцева Ю.В.. Велик A.C., Липасова В.А., Данилова H.H. Новая стратегия антибактериальной терапии: разработка лекарственных средств, подавляющих вирулентность бактерий. Материалы симпозиума «Фундаментальные науки новым лекарствам. Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств». Москва, 9-11 июня 2008 г., стр. 221.

11. Зайцева Ю.В.. Велик A.C., Хмель И.А. Действие препаратов нитрофуранового ряда на Quorum Sensing и формирование биопленок у грамотрицательных бактерий. Российская школа - конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (посвященная 40-летию института ГосНИИгенетика), Москва - Пущино, 20-24 октября 2008 г.

12. И.А. Хмель, М.А. Веселова, Ю.В. Зайцева, A.C. Велик, В.А. Липасова. Quorum Sensing регуляция у грамотрицательных бактерий. Тезисы V Съезда ВОГИС, 2009, Москва, с. 55.

13. Зайцева Ю.В.. Загоскина Н.В., Хмель И.А. Субингибиторные концентрации ванилина и эпикатехина стимулируют формирование биопленок Pseudomonas aeruginosa и Agrobacterium tumefaciens. VII Междунар. Симп. по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты. Материалы докладов. 2009, Москва, с. 93.

14. Зайцева Ю.В.. Хмель И.А. Действие препаратов нитрофуранового ряда и доноров NO на формирование биопленок у грамотрицательных бактерий и Quorum Sensing биосенсоры. Тезисы Междунар. науч. конф. по биоорг. химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвящ. 75-летию со дня рожд. Акад. Ю.А. Овчинникова. Москва, 2009, с. 210-211.

15. Зайцева Ю.В.. Липасова В.А., Хмель И.А. Quorum Sensing системы двух типов у Serratia proteamaculans. Тезисы Междунар. науч. конф. по биоорг. химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвящ. 75-летию со дня рожд. Акад. Ю.А. Овчинникова. Москва, 2009, с. 208-209.

16. J.V. Zavtseva. I.A.Khmel. Quorum Sensing systems of Serratia proteamaculans 94. IV International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology. «BioMicroWorld2011» Torremolinos, Malaga, Spain 14-16 September 2011, p. 535.

* - статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.

Отпечатано в ООО «Аверс Плюс» 150040, г. Ярославль, пр. Октября, 34/21. Тел. 97-69-22, 25-54-85 Тираж 100 экз. Усл. п. л. 1,5. Заказ № 246.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зайцева, Юлия Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Общая характеристика семейства Enterobacteriaceae.

2. QS системы типа LuxI-LuxR.

2.1. Функционирование QS систем LuxI-LuxR типа на примере Vibrio fischeri.

2.2. АГЛ и функционирование Luxl— подобных белков.

2.3. Функционирование LuxR-подобных белков.

3. Участие QS систем типа LuxI-LuxR в регуляции клеточных процессов.

3.1. Синтез антибиотиков.

3.2. Регуляция синтеза внеклеточных ферментов.

3.3.Сворминг, свимминг и слайдинг.

3.4. Биопленки.

3.5. Синтез факторов вирулентности.

3.6. Ферментация глюкозы.

4. QS системы, использующие аутоиндуктор АИ-2 (II тип QS систем).

5. QS системы, использующие аутоиндуктор АИ-3.

6. QS и апоптоз у бактерий.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Среды и условия культивирования бактерий.

2. Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды.

3. Определение продукции АГЛ.

4. Определение сигнапьных молекул QS систем второго типа.

5. Определение АГЛ с помогцъю тонкослойной хроматографии.

6. Количественное определение продукции АГЛ методом жидкостной хроматографии имасс-спектрометрии (LC-MS/MS).

7. Методы работы с ДНК.

8. Трансформация Е. coli.

9. Электропорация.

10. Гибридизация ДНК по Саузерну.

11. Гибридизация РНК по Нозерну.

12. Получение инсерционных мутантов Serratiaproteamaculans 94 методом замены генов.

13. Анализ ферментативных активностей.

14. Определение способности кпеток бактерий к миграции по поверхности среды.

15. Анализ биопленок.

16. Определение действия летучих веществ Serratia proteamaculans 94 на фитопатогенные грибы.

17. Методика анализа состава бактериальных жирных кислот.

18. Метод протеомного анализа.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Уточнение идентификации Serratia proteamaculans (с помощью секвенирования генов 16S РНК).

4.2. Определение синтеза сигнальных молекул QS систем двух типов у

Serratia proteamaculans 94.

4.2.1. Определение с помощью различных биосенсоров способности бактерий синтезировать сигнальные молекулы QS систем первого типа N-ацил-гомосеринлактоны.

4.2.2. Определение сигнальных молекул QS систем первого типа N-ацил-гомосеринлактонов с использованием тонкослойной хроматографии.

4.2.3. Определение синтеза АГЛ с помощью масс-спектрометрического анализа.

4.2.4. Определение сигнальных молекул QS систем второго типа (гомологи фуранозил-борат-диэфира, АИ-2) у S. proteamaculans 94.

4.3. Клонирование и секвенирование генов двух типов QS систем

Serratia proteamaculans 94.

4.3.1. Идентификация, клонирование и изучение особенностей организации генов

QS системы первого типа.

4.3.2. Клонирование и секвенирование гена luxS QS системы второго типа.

4.4. Получение мутантов с нокаутированными генами QS систем.

4.4.1. Получение мутантов с нокаутированными генами синтазы N-ацил-гомосеринлактонов и рецепторного белка.

4.4.2. Определение влияния мутаций на синтез АГЛ.

4.4.3. Получение мутанта в гене luxS (ген синтазы АИ-2 - подобных сигнальных молекул).

4.5. Изучение транскрипции генов QS системы первого типа в штамме

S. proteamaculans 94 и мутантных штаммах.

4.6. Исследование влияния мутации в генах sprl, sprR и luxS на свойства

S. proteamaculans 94.

4.6.1. Синтез внеклеточных ферментов у штамма S. proteamaculans 94 и мутантов.

4.6.2. Синтез летучих органических соединений у штамма S. proteamaculans 94 и мутлитцых штаммов

4.6.3. Определение способности теток штамма S. proteamaculans 94 и мутантных штаммов к миграции по поверхности среды.

4.6.4. Влияние QS систем первого типа на формирование биопленок у Serratia.

4.6.5.Анализ состава бактериальных жирных кислот.

4.7.Сравнение протеомных карт клеточных культур S. proteamaculans 94 и мутантов sprI:Gmr и sprR:Gmr.

4.8. Влияние нитрофуранов, доноров NO и фенольных соединений растительного происхождения на образование биопленок и QS системы бактерий.

4.8.1. Действие нитрофуранов и доноров NO на формирование биопленок

P. aeruginosa РАО 1 и В. cenocepacia 370.Ill

4.8.2. Действие нитрофуранов и доноров N0 на биосенсоры на основе штаммов Escherichia coli, используемых для определения N-ацил-гомосеринлактонов.

4.8.3. Действие фенольных соединений на формирование биопленок

P. aeruginosa РАО 1 и A. tumefaciens С58.

V. ОБСУЖДЕНИЕ.

VI. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические особенности Quorum Sensing систем грамотрицательных бактерий (на модели Serratia) и изучение их роли в регуляции клеточных процессов"

Актуальность проблемы

Изучение биологической значимости регуляторных систем типа QS показало, что эти системы играют ключевую роль в регуляции большого количества процессов бактериальной клетки. Они участвуют во взаимодействии многих бактерий с высшими организмами, животными и растениями, в регуляции вирулентности бактерий, формировании биопленок, регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом различных экзоферментов, токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов, конъюгации, опухолеобразовании у растений, вызванном, агробактериями, ^споруляции у бактерий и др. Использование в последние годы методов транскриптомного и протеомного анализа показало, что QS системы функционируют как глобальные факторы регуляции, т.е. они участвуют в контроле большого количества клеточных процессов, относящихся к различным сторонам метаболизма бактерий.

Тот факт, что QS может быть важнейшим фактором регуляции вирулентности бактерий, обусловил новое направление исследований, связанное с использованием QS регуляции в качестве потенциальной мишени для борьбы с инфекционными заболеваниями. В настоящее время этот подход рассматривается как новая перспективная стратегия антимикробной терапии. В большом количестве лабораторий проводится поиск и изучение веществ, подавляющих QS.

Цель работы и задачи исследования.

В соответствии с этим в работе были поставлены следующие задачи.

1. Исследовать гены QS систем и сигнальные молекулы, участвующие в их функционировании, у бактерий рода Serratia.

2. Выяснить принципы организации и особенности регуляции экспрессии генов QS систем Serratia.

3. Определить роль этих систем в регуляции различных клеточных процессов.

4. Исследовать действие антибактериальных веществ, производных нитрофурана, доноров N0 и растительных веществ фенольной природы на образование биопленок и QS регуляцию.

Научная новизна и практическая значимость.

Результаты, полученные в работе Зайцевой Ю.В., содержат новую информацию о QS системах грамотрицательных бактерий — о генах, участвующих в функционировании QS систем, регуляции их экспрессии и роли в контроле клеточных процессов.

У исследуемого штамма S. proteamaculans 94 идентифицированы QS системы двух типов, использующие в качестве аутоиндукторов N-ацилгомосеринлактоны (АГЛ) и АИ-2. Впервые у бактерий рода Serratia был проведен точный количественный масспектрометрический анализ АГЛ.

В ходе работы были идентифицированы, клонированы и секвенированы гены двух типов QS систем S. proteamaculans: ген синтазы АГЛ sprl, ген регуляторного рецепторного белка sprR и ген luxS, кодирующий синтазу АИ-2 - сигнальную молекулу QS систем второго типа; получены мутации, инактивирующие эти гены. Было показано, что указанные гены QS систем первого типа кластеризованы, они транскрибируются конвергентно и перекрываются в терминальных областях.

С помощью Нозерн-гибридизации впервые изучена транскрипция генов QS системы 1 типа в штамме Serratia proteamaculans дикого типа и инсерционных мутантах с нокаутированными генами sprl и sprR. Установлены тонкие механизмы регуляции транскрипции генов QS системы. Предложена модель экспрессии генов QS системы первого типа S. proteamaculans. Согласно этой модели, белок SprR связывается с ДНК в spr-боксе и репрессирует собственную транскрипцию; связывание его с АГЛ приводит к дерепрессии транскрипции; белок SprR не обязателен для синтеза АГЛ.

Проведен сравнительный протеомный анализ клеток исходного штамма и мутантов. Показано, что экспрессия более 30 белков находится под влиянием SprlR QS-системы. Эти данные свидетельствуют о глобальной роли QS системы в регуляции клеточных процессов. Впервые проведена идентификация белков Serratia proteamaculans, у которых наблюдаются отличия в уровне экспрессии в штамме дикого типа и мутантах. Предполагаемые функции этих белков рассмотрены в свете их клеточных функций и участия в метаболических путях.

Получены данные о роли QS систем двух типов в регуляции клеточных процессов, относящихся к различным сторонам метаболизма S. proteamaculans (синтез внеклеточных протеаз, хитиназ, липаз, гемолизинов, жирных кислот, летучих органических соединений, образование биопленок и др.).

В ходе работы было исследовано действие различных лекарственных веществ и соединений растительного происхождения на QS и зависящий от этого типа регуляции процесс формирования биопленок. Впервые было показано, что производные нитрофурана, доноры оксида азота и фенольные соединения растительного происхождения в субингибиторных концентрациях увеличивают образование биопленок у бактерий.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Бактерии способны чувствовать повышение плотности популяции и отвечать на него быстро и скоординированно индукцией определенных наборов генов. Этот тип регуляции получил название Quorum Sensing (QS); он основан на действии низкомолекулярных сигнальных молекул различной природы, аутоиндукторов, которые накапливаются в культуре при высоких плотностях популяции бактерий и взаимодействуют с рецепторными регуляторными белками. QS системы являются глобальными факторами экспрессии бактериальных генов, они играют ключевую роль в регуляции многих метаболических процессов клетки.

В настоящем обзоре основное внимание будет уделено QS системам бактерий семейства Enterobacteriaceae. Выяснение особенностей, молекулярных механизмов функционирования QS регуляции и ее роли в контроле клеточного метаболизма бактерий этого семейства представляет большой интерес в связи с важностью изучения этих бактерий, вызывающих различные заболевания человека, животных и растений.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Зайцева, Юлия Владимировна

VI. выводы.

5. Сравнительный протеомный анализ клеток исходного штамма и мутантов показал, что экспрессия более 30 белков находится под влиянием SprIR QS-системы.

6. Обнаружена продукция сигнальной молекулы АИ-2 у штамма S. proteamaculans 94. Клонирован и секвенирован ген синтазы АИ-2 QS системы II типа luxS.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зайцева, Юлия Владимировна, Москва

1. Велик, А. С., Завильгельский, Г.Б., Хмель, И.А. Влияние мутаций в генах глобальных регуляторов транскрипции на продукцию аутоиндуктора АИ-2 Quorum Sensing системы Escherichia coli. II Генетика. 2008. - № 44. - С. 1184-1190.

2. Граник, В. Г., Григорьев, Н.Б. Оксид азота N0. Новый путь к поиску лекарств. Москва: Вузовская книга, 2004.

3. Ильина, Т. С., Романова, Ю.М., Гинцбург, АЛ. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина, феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. 2004. -Т. 40, № 11. - С. 1445-1456.

4. Маниатис, Т., Фрич, Э., Сэмбрук, Д. Молекулярное клонирование. Москва Изд. «Мир», 1984.

5. Миллер, Д. Эксперименты в молекулярной генетике. Москва: Изд. «Мир», 1976.

6. Самуилов, В. Д., Олескин, А.В., Лагунова, Е.М. Программируемая клеточная смерть // Биохимия,-2000.-№ 65.-С. 1029—1046.

7. Хмель, И. А., Метлицкая, А.З. Quorum Sensing регуляция экспрессии генов -перспективная мишень для создания лекарств против патогенности бактерий // Молекулярная биология. 2006. -Т. 40, № 2. - С. 195-210.

8. Achtman, М., Zurth, К., Morelli, G., Torrea, G., Guiyoule, A., Carniel, E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis И Proc Natl Acad Sci USA.- 1999. Vol. 96, № 24. - P. 14043-14048.

9. Ahmer, В. M. Cell-to-cell signalling in Escherichia coli and Salmonella enterica 11 Mol Microbiol. 2004. - Vol. 52, № 4. - P. 933-945.

10. Akatsuka, H., Kawai, E., Omori, K., Shibatani, T. The three genes lipB, lipC, and lipD involved in the extracellular secretion of the Serratia marcescens lipase which lacks an N-terminal signal peptide//J Bacteriol. 1995.-Vol. 177, №22.-P. 6381-6389.

11. Allison, C., Lai, H. C., Hughes, C. Co-ordinate expression of virulence genes during swarm-cell differentiation and population migration of Proteus mirabilis II Mol Microbiol. 1992. -Vol. 6, № 12.-P. 1583-1591.

12. Allison, C., Emody, L., Coleman, N., Hughes, C. The role of swarm cell differentiation and multicellular migration in the uropathogenicity of Proteus mirabilis II J Infect Dis. 1994. -Vol. 169, №5.-P. 1 155-1158.

13. Arner, E. S., Holmgren, A. Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase // Eur J Biochem. 2000. - Vol. 267, № 20. - P. 6102-6109.

14. Atkinson, S., Throup, J. P., Stewart, G. S., Williams, P. A hierarchical quorum-sensing system in Yersinia pseudotuberculosis is involved in the regulation of motility and clumping // Mol Microbiol. 1999. - Vol. 33, № 6. - P. 1267-1277.

15. Atkinson, S., Chang, C. Y., Sockett, R. E., Camara, M., Williams, P. Quorum sensing in Yersinia enterocolitica controls swimming and swarming motility // J Bacteriol. 2006. -Vol. 188, № 4. - P. 1451-1461.

16. Atkinson, S., Sockett, R. E., Camara, M., Williams, P. Quorum sensing and the lifestyle of Yersinia II Curr Issues Mol Biol. 2006. - Vol. 8, № 1. - P. 1-10.

17. Balestrino, D., Haagensen, J. A., Rich, C., Forestier, C. Characterization of type 2 quorum sensing in Klebsiella pneumoniae and relationship with biofilm formation // J Bacteriol. 2005. - Vol. 187, № 8. - P. 2870-2880.

18. Bassler, B. L., Wright, M., Showalter, R. E., Silverman, M. R. Intercellular signalling in Vibrio harveyi: sequence and function of genes regulating expression of luminescence // Mol Microbiol. 1993. - Vol. 9, № 4. - P. 773-786.

19. Bassler, B. L., Wright, M., Silverman, M. R. Multiple signalling systems controlling expression of luminescence in Vibrio harveyi: sequence and function of genes encoding a second sensory pathway // Mol Microbiol. 1994. - Vol. 13, № 2. - P. 273-286.

20. Beck von Bodman, S., Farrand, S. K. Capsular polysaccharide biosynthesis and pathogenicity in Erwinia stewartii require induction by an N-acylhomoserine lactone autoinducer // J Bacterid. 1995.-Vol. I77,№ 17.-P. 5000-5008.

21. Binet, R., Letoffe, S., Ghigo, J. M., Delepelaire, P., Wandersman, C. Protein secretion by Gram-negative bacterial ABC exporters—a review // Gene. 1997. - Vol. 192, № 1. - P. 7-11.

22. Bobrov, A. G., Bearden, S. W., Fetherston, J. D., Khweek, A. A., Parrish, K. D., Perry, R. D. Functional quorum sensing systems affect biofilm formation and protein expression in Yersinia pestis II Adv Exp Med Biol. 2007. - Vol. 603. - P. 178-191.

23. Burston, S. G., Clarke, A. R. Molecular chaperones: physical and mechanistic properties // Essays Biochem.- 1995,-Vol. 29.-P. 125-136.

24. Busse, H. J., Denner, E. B., Lubitz, W. Classification and identification of bacteria: current approaches to an old problem. Overview of methods used in bacterial systematics // J Biotechnol. 1996. - Vol. 47, №1.-P. 3-38.

25. Campas, C., Dalmau, M., Montaner, B., Barragan, M., Bellosillo, B., Colomer, D., Pons, G., Perez-Tomas, R., Gil, J. Prodigiosin induces apoptosis of B and T cells from B-cell chronic lymphocytic leukemia // Leukemia. 2003. - Vol. 17, № 4. - P. 746-750.

26. Carlier, A. L., von Bodman, S. B. The rcsA promoter of Pantoea stewartii subsp. stewartii features a low-level constitutive promoter and an EsaR quorum-sensing-regulated promoter // J Bacteriol. 2006. - Vol. 188,№ 12. - P. 4581-4584.

27. Celli, J., Deng, W., Finlay, B. B. Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) attachment to epithelial cells: exploiting the host cell cytoskeleton from the outside // Cell Microbiol. 2000. -Vol. 2, № l.-P. 1-9.

28. Cha, C., Gao, P., Chen, Y. C., Shaw, P. D., Farrand, S. K. Production of acyl-homoserine lactone quorum-sensing signals by gram-negative plant-associated bacteria // Mol Plant Microbe Interact. 1998.-Vol. 11, № 11. - P. 1119-1129.

29. Chen, Y., Cai, J., Murphy, T. J., Jones, D. P. Overexpressed human mitochondrial thioredoxin confers resistance to oxidant-induced apoptosis in human osteosarcoma cells // J Biol Chem.2002. Vol. 277, № 36. - P. 33242-33248.

30. Chernin, L. S. Detection of bacterial homoserine lactone quorum sensing signals. // Molecular Microbial Ecology Manual.-: Kluwer Academic, 2004.-P. 1629-1650.

31. Choi, S. H., Greenberg, E. P. The C-terminal region of the Vibrio fischeri LuxR protein contains an inducer-independent lux gene activating domain // Proc Natl Acad Sci U S A. -1991,-Vol. 883№24 -P 11115-11119

32. Choi, S. H., Greenberg, E. P. Genetic dissection of DNA binding and luminescence gene activation by the Vibrio fischeri LuxR protein // J Bacteriol. 1992. - Vol. 174, № 12. -P. 4064-4069.

33. Christensen, A. B., Riedel, K., Eberl, L., Flodgaard, L. R., Molin, S., Gram, L., Givskov, M. Quorum-sensing-directed protein expression in Serratiaproteamaculans B5a // Microbiology.2003. Vol. 149, № Pt 2. - P. 471-483.

34. Clarke, M. B., Hughes, D. T., Zhu, C., Boedeker, E. C. Sperandio, V. The QseC sensor kinase: a bacterial adrenergic receptor // Proc Natl Acad Sci USA.- 2006. Vol. 103, № 27. -P. 10420-10425.

35. Cook, M. A., Lopez, J. J., Jr. Serratia odorifera biogroup I: an emerging pathogen // J Am Osteopath Assoc. 1998. - Vol. 98, № 9. - P. 505-507.

36. Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms // Annu Rev Microbiol. 1995. - Vol. 49. - P. 711-745.

37. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections // Science. 1999. - Vol. 284, № 5418. - P. 1318-1322.

38. Coulthurst, S. J., Barnard, A. M., Salmond, G. P. Regulation and biosynthesis of carbapenem antibiotics in bacteria // Nat Rev Microbiol. 2005. - Vol. 3, № 4. - P. 295-306.

39. Coulthurst, S. J., Lilley, K. S., Salmond, G. P. Genetic and proteomic analysis of the role of luxS in the enteric phytopathogen, Erwinia carotovora II Mol Plant Pathol. 2006. - Vol. 7, № 1. - P.31-45.

40. Coulthurst. S. J. Clare. S Evans T I Fnnlrk I T Robins K. J., Welch, M„ Douaan G' } - - 7 — -----7 — ■ - *? * ~ ' " J ' " 5 ' " C 5 5

41. Salmond, G. P. Quorum sensing has an unexpected role in virulence in the model pathogen Citrobacter rodentium II EMBO Rep. 2007. - Vol. 8, № 7. - P. 698-703.

42. Cronan, J. E., Jr. Phospholipid modifications in bacteria // Curr Opin Microbiol. 2002. -Vol. 5, №2.-P. 202-205.

43. Danhorn, T., Fuqua, C. Biofilm formation by plant-associated bacteria // Annu Rev Microbiol. -2007.-Vol. 61.-P. 401-422.

44. Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. Quorum sensing and swarming migration in bacteria // FEMS Microbiol Rev. 2004. - Vol. 28, № 3. - P. 261-289.

45. Davies, D. G., Parsek, M. R., Pearson, J. P., Iglewski, B. H., Costerton, J. W., Greenberg, E. P. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm // Science. -1998. Vol. 280, № 5361. - P. 295-298.

46. DeLisa, M. P., Wu, C. F., Wang, L., Valdes, J. J., Bentley, W. E. DNA microarray-based identification of genes controlled by autoinducer 2-stimulated quorum sensing in Escherichia coli IIJ Bacteriol. 2001. - Vol. 183, № 18. - P. 5239-5247.

47. Dennis, J. J., Zylstra, G. J. Plasposons: modular self-cloning minitransposon derivatives for ranid genetic analvsis of PTflm-nftPfltivft bflrtftrifll opnnmp« // Annl Fnvlrnn Mirrnhiril — 1998 —1 u J-----C------------O " O w " f I. * - v ■ .

48. Vol. 64, №7.-P. 2710-2715.

49. Devine, J. H., Shadel, G. S., Baldwin, T. O. Identification of the operator of the lux regulon from the Vibrio fischeri strain ATCC7744 // Proc Natl Acad Sci USA.- 1989. Vol. 86, № 15.-P. 5688-5692.

50. Dufour, A., Furness, R. B., Hughes, C. Novel genes that upregulate the Proteus mirabilis flhDC master operon controlling flagellar biogenesis and swarming // Mol Microbiol. 1998. -Vol. 29, №3,-P. 741-751.

51. Eberl, L., Christiansen, G., Molin, S., Givskov, M. Differentiation of Serratia liquefaciens into swarm cells is controlled by the expression of theflhD master operon // J Bacteriol. 1996. -Vol. 178, №2.-P. 554-559.

52. Eberl, L., Molin, S., Givskov, M. Surface motility of Serratia liquefaciens MG1 // J Bacteriol. -1999.-Vol. 181, №6.-P. 1703-1712.

53. Engelberg-Kulka, H., Sat, B., Reches, M., Amitai, S., Hazan, R. Bacterial programmed cell death systems as targets for antibiotics // Trends Microbiol. 2004. - Vol. 12, № 2. - P. 66-71.

54. Engelberg-Kulka, H., Hazan, R., Amitai, S. mazEF: a chromosomal toxin-antitoxin module that triggers programmed cell death in bacteria // J Cell Sci. 2005. - Vol. 118, № Pt 19. - P. 43274332.

55. Frankel, G., Phillips, A. D., Rosenshine, I., Dougan, G., Kaper, J. B., Knutton, S. Enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli: more subversive elements // Mol Microbiol. 1998. - Vol. 30, № 5. - P. 911-921.

56. Fraser, G. M., Hughes, C. Swarming motility // Curr Opin Microbiol. 1999. - Vol. 2, № 6. -P. 630-635.

57. Fuqua, C., Winans, S. C., Greenberg, E. P. Census and consensus in bacterial ecosystems: the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators // Annu Rev Microbiol. 1996. -Vol. 50.-P. 727-751.

58. Fuqua, C., Greenberg, E. P. Self perception in bacteria: quorum sensing with acylated homoserine lactones//Curr Opin Microbiol. 1998.-Vol. 1,№2.-P. 183-189.

59. Fuqua, C., Greenberg, E. P. Listening in on bacteria: acyl-homoserine lactone signalling // Nat Rev Mol Cell Biol. 2002. - Vol. 3, № 9. - P. 685-695.

60. Fuqua, W. C., Winans, S. C., Greenberg, E. P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators // J Bacteriol. 1994. - Vol. 176, №2.-P. 269-275.

61. Gao, Y., Song, J., Hu, B., Zhang, L., Liu, Q., Liu, F. The luxS gene is involved in AI-2 production, pathogenicity, and some phenotypes in Erwinia amylovora II Curr Microbiol. -2009.-Vol. 58, № l.-P. 1-10.

62. Garrido, C., Gurbuxani, S., P.avagnan, L., Kroemer, G. Heat shock proteins: endogenous modulators of apoptotic cell death // Biochem Biophys Res Commun. 2001. - Vol. 286, № 3. - P. 433-442.

63. Gospodarek, E., Bogiel, T., Zalas-Wiecek, P. Communication between microorganisms as a basis for production of virulence factors // Pol J Microbiol. 2009. - Vol. 58, № 3. - P. 191198.

64. Gould, T. A., Herman, J., Krank, J., Murphy, R. C., Churchill, M. E. Specificity of acyl-homoserine lactone synthases examined by mass spectrometry // J Bacteriol. 2006. -Vol. 188, №2.-P. 773-783.

65. Grogan, D. W., Cronan, J. E., Jr. Cyclopropane ring formation in membrane lipids of bacteria // Microbiol Mol Biol Rev. 1997. - Vol. 61, № 4. - P. 429-441.

66. Hayes, F. Toxins-antitoxins: plasmid maintenance, programmed cell death, and cell cycle arrest //Science.-2003.-Vol. 301, № 5639. P. 1496-1499.

67. Hazan, R., Sat, B., Engelberg-Kulka, H. Escherichia coli mazEF-mediated cell death is triggered by various stressful conditions // J Bacteriol. 2004. - Vol. 186, № 11. - P. 36633669.

68. Heermann, R., Fuchs, T. M. Comparative analysis of the Photorhabdus luminescens and the Yersinia enterocolitica genomes: uncovering candidate genes involved in insect pathogenicity // BMC Genomics. 2008. - Vol. 9. - P. 40.

69. Henrichsen, J. Bacterial surface translocation: a survey and a classification // Bacteriol Rev. -1972. Vol. 36, № 4. - P. 478-503.

70. Hentzer, M., Givskov, M. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections//J Clin Invest. 2003. - Vol. 112, №9.-P. 1300-1307.

71. Hof, H., Stroder, J., Buisson, J. P., Royer, R. Effect of different nitroheterocyclic compounds on aerobic, microaerophilic, and anaerobic bacteria // Antimicrob Agents Chemother. 1986. -Vol. 30, №5. -P. 679-683.

72. Hoffman, L. R., D'Argenio, D. A., MacCoss, M. J., Zhang, Z., Jones, R. A., Miller, S. I. Aminoglycoside antibiotics induce bacterial biofilm formation // Nature. 2005. - Vol. 436, № 7054. - P. 1171-1175.

73. Hofmann, B., Hecht, H. J., Flohe, L. Peroxiredoxins // Biol Chem. 2002. - Vol. 383, № 3-4. -P. 347-364.

74. Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants // Microbiol Mol Biol Rev. 1998. - Vol. 62, № 2. - P. 379-433.

75. Hunt, S., Green, J., Artymiuk, P. J. Hemolysin E (HlyE, ClyA, SheA) and related toxins // Adv Exp Med Biol. 2010. - Vol. 677. - P. 116-126.

76. Janda, J. M., Abbott, S. L. The genus Hafnia: from soup to nuts // Clin Microbiol Rev. 2006. -Vol. 19, № l.-P. 12-18.

77. Johansen, L., Bryn, K., Stormer, F. C. Physiological and biochemical role of the butanediol pathway in Aerobacter (Enterobacter) aerogenes II J Bacteriol. 1975. - Vol. 123, № 3. -P. 1124-1130.

78. Johnson, D. C., Ishihama, A., Stevens, A. M. Involvement of region 4 of the sigma70 subunit of RNA polymerase in transcriptional activation of the lux operon during quorum sensing // FEMS Microbiol Lett. 2003. - Vol. 228, № 2. - P. 193-201.

79. Joshua, G. W„ Karlyshev, A. V., Smith, M. P., Isherwood, K. E., Titball, R. W„ Wren, B. W. A Caenorhabditis elegans model of Yersinia infection: biofilm formation on a biotic surface // Microbiology. 2003. - Vol. 149, № Pt 11. - P. 3221-3229.

80. Katsev, A. M., Wegrzyn, G., Szpilewska, H. Effects of hydrogen peroxide on light emission by various strains of marine luminescent bacteria // J Basic Microbiol. 2004. - Vol. 44, № 3. -P. 178-184.

81. Kolodkin-Gal, I., Hazan, R., Gaathon, A., Carmeli, S., Engelberg-Kulka, H. A linear pentapeptide is a quorum-sensing factor required for waz^F-mediated cell death in Escherichia coli II Science. 2007. - Vol. 318, № 5850. - P. 652-655.

82. Kolodkin-Gal, I., Engelberg-Kulka, H. The extracellular death factor: physiological and genetic factors influencing its production and response in Escherichia coli II J Bacteriol. 2008. -Vol. 190, №9.-P. 3169-3175.

83. Laasik, E., Andresen, L., Mae, A. Type II quorum sensing regulates virulence in Erwinia carotovora ssp. carotovora II FEMS Microbiol Lett. 2006. - Vol. 258, № 2. - P. 227-234.

84. Labbate, M., Queck, S. Y., Koh, K. S., Rice, S. A., Givskov, M., Kjelleberg, S. Quorum sensing-controlled biofilm development in Serratia liquefaciens MG1 // J Bacteriol. 2004. -Vol. 186, №3,-P. 692-698.

85. Law, D. Virulence factors of Escherichia coli OX51 and other Shiga toxin-producing E. coli II J Appl Microbiol. 2000. - Vol. 88, № 5. - P. 729-745.

86. Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K. Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA // BMC Microbiol. 2007. - Vol. 7. - P. 42.

87. Lefebre, M. D., Valvano, M. A. Construction and evaluation of plasmid vectors optimized for constitutive and regulated gene expression in Burkholderia cepacia complex isolates // Appl Environ Microbiol. 2002. - Vol. 68, № 12. - P. 5956-5964.

88. Lerat, E., Moran, N. A. The evolutionary history of quorum-sensing systems in bacteria // Mol Biol Evol. 2004. - Vol. 21, № 5. - P. 903-913.

89. Levine, M. M. Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxigenic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic, and enteroadherent // J Infect Dis. 1987. - Vol. 155, № 3. -P. 377-389.

90. Lewis, K. Programmed death in bacteria // Microbiol Mol Biol Rev. 2000. - Vol. 64, № 3. -P.503-514.

91. Liao, C. H., Revear, L., Hotchkiss, A., Savary, B. Genetic and biochemical characterization of an exopolygalacturonase and a pectate lyase from Yersinia enterocolitica II Can J Microbiol. -1999. Vol. 45, № 5. - P. 396-403.

92. Linares, J. F., Gustafsson, I., Baquero, F., Martinez, J. L. Antibiotics as intermicrobial signaling agents instead of weapons // Proc Natl Acad Sci USA.- 2006. Vol. 103, № 51. - P. 1948419489.

93. Lindsay, A., Ahmer, B. M. Effect of sdiA on biosensors of N-acylhomoserine lactones // J Bacteriol. 2005. - Vol. 187, № 14. - P. 5054-5058.

94. Liu, X., Matsumura, P. The FlhD/FlhC complex, a transcriptional activator of the Escherichia coli flagellar class II operons // J Bacteriol. 1994. - Vol. 176, № 23. - P. 7345-7351.

95. Liu, X., Jia, J., Popat, R., Ortori, C. A., Li, J., Diggle, S. P., Gao, K., Camara, M.

96. C.hprar.terination of two miorum cpncincr cvctf^mc in thp f»nHr»r*V»\/tir' ^owntiri ctfoir»--------------------- ~ . -j--------------. fSVJ'lltl'IH Jl'WIII

97. G3: differential control of motility and biofilm formation according to life-style // BMC Microbiol.-2011.-Vol. 11,№ l.-P. 26.

98. Lonon, M. K., Woods, D. E., Straus, D. C. Production of lipase by clinical isolates of Pseudomonas cepacia IIJ Clin Microbiol. 1988. - Vol. 26, № 5. - P. 979-984.

99. Lukjancenko, O., Wassenaar, T. M., Ussery, D. W. Comparison of 61 sequenced Escherichia coli genomes // Microb Ecol. 2010. - Vol. 60, № 4. - P. 708-720.

100. Lyte, M., Arulanandam, B. P., Frank, C. D. Production of Shiga-like toxins by Escherichia coli 0157:H7 can be influenced by the neuroendocrine hormone norepinephrine // J Lab Clin Med. 1996.-Vol. 128, №4. -P. 392-398.

101. Mahlen, S. D. Serratia infections: from military experiments to current practice // Clin Microbiol Rev.-2011.-Vol. 24, №4.-P. 755-791.

102. Maitra, S. K., Nachum, R., Pearson, F. C. Establishment of beta-hydroxy fatty acids as chemical marker molecules for bacterial endotoxin by gas chromatography-mass spectrometry // Appl Environ Microbiol. 1986.-Vol. 52, №3,-P. 510-514.

103. Mattinen, L., Tshuikina, M., Mae, A., Pirhonen, M. Identification and characterization of Nip, necrosis-inducing virulence protein of Erwinia carotovora subsp. carotovora II Mol Plant Microbe Interact.-2004.-Vol. 17,№ 12.-P. 1366-1375.

104. Mayer, D., Schlensog, V., Bock, A. Identification of the transcriptional activator controlling the butanediol fermentation pathway in Klebsiella terrigena II J Bacteriol. 1995. - Vol. 177, № 18.-P. 5261-5269.

105. Mayer, M. P., Bukau, B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism // Cell Mol Life Sci. 2005. - Vol. 62, № 6. - P. 670-684.

106. Salmond, G. P. Analysis of bacterial carbapenem antibiotic production genes reveals a novel beta-lactam biosynthesis pathway // Mol Microbiol. 1996. - Vol. 22, № 3. - P. 415-426.

107. Meighen, E. A., Dunlap, P. V. Physiological, biochemical and genetic control of bacterial bioluminescence // Adv Microb Physiol. 1993. - Vol. 34. - P. 1 -67.

108. Description of Pantoea stewartii subsp. indologenes subsp. nov. // International journal of systematic bacteriology. 1993. - Vol. 43, № l.-P. 162-173.

109. Michael, B., Smith, J. N., Swift, S., Heffron, F., Ahmer, B. M. SdiA of Salmonella enterica is a LuxR homolog that detects mixed microbial communities // J Bacteriol. 2001. - Vol. 183, № 19.-P. 5733-5742.

110. Miller, M. B., Bassler, B. L. Quorum sensing in bacteria // Annu Rev Microbiol. 2001. -Vol. 55.-P. 165-199.

111. Mittenhuber, G. Occurrence of mazEF-Yike antitoxin/toxin systems in bacteria // J Mol Microbiol Biotechnol. 1999. - Vol. 1, № 2. - P. 295-302.

112. Molina, L., Rezzonico, F., Defago, G., Duffy, B. Autoinduction in Erwinia amylovora:

113. P.viHftnr.P; nf an flfvl-linmOQprinf» lartnnp cicrnal in flip firf» hlirrlit nothnrrpn // I Rcx^tprirJ TAQ^- ----------------- -------J'---------------------------- --------,, V-Vol. 187, №9.-P. 3206-3213.

114. Montaner, B., Perez-Tomas, R. The prodigiosins: a new family of anticancer drugs // Curr Cancer Drug Targets. 2003. - Vol. 3, № 1. - P. 57-65.

115. Moons, P., Van Houdt, R., Vivijs, B., Michiels, C. W., Aertsen, A. Integrated regulation of acetoin fermentation by quorum sensing and pH in Serratia plymuthica RVH1 // Appl Environ Microbiol.-2011.-Vol. 77, № 10.-P. 3422-3427.

116. More, M. I., Finger, L. D., Stryker, J. L., Fuqua, C., Eberhard, A., Winans, S. C. Enzymatic synthesis of a quorum-sensing autoinducer through use of defined substrates // Science. 1996. -Vol. 272, №5268.-P. 1655-1658.

117. Morohoshi, T., Inaba, T., Kato, N., Kanai, K., Ikeda, T. Identification of quorum-sensing signal molecules and the LuxRI homologs in fish pathogen Edwardsiella tarda II J Biosci Bioeng. -2004. Vol. 98, № 4. - P. 274-281.

118. Morohoshi, T., Yokoyama, Y., Ouchi, M., Kato, N., Ikeda, T. Motility and the expression of the flagellin protein FliC are negatively regulated by quorum sensing in Edwardsiella tarda II J Biosci Bioeng.-2009.-Vol. 108,№4.-P. 314-318.

119. Morohoshi, T., Ogata, Y., Ikeda, T. Cell aggregation is negatively regulated by N-acylhomoserine lactone-mediated quorum sensing in Pantoea ananatis SK-1 // J Biosci Bioeng. -2011.-Vol. 112, №6.-P. 566-569.

120. Nakamoto, H., Vigh, L. The small heat shock proteins and their clients // Cell Mol Life Sci. -2007. Vol. 64, № 3. - P. 294-306.

121. Nasser, W., Bouillant, M. L., Salmond, G., Reverchon, S. Characterization of the Erwinia chrysanthemi expI-expR locus directing the synthesis of two N-acyl-homoserine lactone signal molecules // Mol Microbiol. 1998. - Vol. 29, № 6. - P. 1391 -1405.

122. Nesse, L. L., Berg, K., Vestby, L. K., Olsaker, I., Djonne, B. Salmonella Typhimurium invasion of HEp-2 epithelial cells in vitro is increased by N-acylhomoserine lactone quorum sensing signals // Acta Vet Scand. 2011. - Vol. 53. - P. 44.

123. Nivens, D. E., Ohman, D. E., Williams, J., Franklin, M. J. Role of alginate and its O acetylation in formation of Pseudomonas aeruginosa microcolonies and biofilms // J Bacteriol. 2001. -Vol. 183, №3,-P. 1047-1057.

124. O'Toole, G. A., Kolter, R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development // Mol Microbiol. 1998. - Vol. 30, № 2. - P. 295-304.

125. Ovadis, M., Liu, X., Gavriel, S., Ismailov, Z., Chet, I., Chernin, L. The global regulator genes from biocontrol strain Serratia plymuthica 1C1270: cloning, sequencing, and functional studies // J Bacteriol. 2004. - Vol. 186, № 15. - P. 4986-4993.

126. Pandey, D. P., Gerdes, K. Toxin-antitoxin loci are highly abundant in free-living but lost from host-associated prokaryotes // Nucleic Acids Res. 2005. - Vol. 33, № 3. - P. 966-976.

127. Parker, W. L., Rathnum, M. L., Wells, J. S., Jr., Trejo, W. H., Principe, P. A., Sykes, R. B. SQ 27,860, a simple carbapenem produced by species of Serratia and Erwinia II J Antibiot (Tokyo). 1982. - Vol. 35, № 6. - P. 653-660.

128. Parsek, M. R., Val, D. L., Hanzelka, B. L., Cronan, J. E., Jr., Greenberg, E. P. Acyl homoserine-lactone quorum-sensing signal generation // Proc Natl Acad Sci USA.- 1999. -Vol. 96, №8. -P. 4360-4365.

129. Parsek, M. R., Greenberg, E. P. Acyl-homoserine lactone quorum sensing in gram-negative bacteria: a signaling mechanism involved in associations with higher organisms // Proc Natl Acad Sci USA.- 2000. Vol. 97, № 16. - P. 8789-8793.

130. Pearson, J. P., Van Delden, C., Iglewski, B. H. Active efflux and diffusion are involved in transport of Pseudomonas aeruginosa cell-to-cell signals H J Bacteriol. — 1999. — Vol. 181, №4.-P. 1203-1210.

131. Perez-Tomas, R., Montaner, B., Llagostera, E., Soto-Cerrato, V. The prodigiosins, proapoptotic drugs with anticancer properties // Biochem Pharmacol. 2003. - Vol. 66, № 8. - P. 14471452.

132. Persson, T., Givskov, M., Nielsen, J. Quorum sensing inhibition: targeting chemical communication in gram-negative bacteria // Curr Med Chem. 2005. - Vol. 12, № 26. -P. 3103-3115.

133. Rasmussen, T. B., Givskov, M. Quorum sensing inhibitors: a bargain of effects // Microbiology. 2006. - Vol. 152, № Pt 4. - P. 895-904.

134. Reisner. A., Haagensen. J. A., Schembri. M. A., Zechner, E. L., Molin, S. Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms // Mol Microbiol. 2003. - Vol. 48, № 4. -P.933-946.

135. Ren, D., Sims, J. J., Wood, T. K. Inhibition of biofilm formation and swarming of Escherichia coli by (5Z)-4-bromo-5-(bromomethylene)-3-butyl-2(5H)-furanone // Environ Microbiol. -2001.-Vol. 3, № 11.-P. 731-736.

136. Rezzonico, F., Duffy, B. The role of luxS in the fire blight pathogen Erwinia amylovora is limited to metabolism and does not involve quorum sensing // Mol Plant Microbe Interact. -2007. Vol. 20, № 10. - P. 1284-1297.

137. Rezzonico, F., Duffy, B. Lack of genomic evidence of AI-2 receptors suggests a non-quorum sensing role for luxS in most bacteria // BMC Microbiol. 2008. - Vol. 8. - P. 154.

138. Rice, S. A., Koh, K. S., Queck, S. Y., Labbate, M., Lam, K. W., Kjelleberg, S. Biofilm formation and sloughing in Serratia marcescens are controlled by quorum sensing and nutrient cues//J Bacteriol.-2005.-Vol. 187, № 10.-P. 3477-3485.

139. Riedel, K., Ohnesorg, T., Krogfelt, K. A., Hansen, T. S., Omori, K., Givskov, M., Eberl, L. N-acyl-L-homoserine laetone-mediated regulation of the lip secretion system in Serratia liquefaciens MG1 //J Bacteriol. 2001. - Vol. 183, №5.-P. 1805-1809.

140. Salmond, G. P., Bycroft, B. W., Stewart, G. S., Williams, P. The bacterial 'enigma': cracking the code of cell-cell communication // Mol Microbiol. 1995. - Vol. 16, № 4. - P. 615-624.

141. Schaefer, A. L., Hanzelka, B. L., Eberhard, A., Greenberg, E. P. Quorum sensing in Vibrio fischeri: probing autoinducer-LuxR interactions with autoinducer analogs // J Bacteriol. 1996. - Vol. 178, № 10. - P. 2897-2901.

142. Schauder, S., Bassler, B. L. The languages of bacteria // Genes Dev. 2001. - Vol. 15, № 12. -P. 1468-1480.

143. Schauder, S., Shokat, K., Surette, M. G., Bassler, B. L. The LuxS family of bacterial autoinducers: biosynthesis of a novel quorum-sensing signal molecule // Mol Microbiol. -2001. Vol. 41, № 2. - P. 463-476.

144. Schneider, R., Lockatell, C. V., Johnson, D., Belas, R. Detection and mutation of a luxS-encoded autoinducer in Proteus mirabilis II Microbiology. 2002. - Vol. 148, № Pt 3. -P. 773-782.

145. Sharma, V. K., Bearson, S. M., Bearson, B. L. Evaluation of the effects of sdiA, a luxR homoloaue. on adherence and motilitv of Escherichia r.nli 0157 • H7 // Mir.rnhinlnov — 2f>10------j -------------------. ----Vol. 156, № Pt 5. P. 1303-1312.

146. Sinensky, M. Homeoviscous adaptation—a homeostatic process that regulates the viscosity of membrane lipids in Escherichia coli II Proc Natl Acad Sci USA.- 1974. Vol. 71, № 2. -P. 522-525.

147. Sjoblom, S., Brader, G., Koch, G., Palva, E. T. Cooperation of two distinct ExpR regulators controls quorum sensing specificity and virulence in the plant pathogen Erwinia carotovora H Mol Microbiol. 2006. - Vol. 60, № 6. - P. 1474-1489.

148. Slock, J., VanRiet, D., Kolibachuk, D., Greenberg, E. P. Critical regions of the Vibrio fischeri luxR protein defined by mutational analysis // J Bacteriol. 1990. - Vol. 172, № 7. - P. 39743979.

149. Smadja, B., Latour, X., Faure, D., Chevalier, S., Dessaux, Y., Orange, N. Involvement of N-acylhomoserine lactones throughout plant infection by Erwinia carotovora subsp. atroseptica II Mol Plant Microbe Interact. 2004. - Vol. 17,№ ll.-P. 1269-1278.

150. Smith, J. L., Fratamico, P. M., Yan, X. Eavesdropping by bacteria: the role of SdiA in Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium quorum sensing // Foodborne PathogDis.-2011.-Vol. 8, №2.-P. 169-178.

151. Smith, J. N., Ahmer, B. M. Detection of other microbial species by Salmonella-, expression of the SdiA regulon//J Bacteriol.-2003.-Vol. 185,№4.-P. 1357-1366.

152. Snaidr, J., Amann, R., Huber, I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic analysis and in situ identification of bacteria in activated sludge // Appl Environ Microbiol. 1997. - Vol. 63, № 7. -P. 2884-2896.

153. Sperandio, V., Torres, A. G., Giron, J. A., Kaper, J. B. Quorum sensing is a global regulatory mechanism in enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 // J Bacteriol. 2001. - Vol. 183, № 17.-P. 5187-5197.

154. Sperandio, V., Torres, A. G., Jarvis, B., Nataro, J. P., Kaper, J. B. Bacteria-host communication: the language of hormones // Proc Natl Acad Sci USA.- 2003. Vol. 100, № 15.-P. 8951-8956.

155. Stankowska, D., Czerwonka, G., Rozalska, S., Grosicka, M., Dziadek, J., Kaca, W. Influence of quorum sensing signal molecules on biofilm formation in Proteus mirabilis 018 // Folia Microbiol (Praha). 2011.

156. Stevens, A. M., Fujita, N., Ishihama, A., Greenberg, E. P. Involvement of the RNA polymerase alpha-subunit C-terminal domain in LuxR-dependent activation of the Vibrio fischeri luminescence genes // J Bacteriol. 1999. - Vol. 181, № 15. - P. 4704-4707.

157. Su, L. H., Chiu, C. H. Salmonella: clinical importance and evolution of nomenclature // Chang GungMed J.-2007.-Vol. 30, №3,-P. 210-219.

158. Surette, M. G., Bassler, B. L. Quorum sensing in Escherichia coli and Salmonella typhimurium II Proc Natl Acad Sci USA.- 1998. Vol. 95, № 12. - P. 7046-7050.

159. Surette, M. G., Miller, M. B., Bassler, B. L. Quorum sensing in Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harveyv. a new family of genes responsible for autoinducer production // Proc Natl Acad Sci USA.- 1999. Vol. 96, № 4. - P. 1639-1644.

160. Syu, M. J. Biological production of 2,3-butanediol // Appl Microbiol Biotechnol. 2001. -Vol. 55, № l.-P. 10-18.

161. Szpilewska, H., Czyz, A., Wegrzyn, G. Experimental evidence for the physiological role of bacterial luciferase in the protection of cells against oxidative stress // Curr Microbiol. — 2003. — Vol. 47, №5. -P. 379-382.

162. Taga, M. E., Semmelhack, J. L., Bassler, B. L. The LuxS-dependent autoinducer AI-2 controls the expression of an ABC transporter that functions in AI-2 uptake in Salmonella typhimurium II Mol Microbiol. 2001. - Vol. 42, № 3. p. 777-793.

163. Taga, M. E., Miller, S. T., Bassler, B. L. Lsr-mediated transport and processing of AI-2 in Salmonella typhimurium II Mol Microbiol. 2003. - Vol. 50, № 4. - P. 1411-1427.

164. Thomson, N. R., Crow, M. A., McGowan, S. J., Cox, A., Salmond, G. P. Biosynthesis of carbapenem antibiotic and prodigiosin pigment in Serratia is under quorum sensing control // Mol Microbiol. 2000. - Vol. 36, № 3. - P. 539-556.

165. Tomlin, K. L., Malott, R. J., Ramage, G., Storey, D. G., Sokol, P. A., Ceri, H. Quorum-sensing mutations affect attachment and stability of Burkholderia cenocepacia biofilms // Appl Environ Microbiol.-2005.-Vol. 71, №9.-P. 5208-5218.

166. Toth, I. K., Bell, K. S., Holeva, M. C., Birch, P. R. Soft rot erwiniae: from genes to genomes // Mol Plant Pathol. 2003. - Vol. 4, № 1. - P. 17-30.

167. Toth, 1. K., Pritchard, L., Birch, P. R. Comparative genomics reveals what makes an enterobacterial plant pathogen // Annu Rev Phytopathol. 2006. - Vol. 44. - P. 305-336.

168. Tsai, C. S., Winans, S. C. The quorum-hindered transcription factor YenR of Yersinia enterocolitica inhibits pheromone production and promotes motility via a small non-coding RNA//Mol Microbiol.-2011.-Vol. 80, №2.-P. 556-571.

169. Val, D. L., Cronan, J. E., Jr. In vivo evidence that S-adenosylmethionine and fatty acid synthesis intermediates are the substrates for the Luxl family of autoinducer synthases // J Bacteriol. 1998. - Vol. 180,№ 10.-P. 2644-2651.

170. Walters, M., Sircili, M. P., Sperandio, V. AI-3 synthesis is not dependent on luxS in Escherichia coli IIJ Bacteriol. 2006. - Vol. 188, № 16. - P. 5668-5681.

171. Walters, M., Sperandio, V. Quorum sensing in Escherichia coli and Salmonella II Int J Med Microbiol. 2006. - Vol. 296, № 2-3. - P. 125-131.

172. Wang, L., Li, J., March, J. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. /«x^-dependent gene regulation in Escherichia coli K-12 revealed by genomic expression profiling // J Bacteriol. 2005. -Vol. 187, № 24. - P. 8350-8360.

173. Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria // Annu Rev Cell Dev Biol. 2005. - Vol. 21. - P. 319-346.

174. Watson, W. T., Minogue, T. D., Val, D. L., von Bodman, S. B., Churchill, M. E. Structural basis and soecificitv of aevl-homoserine lactone s i sns! product ion in bsc tcnsl cj vioruiTi sensing1 J J O r n O

175. Mol Cell. 2002. - Vol. 9, № 3. - P. 685-694.

176. Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // J Bacteriol. 1991. - Vol. 173, № 2. - P. 697-703.

177. Welch, M., Todd, D. E„ Whitehead, N. A., McGowan, S. J., Bycroft, B. W., Salmond, G. P. N-acyl homoserine lactone binding to the CarR receptor determines quorum-sensing specificity in Erwinia II Embo J. 2000. - Vol. 19, № 4. - P. 631 -641.

178. Xavier, K. B., Bassler, B. L. Interference with AI-2-mediated bacterial cell-cell communication // Nature. 2005. - Vol. 437, № 7059. - P. 750-753.

179. Xavier, K. B., Bassler, B. L. Regulation of uptake and processing of the quorum-sensing autoinducer AI-2 in Escherichia coli IIJ Bacteriol. 2005. - Vol. 187, № 1. - P. 238-248.

180. Yoo, J. S„ Jung, Y. J., Chung, S. Y., Lee, Y. C., Choi, Y. L. Molecular cloning and characterization of CMCase gene (ce/C) from Salmonella typhimurium UR // J Microbiol. -2004. Vol. 42, № 3. - P. 205-210.

181. Young, G. M., Badger, J. L., Miller, V. L. Motility is required to initiate host cell invasion by Yersinia enterocolitica H Infect Immun. 2000. - Vol. 68, № 7. - P. 4323-4326.

182. Zhang, Y., Zhang, J., Hoeflich, K. P., Ikura, M., Qing, G., Inouye, M. MazF cleaves cellular mRNAs specifically at ACA to block protein synthesis in Escherichia coli II Mol Cell. 2003. -Vol. 12, №4.-P. 913-923.

183. Zhang, Y., Zhang, J., Hara, H., Kato, I., Inouye, M. Insights into the mRNA cleavage mechanism by MazF, an mRNA interferase // J Biol Chem. 2005. - Vol. 280, № 5. - P. 31433150.

184. Zhu, H., Sun, S. J., Dang, H. Y. PCR detection of Serratia spp. using primers targetingpfs and luxS genes involved in AI-2-dependent quorum sensing // Curr Microbiol. 2008. - Vol. 57, №4.-P. 326-330.

Информация о работе

Зайцева, Юлия Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.02.07

Диссертация

Молекулярно-генетические особенности Quorum Sensing систем грамотрицательных бактерий (на модели Serratia) и изучение их роли в регуляции клеточных процессов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы