Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутантные копии митохондриальной ДНК в тканях и плазме крови мышей, подвергнутых радиационному воздействию

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Мутантные копии митохондриальной ДНК в тканях и плазме крови мышей, подвергнутых радиационному воздействию"

На правах рукописи

Абдуллаев Серажутдин Абдуллаевич

МУТАНТНЫЕ КОПИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК В ТКАНЯХ И ПЛАЗМЕ КРОВИ МЫШЕЙ, ПОДВЕРГНУТЫХ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ

03.01.01 - радиобиология, биологические науки

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2010

2 5 НОЯ 2010

004614179

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт Теоретической и экспериментальной биофизики РАН (ИТЭБ РАН).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Газиев Ажуб Ибрагимович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Рубанович Александр Владимирович

доктор биологических наук Осипов Андреян Николаевич

Ведущая организация: Объединенный институт ядерных

исследований, г. Дубна

Защита состоится « /¿Л» 2010 г в ч мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.65 при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы, дом 1, Биологический факультет, аудитория 557

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Отзывы просим присылать по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, Веселовой Т.В. Факс: (495) 939-11-15 Автореферат разослан «¿/А 2010 г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Т.В. Веселова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование структурно-функциональных

нарушений генома в клетках человека и животных, подвергнутых воздействию

ионизирующими излучениями (ИИ), остается актуальной проблемой. Многие

основополагающие исследования по данной проблеме проводятся,

ориентируясь на важнейшую мишень радиационного поражения - ядерную

ДНК (яДНК). Однако, хорошо известно, что в клетках млекопитающих, кроме

яДНК, содержатся и множество копии митохондриальная ДНК (мтДНК). В ШМЛг

настоящее рассматривается, что мтДНК является более уязвимой мишенью клетки, по сравнению с яДНК, для эндогенных и экзогенных повреждающих агентов [LeDoux, Wilson, 2005; Wallace et al., 2010].

МтДНК в структурной организации и функционировании имеет ряд особенностей, отличных от яДНК. Так, мтДНК содержит гены, кодирующие белки системы дыхательной цепи [Shadel and Clayton, 1997; Falkenberg et al., 2007]. Для нее характерна повышенная мутабильность, благодаря повреждениям, индуцируемым активными формами кислорода (АФК), генерируемыми в самих митохондриях и ошибками репликативного синтеза [Graziewicz et al., 2006; Larsson, 2010]. В тканях (в том числе в постмитотических тканях мозга, сердца, скелетных мышц) мтДНК может реплицироваться независимо от клеточного цикла в течение всей жизни организма [Wallace 2005; Falkenberg et al., 2007]. Результаты многих исследований показывают, что в мтДНК возникает в 3-50 раз больше повреждений, чем в соразмерном фрагменте яДНК, при воздействии на клетки ИИ, химических мутагенов [Marcelino., Thilly , 1999; Газиев, Шайхаев, 2008]. Процессы репарации ДНК в митохондриях клеток функционируют недостаточно эффективно [Газиев., Подлуцкий, 2003; Stuart., Brown, 2006; Gredilla et al., 2010]. Если репликация поврежденной яДНК блокируется индуцибельной системой контроля точек хода клеточного цикла до завершения ее репарации, то эта система не блокирует репликацию поврежденной мтДНК в митохондриях [Cleaver,1992; Kulawiec et al., 2009]. Возможно, именно по этим

причинам в мтДНК наблюдается накопление мутаций с более высокой частотой, чем в яДНК [Marcelino., Thilly , 1999; Khrapko, Vijg, 2009], с которым связаны клеточная гибель, нестабильность генома [Skulachev, 2006; Norberg et al., 2010].

Вместе с тем, хотя в радиобиологических исследованиях много внимания уделяется радиационному нарушению энергетического метаболизма, сведения по радиационному мутагенезу мтДНК в клетках человека или животных, подвергшихся воздействию ИИ на уровне целого организма, в литературе ограничены и противоречивы.

Стабильность и сохранение митохондриального генома, изменение количества копий мтДНК (дозы генов мтДНК) в клетках играют важную роль в адаптации человека к различным условиям внешней среды. С нарушениями мтДНК ассоциируются широкий спектр заболеваний, ослабление функций тканей, нарушения иммунной системы, развитие опухолевых патологий, старения [Schapira, 2006; Koene, Smeitink, 2009; Wallace, Fan, 2009; Krishnan, Turnbull, 2010; Baines, 2010; Shutt, Shadel, 2010]. Поэтому, исследование возникновения, аккумуляции мутантных копий мтДНК и изменения количественного содержания копий мтДНК в клетках тканей организма млекопитающих, подвергнутых воздействию ИИ, представляется актуальным и востребованным.

Цель исследования:

Цель исследования состояла в определении уровня мутантных копий мтДНК и общего содержания копий мтДНК в тканях и в плазме крови мышей, подвергнутых воздействию ионизирующего излучения.

В задачи работы входило:

1. Выбор и адаптация чувствительного метода для скрининга радиационно-индуцированных мутаций мтДНК тканей мышей.

2. Исследование уровня мутантных копий мтДНК и общего количества копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей в пострадиационный период.

3. Определение динамики изменения количества внеклеточных мутантных копий и общего содержания копий мтДНК, относительно ядерной ДНК, в плазме крови мышей в пострадиационный период.

Научная новизна работы.

Адаптирован и впервые применен метод, основанный на использовании CEL-I эндонуклеазы, специфически расщепляющей ДНК с неспаренными основаниями, для выявления мутаций мтДНК, индуцируемых ИИ in vivo. Сравнение результатов, получаемых CEL-1 эндонуклеазным методом и TTGE-методом (temporal temperature gradient gel electrophoresis -метод) показало, что первый метод более чувствителен, он позволяет анализировать большое количество образцов, дает воспроизводимые результаты и экономичен.

В работе впервые установлено, что в клетках тканей (головной мозг, селезенка) мышей, подвергнутых воздействию рентгеновского излучения, резко возрастает уровень мутантных копий мтДНК с максимумом на 8-й день после облучения и последующим снижением их содержания к 28-у дню пострадиационного времени.

Мутагенез мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей, как и мутагенез ядерных генов (литературные данные), имеет линейную зависимость от дозы рентгеновского излучения (в пределах 1-5 Гр). Результаты анализов мутантных копий мтДНК головного мозга и селезенки облученных мышей показывают снижение количества мутантных копий мтДНК в пострадиационный период. В ткани селезенки этот процесс происходит более активно, чем в ткани головного мозга. Вместе с тем, общее количество копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей, определяемое относительно гена яДНК методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), остается в течение всего пострадиационного времени (8-28 дней) без изменения, хотя и ниже на 25-40% данных контрольной группы (при дозе облучения 5 Гр).

В данном исследовании впервые установлено, что в кровоток облученных мышей в течение пострадиационного времени поступает большое количество

циркулирующей вк-мтДНК, существенная часть которой представлена мутантными копиями. Уровень вк-мтДНК с мутациями в плазме крови мышей зависит от дозы их облучения. Динамика изменения общего содержания циркулирующей вк-мтДНК и уровня ее мутантных копий в плазме облученных мышей отличается от таковой в тканях селезенки и мозга этих же животных. Увеличение содержания мутантных копий вк-мтДНК в плазме облученных мышей совпадает со снижением их уровня в тканях этих же животных. Повышенное содержание мутированных вк-мтДНК в плазме крови облученных мышей свидетельствует об их активной элиминации из клеток тканей в пострадиационный период.

Практическая иенность работы. Результаты исследования радиационного мутагенеза мтДНК и изменения уровня мутантных копий мтДНК в тканях облученных животных в пострадиационной период существенно дополняют знания о механизмах развития лучевой реакции организма. Полученные результаты и использованные методические подходы могут быть применены в дальнейших экспериментальных исследованиях и в клинической практике при радиотерапии опухолей.

Важным результатом, ориентированным на практическое использование, является обнаружение повышенного уровня мутантных копий вк-мтДНК и увеличения содержания общей мтДНК в плазме облученных животных. Поскольку мтДНК является более уязвимой мишенью (чем яДНК) для ИИ и других генотоксических агентов, то повышенное содержание вк-мтДНК с мутациями в плазме крови мышей после радиационного воздействия можно рассматривать как потенциальный биомаркер для оценки радиационного поражения и наличия генотоксического груза.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2007, 2008, 2009, 2010 гг.); на конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии» (Санкт-Петербург, 2008 г.); на конференции «Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии» (Дубна, 2009

г.); на XVI Международной научной конференции молодых ученых «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2009 г.); на Симпозиуме «Пространственно-временные эффекты в радиационной биологии (Испания, Сант Фелиу де Гишолс, 2009); на 37-ой годичной конференции Европейского общества по радиационным исследованиям (Прага, 2009); на III Евразийском конгрессе по медицинской физике «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской физики и инженерии» (Москва, 2010); на 38-ой годичной конференции Европейского общества по радиационным исследованиям (Швеция, Стокгольм, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе, 5 статей в журналах из списка ВАК и 15 тезисов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах, иллюстрирована 2 таблицами и 22 рисунками. Библиографический указатель содержит 221 источников литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В работе использовались самцы мышей линии ВАЬВ/с 2-х месячного возраста. Мышей подвергали облучению на рентгеновской установке РТУ-12 (Медрентген, Россия). После забоя у мышей на исследования брали ткани головного мозга (полушария), селезенки и кровь.

Выделение ДНК. Образцы ДНК выделяли стандартным фенол-хлороформным методом. Внеклеточную ДНК из плазмы выделяли методом адсорбции на магнитных сорбентах с использованием набора реагентов, полученных от ООО "Лаборатория Изоген" (г. Москва).

СЕЬ-1 эндонуклеаза. Большинство анализов были выполнены с использованием СЕЬ-1 эндонуклеазы (Тгап5§епопмс, (США). В части

экспериментов была использована CEL-I эндонуклеаза, выделенная из сельдерея {Apium graveolens), как описано в работах [Yang et al., 2000].

ПЦР-амплификация участков ДНК. Были амплифицированы три участка мтДНК мыши: два из них - последовательности D-loop 1, D-loop 2, и один участок гена ND3 (534 п.н.).

Таблица 1. Анализируемые локусы ДНК и последовательности праймеров, зондов использованных для их амплификации.

Локусы ДНК Размер п.н. Праймеры и зонды 5'—>3' последовательность

D-loop 1 1092 D-1-lfor D-1-lrev -taa аса tta ctc tgg tot tgt aaa cc--att aat aag gcc agg acc aaa cct-

D-loop 2 437 D-1-2 for D-1-2 rev -agg cat gaa agg аса gca c--ata agg cca gga cca aac c-

ND3 534 ND3for ND3rev -agc tct cca ttt att gat gag g--gag gtt gaa gaa ggt aga tgg c-

р53 человека 415 p53 for p53 rev -cac agg tct ccc caa ggc gca c--ggg ccc agg ggt cag egg caa-

ND4 115 ND4 for ND4rev ND4pr -att att att acc cga tga ggg aac c--att aag atg agg gca att age agt-FAM acg cct aaa egс agg gat tía ttt cct a--BHQ-1

ß-actin 110 ß-ac-for ß-ac-rev ß-ac-pr -ctg cct gac ggc cag g--gga aaa gag cct cag ggc at-ROX-cat cac tat tgg caa cga gcg gtt cc--BHO-2

GÄPDH 214 Gapd-for Gapd-rev Gapd-pr -gtg agg gag atg ctc agt gt--ctg gca ttg ctc tea atg ac-ROX-taa gaa acc ctg gac cac cca ccc c--BHQ-2

Все праймеры для амплификации участков мтДНК были выбраны согласно [GenBank W00711.1]. Синтез праймеров и зондов был заказан у фирмы «Синтол» (Москва). Реакционная смесь ПЦР (25-50 мкл) содержала: 75 мМ Трис-HCI, pH 8.8, 20 мМ (NH,)2S04, 2.5 мМ MgCI2, 200 мкМ каждого dNTP, 250 нМ каждого праймера, 0.01% твин-20. В реакционную смесь вводили 1 нг ДНК и 1 единицу суммарную смеси Taq-и P/u-полимераз (Fermentas, Литва), которую вносили методом "горячего старта" после первичной

денатурации ДНК-матриц при 94°С в течение 4-х минут. ПЦР проводили в режиме 30-35 циклов: денатурация 30 секунд при 94°С, отжиг 45 секунд при 62°С и элонгация 45 секунд при 72°С, после которых - завершающая инкубация 4 минуты при 72°С.

Выявление мутаций мтДНК методом гель-электрофореза при временном градиенте температуры (метод-TTGE). Были использованы ПЦР-ампликоны участков D-loop 1, D-loop 2 и ND3, а также фрагмент гена р53 человека (табл.1), как описано в работах [Wong et al., 2002]. Анализы проводили на универсальной системе (D-Code, Bio-Rad, США) при 145 V в течение 5.0 - 5.5 часов при постоянном возрастании температуры геля 1.0 - 1.2 °С/час (в диапазоне 54 - 60 °С). Область температур была подобрана компьютерным моделированием (MacMelt software; Bio-Rad Laboratories).

Выявление мутаций мтДНК методом CEL-I эндонуклеазы. Метод определения мутаций с использованием CEL-I эндонуклеазы включал стадии получения ПЦР-ампликонов из фрагментов мтДНК облученных и контрольных животных с последующим получением из них гетеродуплексов. После обработки гетеродуплексов CEL-I эндонуклеазой, продукты их расщепления определяли методом электрофореза. В качестве эталонных образцов были получены гетеродуплексы ПЦР-ампликонов участков дикого и мутантного гена р53 и гетеродуплексы от двух параллельных ПЦР-ампликонов участка гена р53 дикого типа. Интенсивность флуоресценции ДНК на электрофореграммах регистрировали с помощью гель-документиругощей системы (Alpha Imager, Alpha Innotech), снабженной цифровой CCD камерой и программным обеспечением. Вычисляли процент суммарной флуоресценции полос отщепивших в результате действия CEL-I эндонуклеазы продуктов по отношению к интегральной интенсивности полос ДНК на гелях.

Определение количества копий мтДНК методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Анализы проводили на установке GeneAmp PCR system 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA) с использованием универсальной ПЦР рабочей смеси TaqMan (Applied Biosystems). Изменения количества копий

мтДНК во всех исследуемых образцах определялись по соотношению показаний ПЦР фрагмента гена ND4 мтДНК и ядерных генов GAPDH, или ß-актина, амплификация которых проходила в одной и той же реакционной смеси. Реакционная смесь содержала 10 мМ Трис-HCl, pH 8.3, 50 мМ KCl, 0.2 мМ dNTPs, 2.5 мМ MgCl2, 250 нМ каждого праймера и зондов, 1 ед. Taq ДНК-полимеразы (Applied Biosystems). Реакцию проводили в режиме: первичная денатурация ДНК-матриц и активация фермента при 95°С в течение 5 мин, далее - 40 циклов (денатурации при 95°С 30 сек, отжиг и элонгация при 60°С 1 мин). Праймеры и зонды для ПЦР-РВ, указаны в табл. 1. Результаты величин флуоресценции были количественно рассчитаны с помощью программного обеспечения GeneAmp PCR system 7500 (Applied Biosystems), Mx4000 Р.В., версия 3.0. Изменения относительного числа копий мтДНК рассчитывали по отношению уровня величин флуоресценции продукта ПЦР ND4 к таковой GAPDH или Д-актина.

Статистическая обработка данных. Результаты анализов обрабатывали статистически. Количественные различия данных от разных групп мышей оценивались с использованием /-теста Стьюдента, и при Р< 0.05 разница считалась статистически значимой.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Выбор и адаптация метода для скрининга радиациопно-индуцированных мутаций мтДНК.

Существует множество методов анализа природы и частоты различных мутаций. Нам необходимо было выбрать и адаптировать чувствительный метод для скрининга мутаций в большом количестве образцов ДНК. Поскольку для выявления мутаций в ДНК все чаще используются эндонуклеазы, специфически расщепляющие участки ДНК с неспаренными основаниями и метод гель электрофореза при временном градиенте температуры (метод TTGE), мы решили использовать эти два метода.

Принцип метода TTGE хорошо описан в работах Вонг и др. [Wong, Boles, 2005; Tan et al., 2006]. Метод определения мутаций с использованием инцизионной CEL-I эндонуклеазы также находит применение во многих лабораториях [Yeung et al., 2005; Tsuji, Nilda 2008; Voskarides, Deltas, 2009].

На начальном этапе работы, при использовании метода CEL-I эндонуклеазы, мы получали гетеродуплексы ампликонов участков мтДНК тканей облученных мышей двумя способами. В первом варианте гетеродуплексы получали путем плавления и отжига ПЦР-ампликонов мтДНК от облученных и контрольных мышей раздельно (так, как и в случае метода TTGE). Во втором варианте гетеродуплексы получали путем плавления и отжига смеси ПЦР-ампликонов мтДНК облученных и контрольных мышей. При обоих вариантах формируются гетеродуплексы, но во втором варианте гибридизации - немутированных фрагментов ДНК значительно больше. В качестве контроля использовали гетеродуплексы, полученные путем смешения ампликонов мтДНК тканей от двух мышей контрольной группы.

Результаты показали, что для выявления мутаций методом CEL-I эндонуклеазы вариант получения гетеродуплексов путем смешения ПЦР-ампликонов мтДНК облученных и контрольных животных имеет существенное преимущество. Этот вариант, при котором снижается вероятность связывания двух мутантных нитей между собой, дает четко воспроизводимые результаты в параллельных анализах и является наиболее приемлемым для анализов мутаций ДНК. Мы также провели сравнительные анализы методами TTGE и CEL-I эндонуклеазы, используя в качестве эталонных образцов ДНК человека с нормальным и мутантным геном р53. Для этого были получены ПЦР-ампликоны нормального и мутантного участков гена р53 и из них были приготовлены гетеродуплексы. Полученные данные указывают, что методом CEL-I эндонуклеазы удается регистрировать мутантные и дикие копии фрагментов р53 без потерь, и здесь полосы ДНК на агарозных гелях более выразительны. Для сравнительного определения мутаций, индуцируемых ИИ,

двумя методами в качестве анализируемых мишеней были выбраны ген N03 и два участка 0-1оор.

М 1 2345678 12 345678

А Б

Рис. 1. Выявление мутации в гене ND3 мтДНК мышей методом CEL-I эндонуклеазы (А) и TTGE-методом (Б). Использованы образцы ДИК мозга мышей, изолированных через 14 дней после их облучения в дозе 5 Гр. (А) - полосы 1,3, 5, 7 - гетеродуплексы ПЦР-ампликонов облученных и контрольных мышей; полосы 2, 4, 6, 8 -гетеродуплексы ПЦР-ампликонов мтДНК контрольных мышей. (Б) - 1-4 ПЦР-ампликоны мтДНК контрольных мышей; 5-8 - ПЦР-ампликоны мтДНК облученных мышей. М - маркер, здесь и на других рисунках.

Электрофореграммы гетеродуплексов после их обработки CEL- I эндонуклеазой показали наличие мутаций во всех трех анализируемых участках (ND3, D-loop 2, и D-loop 1) мтДНК головного мозга мышей после их облучения. Как показывают результаты анализов, (на рис. 1 показаны только результаты анализа гена ND3), метод CEL-I эндонуклеазы позволяет наглядно регистрировать мутации в мтДНК ткани облученных мышей. С другой стороны, анализы показали отсутствие четкой воспроизводимости данных, получаемых методом TTGE, по сравнению с таковыми, полученными методом CEL-I эндонуклеазы (рис. 1).

Сравнение двух методов для определения мутаций в мтДНК головного мозга облученных мышей, показывает, что метод CEL-I эндонуклеазы более чувствителен, он позволяет одновременно проводить скрининг большого количества образцов, получать воспроизводимые результаты, не требует сложного оборудования и более экономичен. Результаты анализов можно

выразить количественно в относительных единицах (% расщепления гетеродуплексов СЕЬ-1 эндонуклеазой характеризует уровень мутантных копий). С использованием данного метода были продолжены дальнейшие исследования.

2. Исследование уровня мутантных копий мтДНК и общего количества копий мтДНК в тканях головного мозга н селезенки облученных мышей.

Сравнительные анализы по трем локусам мтДНК тканей головного мозга и селезенки мышей в различные сроки после их облучения в дозе 5 Гр показали, что гетеродуплексы ПЦР-ампликонов мтДНК из обеих тканей облученных и контрольных мышей подвергаются ферментативному расщеплению в разной степени. Это зависит от срока получения образцов ДНК из тканей мышей после их облучения. Данные указывает, что гетеродуплексы содержат неспаренные основания (инцизионные сайты), распознающиеся этим ферментом.

Рис. 2. Процент расщепления СЕЬ-1 эндонуклеазой гетеродуплексов, полученных из ПЦР-ампликонов участков мтДНК селезенки (А) и мозга (Б) мышей. Гетеродуплексы (1-3) получены из ПЦР-ампликонов участков мтДНК облученных и контрольных мышей.

(1) - гетеродуплексы ПЦР-ампликонов N133,

(2) - гетеродуплексы ПЦР-ампликонов 0-1оор 1

(3) - гетеродуплексы ПЦР-ампликонов 0-1оор 2

(4) - гетеродуплексы ПЦР-ампликонов 0-!оор 1 мтДНК мышей контрольной группы. По оси ординат: процент продуктов, отщепляемых СЕЬ-1 эндонуклеазой. По оси абсцисс - дни после облучения.

Неспаренные основания в гетеродуплексах формировались благодаря наличию мутаций в ПЦР-амшшконах участков мтДНК тканей облученных мышей. На рис. 2 представлены данные, показывающие проценты продуктов, отщепляемых CEL-I эндонуклеазой от гетеродуплексов ПЦР-ампликонов всех трех фрагментов мтДНК тканей облученных и контрольных мышей. Также, здесь можно видеть одинаковый фоновый уровень продуктов, отщепляемых CEL-I эндонуклеазой от гетеродуплексов мтДНК тканей двух контрольных мышей. Результаты показывают, что больше всего подвергаются расщеплению CEL-I эндонуклеазой гетеродуплексы ПЦР-ампликонов трех участков мтДНК селезенки и головного мозга мышей на 8-й день после их облучения. Процент продуктов, отщепляемых CEL-I эндонуклеазой, значительно ниже в гетеродуплексах ПЦР-ампликонов мтДНК, выделенных из тканей мышей через 14 и 28 дней после их облучения (рис. 2). Причем, это в одинаковой мере характерно для гетеродуплексов гена ND3 и участков D-loopl и D-loop2. Эти результаты указывают, что, если на восьмой день после облучения мы регистрируем значительный уровень мутантных копий мтДНК в тканях селезенки и мозга, то на 14-й и 28-й дни после облучения мышей количество мутантных копий становится существенно меньше.

Рис, 3. Электрофореграммы продуктов расщепления CEL-I эндонуклеазой

гетеродуплексов ПЦР-ампликонов мтДНК (D-^ loop 2) тканей необлученных и облученных мышей (в дозах 1, 3, 5 Гр). А - мтДНК мозга, Б - мтДНК селезенки. 1-3 - гетеродуплексы ПЦР-ампликонов мтДНК необлученных и облученных мышей соответственно через 8, 14, g 28 дней после облучения. К - гетеродуплексы ампликонов мтДНК двух необлученных мышей.

Учитывая одинаковую динамику пострадиационного изменения содержания мутантных копий мтДНК по трем локусам, мы провели анализы по

1 Гр ЗГР 5Гр

МК12 3 12 3 12 3

выяснению изменения уровней мтДНК с мутациями по одному локусу в тканях мышей, облученных в разных дозах. На рис. 3 представлены образцы электрофореграмм гетеродуплексов ПЦР-ампликонов мтДНК участка 0-1оор 2 после их инкубации с СЕЬ-1 эндонуклеазой. Можно видеть полосы продуктов ферментативного расщепления гетеродуплексов СЕЬ-1 эндонуклеазой (за исключением гетеродуплексов ПЦР-ампликонов мтДНК тканей необлученных мышей). На рис. 4. представлены обобщенные результаты независимых повторных анализов продуктов, отщепляемых СЕЬ- I эндонуклеазой от гетеродуплексов, полученных из ПЦР-ампликонов мтДНК мозга и селезенки необлученных и облученных (1-5 Гр) мышей.

Рис. 4. Расщепление СЕЬ-1 эндонуклеазой гетеродуплексов, полученных из ПЦР-ампликонов мтДНК ф-1оор 2) необлученных и облученных мышей. (/4) - головной мозг, (£Г) - селезенка. По оси абсцисс - доза облучения (Гр), по оси ординат - % расщепления гетеродуплексов. 1,2,3 - время после облучения через 8,14,28 дней.

Из представленных данных, как можно было ожидать, видно, что с увеличением дозы облучения мышей увеличивается и доля мутантных копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки. Как показано на кривых 1-3 (рис.4), если максимальные значения содержания мутантных копий мтДНК (% расщепления гетеродуплексов) регистрируется на 8-й день после облучения

мышей, то в последующие пострадиационные сроки (14, 28 дни) мы видим их резкое снижение.

Причем, это снижение более активно происходит в ткани селезенки, чем в ткани мозга. Наблюдаемое снижение мутантных копий мтДНК в тканях облученных мышей в пострадиационный период, возможно, связано с их селективной элиминацией или со снижением общего содержания копий мтДНК в этих тканях. Для выяснения этого вопроса необходимо было определить динамику изменения содержания общей мтДНК в тканях мышей и внеклеточной мтДНК (вк-мтДНК) с мутациями в плазме их крови.

Анализы общего содержания мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей проводили методом ПЦР-РВ, путем сравнения продукта ПЦР гена N04 мтДНК с продуктами двух генов яДНК (уЗ-актина и БАРОН) в параллельных экспериментах и в разное время года. Результаты анализов количества копий мтДНК (по гену N04) относительно ядерных генов /?-актина и БАРОН в тканях мышей показали сравнительно близкие значения.

Результаты по определению изменения содержания мтДНК (по гену N04) относительно яДНК (ген БАРОН) в тканях головного мозга и селезенки мышей после их облучения в дозах 1-5 Гр представлены на рис. 5. Видно, что статистически значимых изменений количества копий мтДНК в тканях мышей не регистрируется после их облучения (на 8-28 дни) в дозах 1 и 3 Гр.

Рис. 5. Изменение отношения количества копий мтДНК (ген N04) к количеству яДНК (ген БАРОН) в мозге (А) и селезенке (Б) мышей, облученных в дозах: 1 - 1 Гр, 2 - 3 Гр, 3 - 5 Гр. По оси абсцисс (8,14,28) - дни после облучения; по оси ординат - отношение N04 к БАРОН в процентах. За 100% приняты данные контрольных мышей.

8 14 28 Время после облучения (дои)

Однако содержание общего количества копий мтДНК в тканях облученных мышей (в дозе 5 Гр) на 25-40% ниже данных контрольной группы (рис.5).

Таким образом, мы обнаружили повышенный уровень мутантных копий мтДНК в тканях облученных мышей, который снижается в последующие сроки пострадиационного времени. Также, мы регистрировали относительно стабильный уровень общего количества мтДНК в тканях облученных мышей в пострадиационный период, хотя он остается существенно ниже (при дозе облучения 5 Гр), чем в тканях контрольных животных.

3. Изменения количества внеклеточных мутантных копий и общего содержания копий мтДНК в плазме крови мышей в пострадиационный период.

В первой серии экспериментов мы анализировали внеклеточную мтДНК (вк-мтДНК) в плазме крови мышей в различные сроки после их облучения в дозе 5 Гр. Обобщенные результаты независимых повторных анализов в этих экспериментах представлены на рис. 6. Эти данные указывают на увеличение количества мутантных копий вк-мтДНК в плазме крови облученных мышей в течение всего 28 дневного пострадиационного периода. Однако уровень мутантных копий вк-мтДНК в плазме облученных мышей зависит от пострадиационного времени.

Рис. 6. Процент расщепления СЕЬ- I эндонуклеазой гетеродуплексов ПЦР-ампликонов мтДНК плазмы крови необлученных и облученных мышей.

а - гетеродуплексы N03 необлученных и облученных мышей,

б - гетеродуплексы Б-кюр 2 необлученных и облученных мышей,

в - гетеродуплексы 0-1оор 2 необлученных мышей.

1 4 8 14 28 Время после облучения (дви)

Так, в условиях данного эксперимента (облучение мышей в дозе 5 Гр), наибольшее количество мутантных копий мтДНК в плазме этих мышей выявляется на 14-й день после их облучения. Содержание мутантных копий вк-мтДНК в плазме мышей как в начальные сроки (1-й, 4-й дни), так и на 28-й день существенно ниже, чем таковые на 8-й - 14-й дни пострадиационного времени (рис. 6). Эти данные, скорее всего, характеризуют динамику поступления в кровоток и вывод из него вк-мтДНК с мутациями у облученных животных, но не позволяют оценить изменения количества молекул общей вк-мтДНК относительно я ДНК в плазме крови.

Проведенные анализы по определению количества копий вк-мтДНК (ген N04) относительно яДНК (ген САРОН) показали, что содержание общей вк-мтДЬЖ в плазме крови облученных мышей в 3-4 раза выше (на 8, 14, 28-й дни, после облучения в дозе 5 Гр), но сравнению с данными контрольных животных. При этом, максимальное повышение общей вк-мтДНК в плазме крови облученных мышей, как и при анализах мутантных мтДНК, наблюдается на 14-й день после облучения. На рис. 7 представлены образцы электрофореграмм гетеродуплексов ПЦР-ампликонов участка 0-!оор 2 'К-мтДНК плазмы после их инкубации с СЕЫ эндонукдеазой, Вк-мтДНК, ипюльзованная в этих анализах (рис.7), получена из плазмы мышей через 8, ¡4, 28 дней после облучения в дозах 1-5 Гр.

щ т 5 гр

МК 123 ШШ

Ышт рЩЯШ га

■ • ... • ¡¡¡00 ■■■.,'м''"

Рис. 7. Электрофореграммы продуктов расщещения СЕЬ-1 эндонуклеазой гетеродуплексов ПЦР-ампликонов

мтДРК (Р-1оор 2) плазмы крови необученных и облученных мышей (в дозас 1, 3 а 5 Гр). 1-3 - гетеродуплексы амгликош» мтДНК необлученных и обтученных мышей соответственно через 8. 14, 28 даей после облучения. К -гетеродуплксы ампликонов мтДНК двух необлучекых мышей.

Можно видеть, что гетеродуплексы

ПЦР-ампликонов вк-мтДНК плазмы от двух необлученных мышей не подвержены существенному расщеплению СЕЬ-1 эндонуклеазой. Однако гетеродуплексы, полученные из ампликонов вк-мтДНК контрольных и облученных мышей (в дозах 1-5 Гр), частично расщепляет СЕЬ-1 эндонуклеаза. Анализы электрофореграмм позволили определить процент ферментативного расщепления гетеродуплексов (рис. 8). Из представленных данных видно, что возрастание доли мутантных копий вк-мтДНК в плазме облученных мышей зависит от дозы их облучения. Однако следует отметить, что доля мутантных копий вк-мтДНК в составе общей циркулирующей вк-ДНК плазмы облученных мышей значительно выше, чем в составе общей ДНК, выделенной из тканей этих же мышей (см. рис. 4). Более того, здесь мы видим иной характер изменения уровня содержания мутантных копий вк-мтДНК в плазме мышей в пострадиационный период. Если в тканях облученных мышей максимальное содержание мутантных копий мтДНК (% расщепления

Рис. 8. Расщепление СЕН эндонуклеазой гетеродуплексов ПЦР-ампликонов вк-мтДНК (В-1оор 2) плазмы необлученных и облученных мышей. По оси абсцисс - доза облучения (Гр), по оси ординат - % расщепления гетеродуплексов.

1, 2, 3 - время после облучения соответственно через 8,14,28 дней.

0 1 3 5

доза облучения (Гр)

гетеродуплексов СЕЬ-1 эндонуклеазой) наблюдается на 8-й день после облучения, то наибольшее количество вк-мтДНК с мутациями в плазме мы регистрируем на 14-й день после их облучения (рис.8). Однако, доля мутантных копий вк-мтДНК в составе циркулирующей ДНК плазмы крови мышей, как и в тканях, также резко снижается на 28-й день после их облучения.

18

р

§25

215.

310-

На рис.9 представлены результаты анализов содержания мтДНК (по гену N04) относительно яДНК (ген ОАРИН) в плазме мышей после их облучения в дозах 1-5 Гр.

Время после облучения (дни)

Они существенно отличаются от результатов анализа содержания общих копий мтДНК в тканях облученных мышей. В плазме крови облученных мышей мы наблюдаем повышенный уровень общей вк-мтДНК, по сравнению с данными от контрольных животных, как и содержание мутантных копий вк-мтДНК, особенно на 8-й и 14-й дни после их облучения (рис. 9).

Рис. 9. Отношение количества копий вк-мтДНК (ген N04) к количеству вк-яДНК (ген йАРОН) плазмы мышей, облученных в дозах 1-1 Гр, 2-3 Гр, 3-5 Гр. По оси абсцисс: (8, 14, 28) дни после облучения; по оси ординат: отношение НВ4ЮАРВН в процентах. За 100% приняты данные контрольных мышей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, в результате выполнения данного исследования нам удалось получить новые данные, характеризующие уровень мутантных копий мтДНК в тканях (головной мозг и селезенка) и в плазме мышей, подвергнутых радиационному воздействию. Одновременно мы получили результаты изменения общего содержания копий мтДНК, относительно яДНК, в тканях и плазме этих мышей. Результат первой серии экспериментов - подобраны условия использования «метода СЕЬ-1 эндонуклеазы» для относительной количественной оценки мутантных копий мтДНК в тканях и в плазме животных, подвергнутых радиационному воздействию. Полученные нами результаты по определению мутаций мтДНК в тканях и в составе

19

циркулирующей ДНК облученных мышей, с использованием СЕЫ эндонуклеазы, не позволяют представить расчетные величины по реальной частоте мутаций мтДНК, индуцируемых ИИ. Однако эти данные позволяют характеризовать уровень гетероплазмии мтДНК в тканях и в плазме животных, подвергнутых воздействию ИИ. Согласно полученным нами данным, можно полагать, что формирование мутаций мтДНК в тканях мышей имеет линейную зависимость от дозы облучения. Ранее была выявлена линейная зависимость формирования частоты мутаций в составе яДНК тканей головного мозга и селезенки мышей, облученных разными дозами рентгеновского излучения [Ыакатига е1 а1., 2000; Опо е1 а1., 2003]. Однако динамика снижения мутантных копий мтДНК, регистрируемая нами, не характерна для мутаций генов яДНК. Более того, полученные данные позволяют предполагать, что в пострадиационный период снижение мутантных копий мтДНК быстрее протекает в активно пролиферирующих тканях (селезенка), чем в постмитотических тканях (головной мозг). Уровень частоты мутаций, выявляемых в составе яДНК тканей головного мозга и селезенки мышей, подвергнутых воздействию рентгеновского излучения, сохраняется без изменения в течение четырех месяцев [Опо й а!., 2003].

Результаты наших экспериментов показывают, что высокий уровень мутантных копий мтДНК в тканях мышей, наблюдаемый на 8-й день после их облучения, постепенно снижается к 28-му дню пострадиационного времени. При этом, содержание общего количества мтДНК в тканях этих мышей остается на одинаковом уровне во все указанные после облучения дни, хотя на 25-40% ниже данных контроля при дозе облучения 5 Гр. Одновременно со снижением мутантных копий мтДНК в тканях, мы регистрируем резкое увеличение их доли, со сдвигом максимума на 14-й день после облучения, в составе циркулирующей вк-ДНК плазмы этих же мышей. Можно предполагать, что повышенный уровень вк-мтДНК с мутациями в плазме крови облученных мышей в пострадиационные сроки (8-28-й дни) обусловлен, продолжающейся гибелью клеток тканей, и, возможно, селективной элиминацией копий мтДНК с

мутациями из клеток тканей. Элиминация мтДНК с мутациями из клеток может происходить в результате митофагии митохондрий, несущих поврежденные и мутантные копии ДНК [Не, Klionsky, 2009; Tolkovsky, 2009]. Очевидно, повышенный уровень общей мтДНК и ее мутантных копий в плазме облученных животных происходит не только в результате их элиминации из клеток головного мозга и селезенки. Они могут поступать в кровоток из всех тканей облученной особи и создавать повышенный уровень вк-мтДНК в плазме животных в пострадиационный период. Возможно, удастся использовать повышенный уровень мтДНК и ее мутантных копий в плазме как биомаркер для оценки радиационного поражения организма.

ВЫВОДЫ

1. Адаптирован и впервые применен метод, основанный на использовании CEL-I эндонуклеазы, специфически расщепляющей ДНК с неспаренными основаниями, для выявления мутаций мтДНК, индуцируемых ионизирующей радиацией in vivo. Метод достаточно чувствителен и экономичен, позволяет анализировать большое количество образцов ДНК, получать воспроизводимые результаты.

2. Впервые установлено возникновение повышенного уровня мутантных копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки мышей, подвергнутых радиационному воздействию. Мутагенез мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей имеет линейную зависимость от дозы рентгеновского излучения (в пределах 1-5 Гр).

3. Показано, что уровень мутантных копий мтДНК в тканях облученных мышей значительно снижается в течение пострадиационного времени. Снижение мутантных копий мтДНК в ткани селезенки происходит более активно, чем в ткани головного мозга. Содержание общей мтДНК относительно яДНК в тканях облученных мышей остается в течение пострадиационного времени (828 дней) без изменения, хотя и ниже на 25-40% данных контрольной группы (при дозе облучения 5 Гр).

4. Установлено резкое увеличение уровня вк-мтДНК и ее мутантных копий в плазме крови облученных мышей в течение пострадиационного времени (8-28 дней). Увеличение содержание мутантных копий вк-мтДНК в плазме облученных мышей совпадают со снижением их уровня в тканях этих же животных. Результаты свидетельствуют о поступлении в кровоток облученных мышей мутантных копий мтДНК, элиминируемых из тканей этих животных.

5. Повышенные уровни содержания общей мтДНК и ее мутантных копий в плазме крови животных, подвергнутых радиационному воздействию можно рассматривать как потенциальные биомаркеры для оценки радиационного поражения и пострадиационного генотоксического груза.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Абдуллаев СЛ., Гуляева H.A., Безлепкин В.Г., Газиев А.И. Сравнительное определение мутаций в мтДНК облученных мышей с использованием эндонуклеазы, специфичной к неспаренным основаниям, и методом TTGE.// Радиационная биология. Радиоэкология, 2009, том 49, № 1, с. 21-28

2. Гуляева H.A., Абдуллаев СЛ., Малахова JIB., Аитипова В.Н., Безлепкин В.Г., Газиев А.И. Снижение количества мутантных копий митохондриальной ДНК в тканях облученных мышей в пострадиационный период. // Генетика, 2009,том 45, № 7, с. 949-956.

3. Газиев А.И., Абдуллаев CA., Атипова В.Н., Гуляева H.A., Малахова JI.B., Шайхаев Г.О., Безлепкин В.Г. Быстрое выявление мутаций эндонуклеазным методом в тканевой и циркулирующей митохондриальной ДНК после радиационного воздействия.// Технология живых систем, 2009, том 6, № 2, с. 10-23.

4. Абдуллаев С.А, Аитипова В.Н., Газиев А.И. Содержание внеклеточной митохондриальной ДНК с мутациями резко повышено в плазме крови облученных мышей.// Молекулярная биология, 2009, том 43, № 6, с. 1063-1069.

5. Абдуллаев С.А., Анищенко Е.С., Газиев А.И. Мутантные копии митохондриальной ДНК в тканях и в плазме мышей, подвергнутых воздействию рентгеновским излучением.// Радиационная биология. Радиоэкология, 2010, том 50, № 3, с. 318-328.

Тезисы

1. Абдуллаев С.А., Гуляева H.A., Аитипова В.Н. Исследование уровня гетероплазмии митохондриальной ДНК в клетках тканей мышей, подвергшихся радиационному воздействию. // Тезисы 11-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2007, с.66.

2. Абдуллаев СЛ., Гуляева H.A., Вельская И.И., Аитипова В.Н., Ежова A.B. Мутации митохондриальной ДНК, выявляемые TTGE анализом, как генетический маркер генотоксического груза. // Тезисы 11-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2007, с.66-67.

3. Абдуллаев С.А., Гуляева Н.А., Антипова В.Н. Гетероплазмия митохондриальной ДНК в клетках тканей мышей, подвергшихся радиационному воздействию. // Материалы 3-й Всероссийской научно-технической Интернет - конференции «Современные проблемы экологии и безопасности». Тульский Государственный Университет. Тула, 2007.

4. Абдуллаев С.А., Гуляева Н.А., Жураковский А.Г., Газиев А.И. Определение несгаренных оснований в митохондриальной ДНК и изменения количества ее копий в тканях мышей после рентгеновского облучения. // Материалы Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии». Санкт-Петербург, 2008, с.114.

5. Абдуллаев С.А., Гуляева Н.А., Малахова Л.В., Газиев А.И. Определение мутаций митохондриальной ДНК в тканях Х-облученных мышей, с помощью CEL I нуклеазы. // Тезисы 12-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2008, с.5.

6. Абдуллаев С.А., Антипова В.Н., Гуляева Н.А., Малахова Л.В., Газиев А.И. Скрининг мутаций мтДНК тканей облученных мышей с использованием CEL-I эндонуклеазы. // Тезисы конференции «Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии». Дубна, 2009.

7. Абдуллаев СА. Выявление мутаций в тканевой и циркулирующей митохондриальной ДНК после радиационного воздействия. // Тезисы XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ». Москва, 2009, с.З.

8. Abdullaev S. A., Gulyaeva N. A., Bezlepkin V. G., and Gaziev A. I. Determination of mutations in tissue mitochondrial DNA of X-irradiated mice by means of CEL I nuclease. // ESF-EMBO Symposium «Spatio-Temporal Radiation Biology: Transdisciplinary Advances for Biomedical Applications». Sant Feliu de Guixols, Spain, 2009.

9. Abdullaev S.A., Antipova V.N., Gaziev A.I. Increase of extracellular mitochondrial DNA with mutations in blood plasma of X-irradiated mice. // 37й1 Annual Meeting of the European Radiation Research Society. Prague, Czech Republic, 2009.

10. Абдуллаев С.А., Антипова B.H., Газиев А.И. Облучение мышей гамма-радиацией приводит к резкому повышению содержания митохондриальной ДНК с мутациями в плазме крови. // Тезисы конференции «90-летие создания Института биофизики в России». Пущино, 2009.

11. Абдуллаев СЛ., Антипова В.Н., Газиев А.И. Содержание внеклеточной митохондриальной ДНК с мутациями резко повышенно в плазме крови облученных мышей. // Тезисы 13-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2009, с.4.

12. Абдуллаев С.А. Анализ мутангных копий митохондриальной ДНК в тканях и плазме крови облученных мышей. Сборник работ молодых ученых ИТЕБ РАН. Пущино, 2009, с.30-31.

13. Абдуллаев С.А. Мутантные копии митохондриальной ДНК в тканях и в плазме мышей, подвергнутых воздействию рентгеновским излучением. // Тезисы 14-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2010, т.2, с. 102.

14. Абдуллаев С.А. Повышение уровня мутантных копий циркулирующей митохондриальной ДНК в зависимости от дозы облучения. // Сборник тезисов III Евразийского конгресса по медицинской физике «Медицинская физика 2010». Москва, 2010, т.1, с.425.

15. Abdullaev S.A. Mutant copies of mitochondrial DNA in tissues and plasma of X-rays exposed mice. // 38th Annual Meeting of the European Radiation Research Society. Stockholm, Sweden, 2010, с 122.

Подписано в печать: 02.11.2010

Заказ №4443 Тираж-100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 ч^т.аиизгеГегаС.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Абдуллаев, Серажутдин Абдуллаевич

СПИСОК ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Структурно-функциональная характеристика мтДНК.

2. Повреждение мтДНК эндогенными и экзогенными агентами.

3. Репарация повреждений и формирование мутаций мтДНК.

4. Внеклеточная мтДНК-потенциальный маркер оценки радиационного поражения.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Животные.

2.2. Радиационная обработка.

2.3. Основные химические реактивы.

2.4. Выделение ДНК фенольным методом.

2.5. Выделение внеклеточной ДНК из плазмы с использованием магнитных сорбентов.

2.6. Определение содержания ДНК.

2.7. Получение CEL -I эндонуклеазы.

2.8. ПЦР-амплификация участков ДНК.

2.9. Выявление мутаций мтДНК методом гель-электрофореза ДНК при временном градиенте температуры (temporal temperature gradient gel electrophoresis-TTGE).

2.10. Выявление мутаций мтДНК с использованием CEL-I эндонуклеазы.

2.11. Определение количества копий мтДНК методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).

2.12. Статистическая обработка данных.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выбор и адаптация чувствительного метода для скрининга радиационно-индуцированных мутаций мтДНК.

3.2. Исследование уровня мутантных копий мтДНК и общего количества копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей.

3.3. Изменения количества внеклеточных мутантных копий и общего содержания копий мтДНК в плазме крови облученных мышей в пострадиационный период.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мутантные копии митохондриальной ДНК в тканях и плазме крови мышей, подвергнутых радиационному воздействию"

о

Исследование структурно-функциональных нарушений генома в клетках человека и животных, подвергнутых воздействию ионизирующими излучениями (ИИ) остается актуальной проблемой как для определения риска генетических и канцерогенных последствий, так для разработки чувствительных маркеров оценки генотоксического груза и профилактических мер развития патологий, инициируемых радиацией. Многие основополагающие исследования по данной проблеме проводились и проводятся, ориентируясь на важнейшую мишень радиационного поражения — ядерную ДНК (яДНК). Однако, хорошо известно также, что в каждой соматической клетке млекопитающих, кроме ядерного генома, содержатся тысячи копий молекул митохондриальной ДНК (мтДНК). В последнее время, с появлением новых молекулярных методов, активно развиваются исследования- по изучению повреждения, репарации- и мутагенеза мтДНК в* клетках. В? настоящее время можно полагать, что мтДНК является* более уязвимой-мишенью клетки, по сравнению с яДНК, для эндогенных и экзогенных повреждающих агентов [LeDoux, Wilson, 2005; Wallace etal'., 2010]. МтДНК имеет ряд особенностей, отличных от я ДНК, в структурной* организации- и функционировании^. Так, мтДНК в соматических клетках животных и человека представлена множеством (от нескольких сот до нескольких тысяч) копий ковалентно замкнутых молекул размером* около 16,5 т.п.н., содержащих гены, кодирующие 13 белков системы дыхательной цепи [Shadel and Clayton, 1997;. Falkenberg et al., 2007]. Митохондриальный геном наследуется по материнской линии [Giles et al., 1980]. Для него характерна повышенная мутабельность благодаря повреждениям, индуцируемым активными формами кислорода (АФК), генерируемыми в самих митохондриях и ошибками репликативного синтеза с участием ДНК-полимеразы гамма [Graziewicz et al., 2006; Larsson, 2010]. В тканях (в том числе постмитотических тканях мозга, сердца, скелетных мышц), в популяциях клеток, независимо от их пролиферативной активности, мтДНК, в отличие от яДНК, может реплицироваться независимо от клеточного цикла в течение всей жизни организма [Wallace 2005; Falkenberg et al., 2007]. Результаты многих исследований показывают, что в мтДНК возникают в 3-50 раз больше повреждений (в зависимости от повреждающего агента), чем в соразмерном фрагменте яДНК, при действии на клетки ИИ, химических мутагенов, противоопухолевых и противовирусных препаратов [Marcelino., Thilly, 1999; Газиев, Шайхаев, 2008]. Процессы репарации ДНК в митохондриях клеток функционируют недостаточно эффективно, по сравнению с таковыми в ядрах [Газиев, Подлуцкий, 2003; Stuart., Brown, 2006; Gredilla et al., 2010]. Если репликация поврежденной я ДНК блокируется индуцибельной системой контроля точек хода клеточного цикла (cell' cycle checkpoint) до завершения ее репарации, то» эта система не блокирует репликацию поврежденной мтДНК в митохондриях [Oleaver ,1992; Lallev et al., 1993; Kulawiec et al., 2009]. В отличие от я ДНК, мтДНК Hev ассоциирована с гистонами и не содержит некодируемые последовательности (за исключением участка D-loop), транскрибируется как единый полицистронный блок, и любые нарушения в ней могут быть > патогенетическими. Возможно, что именно по этим причинам-в мтДНК наблюдается накопление мутаций с более высокой частотой, чем в яДНК [Khrapko, Vijg, 2009] и для митохондрий характерно явление гетероплазмии (одновременное присутствие мутантных и нормальных копий в одной клетке). Когда количество1 мутантных молекул мтДНК превышает определенный порог (повышенный уровень гетероплазмии), возникает митохондриальная дисфункция, с которой связаны развитие «митохондриальных» болезней, клеточная гибель, нестабильность-, генома [Skulachev, 2006; Wang, Youle, 2009; Norberg et al., 2010].

Вместе с тем, хотя в радиобиологических исследованиях много внимания уделяется радиационному нарушению энергетического метаболизма, сведения по радиационному мутагенезу мтДНК в клетках человека или животных, подвергшихся воздействию ИИ на уровне целого организма,, в литературе ограничены и противоречивы. Так, в ряде исследовании показано изменения количества копий мтДНК и формирование делеций мтДНК в клетках млекопитающих, подвергнутых радиационному воздействию [Malakhova et al., 2005; Murphy et al., 2005; Nugent et al., 2007; Wang et al., 2007]. Повышенная частота точечных мутаций мтДНК наблюдали в клетках периферической крови людей, проживающих на территории с повышенным радиационным фоном [Forster et al., 2002]. Высокая частота делеций в мтДНК, чем в яДНК, регистрируется у пациентов после сеансов радио-химиотерапии опухолей [Wardell et al., 2003]. Однако не удалось выявить существенного увеличения частоты мутаций мтДНК у полевок, обитающих в зоне аварии Чернобыльской АЭС [Wickliffe et al., 2002]. Не был зарегистрирован повышенный уровень мутаций мтДНК в клетках крови- людей в отдаленные сроки после хронического воздействия на них радиации в условиях ядерного производства [Wilding et al., 2006] и испытаний^ ядерного оружия на- Семипалатинском полигоне [Hamada et ai., 2003].

Стабильность и сохранение митохондриального генома, изменение количества копий мтДНК (дозы генов мтДНК) в клетках играют важную роль в адаптации человека к различным- условиям внешней* среды. С нарушениями мтДНК ассоциируются широкий спектр дегенеративных заболеваний, ослабление функций тканей, нарушения иммунной системы, развитие опухолевых патологий, старения [Schapira, 2006; Jou et al., 2009;. Koene, Smeitink, 2009; Tsutsui et al., 2009; Wallace, Fan,. 2009; Krishnan, Turnbull, 2010; Tuppen et al., 2010; Baines, 2010; Shutt, Shadel, 2010]. Статус митохондрий клетки и мтДНК оказывают влияние на развитие различных клеточных ответов на действие физических и химических агентов.

Поэтому, дальнейшие комплексное исследование возникновения, аккумуляции мутантных копий мтДНК и изменения количественного содержания' копий мтДНК в клетках тканей организма млекопитающих, подвергнутых воздействию ИИ, представляется актуальным и востребованным.

Целью исследования

Цель исследования состояла в определении изменения уровня мутантных копий мтДНК и общего содержания копий мтДНК в тканях и в плазме крови мышей, подвергнутых воздействию ионизирующего излучения.

В задачи работы входило:

1. Выбор и адаптация чувствительного метода для скрининга радиационно-индуцированных мутаций мтДНК тканей мышей.

2. Исследование уровня мутантных копий мтДНК и общего количества копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей в пострадиационный период.

3. Определениел динамики изменения количества внеклеточных мутантных копий- и общего содержания копий» мтДНК, относительно ядерной ДНК, в плазме крови мышей в пострадиационный период.

Научная новизна работы.

Адаптирован и впервые применен метод, основанный на использовании CEL-I эндонуклеазы, специфически расщепляющей ДНК с неспаренными основаниями, для выявления неизвестных мутаций мтДНК, индуцируемых ИИ in vivo. Сравнение результатов, получаемых CEL- I эндонуклеазным методом и TTGE-методом (temporal temperature gradient gel electrophoresis -метод) показало, что первый метод более чувствителен, он позволяет анализировать большое количество образцов, дает воспроизводимые результаты и экономичен.

В работе впервые установлено, что. в клетках тканей (головной мозг, селезенка) мышей, подвергнутых воздействию рентгеновского излучения, резко возрастает уровень мутантных копий мтДНК (повышение гетероплазмии мтДНК), с максимумом на 8-й день после облучения и последующим снижением их содержания к 28-у дню пострадиационного времени.

Мутагенез мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей, как и мутагенез ядерных генов, имеет линейную зависимость от дозы рентгеновского излучения (в пределах 1-5 Гр). Результаты сравнительных анализов мутантных копий мтДНК головного мозга (постмитотической ткани) и селезенки (митотически активной ткани) облученных мышей показывают снижение количества мутантных копий мтДНК в пострадиационный период. В ткани селезенки этот процесс происходит более активно, чем в ткани головного мозга.

Вместе с тем, общее количество копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей, определяемое относительно гена яДНЕС методом ПНР в реальном времени- (ПЦР-РВ), остается' в течение всего пострадиационного времени (8-28 дней) без изменения, хотя. и. ниже на 25-40% данных контрольной группы (при дозе облучения 5 Гр).

В данном исследовании впервые установлено, что в кровоток облученных мышей в течение длительного пострадиационного времени поступает большое количество циркулирующей вк-мтДНК, существенная часть которой представлена мутантными- копиями. Уровень вк-мтДНК« с мутациями в плазме крови мышей зависит от дозы их облучения. Динамика изменения общего содержания циркулирующей вк-мтДНК и уровня.ее мутантных копий в плазме облученных мышей (в пострадиационный период) отличается от таковой в тканях селезенки и мозга этих же животных. Увеличение содержания мутантных копий вк-мтДНК в плазме облученных мышей совпадает со снижением их уровня в тканях этих же животных. Повышенное содержание мутированных вк-мтДНК в плазме крови облученных мышей свидетельствует об их активной элиминации из клеток тканей в пострадиационный период.

Практическая ценность работы.

Результаты исследования радиационного мутагенеза мтДНК и изменения уровня мутантных копий мтДНК в тканях облученных животных в пострадиационной период существенно дополняют знания о молекулярных механизмах развития лучевой реакции организма. Полученные результаты и использованные в работе методические подходы могут быть применены в дальнейших экспериментальных исследованиях и в клинической практике при радиотерапии опухолей.

Важным результатом, ориентированным на практическое использование, является обнаружение повышенного уровня мутантных копий вк-мтДНК и увеличения содержания общей мтДНК в плазме облученных животных. Поскольку мтДНК является более уязвимой мишенью (чем яДНК) для ИИ" и других генотоксических агентов, то повышенное содержание вк-мтДНК с мутациями- в плазме крови мышей после радиационного воздействия можно рассматривать как потенциальный биомаркер для: оценки радиационного поражения и наличия генотоксического груза.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены^ на школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2007, 2008, 2009, 2010 гг.); на Российской' научной конференции «Медико-биологические проблемы! токсикологии» (Санкт-Петербург, 2008 г.); на конференции «Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии» (Дубна, 2009 г.); на XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2009 г.); на Симпозиуме «Пространственно-временные эффекты в радиационной биологии (Испания, Сант Фелиу де Гишолс, 2009); на 37-ой годичной* конференции Европейского общества по радиационным исследованиям (Прага, 2009); на III Евразийском конгрессе по медицинской физике «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской физики и инженерии» (Москва, 2010); на 38-ой годичной конференции Европейского общества по радиационным исследованиям (Стокгольм, 2010).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах из списка ВАК РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 107 страницах, иллюстрирована 2 таблицами и 22 рисунками. Библиографический указатель содержит 221 источников литературы.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Абдуллаев, Серажутдин Абдуллаевич

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Итак, можно констатировать, что в мтДНК возникают больше повреждений; чем в соразмерном' фрагменте яДНК, не только в результате действия АФК, генерируемых в самих митохондриях, но и при действии на клетки ИИ,' УФ-света, противоопухолевых и противовирусных препаратов.

Этот повышенный уровень повреждений ■ в>мтДНК, по сравнению с яДНК, облученных клеток, можно полагать, обусловлен сочетанным действием АФК, генерируемых митохондриях и индуцируемых ИИ. Было^ показано, что радиационное нарушение ЦПЭ в митохондриях может привести к. увеличению АФК и усилению окислительного * стресса [УовЫск е! а1., 2000]. Что-касается высокой частоты повреждений; мтДНК, по сравнению' с яДНК, в клетках обработанных различными, химическими агентами, то это является, скорее всего, результатом более активного проникновения' этих соединений« из цитоплазмы в митохондрии.

Таким образом, мтДНК в отличие от яДНК, является более уязвимой мишенью для эндогенных АФК и экзогенных повреждающих агентов.

С другой стороны анализ многих данных, посвященных исследованию репарации мтДНК, позволяет заключить, что в митохондриях клеток млекопитающих полностью функционируют только те репарационные системы, которые имеют ограниченный набор ферментов [Газиев, Подлуцкий, 2003; Stuart, Brown, 2006, Gredilla et al., 2010]. Так, доказано, что механизмы ЭРН не функционируют в митохондриях [Clayton, et al., 1974]. Однако показано, что в митохондриях клеток млекопитающих реализуется система ЭРО с короткими заплатками [Bohr, 2002]. Кроме ЭРО в митохондриях млекопитающих выявлены и другие системы антимутагенной репарации ДНК [Gredilla et al., 2010]. Вместе с тем, как признано многими исследователями, в целом, процессы репарации мтДНК в митохондриях клеток млекопитающих функционируют недостаточно эффективно.

О низкой эффективности функционирования систем репарации в митохондриях млекопитающих свидетельствует множество данных, указывающих на накопление нерепарированных повреждений и на повышение частоты спонтанных мутаций в мтДНК, по сравнению с яДНК, с возрастом организма. И один из современных постулатов1 о механизмах старения связан с накоплением структурных изменений в мтДНК клеток тканей с возрастом [Wallace et al., 2010; Baines, 2010; Krishnan, Turnbull, 2010; Larsson, 2010].

В тканях (головного мозга, сердца, скелетных мышц), в. популяциях клеток, независимо от их пролиферативной активности и клеточного цикла, мтДНК, в отличие от яДНК, может реплицироваться в течение всей жизни [Clayton, 2003; Falkenberg et al., 2007]. Более того, если репликация поврежденной яДНК блокируется индуцибельной системой контроля хода клеточного цикла (cell cycle checkpoint)'до завершения ее репарации, то, как указывает ряд данных, в митохондриях не происходит блокировки репликации мтДНК, поврежденной ИИ [Cleaver, 1992; Lallev et al., 1993; Chung et al., 2001].

При этом, можно полагать, что репликативный синтез может протекать не только на неповрежденных копиях мтДНК-матриц, но и на мутированных или поврежденных матрицах. Очевидно, спонтанные и индуцированные (не репарированные или ошибочно репарированные) повреждения мтДНК в последующих кругах репликации будут реализовываться в мутации и делеции митохондриального генома.

Скорее всего, именно по этим причинам в мтДНК тканей организма, возможно, возникновение мутаций с более высокой частотой, чем в яДНК, после радиационного воздействия. Согласно данным разных авторов, частота спонтанных и индуцированных мутаций в генах мтДНК в 10-100 раз выше, чем в я ДНК [Beckman, Ames, 1998; Marcelino, Thilly, 1999; Khrapko, Vijg 2009; Singh, Kulawiec, 2009; Milone, Massie, 2010].

Увеличение частоты повреждений и мутаций в мтДНК тканей мозга, сердца и скелетных мышц, отражается на функциях этих тканей, а также играет значительную роль в развитии дегенеративных процессов и различных патологий [Wallace, 2005; Wallace et al., 2010; Baines, 2010; Krishnan, Turnbull, 2010; Larsson, 2010]. Когда количество мутантных молекул мтДНК превышает определенный порог, (повышенный уровень гетероплазмии),. возникает митохондриальная дисфункция, с которой ассоциируется развитие множества патологий.

Для скрининга спонтанных и индуцированных ИИ точечных мутаций, в последовательностях ДНК или отдельных генах млекопитающих на уровне целого организма первостепенное значение- приобретает выбор чувствительного и экономичного-метода. На основании* анализа-литературы мы выбрали два наиболее адекватных метода для возможного их использования при определении мутаций в большом количестве образцов ДНК, получаемых из тканей мышей, подвергнутых радиационному воздействию. Эти были - «CEL-I эндонуклеазный метод», основанный на использовании CEL-I эндонуклеазы, специфически расщепляющей участки ДНК с неспаренными основаниями, и метод гель электрофореза при временном градиенте температуры (temporal temperature gradient gel electrophoresis - TTGE). Сравнение результатов, получаемых обоими методами, позволило заключить, что CEL- I эндонуклеазный метод дает более качественные результаты, чем TTGE-метод.

Более того, GEL-1 эндонуклеазный метод более чувствителен, по сравнению с TTGE-методом. GEL-I эндонуклеазный метод позволяет одновременно проводить анализ большого количества образцов ДНК, получать воспроизводимые результаты, не требует сложного оборудования и экономичен. Важнейшим этапом при выявлении мутаций, индуцируемых ИИ, методом CEL-I эндонуклеазы является получение: гетеродуплексов путем гибридизации ПЦР-ампликонов участков мтДНК облученных и контрольных животных. Эта процедура дает существенное преимущество для более четкого воспроизводства результатов в; параллельных анализах и является необходимым при выявлении мутаций ДНК. CEL-I эндонуклеазный метод является достаточно чувствительным инструментом для выявления мутации в последовательностях ДНК, индуцируемых ИИ. С помощьк»этого метода может быть выявлена, одна, мутантная; молекула; среди; 30-35 нормальных (диких) молекул размером около; 500т 1000; п.н. [Bannwarth et al., 2008; Tsuji, Niida, 2008]. Для. анализа мутаций; мтДНК, индуцируемых; ИИ в дозах 1-5 Fp, этим методом мы, использовали? гетеродуплексы; ИЦР-ампликоновштДНК- размером 437-1092: п.н: Что касается; определения, мутаций мтДНК, возникающих при малых дозах облучения, животных, то для. этого требуется: получение гетеродуплексов!ЩР-ампликонов,участков ДНК большего размера (2000-5000 п.н.):. Таким?: образом; метод определения« мутаций; с использованием, GEL-I эндонуклеазы, позволяет достичь необходимой чувствительности.

Прежде, чем начать основные эксперименты;, с использованием этого метода, мы определяли расщепление «эталонного» гетеродуплекса, полученного из ПЦР-ампликонов, заранее подобранных фрагментов дикого и мутантного типов гена р53, GEL-эндоиуклеазой. Результаты наших экспериментов i показали; что4 метод может, быть , использован для выявления неизвестных мутаций в тканях млекопитающих, индуцируемых ионизирующей радиацией. Полученные нами результаты по определению мутаций мтДНК в тканях и в составе, циркулирующей ДНК облученных мышей, с использованием CEL-I эндонуклеазы, не позволяют представить расчетные величины по реальной частоте мутаций мтДНК, индуцируемых ИИ. Однако эти данные позволяют характеризовать степень гетероплазмии (одновременное присутствие мутантных и диких копий) мтДНК в тканях и в плазме животных, подвергнутых радиационному воздействию.

Доля мутантных копий мтДНК (или гетероплазмия) в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей, увеличивается- в зависимости от дозы рентгеновского излучения. Здесь мы наблюдаем, подобную линейную зависимость, которая была выявлена при определении частоты мутаций в составе яДНК тканей головного мозга И' селезенки мышей, облученных разными дозами» рентгеновского излучения [Nakamura. et al., 2000; Ono et al., 2003]. Результаты-наших- экспериментов показали, что уровень гетероплазмии мтДНК в клетках тканей организма, после радиационного воздействия, существенно- повышается, и это- может оказывать, влияние, на- многие молекулярные и клеточные процессы, связанные: с развитием лучевойфеакции организма.

Ранее было- показано, что ИИ вызывает in1 vivo больше повреждений в мтДНК, чем в соразмерном фрагменте яДНК. Также было установлено, что ИИ индуцирует синтез мтДНК и.биогенез, митохондрий в клетках тканей животных в, течение 2-5 часов, после их облучения мышей, [Malakhova. et al., 2005; Патрушев и-др., 2006; Евдокимовский и др., 2007; Nugent'et al., 2007; Zhang et al., 2007]. Хотя, механизмы усиления;биогенеза митохондрий и синтеза мтДНК после* действия ИИ' не достаточно ясны, индукция! этих процессов ассоциируется с развитием компенсаторной реакции в клетках в; связи с повреждением мтДНК и снижением'энергообеспечения клеток [Lee, Wei, 2005; Газиев, Шайхаев, 2008]. Можно полагать,.что значительное количество вновь синтезируемых копий мтДНК на- поврежденных матрицах будут содержать мутации. Это может привести к возникновению повышенной гетероплазмии в клетках тканей облученных животных в пострадиационный период. В течение от 8 до 28 дней пострадиационного периода, мы обнаружили снижение уровня общего количества копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки мышей, облученных в дозе 3-5 Гр. Увеличение мутантных копий и снижение общего содержания копий мтДНК в тканях мышей в течение длительного пострадиационного периода свидетельствует о нарушении энергетического метаболизма и возникновении дисфункции митохондрий в тканях облученного организма. Такая ситуация в свою очередь может приводить к усилению продукции АФК в митохондриях и последующему увеличению повреждений, с которыми, в определенной мере, связана последующая нестабильность генома облученных клеток [Miller et al., 2008;,Wallace et al., 2010]. Как установлено в настоящее время, клетки разных тканей, для их нормального функционирования, требуют определенный-уровень содержания копий. мтДНК [Clay et al., 2009; Krishnan et al., 2010].

Результаты наших экспериментов показывают, что высокий уровень гетероплазмии (мутантных. копий мтДНК) в тканях мышей, наблюдаемый, на 8 день,после их облучения, постепенно снижается ^ 28 дню пострадиационного, периода. С другой стороны, содержание общего количества мтДНК (из. расчета на яДНК) в тканях мышей фактически, остается на одинаковом уровне во все сроки исследования после облучения в дозах 1-5 Гр. Заметим, что снижение доли мутантных молекул мтДНК происходит быстрее в селезенке, клетки которой более активно подвержены- радиационной гибели, чем клетки головного мозга. Такая- динамика снижения» мутаций не характерна для яДНК. Как показывают ранее полученные данные Оно и соавторов [Ono et al., 2003], уровень частоты соматических мутаций; выявляемых в составе яДНК тканей головного мозга и. селезенки мышей, подвергнутых воздействию рентгеновским излучением, сохраняется без изменения в течение четырех месяцев.

Одновременно со снижением мутантных копий мтДНК в тканях, мы регистрируем резкое увеличение их доли, со сдвигом максимума на 14 день после облучения, в составе циркулирующей вк-ДНК плазмы этих же мышей. Известно, что соматические клетки с нерепарированными или летальными повреждениями я ДНК могут подвергаться гибели разными путями. В нормальных физиологических условиях в плазме крови животных и человека всегда содержится определенное количество циркулирующей вк-ДНК. При массовой гибели клеток в тканях организма в результате радиационного поражения или при иной патологии, возможно, выявление, значительного повышения уровня вк-ДНК в плазме (сыворотке) крови и других N биологических жидкостях [Umansky, Tomei, 2006; Tsang; Lo, 2007; Тамкович и др. 2008; Holdenrieder, Stieber, 2009]. Усиление гибели клеток, при проведении радиотерапии опухолей, сопровождается увеличением содержания вк-ДНК в плазме и в, других биологических жидкостях у пациентов, [Cheng et al., 2009]. Увеличение содержания- общей циркулирующей ДНК в» плазме- крыс, подвергнутых радиационному воздействию, было показано в, работе Владимирова с сотрудниками [Vladimirov et al., 1992]. Результаты наших анализов показывают, что в плазме мышей доля мутантных» копий вк-мтДНК на 14 день после облученияувеличиваетсяв, 15 раз (при;дозе 5 Гр) по сравнению с контролем, тогда как общее содержание вк-мтДНК увеличивается в 4 раза (рис. 21, 22).

Как известно, гибель клеток тканей, облученных животных может происходить различными путями в течение длительного времени и зависит от дозы облучения. При этом, максимум активной гибели различных клеток приходится на 6-10 часы после облучения животных сублетальными дозами радиации [Maruyama, Feola, 1987; Nomura et al., 1992]° Полученные нами данные, указывающие на увеличение содержания внеклеточной мтДНК с мутациями В' плазме крови мышей в- течение 28 дней после их облучения, нельзя связывать с максимумом активной фазы апоптоза клеток тканей этих животных. Скорее всего, повышенный уровень мтДНК с мутациями в плазме облученных мышей, можно предполагать, связан с отсроченной гибелью клеток и селективной элиминацией поврежденных и мутантных копий мтДНК из клеток.

Известно, что в отдаленные сроки пострадиационного времени количество гибнущих клеток существенно снижается, но гибель клеток связанная с индуцированной нестабильностью генома, может продолжаться. Одним из характерных признаков индуцированной нестабильности генома является отсроченная гибель клеток в течение длительного пострадиационного времени [Morgan et al., 1996; Zhivotovsky, Kroemer, 2004]. Возможно, увеличение количества мутантных копий мтДНК приводит к усилению продукции АФК и последующему увеличению- повреждений митохондриального генома и митохондриальной:дисфункции, которые оказывают влияние на радиационную индукцию нестабильности генома в облученных клетках [Kulkarni et al., 2009; Park et al., 2009; Anoopkumar-Dukie et al., 2009; Bianchi, 2010]. Следовательно; развитие каскада этих взаимосвязанных процессов; может, приводить к продолжению отстроченной» клеточной гибели [Morgan: et al., 1996; Zhivotovsky, Kroemer, 2004] и, соответственно, к; выбросу большого количества вк-ДНК в кровоток облученных животных. Можно предполагать, что повышенный уровень вк-мгДНК с мутациями в- плазме крови облученных мышей в отдаленные пострадиационные сроки (8-28 дни) * обусловлен, также, и селективной элиминацией копий. мтДНК с. мутациями из клеток тканей [Alexeyev et al., 2008]. Элиминация 'мтДНК с мутациями из; клеток может происходить, в результате митофагии митохондрий, несущих поврежденные и мутантные копий ДНК [Не, Klionsky, 2009]. Очевидно, пусковым; механизмом митофагии является повреждение макромолекул в митохондриях атаками-АФК [Tolkovsky,.2009]. Высвобождаемые в результате митофагии фрагменты мтДНК могут поступать в цитозоль [Patrushev et al., 2006] и затем в кровоток. Митофагия и постоянный; синтез мтДНК способствует обеспечению митохондриального гомеостаза, необходимого для выживания клеток [Не, КИопэку, 2009; ТоИсоувку, 2009].

Таким образом, результаты нашего исследования позволяют полагать, что мутагенез мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей, так же как, и мутагенез ядерных генов, имеет линейную зависимость от дозы ИИ. В отличие от мутантных ядерных генов, большая часть мутантных копий мтДНК элиминируется из тканей мозга и селезенки, при сохранении в них на одинаковом уровне общего содержания мтДНЕС, в течение 28 дневного пострадиационного периода. Результаты показывают, что в течение указанного пострадиационного времени в плазме облученных мышей сохраняется высокий уровень вк-мтДНК с мутациями, с максимумом на 14 день, в составе циркулирующей ДНК. Одновременно мы регистрируем существенное повышение содержания общей вк-мтДНК в плазме облученных мышей. Повышенное содержание вк-мтДНК с мутациями в плазме крови после радиационного воздействия можно рассматривать как потенциальный биомаркер для оценки радиационного поражения организма животных и человека, а также действия других генотоксических агентов. Однако для этого требуется продолжение исследований в условиях клиники.