Исследование процессов репликации и транскрипции митохондриальной ДНК клеток крови мышей при рентгеновском облучении

Евдокимовский, Эдуард Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование процессов репликации и транскрипции митохондриальной ДНК клеток крови мышей при рентгеновском облучении
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование процессов репликации и транскрипции митохондриальной ДНК клеток крови мышей при рентгеновском облучении"

На правах рукописи

□034е06Э4

Евдокимовский Эдуард Владимирович

Исследование процессов репликации и транскрипции митохондриальной ДНК клеток крови мышей при рентгеновском облучении.

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Пущино 2009 г.

2 8 ЯНВ ?ою

003490694

Работа выполнена в лаборатории радиационной молекулярной биологии Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители: кандидат биологических наук

Ушакова Татьяна Евгеньевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Железная

Защита диссертации состоится «18» февраля 2010 г. в 15:30 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.038.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН г. Пущино по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан «/?» О 1 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Людмила Алексеевна

кандидат биологических наук Масулис

Ирина Станиславовна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

кандидат биологических наук Т.И.

Смолихина

Актуальность проблемы

Два последних десятилетия в молекулярной генетике можно смело назвать «веком митохондриалыюй ДНК». Это связано с тем, что именно в это время появились сведения о большом числе заболеваний, вызванных дисфункцией митохондрий и, в отдельных случаях, дефектами в митохондриальном геноме (Wallace 2005). В настоящее время установлена структура мтДНК, расположение се генов на разпых цепях, особенности репликации и транскрипции, а также регуляция этих процессов ядерными факторами в условиях физиологической нормы (Fernandez-Silva et al., 2003). В то же время мехапизмы, лежащие в основе поддержания числа копий мтДНК и уровня транскрипции митохондриальных генов, практически неизвестны. Особый интерес вызывает функционирование мтДНК в условиях окислительного стресса, поскольку сами митохондрии в клетке являются генераторами активных форм кислорода и свободных радикалов. В норме в клетке сохраняется баланс между генерацией АФК и их детоксикацией, однако при воздействии внешнего источника окислительного стресса (например, рентгеновское облучение) этот баланс нарушается, что приводит к повреждению части молекул мтДНК.

Появляющиеся в последнее время новые возможности исследования (ПЦР в реальном времени) позволяют получить количественные данные о копшшости мтДНК и ее транскрипции. Эти же методы позволяют исследовать функционирование митохондриальпого генома в клетках таких тканей, которые никогда не являлись классическими моделями для исследования митохондрий, например в клетках крови. Кроме того, в кровяное русло поступают продукты распада клеток всего оргапизма, в том числе фрагменты ядерной и митохондриалыюй ДНК. Одной из медицинских задач является поиск маркеров, которые позволяли бы неинвазивными методами оценить генотоксический груз, например, при проведении радиохимиотераляи онкологических больных. То обстоятельство, что в пределах любой ткани копийность мтДНК - относительно постоянная величина, а число копий мтДНК на несколько порядков превосходит число копий ядерных генов, позволяет предположить, что именно фрагменты мтДНК могут потенциально быть искомым маркером.

Поскольку в настоящее время практически отсутствуют представления о нестабильности генетического аппарата митохондрий в условиях окислительного стресса, исследование функционирования мтДНК клеток крови мышей при воздействии внешнего мощного источника окислительного стресса (рентгеновского облучения) может расширить существующие представления о митохондриальном генетическом аппарате и иметь практическую ценность в медицинской диагностике.

Цели п задачи работы

Целью работы является исследование процессов репликации и транскрипции митохондриальной ДНК клеток крови мышей при рентгеновском облучении. Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Определить абсолютное количество фрагментов митохондриальных генов (ND2, ND4, CYTB, АТР6) и регуляторного участка D-LOOP в ядросодержащих клетках крови контрольных мышей.

2. Определить абсолютное количество транскриптов митохондриальных генов (ND2, ND4, CYTB, АТР6) в ядросодержащих клетках крови контрольных мышей.

3. Определить количество фрагментов ядерной и митохондриальной ДНК в сыворотке крови контрольных мышей.

4. Исследовать изменения копийности мтДНК в клетках крови в разные сроки после рентгеновского облучения мышей в дозах I и 10 Гр.

5. Исследовать изменение процесса транскрипции мтДНК в клетках крови в разные сроки после рентгеновского облучения мышей в дозах 1 и 10 Гр.

6. Исследовать изменение содержания митохондриальных и ядреных фрагментов ДНК в сыворотке крови в разные сроки после рентгеновского облучения мышей в дозах 1 и ЮГр.

7. Проанализировать отношение митохондриальных фрагментов ДНК к ядерным в сыворотке крови в разные сроки после рентгеновского облучения мышей в дозах 1 и ЮГр.

Научная новизна работы

Настоящее исследование существенно расширяет современные представления о процессах репликации и транскрипции мтДНК в клетках крови. Механизм экспрессии мтДНК представляется более сложным, чем можно было бы предположить, поскольку количество транскриптов разных митохондриальных генов оказалось неэквимолярным, несмотря на то, что инициация транскрипции этих генов осуществляется с общего промотора. Полученные результаты позволяют предположить о наличии механизма посттранскрипционной регуляции числа транскриптов митохондриальных генов.

В условиях окислительного стресса (рентгеновское облучение мышей), когда уровень АФК и свободных радикалов превышает физиологическую норму, обнаружено изменение копийности мтДНК и транскрипции ее генов в зависимости от дозы облучения - от относительно низкой - 1 Гр, до летальной - 10 Гр. На фоне изменения количества мтДНК в ядросодержащих клетках крови происходит изменение количества фрагментов мтДНК и яДНХ в сыворотке крови. Изменяющееся соотношение мтДНК/яДНК в сыворотке крови при

облучении мышей является показателем степени повреждения организма в целом, поскольку в кровяное русло поступают продукты распада всех радиочувствительных клеток.

Научно-практическое значение

Исследование копийностн мтДНК в клетках крови, измепения сс репликации и транскрипции, в сумме с данными о количестве фрагментов мтДНК в сыворотке крови, может быть в перспективе использовано при оценке генотоксического груза при радиационных авариях, проведении курса радио-химиотерапии онкологических больных, изучении нейродегенеративных болезпей человека.

Апробация диссертации

Результаты диссертационной работы доложены на 10 и 12 Пущинских школах-конференциях молодых учепых (2006 и 2008 гт); на V съезде по радиационным исследованиям «Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность» (Москва, 2006); на 35-ой конференции Европейского общества радиационных исследований (ERRS) (Киев, 2006); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, основных выводов работы, списка литературы. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 3 таблицы. Список литературы включает 183 наименования.

Используемые сокращения

мтДНК - митохондриальная ДНК, мтРНК - митохоидриальная РНК, яДНК - ядерная ДНК, мРНК - матричная РНК, АФК - активные формы кислорода, ЭТЦ - электрон-транспортная цепь, ND2 - NADH-dehydrogenase subunit 2 (вторая субъсдишща комплекса NADH-дегидрогеназы), ND4 - NADH-dehydrogenase subunit 4 (четвертая субъедшшца комплекса NADH-дегидрогеназы), CYTB - cytochrome b (цитохром б), АТР6 - АТР-synthetase subunit 6 (шестая субъединица комплекса АТФ-синтазы), D-LOOP -область Д-петли.

Материалы и методы

Лабораторные животные. Эксперименты проводили на самцах мышей линии BALB/c из питомника экспериментальных животных Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН (г. Пущино).

Рентгеновское облучение мышей в дозах 1,10 Гр проводили на установке РУТ 250-151, мощность облучения 2 Гр/мин. После облучения мышей содержали в стандартных условиях вивария ИТЭБ РАН. Через различные сроки после облучения (1 час, 3 часа, 5 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа) мышей умерщвляли и собирали кровь в пластиковые пробирки типа Eppendorf.

Проточная цитомстрня проводилась на приборе Partee PAS III ("Partee GmbH", Germany) при стандартных условиях описанных производителем. Разделение лейкоцитов крови на отдельные субпопуляции проводилось на основе различного светорассеяния этих клеток.

Выделение митохондрий из печенн мышей. После умерщвления мыши печень быстро извлекали и помещали в ледяную среду выделения (СВ), содержащую 225 мМ манит, 75 мМ сахарозу, 1 мМ ЭГТА, 0,1% бычий сывороточный альбумин, 10 мМ HEPES pH 7,4. Три раза промывали ледяной СВ, измельчали хирургическими ножницами в чашке Петри с небольшим количеством СВ. Измельченную ткань гомогенизировали в 10 объемах ледяной СВ, добавляли равный объем ледяной СВ. Центрифугировали 10 минут при ускорении 2000g, 2°С. Супернатант переносили в чистую пробирку и центрифугировали 10 минут при ускорении 12000g. Полученный осадок ресуспендировали в 20 мл среды, содержащей 225 мМ манит, 75 мМ сахарозу, 10 мМ HEPES (pH 7,4). Центрифугировали 10 минут при ускорении 12000g. Полученный осадок митохондрий использовали для выделения ДНК.

Выделение ДНК из форменных элементов крови. Кровь разделяли на сыворотку и форменные элементы методом пассивного осаждения. Через 1 час инкубации при 37°С образцы центрифугировали в течение 1 мин при 150g. Сыворотку осторожно отбирали, к осадку форменных элементов добавлялся лизирующий буфер (4M тиоционат гуанидина, 25 мМ натрия цитрат (pH 7,0), 0,5% саркозил) в объеме 1:1,1/20 V 1М трис-HCl, pH 8.0, 1/20 V 4M NaCl, тщательно перемешивали после внесения каждого реактива, затем добавляли равный объем смеси трис-насыщенный фенол (pH 8,0):хлороформ в соотношении 5:1, гомогенизировали и оставляли на 20 мин при 4°С. После центрифугирования в течение 5 мин при ускорении 2500g водную фазу отбирали и проводили дополнительную очистку хлороформом в соотношении 1:1. После центрифугирования (5 мин, 2500g) отбирали водную фазу, добавляли два объема 96% этанола и оставляли на ночь при -20°С. ДНК осаждали при центифугировании (10 мин, 12000g), осадок дважды промывали 70% этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCl pH 8.0,1мМ ЭДТА).

Выделение ДНК из сыворотки крова (сорбция ua магнитных сорбентах). К 70 мкл

сыворотки добавляли 5 мкл IM трис-HCl, pH 8.0, 25 мкл 4M NaCl и 10 мкл магнитных сорбентов. После инкубации в течение 15 мш при 55°С проводили связывание сорбентов на магнитном штативе. Элюцию ДНК с сорбентов осуществляли в ТЕ-буфере в объеме 70 мкл в течение 15 мин при 65°С.

Выделение ДНК из митохондрий. Выделение ДНК из митохондрий осуществлялось согласно методу, описанному в пункте 2.5.1

Выделение РНК. Тотальную РНК из форменных элементов крови выделяли методом Хомчински и Саччи (Chomzynski and Sacchi, 1987).

Обработка РНК ДНК-азой При выделении тотальной РНК в препарате РНК соосаждается значительное количество мтДНК. Для того, чтобы очистить препарат РНК от мтДНК проводилась обработка ДНК-азой в объеме 50 мкл в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl pH 7.5, 10 мМ MgCl2, 1 мМ СаС12 (Силекс, Россия) и 50 U ДНК-азы I (Силскс, Россия). Смесь инкубировали при 37°С в течение 30 минут, разводили в два раза деинизованной водой, добавляли равный объем смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), перемешивали. Центрифугировали 5 минут при ускорении 5000 об/мин (центрифуга Eppendorf 5415). Отбирали верхнюю фазу, добавляли 1/10 объема AcONa, равный объем изопропанола и оставляли на 24 часа при -20°С. Центрифугировали 5 минут при ускорении 12000 об/мин (центрифуга Eppendorf 5415). Осадок РНК дважды промывали 70% этанолом. После высушивания на воздухе РНК растворяли в воде, обработанной DEPC.

Обратная транскрипция. Синтез первой цепи кДНК осуществляли по следующей процедуре: 2 мкл мРНК и 1 мкл oligo-d(T)ig праймера инкубировали в течение 5 минут при +70°С, после охлаждения при +4°С добавляли буфер, содержащий 10мМ Tris-HCl pH 8.3, 50 мМ KCl, 0,2 мМ dNTPs, 1,6 мМ MgJ+ , 1 мкл RNAsin™ (Fermentas) и 1 мкл (200 ед.) Н-Minus™ M-MuLv обратной траискриптазы (Fermentas). Время инкубации составляло 30 минут при +40°С. Реакцию останавливали нагреванием при 95°С в течение 10 минут.

ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторах Applied Biosystems 7500 Real-Time System и Applied Biosystems 7300 Real-Time System («Applied Biosystem, USA»). Система ПЦР-РВ и ОТПЦР-РВ включала технологию TaqMan, основанную на 5'-экзонуклеазной активности 7я<?-полимеразы. Зонды были помечены флуорофором на 5' конце и тушителем на 3' конце. Все реакции ПЦР-РВ проводились в буфере, содержащем ЮмМ Tris-HCl pH 8.3, 50 мМ KCl, 0,25 мМ dNTPs, 2,5 мМ Mg2+, 300 нМ каждого праймера и 150 нМ каждого зонда, 1,5 ед. Taq-полимеразы.

Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле. При проведении горизонтального электрофореза использовали ТАЕ-буфер pH 8,0 (40 мМ Tris,

1.5М ацетата натрия, 1 мМ ЕОТА) и 2% агарозный гель. Напряженность электрического поля - 5У/см. Гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали.

Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в полиакрпламидном геле осуществлялось в нативных условиях (вертикальный электрофорез) при концентрации полиакриламида в геле 8% (соотношение акриламид:бис-акриламид 24:1) в ТВЕ-буфере (рН 8,3). Длина пробега составляла 20 см. После завершения электрофоретического разделения фрагментов ДНК гель окрашивался раствором нитрата серебра.

Визуализация фрагментов ДНК в полиакриламидяом геле при окрашивании нитратом серебра. Перед окраской гель фиксировался в 10% растворе этилового спирта в течение 5 минут, затем этиловый спирт замещался 1% раствором азотной кислоты (3-5 мин) и помещался на 20 минут в 0,012 М раствор нитрата серебра, в который предварительно добавляли 800 мкл 37% формальдегида. Затем проводилась однократная промывка геля от раствора нитрата серебра в дистиллированной воде (15-20 секунд). Проявление окраски наступало в 0,35 М растворе углекислого натрия, в который предварительно добавляли 800 мкл 37% формальдегида. Окраска геля останавливалась добавлением в раствор избытка 10% раствора уксусной кислоты. Готовый гель высушивался на воздухе и сканировался. Праймеры и зонды, использованные для количественного определения мтДНК, указаны в таблице 1.

Таблица 1. Олигонуклеотиды, использованные для ПЦР в реальном времени.

Название праймера Последовательность Длина амплюсона

Бс1а-аспп Рог АСЮ САТ СТА ССТ лес САТ ССА 81

Вет-асш Яеу ТСТ ССО ОАО ТСС АТС АСА АТО

Ве(а-ас1т РгоЬе ГАМ-ТСТ ССС ТСТ АТС ССТ СТО СТС СТА ССА С-ВН01

АТР6 Рог (8265-8287) ААТ ТАС АСЮ СТГ ССО АСА САА АС 79

АТР6 Лет (8342-8319) ТОО ААТ ТАС ТСА ААТ ТОО АСТ ТСС Т

АТРбРшЬе (8290-8? 16) Су5-ААА АвС ТСА СГТ ОСС САС ГГС СТГ ССЛ-ВН<}2

И. Гот (15687-15709) ААТ СТА ССА ТСС ТСС ОТО ААА СС 62

01, Ист (15748-15732) (КС ССХЗАСС ОАО ААО АО

01. РгоЬе (15711-15730) К60-АСА АСС СОС ССА ССА АТО СС-ВН01

СУТВГог(14«62-|4680) ОСС лее ТТС АСС СОА ТТС Т 64

СУТВР.еу(14725-!4707) ТТС СТА СКХЗ ССО СОЛ ТАА Т

СУШ РгоЬе (14682-14705) ЙОХ-СОС ТГТ ССА СТТ САТ СТТ АСС АТГ ВН(}2

№>2 Гот (4062-4082) САС САТ САА СТО ЛАв САС САА 76

N0211« (4137-4117) АСО АТС ОСС Л ОО А 00 АТА АТТ

N02 РгоЬе (4085-4112) ГАМ-АЛА ТАС ТТС ОТС АСА САА ССА АСА СЗСС Т-ВН<21

N04 Рог (10558-10582) АТТ АТГ АТГ АСС СОА ТвЛ ООО ААС С 110

N1)41^(10667-10644) АТТ ААО АТО АйО ССА АТГ А<ЗС АОТ

N04 РгоЬе(10590-10617) КОХ-АСО ССТ ААА СОС АСО ОАТ ТТЛ ТТТ ССТ Л-ВНС12

Результаты и обсуждение

Митохондриальный генетический аппарат по своей структуре позволяет автономно от ядра осуществлять процессы репликации, транскрипции и трансляции мтДНК.

Определение количества копий мтДНК в ядросодержащих клетках крови контрольных мышей

Для исследования процессов репликации мтДНК выбраны пять участков мтДНК тяжелой цепи: гены N02 и N04, кодирующие субъединицы первого комплекса дыхательной цепи, ген СУТВ входящий в состав третьего комплекса дыхательной цепи, ген АТР6, кодирующий субъединицу митохондриальной АТФ-азы (пятый комплекс дыхательной цепи), а также область Д-петли - единственного регуляторного участка мтДНК, содержащего точку начала репликации и промоторы транскрипции для обеих цепей мтДНК.

Рис 1. Схема расположения исследуемых генов на молекуле мтДНК

Абсолютное значение копий мтДНК на гаплоидный набор клетки определено на основе метода ЦПР в реальном времени.

Как видно из рисунка 2, не наблюдается достоверных различий в числе копий исследованных митохондриальных генов, следовательно, мы можем усреднить их значения и определить не только количество конкретного гена, но и количество нативных молекул мтДНК, т.е. определить копийность мтДНК на гаплоидный набор клетки. Таким образом, копийность мтДНК в ядросодержащих клетках крови, полученная усреднением числа копий 5 митохондриальных генов, составляет 4700±1080 (п=10) копий мтДНК на гаплоидный набор клетки.

юооо

3000

I СТ

Рис. 2 Количество копий митохондриальных генов на одну копию однокопийного ядерного гена бета-актина. п=10, различия между генами недостоверны.

Известно, что клетки крови обладают сравнительно небольшим числом митохондрий и, соответственно, мтДНК по сравнению с другими тканями. Так, в нейтрофилах человека число копий мтДНК, определенное методом ПЦР в реальном времени, равняется примерно 100 на клетку (Ма1аш1а й а1., 2004), число копий мтДНК в лимфоцитах человека несколько выше, до 300-400 копий на клетку (СовБап'гга Щ а!., 2002; ОаЬап ее а1., 2001), в моноцитах методом электронной микроскопии показано небольшое количество митохондрий. Таким образом, среднее значение числа копий мтДНК в ядросодержащих клетках человека находится на уровне нескольких сотен копий мтДНК на клетку. Определенное нами количество копий мтДНК в ядросодержащих клетках крови мышей на порядок выше, что объясняется гораздо более высоким уровнем метаболизма мышей по сравнению с человеком.

Исследование процессов транскрипции митохондриалышх генов в клетках крови контрольных мышей.

Для нормального функционирования митохондрий необходимо, чтобы в них поддерживался достаточно высокий уровень транскрипции митохондриальных генов, поскольку все гены, закодированные в митохондриальной ДНК, необходимы для работы ЭТЦ. В настоящей работе проведена оценка количества транскриптов 4-х митохондриальных генов в клетках крови контрольных мышей. Анализ количества транскриптов митохондриальных генов осуществлялся на кДНК, синтезированной с мРНК клеток крови. Также как и при исследовании копийности мтДНК, количество митохондриальных транскриптов выражали в пересчете на 1 транскрипт ядерного гена бета-актина.

Процесс транскрипции мтДНК начинается с синтеза длинной молекулы-предшественника, охватывающей всю кольцевую молекулу мтДНК. Этот процесс симметричен и одинаков для обеих цепей мтДНК - легкой и тяжелой, несмотря на то, что легкая цепь кодирует всего одну мРНК и 8 тРНК, а тяжелая, соответственно, 12 мРНК, 2 рРНК и 12 тРНК. «Знаками препинания» являются гены тРНК, которые расположены между генами полипептидов и рРНК. После синтеза первичного транскрипта происходит процессинг, т.е., вырезание мРНК и полиаденилирование образовавшихся молекул. Поскольку все гены мтДНК синтезируются с одного промотора, следовало бы ожидать, что количество транскриптов различных генов после процессинга окажется примерно одинаковым. Однако нами было обнаружено, что количество транскриптов, относящихся к разным комплексам дыхательной цепи, оказалось разным (рис 3).

390

360

* 330 -

80 70 60 50 40 30 20 10 0

ND2

ND4 Dloop CtfB ATP 6

Рис. 3 Количество транскриптов разных митохондриальных генов в клетках крови контрольных мышей. п=10

Наименьший уровень экспрессии был зафиксирован у генов I комплекса ЭТЦ - ND2 и ND4, всего 4 копии на один транскрипт ядерного гена бета-актина. Значительно выше уровень транскрипции у гена CYTB, входящего в III комплекс дыхательной цепи, - 49 копий мРНК на одну копию мРНК бета-актина. Наибольший уровень экспрессии (320 копий на одну копию бета-актина) наблюдается у гена АТР6, кодирующего одну из субъединиц АТФ-азы, которую часто называют V комплексом дыхательной цепи. Таким образом, чем дальше по пути следования электронов расположен комплекс дыхательной цепи, тем выше его экспрессия, что согласуется с количественным распределением белковых комплексов дыхательной цепи на внутренней мембране митохондрий (Schägger and Pfeiffer, 200!). Наиболее вероятный механизм посттранскрипционной регуляции количества митохондриальных транскриптов - это различная их стабильность внутри митохондрии, которая определяется степенью полиаденилирования их З'-конца (Piechota et al., 2006). На гистограмме на рис. 3 приведено значение числа транскриптов и для области мтДНК, не кодирующей генетической информации, - области Д-петли. Однако этот участок является транскрибируемым и входит в состав первичного транскрипта, который в дальнейшем подвергается процессингу. Небольшое число транскриптов этого участка говорит нам о том, что первичный транскрипт мтДНК в митохондриях довольно быстро расщепляется на молекулы мРНК, рРНК и тРНК.

Таким образом, в митохондриях ядросодержащих клеток крови мышей уровень транскрипции митохоидриальных генов, если судить по количеству первичного транскрипта (Д-петля), сопоставим с уровнем транскрипции ядерного конститутивного гена бета актина. Количество траискриптов генов ND2 и ND4 также мало отличается от количества копий гена бета-актина. С учетом того, что транскрипция всех митохоидриальных генов находится под контролем единого промотора, кажется парадоксальным столь значительное превышение мРНК генов АТР6 и CYTB пад общим уровнем. Можно предположить, что эффективность ПЦР для генов АТР6 и CYTB выше, чем для гепов ND2, ND4, D-LOOP. Однако при определении числа траискриптов всех этих гепов использовались те же условия ПЦР «по и при определении числа копий мтДНК, где различия между этими же генами недостоверны. Второй возможной причиной разного количества митохоидриальных траискриптов могла бы быть недостаточная процсссивность РНК-зависимой ДНК-полимеразы при проведении реакции обратной транскрипции. Однако в этом случае, если учитывать направленность синтеза, количество траискриптов генов АТР6 и CYTB должно быть значительно ниже, чем генов ND2 и ND4.

Все вышесказанное убеждает нас в том, что полученные результаты отражают истинную картину процесса транскрипции митохоидриальных гепов в клетках крови, а не являются следствием артефактов при проведении экспериментов, тем более, что полученные значения находятся в соответствии с соотношением белховых комплексов дыхательной цепи на внутренней мембране митохондрий.

Функционирование митохондриалытго генетического аппарата в ядросодержащих клетках крови при облучении мышей в дозе 1 Гр.

Популяциошшй состав ядросодержащих клеток крови при облучении мышей в дозе 1 Гр.

Кровь представляет собой гетерогенную популяцию различных видов клеток. Клетки, содержащие ядро, подразделяются на три основные популяции: гранулоциты (состоящие, в основном, из нейтрофилов), лимфоциты, моноциты. Методом проточной цитометрии на основе параметров светорассеяния клеток было определено долевое распределение основных ядерных популяций клеток у контрольных мышей.

Относительно равноценными по количеству являются популяции гранулоцитов и лимфоцитов (44% и 50%, соответственно). Минорной составляющей является популяция моноцитов: 8-10%. В первые 5 часов после облучения мышей в дозе 1 Гр клеточный состав практически не меняется. Через сутки 20% лимфоцитов погибло в результате апоптоза и

популяция лимфоцитов все еще не восстановлена через 48 часов после облучения в дозе 1 Гр (табл. 2).

Таблица 2 Долевое распределение клеточных популяций контрольных и облученных в дозе 1 Гр мышей.

контроль 1 час 5 часов 24 часов 48 часов

Лимфоциты 50±1,5 42,6±С,6 44,2±3,5 Зб,9±6,4 38,2±б,8

Гранулоциты 44±1,5 44,4±3,0 55,8±3,5 54,2±10,5 39,3±5,6

Моноциты 6±0,7 13,0±3,1 !1±2,5 8,9±4,7 22,5*2,3

Копийность мтДНК в клетках крови облученных в дозе 1 Гр мышей

Помимо выполнения своей главной задачи- генерации АТФ, деятельность митохондрий приводит к образованию побочных продуктов - АФК и свободных радикалов. мтДНК находится в непосредственной близости от ЭТЦ и, вследствие этого, является основной мшпепью для повреждающего действия этих повреждающих агентов. Возможно, многокопийность мтДНК в любых клетках представляет собой часть механизма, сохраняющего целостность генетического пула митохондрий при повреждении части молекул мтДНК. Мы попытались оценить функционирование митохондриального генома в условиях, когда к действию АФК, генерируемых в митохондриях в норме, добавляется действие АФК, неизбежно образующихся при окислительном стрессе, вызванном рентгеновским облучением в дозе 1 Гр.

Как можно видеть на рисунке 5, уже через час после облучения мышей в дозе 1 Гр количество копий мтДНК в клетках крови снижается в 2 раза и не восстанавливается в течение 3-х суток.

01 5 24 72

Время после облучения мышей в дозе 1 Гр, ч Рис. 5 Пострадиационное изменение количества копий мтДНК на гаплоидный набор в клетках крови мышей, п-10 Единица на оси ординат - количество ко пий мтДНК на гаплоидный набор в клетках крови контрольных мышей.

Кинетика изменения количества копий генов N04, СУТВ, АТР6 и фрагмента Д-петли проявляется однотипно и, используя вышеописанную логику перевода количества генов в число копий мтДНК, можно утверждать, что число нативных копий мтДНК в клетках крови снижено в условиях повышенного содержания АФК и свободных радикалов.

Исследование процессов транскрипции митохондриальных генов в клетках крови облученных в дозе 1 Гр мышей.

После облучения мышей в дозе 1 Гр число транскрштгов генов СУТВ и АТР6 значительно возрастает к 5 часам (рис. 6). В более поздние сроки после облучения количество транскриптов постепенно снижается и к 72 часам составляет 20% от контрольного.

Как следует из рисунка 6, изменение количества транскриптов двух различных митохондриальных генов совпадает друг с другом, несмотря на их разный уровень в контроле (317 копий АТР6 и 49 копий СУТВ на одну копию ядерного гена бета-актина).

Однотипность изменения свидетельствует о том, что регуляция числа копий этих транскриптов, происходит на уровне инициации транскрипции. 10 9 8

7 • 6 -5

4 Н 3 2 1 0

■з

I-

Контроль 1 час 5 часов 24 часа 72 часа Время после облучения мышей в дозе 1 Гр, ч Рис. б Пострадиационные изменения в количестве транскриптов митохондриальных генов СУТВ и АТР6 в тетках крови при облучении мышей в дозе 1 Гр. п-10. Единица на оси ординат - количество копий митохондриалыюй кДНК на один транскрипт ядерного однокопийного гена бета-актина в клетках крови контрольных мышей.

Увеличение транскрипции мтДНК в первые пять часов в выживших клетках крови после облучения мышей в дозе 1 Гр, возможно, является компенсаторной реакцией клеток на потерю ими части своих митохондрий. Однако активация эта кратковременная, поскольку уже через сутки количество транскриптов мтДНК снижается до контрольного уровня, а через 72 часа становится значительно ниже контроля. Необходимо подчеркнуть, что в это же время число нативных копий мтДНК значительно снижено. Поскольку матрицей для осуществления транскрипции является мтДНК, отчасти это служит объяснением снижения уровня транскрипции. Однако нельзя исключить и влияние многих ядерных факторов, осуществляющих регуляцию транскрипции мтДНК, уровень экспрессии которых также может претерпевать пострадиационные изменения.

Таким образом, в условиях превышения контрольного уровня АФК и радикалов, которые не приводят к массовой гибели клеток крови, происходит значительное изменение

функционирования всего генетического аппарата митохондрий. На уровне копийности мтДНК эти изменения проявляются в снижении количества нативных копий мтДНК. В первые часы после облучения клетки пытаются компенсировать деструктивные изменения мтДНК активизацией процессов транскрипции, однако в более поздние сроки развития радиационного эффекта компенсаторный ответ клеток истощается. Все это свидетельствует о высокой чувствительности генетического аппарата митохондрий к повреждающему действию АФК и радикалов.

Исследование нарушения функционирования митохондриального генома в крови мышей, облученных в дозе 10 Гр

Радиационно-индуцированное изменение популяций

ядросодержащих клеток крови мышей.

Общепризнанным фактом является то, что лимфоциты подвержены апоптозу как при нормальных физиологических условиях, так и при индукции апоптоза любым внешним источником: действие ионизирующего и рентгеновского облучения, активация апоптоза через так называемые «рецепторы смерти», истощение питательных веществ в сыворотке в культуре клеток. Действительно, как показано в табл. 3, лимфоциты представляют собой стремительно элиминирующую популяцию. Уже через 5 часов после облучения мы наблюдаем массовую тибель наиболее радиочувствительной популяции лейкоцитов -лимфоцитов. Их долевой состав снижается более чем на 20% через пять часов и на 80% через 24 и 48 часов после облучения в дозе 10 Гр. Несомненно, количество других форменных элементов (гранулоцитов и моноцитов) также снижается в абсолютных числах (количество клеток на мл крови), однако их доля в клеточном составе крови возрастает за счет быстрого вымирания популяции лимфоцитов.

Таблица 3. Долевое распределение клеточных популяций контрольных и облученных в дозе 10 Гр мышей.

контроль 1 час 5 часов 24 часа 48 часов

Лимфоциты 50±1,5 44,5±9,5 Зб,7±1,8 9±0,9 11,6±1,2

Гранупоциты 44±1,5 44,1±6,7 63,3+1,8 61,4±5,7 69±3,2

Моноциты 6±0,7 11,4±1,5 13,5±1,1 29,6±6,2 19,4±4,5

Копийность мтДНК и количество ее транскриптов в клетках крови облученных в дозе 10 Гр мьчией.

Поскольку, как обсуждалось выше, анализируемые фрагменты мтДНК представляют собой участки генов, расположенных в разных местах кольцевой молекулы, мы можем говорить це только о количестве конкретного гена, но и о количестве самих полноразмерных молекул мтДНК.

Время после облучения мышей в дозе 10 Гр, ч Рис. 7 Пострадиационное изменение количества копий мтДНК на гаплоидный набор в клетках крови мышей. п~10 Единица на оси ординат - количество копий мтДНК на гаплоидный набор в клетках крови контрольных мышей

То, что через час после облучения количество молекул мтДНК в клетках крови увеличено в три раза, свидетельствует о том, что облучение инициировало процесс ее репликации. При облучении в летальных дозах клетки погибают, в основном, в процессе апоптоза, который требует больших затрат энергии. Индукция репликации мтДНК, означающая активацию биогенеза митохондрий в целом, может являться одним из этапов реализации программы апоптоза.

мРНК, как одноцепочечная молекула, более чувствительна к повреждающему действию облучения, чем двуцепочечная ДНК. Тем не менее, количество митохондриальных транскриптов в первые 5 часов после облучения увеличено в той же степени, что и

количество копий мтДНК (рис. 8). На рисунке 8 а, представлены суммированные данные по четырем митохондриальным генам (N02, N04, СУТВ, АТР6), расположенным на тяжелой цепи мтДНК. Аналогичным образом изменяется количество транскриптов гена N06, расположенного на легкой цепи мтДНК (рис. 8 б).

Вреыя после облучения мышей 6 дозе 10 Гр, ч Время после облучения мышей в дозе 10 Гр, ч

Рис. 8 Изменение уровня транскрипции митохондриальных генов в клетках крови при облучении мышей в дозе 10 Гр. а) Изменение количества транскриптов митохондриальных генов тяжелой цепи (N02, N04, СУТВ, АТР6), соотнесенное к одной копии транскрипта ядерного гена бета-актина, б) Изменение количества транскриптов митохондриального гена легкой цепи N06, соотнесенное к одной копии транскрипта ядерного гена бета-актина

На графике представлены количества транскриптов мтДНК, рассчитанных на одну копию транскрипта ядерного гена бета-актина. Необходимо отметить, что число транскриптов мтДНК в клетках крови в первые пять часов после облучения мышей в дозе 10 Гр изменяется в полном соответствии с числом молекул мтДНК, что свидетельствует об активизации функционирования генетического аппарата митохондрий в целом и, в конечном итоге, приводит к активации процессов, связанных с синтезом АТФ, по крайней мере, в лимфоцитах. Через сутки после облучения не удается амплифицировать фрагменты кДНК гена бета-актина, поскольку количество кДНК становится ниже предела чувствительности ПЦР в реальном времени, то есть развитие радиационного эффекта проявляется в снижении процесса транскрипции конститутивных генов.

Необходимо отметить, что в более поздние сроки и количество мтДНК катастрофически снижается (рис. 7), то есть развитие радиационного повреждения молекул

мтДНК не компенсируется процессами репликации, либо механизм этого процесса уже в значительной степени нарушен.

Снижение количества транскриптов генов конститутивных белков в клетках крови говорит о серьезном изменении функционирования клеток. Маловероятно, чтобы клетки, утратившие способность поддерживать транскрипцию своих конститутивных генов, могли бы выполнять свои основные функции. В литературе описаны случаи снижения митохондриальной массы и даже полного исчезновения митохондрий из клеток в результате нарушения транскрипции ядерных факторов, обеспечивающих репликацию и транскрипцию мтДНК, что приводит к серьезной дисфункции митохондрий и утрате мтДНК в более поздние сроки после облучения в летальной дозе. Наблюдаемая картина изменений непосредственно предшествует гибели животных.

Количество митохондриальных и ядерных фрагментов в сыворотке контрольных и облученных мышей.

В условиях нормального функционирования организма постоянно происходит гибель множества клеток. Большая часть их погибает по типу программируемой клеточной гибели - апоптоза. При этом апоптотические тельца, содержащие продукты распада клеток, в том числе и ДНК, попадают в кровяное русло. Таким образом, в сыворотке крови контрольных животных без всяких внешних повреждающих воздействий можно детектировать фрагменты нуклеиновых кпелот, как яДНК, так и мтДНК.

Все представления об изменении копийности мтДНК, ее репликации и транскрипции в настоящей работе базируются на абсолютных значениях числа копий мтДНК и ее транскриптов в ядросодержащих клетках крови. В том случае, когда копийность мтДНК в клетках крови была снижена, естественно было бы предположить, что либо поврежденные молекулы мтДНК подвержены глубокой деградации внутри митохондрий, либо фрагменты мтДНК поступают в кровяное русло. Анализ изменения количества митохондриальных и ядерных фрагментов в сыворотке крови позволил предложить такой параметр как мтДНК/яДНК.

Динамика изменения данного параметра отражает драматические события, развивающиеся во всех радиочувствительных тканях организма и, в какой-то мере, может быть показателем радиационного повреяедения организма. Мы полагаем это еще и потому, что как при облучении в дозе 1 Гр, так и при облучении в дозе 10 Гр предлагаемый нами параметр (мтДНК/яДНК) является зеркальным отображением изменения копийности мтДНК в лимфоцитах крови в первые сутки после облучения (рис. 9).

Рис. 9 Зависимость количества митохондриальных фрагментов в сыворотке крови от изменения копийности мтДНК в клетках крови мышей, а) облучение мышей в дозе 10 Гр б) облучение мышей в дозе 1 Гр. Черные кружки - мтДНК в клетках крови, светлые кружки -мтДНКв сыворотке крови

Наблюдаемый процесс приводит к значительному снижению параметра мтДНК/яДНК в сыворотке, что может служить критерием массовой клеточной гибели тканей всего организма.

Поскольку основной вклад в повреждающее действие облучения вносят свободные радикалы и АФК, образующиеся при радиолизе воды, можно предполагать, что наблюдаемая дисфункция генетического аппарата митохондрий может быть характерна не только для облучения, но и в целом для окислительного стресса.

Заключение

электронтранспортной цепи. Можно полагать, что нарушение функционирования митохондриального генетического аппарата связано не столько с повреждением единичных копий мтДНК, сколько с нарушением копийности мтДНК в клетке. Действительно, превышение уровня АФК и свободных радикалов (облучение мышей в дозе 1 Гр) приводит к двукратному снижению копийпостп мтДНК в ядросодержащих клетках крови. Тем не мепее, в этих условиях аппарат транскрипции мтДНК по-видимому не претерпевает серьезных нарушений и уровень митохондриальных транскриптов увеличивается, тем самым компенсируя снижение количества копий мтДНК в клетках крови. Таким образом, при рентгеновском облучении мышей в дозе 1 Гр выявлены нарушения функционирования генетического аппарата митохондрий на уровне копийности мтДНК и транскрипции ее генов. Тем не менее, эта нарушения не являются катастрофическими для клетки.

Все результаты, полученные в настоящем исследовании, представлены в абсолютных значениях количества митохондриальных генов и транскриптов в клетке. Использование количественного метода позволило, неожиданно для нас определить, что механизм транскрипции митохондриальных гспов в условиях нормы представляется более сложным, чем можно было бы ожидать из современных представлений. Одним из базовых представлений процессов транскрипции мтДНК являлось наличие единого полицистроипого блока и единого промотора для всех генов, расположенных на одной цепи мтДНК. Однако оказалось, что количество транскриптов разных митохондриальных генов, кодирующих различные субъединицы комплексов дыхательной цепи, не эквимолярно и, более того, находится в соответствии с распределением белковых комплексов дыхательной цепи на внутренней мембране митохондрий. Это позволяет предположить о наличии механизма поспранскршщионной регуляции времени жизни молекул мРНК митохондриальных генов.

В условиях развивающегося апоптоза, когда происходит массовая гибель радиочувствительных клеток, в первые часы после облучения индуцируются процессы как репликации, так и транскрипции мтДНК. Известно о роли митохондрий в апоптозе, который является чрезвычайно энергозатратным процессом. Мы полагаем, что индукция репликации и транскрипции мтДНК в первые часы развития программируемой клеточной гибели является одним из важных звеньев реализации этой программы. В более поздние сроки после облучения мышей (сутки-трое) митохоидриальный генетический аппарат практически полностью истощен: резко снижено количество копий мтДНК и практически прекращена экспрессия митохондриальных генов, что непосредственно предшествует гибели животных.

Количественный анализ фрагментов митохондриальной и ядерной ДНК, как в условиях физиологической нормы, так и в условиях рентгеновского облучения мышей, показал, что соотношение митохондриальной и ядерной ДНК в сыворотке крови в значительной степени отражает состояние митохондриального генетического аппарата.

В этом смысле исследование клеток крови представляется перспективным не только возможностью исследовать митохондриальный генетический аппарат ядросодержащих клеток, но и оценкой влияния генотоксическах агентов, в результате действия которых в кровяное русло поступают продукты клеточного распада не только форменных элементов крови, но и клеток всех поврежденных тканей.

При лечении онкологических заболеваний самым распространенным неинвазивным методом лечения является радиохимиотерапия. В большинстве случаев средства, применяемые для ее проведения, вызывают повреждения не только опухолевых, но и нормальных тканей, с этим связано множество побочных эффектов и осложнений у пациентов. До сих пор не выработан маркер генотоксического груза при проведении радиохимиотерапии. Нам кажется, что соотношение мтДНК/яДНК в значительной степени отражает уровень повреждения функционирования как митохондриального, так и ядерного генома и, в перспективе, может рассматриваться как показатель гибели клеток при действии генотоксических факторов.

Выводы

1. Рентгеновское облучение мышей изменяет функционирование митохондриального генетического аппарата клетох крови.

2. При рентгеновском облучении мышей в дозе 1 Гр в два раза уменьшается копийность митохондриальной ДНК в клетках крови.

3. В первые часы после рентгеновского облучения мышей в дозе 1 Гр активизируются процессы транскрипции митохондриальных генов, что рассматривается как компенсаторный ответ клетки на уменьшение нативных молекул мтДНК.

4. При развитии апоптоза, инициированного действием летальной дозы 10 Гр индуцируются процессы репликации и транскрипции митохондриальной ДНК в клетках крови мышей.

5. В условиях массовой клеточной гибели (вторые-третьи сутки после облучения мышей в дозе 10 Гр) практически прекращаются процессы репликации и транскрипции мтДНК.

6. Измененное функционирование митохондриального генома в клетках крови при рентгеновском облучении мышей в разных дозах проявляется в изменении количеств митохондриальных и ядерных фрагментов ДНК.

7. Отношение митохоцдриальных фрагментов к ядерным (параметр мтДНК/яДНК) рассматривается как возможный показатель гибели клеток всего организма

Список публикаций по теме диссертации

1. Патрушев М.В., Патрушева В.Е., Касымов В.А., Евдокимовский Э.В.. Ушакова Т.Е., Газиев А.И. Элиминация мтДНК из митохондрий и активация ее репликации в клетках тканей облученных мышей. Цитология, 2006, том 48, вып. 8, стр. 684-695

2. Евдокимовский Э.В.. Патрушев М.В., Ушакова Т.Е., Газиев А.И. В клетках крови облученных мышей наблюдается изменение количества копий мтДНК и ее транскрипция, а в сыворотке появляются ее фрагменты. Радиационная биология.

Радиоэкология, 2007, том 47, вып. 4, стр. 402-407

3. Евдокимовский Э.В.. Патрушев М.В., Ушакова Т.Е., Газиев А.И. Исследование

повреждающего действия рентгеновского облучения и блеомицина на фрагментацию и репликацию мтДНК в клетках крови мышей. Материалы V съезда по радиационным исследованиям «Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность». Москва 10-14 апреля 2006 г.

4. Евдокимовский Э.В.. Патрушев М.В., Ушакова Т.Е., Газиев А.И. Нестабильность мтДНК в крови мышей при действии рентгсповского облучения и цитостатических антибиотиков. Сборник тезисов 10-й международной школы-конференции молодых

ученых «Биология-наука XXI века» Пущино, 17-21 апреля 2006 г.

5. E.V. Evdokimovskv. M.V. Patrushev, Т.Е. Ushakova, A.I. Gaziev. Change in mtDNA

replication and transcription in the blood cclls of micc after treatment with X-rays and bleomycin. The 35lh Annual Meeting of the European Radiation Research Sovicty, Kiev, 2225.08.2006

6. M.V. Patrushev, E.V. Evdokimovskv. Gubina N.E., Merekina O.S., Ushakova Т.Е., Gogvadze V.G., Gaziev A.I. Altérations of mtDNA functionality in brain and spleen after irradiation. The 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Soviety, Kiev, 2225.08.2006

7. Губина H.E., Евдокимовский Э.В.. Ушакова Т.Е. Исследование процессов транскрипции митохопдриальиых и ядерных генов в разных тканях мышей в условиях окислительпого стресса. Сборник тезисов 12-й международной школы-конференции

молодых ученых «Биология-наука XXI века» Пущино, 10-14 ноября 2008 г.

8. Губина Н.Е., Мерехина О.С., Евдокимовский Э.В.. Ушакова Т.Е. Исследование

репликации и транскрипции мтДНК в разных тканях облученных мышей. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 г. Новосибирск.

Подписано в печать:

28.12.2009

Заказ № 3242 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Евдокимовский, Эдуард Владимирович

Список использованных сокращений:.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Митохондрии обладают собственным генетическим аппаратом.

1.2 Структура мтДНК.

1.3 Транскрипция мтДНК.

1.3.1 Продукты транскрипции мтДНК.

1.3.2 Механизм транскрипции и цис-действуюгцие элементы.

1.3.3 Процессинг и созревание РНК.

1.3.4 Факторы транскрипции.

1.4 Репликация мтДНК.

1.4.1 Ферменты репликации.

1.5 Роль митохондрий в апоптозе.

1.5.1 Апоптоз и митохондриальная пора permeability transition pore) - РТР.

1.6 Повышенный уровень повреждения мтДНК в норме и при окислительном стрессе.

1.7 Форменные элементы крови.

1.7.1 Необычная роль митохондрий в процессе жизнедеятельности нейтрофилов и эозинофилов.

2. Материалы и методы.

2.1 Лабораторные животные.

2.2 Рентгеновское облучение.

2.3 Проточная цитометрия.

2.4 Выделение митохондрий из печени мышей.

2.5 Выделение ДНК.

2.5.1 Выделение ДНК из форменных элементов крови.

2.5.2 Выделение ДНК из сыворотки крови сорбция на магнитных сорбентах).

2.5.3 Выделение ДНК из митохондрий.

2.6 Выделение РНК.

2.7 Обработка РНК ДНК-азой.

2.8 Обратная транскрипция.

2.9 ГТЦР в реальном времени.

2.10 Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле.

2.11 Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в полйакриламидном геле.

2.12 Визуализация фрагментов ДНК в полиакриламидном геле при окрашивании нитратом серебра.

3. Результаты исследований и обсуждение.

3.1 Количественная оценка числа копий мтДНК и ее транскриптов в ядросодержащих клетках крови контрольных мышей.

3.1.1 Определение количества копий мтДНК в ядросодержащих клетках крови контрольных вышей.

3.1.2 Исследование процессов транскрипции митохондриальных генов в клетках крови контрольных мышей.

3.2 Функционирование митохондриального генетического аппарата в ядросодержащих клетках крови при облучении мышей в дозе 1 Гр.

3.2.1 Популяционный состав ядросодержащих клеток крови при облучении мышей в дозе 1 Гр.

3.2.2 Копийность мтДНК в клетках крови контрольных и облученных в дозе 10 Гр мышей.

3.2.3 Количество митохондриальных и ядерных фрагментов в сыворотке контрольных и облученных в дозе 1 Гр мышей.

3.2.4 Исследование процессов транскрипции митохондриальных генов в клетках крови облученных в дозе 1 Гр мышей.

3.3 Исследование нарушения функционирования митохондриального генома в крови мышей, облученных в дозе 10 Гр.

3.3.1 Радиационно-индуцированное изменение популяций ядросодержащих клеток крови мышей.

3.3.2 Копийность мтДНК в клетках крови облученных в дозе 10 Гр мышей.

3.3.3 Исследование процессов транскрипции митохондриальных генов в клетках крови облученных в дозе 10 Гр мышей.

3.3.4 Количество митохондриальных и ядерных фрагментов в сыворотке контрольных и облученных в дозе 10 Гр мышей.

3.3.5 Отношение мтДНК/яДНК как возможный показатель клеточной гибели.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование процессов репликации и транскрипции митохондриальной ДНК клеток крови мышей при рентгеновском облучении"

Два последних десятилетия в молекулярной генетике можно смело назвать «веком митохондриальной ДНК». Это связано с тем, что именно в это время появились сведения о большом числе заболеваний, вызванных дисфункцией митохондрий и, в отдельных случаях, дефектами в митохондриальном геноме (Wallace 2005). В настоящее время установлена структура мтДНК, расположение ее генов на разных цепях, особенности репликации и транскрипции, а также регуляция этих процессов ядерными факторами в условиях физиологической нормы (Fernandez-Silva et al., 2003). В то же время механизмы, лежащие в основе поддержания числа копий мтДНК и уровня транскрипции митохондриальных генов, практически неизвестны. Особый интерес вызывает функционирование мтДНК в условиях окислительного стресса, поскольку сами митохондрии в клетке являются генераторами активных форм кислорода и свободных радикалов. В норме в клетке сохраняется баланс между генерацией АФК и их детоксикацией, однако при воздействии внешнего источника окислительного стресса (например, рентгеновское облучение) этот баланс нарушается, что приводит к повреждению части молекул мтДНК.

Появляющиеся в последнее время новые возможности исследования (ПЦР в реальном времени) позволяют получить количественные данные о копийности мтДНК и ее транскрипции. Эти же методы позволяют исследовать функционирование митохондриального генома в клетках таких тканей, которые никогда не являлись классическими моделями для исследования митохондрий, например в клетках крови. Кроме того, в кровяное русло поступают продукты распада клеток всего организма, в том числе фрагменты ядерной и митохондриальной ДНК. Одной из медицинских задач является поиск маркеров, которые позволяли бы неинвазивными методами оценить генотоксический груз, например, при проведении радиохимиотерапии онкологических больных. То обстоятельство, что в пределах любой ткани копийность мтДНК - относительно постоянная величина, а число копий мтДНК на несколько порядков превосходит число копий ядерных генов, позволяет предположить, что именно фрагменты мтДНК могут потенциально быть искомым маркером.

Поскольку в настоящее время практически отсутствуют представления о нестабильности генетического аппарата митохондрий в условиях окислительного стресса, исследование функционирования мтДНК клеток крови мышей при воздействии внешнего мощного источника окислительного стресса (рентгеновского облучения) может расширить существующие представления о митохондриальном генетическом аппарате, и иметь практическую ценность в медицинской диагностике.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Евдокимовский, Эдуард Владимирович

Выводы

1. Рентгеновское облучение мышей изменяет функционирование митохондриального генетического аппарата клеток крови.

7. Отношение митохондриальных фрагментов к ядерным (параметр мтДНК/яДНК) рассматривается как возможный показатель гибели клеток всего организма

Заключение

Функционирование митохондрий в любых тканях млекопитающих в значительной степени определяется собственным генетическим аппаратом, существующем в условиях повышенного уровня активных форм кислорода, что создает условия генетической нестабильности. При действии различных генотоксических агентов, таких как цитостатические антибиотики, рентгеновского и гамма-облучения, достаточно полно охарактеризовано повреждение отдельных молекул мтДНК (возникновение мутаций, делеций, одно- и двунитевых разрывов). Все эти повреждения носят вероятностный характер и, например, мутация на уровне любого гена в отдельной молекуле мтДНК ни в коей мере не затрагивает нуклеотидную последовательность этого же гена в любой молекуле мтДНК. По-видимому многокопийность мтДНК — это защита органеллы от высокой повреждаемости молекул, существующих в условиях повышенного окислительного риска — близости электронтранспортной цепи. Можно полагать, что нарушение функционирования митохондриального генетического аппарата связано не столько с повреждением единичных копий мтДНК, сколько с нарушением копийности мтДНК в клетке. Действительно, превышение уровня АФК и свободных радикалов (облучение мышей в дозе 1 Гр) приводит к двукратному снижению копийности мтДНК в ядросодержащих клетках крови. Тем не менее, в этих условиях аппарат транскрипции мтДНК по-видимому не претерпевает серьезных нарушений и уровень митохондриальных транскриптов увеличивается, тем самым компенсируя снижение количества копий мтДНК в клетках крови. Таким образом, при рентгеновском облучении мышей в дозе 1 Гр выявлены нарушения функционирования генетического аппарата митохондрий на уровне копийности мтДНК и транскрипции ее генов. Тем не менее, эти нарушения не являются катастрофическими для клетки.

Все результаты, полученные в настоящем исследовании, представлены в абсолютных значениях количества митохондриальных генов и транскриптов в клетке. Использование количественного метода позволило, неожиданно для нас определить, что механизм транскрипции митохондриальных генов в условиях нормы представляется более сложным, чем можно было бы ожидать из современных представлений. Одним из базовых представлений процессов транскрипции мтДНК являлось наличие единого полицистронного блока и единого промотора для всех генов, расположенных на одной цепи мтДНК. Однако оказалось, что количество транскриптов разных митохондриальных генов, кодирующих различные субъединицы комплексов дыхательной цепи, не эквимолярно и, более того, находится в соответствии с распределением белковых комплексов дыхательной цепи на внутренней мембране митохондрий. Это позволяет предположить о наличии механизма посттранскрипционной регуляции времени жизни молекул мРНК митохондриальных генов.

В условиях развивающегося апоптоза, когда происходит массовая гибель радиочувствительных клеток, в первые часы после облучения индуцируются процессы как репликации, так и транскрипции мтДНК. Известно о роли митохондрий в апоптозе, который является чрезвычайно энергозатратным процессом. Мы полагаем, что индукция репликации и транскрипции мтДНК в первые часы развития программируемой клеточной гибели является одним из важных звеньев реализации этой программы. В более поздние сроки после облучения мышей (сутки-трое) митохондриальный генетический аппарат практически полностью истощен: резко снижено количество копий мтДНК и практически прекращена экспрессия митохондриальных генов, что непосредственно предшествует гибели животных.

Снижение копийности мтДНК в клетке объясняется высокой степенью повреждения молекул мтДНК. Мы предположили, что фрагменты поврежденной мтДНК могут быть зарегистрированы в сыворотке крови наряду с фрагментами деградированной ядерной ДНК. Количественный анализ фрагментов митохондриальной и ядерной ДНК, как в условиях физиологической нормы, так и в условиях рентгеновского облучения мышей, показал, что соотношение митохондриальной и ядерной ДНК в сыворотке крови в значительной степени отражает состояние митохондриального генетического аппарата.

В этом смысле исследование клеток крови представляется перспективным не только возможностью исследовать митохондриальный генетический аппарат ядросодержащих клеток, но и оценкой влияния генотоксических агентов, в результате действия которых в кровяное русло поступают продукты клеточного распада не только форменных элементов крови, но и клеток всех поврежденных тканей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Евдокимовский, Эдуард Владимирович, Пущино

1. Adams, J.M. and Cory, S. (1998) The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science 281, 1322-1326.

2. Albring M., Griffith J., Attardi G. Association of a protein structure of probable membrane derivation with HeLa cell mitochondrial DNA near its origin of replication. Proc Natl Acad Sci USA. 1977. 74. 1348-1352.

3. Amundson S.A., Grace M. B., McLeland C.B., Epperly M.W., Yeager A., Zhan Q., Greenberger J.S., and. Fornace A.J, Jr. Human In vivo Radiation-Induced Biomarkers: Gene Expression Changes in Radiotherapy Patients. Cancer Research. 2004. 64. 6368-6371.

4. Aouida M., Leduc A., Wang H., Ramotar D. Characterization of a transport and detoxification pathway for the antitumor drug bleomycin in Saccharomyces cerevisiae. Biochem. J. 2004(a). 384. 47-58.

5. Aouida, M., Tounekti, O., Leduc, A., Belhadj, O., Mir, L. and Ramotar, D. Isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae mutants with enhanced resistance to the anticancer drug bleomycin. Curr. Genet. 2004(b). 45. 265-272.

6. Arcari P., Brownlee G.G. The nucleotide sequence of a small (3S) seryl-tRNA (anticodon GCU) from beef heart mitochondria. Nucleic Acids Res. 1980. 8. 5207-5212.

7. Attardi G., Schatz G. Biogenesis of mitochondria. Annu Rev Cell Biol. 1988.4.289-333.

8. Bai Y.D., Attardi G. The mtDNA-encoded ND6 subunit of mitochondrial NADH dehydrogenase is essential for the assembly of the membrane arm and the respiratory function of the enzyme. EMBO J. 1998. 17. 4848-4858.

9. Barja G. and Herrero A. Oxidative damage to mitochondrial DNA is inversely related to maximum life span in the heart and brain of mammals //FASEB J. 2000. Y. 14. P. 312-318.

10. Barry, M. et al. (2000) Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol. Cell. Biol. 20, 3781-3794

11. Bentley D. The mRNA assembly line, transcription and processing machines in the same factory. Curr Opin Cell Biol. 2002. 14. 336-342.

12. Bogenhagen D.F., Applegate E.F., Yoza B.K. Identification of a promoter for transcription of the heavy strand of human mtDNA, in vitro transcription and deletion mutagenesis. Cell. 1984. 36. 1105-1113.

13. Bogenhagen D.F., Clayton D.A. Mouse L cell mitochondrial DNA molecules are selected randomly for replication throughout the cell cycle. Cell. 1977. 11.719-727.

14. Bogenhagen D.F., Pinz K.G., Perez-Jannotti R.M. Enzymology of mitochondrial base excision repair. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001.68.257-271.

15. Borregaard N., Herlin T. Energy metabolism of human neutrophils during phagocytosis. J. Clin. Invest. 1982. 70. 550-557

16. Bredel M. Anticancer drug resistance in primary human brain tumors. Brain research reviews. 2001. 35. 161-204.

17. Brown T.A., Clayton D.A. Release of replication termination controls mitochondrial DNA copy number after depletion with 2,,3,-dideoxycytidine. Nucleic Acids Res. 2002. 30. 2004-2010.

18. Chai J, Du C, Wu JW, Kyin S, Wang X, Shi Y: Structural and bio-chemical basis of apoptotic activation by Smac/DIABLO. Nature 2000, 406(6798):855-862.

19. Chance B., Sies H., Boveris A. Hydroperoxide metabolism in mammalian organs // Physiol. Rev. 1979. V. 59. P. 527-605.

20. Chandra, D., Liu, J.W., and Tang, D.G. (2002). Early mitochondrial activation and cytochrome c upregulation during apoptosis. J. Biol. Chem. 277, 50842-50854

21. Chang D.D., Clayton D.A. Precise asignment of the heavystrand promoter of mouse mitochondrial DNA: cognate start sites are not required for transcriptional initiation. Mol Cell Biol. 1986b. 6. 3262-3267.

22. Chang D.D., Clayton D.A. Precise asignment of the light strand promoter of mouse mitochondrial DNA: a functional promoter consist of multiple upstream domains. Mol Cell Biol. 1986a. 6. 3253-3261.

23. Chang D.D., Clayton D.A. Precise identification of individual promoters for transcription of each strand of human mitochondrial DNA. Cell. 1984. 36. 635-643.

24. Chomczynski V, Sacchi N Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987. 162(1): 156-159.

25. Chung H.C., Kim S.H., Lee M.G., Cho C.K., Kim T.H., Lee D.H., Kim S.G., Mitochondrial dysfunction by gamma-irradiation accompanies the induction of cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) in rat liver. Toxicology. 2001. 161(l-2):79-91.

26. Clayton D.A. Transcription and replication of animal mitochondrial DNAs. Int Rev Cytol. 1992. 141.217-232.

27. Cloos CR, Daniels DH, Kalen A, Matthews K, Du J, Goswami PC, Cullen JJ. Mitochondrial DNA depletion induces radioresistance by suppressing G2 checkpoint activation in human pancreatic cancer cells. Radiat Res. 2009 May;171(5):581-7

28. Cooke M.S., Evans M.D., Dizdaroglu M., Linec J. Oxidative DNA damage: mechanism, mutation and disease. FASEB J. 2003. 17. 1195-1214.

29. Cote J. and Ruiz-Carrillo A. Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G. Science. 1993. 261. 765-769.

30. Cummings O.W., King T.C., Holden J.A., and Low R.L. Purification and characterization of the protein endonuclease in extract of bovine heart mitochondria. 1987. J. Biol. Chem. 62. 2005-2015.

31. Dix D.J., Lin P.N., McKenzie A.R., Waiden W.E., Theil E.C. The influence of the base-paired flanking region on structure and function of the ferritin mRNA iron regulatory element. J. Mol. Biol. 1993. 231(2). 230-240.

32. Doda J.N., Wright C.T., Clayton D.A. Elongation of displacement-loop strands in human and mouse mitochondrial DNA is arrested near specific template sequences. Proc Natl Acad Sei USA. 1981. 78. 6116-6120.

33. Du C, Fang M, Li Y, Li L, Wang X: Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell 2000, 102(l):33-42.

34. Dubin D.T., Montoya J., Timko K.D., Attardi G. Sequence analysis and precise mapping of the 3,-ends of HeLa cell mitochondrial ribosomal RNAs. J Mol Biol. 1982. 157. 1-19.

35. Duff R.J., Vroom E., Geluk A., Hecht S.M. Evidence for C-l' abstraction from modified oligonucleotides by Fe-bleomycin. J. Am. Chem. Soc. 1993. 115. 3350-3351.

36. Enriquez J.A., Fernandez-Silva P., Garrido-Perez N., Lopez-Perez M.J., Perez-Martos A., Montoya J. Direct regulation of mitochondrial RNA synthesis by thyroid hormone. Mol Cell Biol. 1999a. 19. 657-670.

37. Enriquez J.A., Fernandez-Silva P., Montoya J. Autonomous regulation in mammalian mitochondrial DNA transcription. Biol Chem. 1999b. 380. 737747.

38. Ephrussi B., Hottinguer H., Tavlitzki J. Action de Pacriflavine sur les levures. II. Etude genetique du mutant "petite colonie". Ann Inst Pasteur 1949. 76. 351-367.

39. Falkenberg M., Gaspari M., Rantanen A., Trifunovic A., Larsson N.G., Gustafsson C.M. Mitochondrial transcription factors B1 and B2 activate transcription of human mtDNA. Nat Genet. 2002. 31. 289-294.

40. Farr C.L., Wang Y., Kaguni L.S. Functional interactions of mitochondrial DNA polymerase and single-stranded DNAbinding protein. Template-primer DNA binding and initiation and elongation of DNA strand synthesis. J Biol Chem. 1999. 274. 14779-14785.

41. Febres E.D., Pramanik A., Caton M., Doherty K., McKoy J., Garcia E., Alejo W. and Wood Moore C. The novel BLM3 gene encodes a protein that protects against lethal effects of oxidative damage. Cell. Mol. Biol. 2001. 47. 1149-1162.

42. Fernandez-SiIva P., Enriquez J., Montoya J. Replication and transcription of mammalian mitochondrial DNA. Exp. Physiol. 2003. 88.1, 41-56.

43. Fisher R.P., Clayton D.A. A transcription factor required for promoter recognition by human mitochondrial RNA polymerase. J Biol Chem. 1985. 260. 11330-11338.

44. Fisher R.P., Clayton D.A. Purification and characterization of human mitochondrial transcription factor 1. Mol Cell Biol. 1988. 8. 3496-3509.

45. Fisher R.P., Lisowsky T., Parisi M.A., Clayton D.A. DNA wrapping and bending by a mitochondrial high mobility grouplike transcriptional activator protein. J Biol Chem. 1992. 267. 3358-3367.

46. Fisher R.P., Topper J.N., Clayton D.A. Promoter selection in human mitochondria involves binding of a transcription factor to orientation-independent upstream regulatory elements. Cell. 1987. 50. 247-258.

47. Ghivizzani S.C., Madsen C.S., Nelen M.R., Ammini C.V., Hauswirth W.W. In organello footprint analysis of human mitochondrial DNA, human mitochondrial transcription factor A interactions at the origin of replication. Mol Cell Biol. 1994. 14. 7717-7730.

48. Gleyser N., Vercauteren K., Scarpulla R.C. Control of mitochondrial transcription specifity factor (TFB1M and TFB2M) by nuclear respiratory factors (NRF-1 and NRF-2) and PGC-1 family coactivators. Molecular and cellular biology. 2005. 25(4). 1354-1366.

49. Gong B., Chen Q., Almasan A. Ionizing radiation stimulates mitochondrial gene expression and activity // Radiat Res. 1998. V. 150. P. 505-512.

50. Graves S.W., Johnson A.A., Johnson K.A. Expression, purification, and initial kinetic characterization of the large subunit of the human mitochondrial DNA polymerase. Biochemistry. 1998. 37. 6050-6058.

51. Gray H., Wong T.W. Purification and identification of subunit structure of the human mitochondrial DNA polymerase. J Biol Chem. 1992. 267. 58355841.

52. Grazievich M.A., Day B.J., Copeland W. The mitochondrial DNA-polymerase as a target of oxidative damage. Nucleic Acid Research. 2002. 30. 2817-2824.

53. Green, D.R., and Evan, G.I. (2002). A matter of life and death. Cancer Cell 1, 19-30.

54. Gross, A. et al. (1999) BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 13, 1899-1911

55. Hamilton M.L., Van Remmen H., Drake J.A. et al. Does oxidative damage to DNA increase with age? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 10469-10474.

56. Hecht, S. M. Bleomycin: new perspectives on the mechanism of action. J. Nat. Prod. 2000. 63. 158-168.

57. Hehman G.L., Hauswirth W.W. DNA helicase from mammalian mitochondria. Proc Natl Acad Sci USA. 1992. 89. 8562-8566.

58. Hixson J.E., Wong T.W., Clayton D.A. Both the conserved stem-loop and divergent 5'-flanking sequences are required for initiation at the human mitochondrial origin of light-strand DNA replication. J Biol Chem. 1986. 261. 2384-2390.

59. Hofhaus G., Attardi G. Efficient selection and characterization of mutants of a human cell line which are defective in mitochondrial DNA-encoded subunits of respiratory NADH dehydrogenase. Mol Cell Biol. 1995. 15. 964-974.

60. Holmes C.E., Abraham T.E., Hecht S.M., Florentz C., Giege R. Fe-bleomycin as a probe of RNA conformation. Nucleic Acid Research. 1996. 24(17). 3399-3406.

61. Holmes C.E., Carter B.J., Hecht S.M. Characterization of iron(II)-bleomycin-mediated RNA strand scission. Biochemistry. 1993. 32. 42934307.

62. Holt I.J., Harding A.E., Petty R.K.H., Morgan-Hughes J.A. A new mitochondrial disease associated with mitochondrial DNA heteroplasmy. Am J Hum Genet. 1990. 46. 428-433.

63. Holt I.J., Lorimer H.E., Jacobs H.T. Coupled leading- and lagging-strand synthesis of mammalian mitochondrial DNA. Cell. 200. 100. 515-524.

64. Hudson E.K., Hogue B.A., Souza-Pinto N.C. et al. Age-associated change in mitochondrial DNA damage // Free Radic. Res. 1998. V. 29. P. 573-579.

65. Iborra F.J., Kimura H., Cook P.R. The functional organization of mitochondrial genome in human cells. BMC Biology. 2004. 2:9

66. Inoue M., Sato E.F., Nishikawa M., Park A.M., Kira Y., Imada I., Utsumi K. Mitochondrial generation of reactive oxygen species and its role in aerobic . life. Curr. Med. Chem. 2003. 10. 2495-2505.

67. Jakupciak J.P., Wang W., Markowitz M.E., Ally D., Coble M., Srivastava S., Maitra A.,. Barker P.E, Sidransky D. and O'Connell C.D. Mitochondrial DNA as a Cancer Biomarker. J. Mol. Diagn. 2005. 7. 258-267.

68. Jorde L.B., Watkins W.S., Bamshad M.J., Dixon M.E., Ricker C.E., Seielstad M.T., and Batzer M.A. The Distribution of Human Genetic Diversity: A Comparison of Mitochondrial, Autosomal, and Y-Chromosome Data. Am. J. Hum. Genet. 2000. 66. 979-989.

69. Kadenbach B., Possekel S., Huttemann M., Arnold S. Biochemical defects and genetic abnormalities in cytochrome c oxidase of patients with Leigh syndrome. Biofactors. 1998. 7. 273-276.

70. Kamal M.A., French S.W. Drug-induced increased mitochondrial biogenesis in a liver biopsy. Exp. Mol. Pathol., 2004. 77. 201-204.

71. Kang D., Hamasaki N. Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer. Curr. Medic. Chem. 2005. 12. 429-441.

72. Kaufmann, S.H., Hengartner M. O. Programmed cell death: alive and well in the new mallenium. 2001. Trends in cell biol. 11(12), 526-534.

73. Kawano Y., Kumagai T., Muta K., Matoba Y., Davies J., Sugiyama M. The 1.5 A crystal structure of a bleomycin resistance determinant from bleomycin-producing Streptomyces verticillus. J. Mol. Biol. 2000. 295(4). 915-25.

74. Kelly D.P., Scarpulla R.C. Transcriptional regulatory circuits controlling mitochondrial biogenesis and function. Genes & Dev. 2004. 18. 357-368.

75. Kluck, R.M., Bossy-Wetzel, E., Green, D.R., and Newmeyer, D.D. (1997). The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis. Science 275, 1132-1136.

76. Kosovsky M., Soslau G. Immunological identification of human platelet mitochondrial DNA topoisomerase-I. Biochim Biophys Acta. 1993. 1164. 101-107.

77. Kruse B., Narasimhan N., Attardi G. Termination of transcription in human mitochondria, identification and purification of a DNA binding protein factor that promotes termination. Cell. 1989. 58. 391-397.

78. Kuroda R., Satoh H., Shinomiya M., Watanabe T., Otsuka M. Novel DNA photocleaving agents with high DNA sequence specificity related to the antibiotic bleomycin A2. Nucleic Acid Research. 1995. 23(9). 1524-1530.

79. Kuwana, T., Mackey, M.R., Perkins, G., Ellisman, M.H., Latterich, M., Schneiter, R., Green, D.R., andNewmeyer, D.D. (2002). Bid, bax, and lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane. Cell 111, 331-342.

80. Lecrenier N., Foury F. New features of mitochondrial DNA replication system in yeast and man. Gene. 2000. 246. 37-48.

81. Lee H.C., Yin P.H., Lu C.Y. et al. Increase of mitochondria and mitochondrial DNA in response to oxidative tress in human cells // Biochem. J. 2000. V. 348. P. 425-432.

82. Lee H.C., Yin P.H., Lu C.Y., Chi C.W., Wei Y.H. Increase of mitochondria and mitochondrial DNA in response to oxidative stress in human cells. Biochem. J. 2000. 348 (2). 425-432.

83. Levin J.D., Demple B. In vitro detection of endonuclease IV-specific DNA damage formed by bleomycin in vivo. Nucleic Acid Research. 1996. 25(5). 885-889.

84. Lim S.E., Longley M.J., Copeland W.C. The mitochondrial p55 accessoryIsubunit of human DNA polymerase gamma enhances DNA binding, promotes processive DNA synthesis, and confers N-ethylmaleimide resistance. J Biol Chem. 1999. 274. 38197-38203.

85. Liu C.Y., Takemasa A., Liles W.C., Goodman R.B., Jonas M., Rosen H., Chi E., Winn R.K., Harlan J.M., Chuang P.I. Broad-spectrum caspase inhibition paradoxically augments cell death in TNF-alpha-stimulated neutrophils. Blood. 2003. 101. 295-304

86. Liu, X., Kim, C.N., Yang, J., Jemmerson, R., and Wang, X. (1996). Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and'cytochrome c. Cell 86, 147-157.

87. Longley M.J., Nguyen D., Kunkel T.A., Copeland W.C. The fidelity of human DNA polymerase gamma with and without exonucleolytic proofreading and the p55 accessory subunit. J Biol Chem. 2001. 276. 38555-38562.

88. Maianski N.A., Roos D., Kuijpers T.W. Tumor necrosis factor alpha induces a caspase-independent death pathway in human neutrophils. Blood. 2003. 101. 1987-1995.

89. Marchetti, P., Castedo, M., Susin, S.A., Zamzami, N., Hirsch, F., Geuskens, M., and Kroemer, G. (1996). Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis. J. Exp. Med. 184, 1155-1160.

90. Marchington D.R., Macaulay V., Hartshorne G.M., Barlow D., Poulton J. Evidence from human oocytes for a genetic bottleneck in an mtDNA disease. Am J Hum Genet. 1998. 63. 769-775.

91. Masuyama M, Iida R, Takatsuka H, Yasuda T, Matsuki T., Quantitative change in mitochondrial DNA content in various mouse tissues during aging. Biochim. Biophys. Acta. 2005. 1723 (1-3). 302-308.

92. Mayanski N.A., Geissler J., Srinivasula S.M., Alnemri E.S., Roos D., Kuijpers T.W. Functional characterisation of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell death and differentiation. 2004. 11. 143153.

93. McCulloch V., Seidel-Rogol B.L., Shadel G.S. A human mitochondrial transcription factor is related to RNA adenine methyltransferases and binds s-adenosylmethionine. Mol Cell Biol. 2002. 22. 1116-1125.

94. McPhail L.C., Henson P.M., Johnston R.B. Jr. Respiratory burst enzyme in human neutrophil. J. Clin. Invest. 1981. 67. 710-717.

95. Montoya J., Christianson T., Levens D., Rabinowitz M., Attardi G. Identification of initiation sites for heavy strand and light strand transcription in human mitochondrial DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1982. 79.7195-7199.

96. Montoya J., Gaines G.L., Attardi G. The pattern of transcription of the human mitochondrial rRNA genes reveals two overlapping transcription units. Cell. 1983. 34. 151-159.

97. Montoya J., Ojala D., Attardi G. Distinctive features of the 5-terminal sequences of the human mitochondrial mRNAs. Nature. 1981. 290. 465-470.

98. Morgan M.A., Hecht S.M. Iron(II)-bleomycin-mediated degradation of a DNA-RNA heteroduplex. Biochemistry. 1994. 33. 10286-10293.

99. Murphy B.M., O'Neill A.J., Adrain C., Watson R.W., Martin SJ. The apoptosome pathway to caspase activation in primary human neutrophils exhibits dramatically reduced requirements for cytochrome c. J. Exp. Med. 2003. 197. 625-632.

100. Nass M.M.K., Nass S. Intramitochondrial fibers with DNA characteristics. J Cell Biol. 1963. 19. 593-629.

101. Newmeyer D.D., Ferguson-Miller S. Mitochondria: Releasing Power for Life and Unleashing the Machineries of Death. Cell. 2003. 112. 481-490.

102. Newmeyer D.D., Fergusson-Miller S. Mitochondria: releasing power for life and unleashing the machineries for death. 2003. Cell. 112. 481-490.

103. Newmeyer, D.D., Farschon, D.M., and Reed, J.C. (1994). Cell-free apoptosis in Xenopus egg extracts: inhibition by Bcl-2 and requirement for an organelle fraction enriched in mitochondria. Cell 79, 353-364.

104. Nisoli E., Clementi E., Paolucci C., Cozzi V., Tonelo C., Sciorati C., Bracale R., Valerio A., Francolini M., Moncada S., Carruba M. Mitochondrial biogenesis in mammals: the role of endogenous nitric oxide. Sciense. 2003. 299. 896-899.

105. O'Farrell P.A., Gonzalez F., Zheng W., Johnston S.A., Joshua-Tor L. Struct. Fold. Des. 1999. 7. 619.

106. Ojala D., Montoya J., Attardi G. tRNA punctuation model of RNA processing in human mitochondria. Nature. 1981. 290. 470^474.

107. Papa S. Mitochondrial oxidative phosphorylation changes in the life span. Molecular aspects and physiopathological implications // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1276. P. 87-105.

108. Parisi M.A., Clayton D.A. Similarity of human mitochondrial transcription factor 1 to high mobility group proteins. Science. 1991. 252. 965-969.

109. Parrish J., Li L., Klotz K., Ledwich W., Wang X., Xue D. Mitochondrial endonuclease G is important for apoptosis in C. Elegans. 2001. Nature. 412. 90-94.

110. Pastorino, J.G., Chen, S.T., Tafani, M., Snyder, J.W., and Farber, J.L. (1998). The overexpression of Bax produces cell death upon induction of themitochondrial permeability transition. J. Biol. Chem. 273, 7770-7775.

111. Patrushev M.V., Kasymov V.A, Patrusheva V., Ushakova T.E., Gogvadze V.G. and Gaziev A.I. Mitochondrial permeability transition triggers the release of mtDNA fragments. Cellular and Molecular Life Sciences. 2004. 61. 001-04.

112. Patrushev M.V., Kasymov V.A, Patrusheva V., Ushakova T.E., Gogvadze V.G., and Gaziev A.I. Release of mitochondrial fragments from brain mitochondria of irradiated mice. Mitochondrion. 2006. 6(1). 57-62.

113. Peachman K., Lyles D., Bass D. Mitochondria in eosinophyls: functional role in apoptosis but not respiration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. 98(4). 1717-1722.

114. Perez-Jannotti R.M., Klein S.M., Bogenhagen D.F. Two forms of mitochondrial DNA ligase III are produced in Xenopus laevis oocytes. J Biol Chem. 2001. 276. 48978-48987.

115. Pinz K.G., Bogenhagen D.F. Efficient repair of abasic sites in DNA by mitochondrial enzymes. Mol Cell Biol. 1998. 18. 1257-1265.

116. Prasanna P.G., Hamel C.J., Escalada N.D., Duffy K.L., Blakely W.F. Biological dosimetry using human interphase peripheral blood lymphocytes. Mil Med. 2002. 167(2 Suppl), 10-13.

117. Prieto-Martin A., Montoya J., Martinez-Azorin F. A study on the human mitochondrial RNA polymerase activity points to existence of a transcription factor B-like protein. FEBS Lett. 2001. 503. 51-55.

118. Pron, G., Belehradek, Jr, J. and Mir, L. M. Identification of a plasma membrane protein that specifically binds bleomycin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. 194. 333-337.

119. Pryde J.G., Walker A., Rossi A.G., Hannah S. Haslett C. Temperature dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion intomitochondria at 151C prevents the release of cytochrome c. J. Biol. Chem. 2000. 275. 33574-33584.

120. Pu, Y., and Chang, D.C. (2001). Cytosolic Ca2+ signal is involved in regulating UV-induced apoptosis in hela cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 282, 84-89.

121. Puranam R.S., Attardi G. The RNase P associated with HeLa cell mitochondria contains an essential RNA component identical in sequence to that of the nuclear RNase P. Mol Cell Biol. 2001. 21. 548-561.

122. Richter C., Park J.W. and Ames B.N. Normal oxidative damage to mitochondrial and nuclear DNA is extensive // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 6465-6467.

123. Richter C., Park J.W., Ames B.N. Normal oxidative damage to mitochondrial and nuclear DNA is extensive. Proc Natl Acad Sci USA. 1988. 85. 6465-6467.

124. Roberti M., Musicco C., Polosa P.L., Gadaleta M.N., Cantatorc P. DNA-helicase activity from sea urchin mitochondria. Biochem Biophys Res Commun. 1996. 219. 134-139.

125. Rossa W. K. Chiu, Lisa Y. S. Chan, Nicole Y. L. Lam, Nancy B. Y. Tsui, Enders K. O. Ng, Timothy H. Rainer, and Dennis Lo. Quantitative analysis of circulating mitochondrial DNA in plasma. Clinical Chemistry. 2003.49:5.719-726.

126. Rossmanith W., Tullo A., Potuschak T., Karwan R., Sbisa E. Human mitochondrial tRNA processing. J Biol Chem. 1995. 270. 12885-12891.

127. Santos J., Mandavilli B., Van Houten B. Measurement of oxidative damage and repair in mitochondria using quantitative PCR. Methods Mol. Biol. 2002. 197. 159-176.

128. Sanz, G., Mir, L. and Jacquemin-Sablon, A. Bleomycin resistance in mammalian cells expressing a genetic suppressor element derived from the SRPK1 gene. Cancer Res. 2002. 62. 4453-4458.

129. Scarpulla R.C. Nuclear control of respiratory gene expression in mammalian cells. J. Cell. Biochem. 2006. 97(4). 673-683.

130. Schagger H. and Pfeiffer K. The Ratio of Oxidative Phosphorylation Complexes I-V in Bovine Heart Mitochondria and the Composition of Respiratory Chain Supercomplexes. The Journal of Biological Chemistry. 2001; 276(41), 37861-37867.

131. Schwartz M., Vissing J. Paternal inheritance of mitochondrial DNA. N Engl J Med. 2002. 347. 576-580.

132. Scorrano, L., Ashiya,M., Buttle, K.,Weiler, S.,Oakes, S.A.,Mannella, C.A., and Korsmeyer, S.J. (2002). A distinct pathway remodels mitochondrial cristae andmobilizes cytochrome c during apoptosis.Dev. Cell 2, 55-67.

133. Shadel G. S., Clayton D. A. Mitochondrial DNA maintenance in vertebrates. Annu. Rev. Biochem. 1997. 66. 409-435.

134. Shang J., Clayton D.A. Human mitochondrial transcription termination exhibits RNA polymerase independence and biased bipolarity in vitro. J Biol Chem. 1994. 269. 29112-29120.

135. Shuster R.C., Rubenstein A.J., Wallace D.C. Mitochondrial DNA in anucleate human blood cells. Biochem Biophys Res Commun 1988. 155. 1360-1365.

136. Skulachev V.P. Mitochondria in the programmed death phenomena; a principle of biology: "it is better to die than to be wrong". IUBMB Life, 2000; 49(5):365-73.

137. Steighner R.J., Povirk L.F. Bleomycin-induced DNA lesions at mutational hot spots: implications for the mechanism of double strand damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. 87. 8350-8354.

138. Sutovsky P., Moreno R.D., Ramalho-Santos J., Dominko T., Simerly C., Schatten G. Ubiquitinated sperm mitochondria, selective proteolysis, and the regulation of itochondrial inheritance in mammalian embryos. Biol Reprod. 2000. 63. 582-590.

139. Takeshita M., Grollman A., Ohtsubo E., Ohtsubo H. Interaction of bleomycin with DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. 75. 5983-5987.

140. Tang J.T., Yamazaki H., Inoue T. et al. Mitochondrial DNA influences radiation sensitivity and induction of apoptosis in human fibroblasts // Anticancer Res. 1999. V. 19. P. 4959-4964

141. Taylor R.W., Turnbull D.M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat. Rev. Genet. 2005. 6(5). 389-402.

142. Van Dyck E., Foury F., Stillman B., Brill S.J. A single-stranded DNA binding protein required for mitochondrial DNA replication in S. cerevisiae is homologous to E. coli SSB. EMBO J. 1992. 11. 3421-3430.

143. Van Loo G., Saelens X., van Gurp M., MacFarlane M., Martin S.J.and Vandenabeele P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a

144. Russian roulette with more than one bullet. 2002. Cell Death and Differentiation. 9. 1031-1042.

145. Walberg M.W., Clayton D.A. In vitro transcription of human mitochondrial DNA, identification of specific light strand transcripts from the displacement loop region. J Biol Chem. 1983. 258. 1268-1275.

146. Walberg M.W., Clayton D.A. Sequence and properties of the human KB cell and mouse L cell D-loop regions of mitochondrial DNA. Nucleic Acids Res. 1981. 9. 5411-5421.

147. Wallace D.C. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging and cancer: a dawn for evolutionary medicine. Annu. Rev. Genet. 2005. 39. 359-407.

148. Wang J., Silva J.P., Gustafsson C.M., Rustin P., Larsson N-G. Increased in vivo apoptosis in cells lacking mitochondrial DNA gene expression. PNAS (2001), 98(7), 4038-4043.

149. Wardell T.M., Ferguson E., Chinnery P.F., Bortwiek G.M. Changes in the human mitochondrial genome after treatment of malignant disease. Mutat. Res. 2003. 525(1-2). 19-27.

150. Wei Y.H., Lee C.F., Lee H.C. et al. Increases of mitochondrial mass and mitochondrial genome in association with enhanced oxidative stress in human cells harboring 4,977 BP-deleted mitochondrial DNA // Ann. N. Y. Acad. Sei. 2001. V. 928. P. 97-112.

151. Widlalc P., Garrad W.T. Discovery, regulation, and action of the major apoptotic nucleases DFF40/CAD and Endonuclease G. 2005. Journal of cellular biochemistry. 94. 1078-1087.

152. Wilding, C. S., Cadwell, K., Tawn, E. J., Relton, C. L., Taylor, G. A., Chinnery, P. F. and Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA Mutations in Individuals Occupationally Exposed to Ionizing Radiation. Radiat. Res. 2006. 165,202-207.

153. Wong T.W., Clayton D.A. DNA primase of human mitochondria is associated with structural RNA that is essential for enzymatic activity. Cell. 1986. 45. 817-825.

154. Wong T.W., Clayton D.A. In vitro replication of human mitochondrial DNA, accurate initiation at the origin of lightstrand synthesis. Cell. 1985. 42. 952-958.

155. Yamaguchi Y., Hayashi Y., Sugama Y., Miura Y., Kasahara T., Kitamura S., Torisu M., Mita S., Tominaga A., Takatsu K., Suda T. J. Exp. Med. 1988. 167. 1737-1742.

156. Yamaguchi Y., Suda T., Ohta S., Tominaga K., Miura Y., Kasahara T. Blood. 1991. 78. 2542-2547.

157. Yang, J., Liu, X., Bhalla, K., Kim, C.N., Ibrado, A.M., Cai, J., Peng, T.-I., Jones, D.P., and Wang, X. (1997). Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked. Science 275, 11291132.

158. Yoshida К., Yamazaki H., Ozeki S. et al. Role of mitochondrial DNA in radiation exposure // Radiat. Medicine. 2000. V. 18. P. 87-91.

159. Yoza B.K., Bogenhagen D.F. Identification and in vitro capping of a primary transcript of human mitochondrial DNA. J Biol Chem. 1984. 259. 3909-3915.

160. Zorov D.B., Bannikova S.Y., Belousov V.V., Vyssokikh M.Y., Zorova L.D., Isaev N.K., Krasnikov B.F., and Plotnikov E.Y. Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Friends or Foes? Biochemistry (Moscow), 2005. 70(2), 215-221.

161. Газиев А. И., Подлуцкий А. Я. Низкая эффективность систем репарации в митохондриях. Цитология. 2003. 45 (4). 403-417.

Информация о работе

Евдокимовский, Эдуард Владимирович
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.01.03

Диссертация

Исследование процессов репликации и транскрипции митохондриальной ДНК клеток крови мышей при рентгеновском облучении - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы