Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Репарация и репликация ДНК в УФ-облученных клетках различной степени дифференциации

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Репарация и репликация ДНК в УФ-облученных клетках различной степени дифференциации"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ Институт Молекулярной Биологии

УДК 576.3:612.8.015.577.391 На правах рукописи

МАНУКЯН ' Зорайр Микаелович

РЕПАРАЦИЯ И РЕПЛИКАЦИЯ ДНК В УФ-ОБЛУЧЕННЫХ КЛЕТКАХ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ

I р ^ 0 Д Ч-.ОО.ОЗ - Молекулярная биология и генетика

- , • и АВТОРЕФЕРАТ

МсК 1997

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ереван- 1997

<ц:51ш8т>ь <цп,ри1ц;5пь№зиъ п-мпыз-зпп/ььрг» иао-изм, ичцаь-ш^и

ищЬЦпцш^С иЬбишршВтр^О Мдиш^штш

пн<>а 576.3:612.8.015.577.391 р.ошцр}! ^рш^шсрт!

ииъпьчшгь

2прш,|р Ц^ри^Ь]!! 0-l.fi> -ii П-0<ПирЦЗМГЬ Ь П.ЬПЦ.И4ЦвМГЬ вирры» тш'битл»

о-1'Л>з>ьрьъя>шо пыг-вигш<шзь>ч1ш оаняизт» ч-пьрпиг

ч-.00.03-15п|ы(п1цш111)ьсиц1рш0тр;ш0 ь цьсьш^ш |5|шшш<{]11лшр.|1и|!р

1)ьсишрш0ш11ш0 qi^шшpjmgcъil]l ры}сшдпф ч1ипш1)ш0 шиш[к1ш0|1 Ми^дйшШ шшЬйш1ипишр;ш0

и ь а и" и ч- ь р

ьрьшв-1997

Работа выполнена в Институте Молекулярной Биологии Национальной Академии Наук Республики Армения.

Научные руководители

академик HAH РА КАРАГЕЗЯН К.Г. академик HAH РА ШУКУРЯН Ю.Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ю.А.МАГАКЯН доктор биологических наук Ж.И.АКОПЯН

Ведущая оргапизация - Институт Зоологии HAH РА.

Защита состоится / декабря, 1997 г. в 14ч. в Институте биохимии им. акад. Г.Х.Бунятяна ПАН РА (375014, Ереван, ул.Паруйра Севака 5/1).на заседании Специализированного Совета 042

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института биохимии им. акад. Г.Х.Бунятяна HAH РА.

Автореферат диссертации разосланную дбября 1997 г.

^J^ytбя!

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук, профессор

А.А.СИМОНЯН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ядра клеток эукариот представляют собой высокоспециализированные органеллы, предназначенные для сохранения, регулярного удвоения и упорядоченной передачи наследственной информации на периферические эффекторные устройства. Соответствующие этим функциям процессы репарации, репликации и транскриици ДНК, протекающие в очень ограничеснном объеме ядра, должны строго регулироваться. Структурно-функциональные аспекты такой регуляции изучены недостаточно. Резистентность клеток обеспечивается взаимодействием разветвленных репарационных систем, устраняющих потенциально летальные повреждения. Нерепарированные и нерепарируемые повреждения реализуются в мутагенные или летальные. Нарушение процессов репарации ДНК могут проявляться в виде различных клинических симптомов. Репарация и репликация ДНК интенсивно исследуются в связи с проблемами канцерогенеза старения и возникновения наследственных заболеваний. Важным ответом клетки на повреждения ДНК, является остановка продвижения клеток по циклу в контрольных точках С, и С2, что дает время для репарации ДНК до вступления клеток в фачы Я и М. В последнее время активно исследуется участие специфического опухолевого супрессора р53 в осуществлении контроля клеточного цикла. Установлено, что после ДНК-повреждающих агентов, либо происходит р53 - зависимый блок клеточного цикла в в, и фазах с последующим возобновлением

пролиферации, либо наступает программированная клеточная гибель (агюптоз). Особый интерес представляет сравнительное исследование механизмов репарации ДНК и репликативного синтеза в клетках высших эукариот, различающихся по степени клеточной дифференциации. Имеющиеся в литературе данные по этому вопросу немногочисленны и неоднозначны.

Цель и основные задачи исследования. Целью настоящей работы было проведение сравнительного исследования систем репарации и репликации ДНК в линиях клеток мыши, различающихся по степени дифференциации:

нейробластомы Ы-2а и фибробластов Ьрд.

В работе были поставлены следующие конкретные задачи:

- определить способность к выщеплению ПД из ДНК УФ-облученных клеток N-23 и

*

- исследовать летальное действие УФ-лучей на клетки клонов М-2л и Ц,,,;

- изучить эффективность и кинетику ПРР ДНК при УФ-облучепии;

- исследовать репликацию ДНК и влияние дсРНК на включение 3Н-тимидина в УФ-облученных клетках двух указанных клеточных линиях;

- определить способность клеток 1М-2а и к обходу повреждений на матрицах с повреждениями, вызванными УФ-облучением;

- изучить восстановление митотического цикла в УФ-облученных клетках линий и Ы-2а;

- провести анализ полученного эксперимента\ьного материала для применения методов математического моделирования.

Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное исследование состояния систем репарации и репликации ДНК на молекулярном и клеточном уровнях и УФ-облученных линиях клеток, различающихся по степени дифференциации (нейробластомы М-2а и фибробластов Установлено, что клетки Г\'-'2а и Ь.*,, резистентные к Уф-радиации по критерию выживаемости, практически не способны удалять из ДНК основной летальный фотопродукт - ПД. Интенсивность ПРР ДНК клеток 1Ч-2а превосходит таковую а клетках Ц^,, но в отличие от последних, М-2а не способны к беспрепятственному синтезу ДНК на поврежденной матрице через длительное время после действия УФ. Клетки нейробластомы Ы-2а оказались несравненно более чувствительными к действию УФ-облучения в отношении восстановления митотического цикла. По данным математического анализа экспериментального материала, процесс ПРР ДНК в обеих линиях клеток согласуется с гипотезой образования "пробелов".

Впервые представлены особенности влияния дсРНК на синтез ДНК в обеих клеточных линиях с отчетливо происходящим ннгибированием процесса включения эН-тимидина в ДНК на фоне повышения их выживаемости и эффективности клонирования.

Впервые предложена математическая модель репаративного ответа УФ-облученных клеток при прохождении клеточного цикла.

Практическое значение работы. Полученные результаты углубляют современные представления природы восстановления генетического

л

материала в клетках с различной степенью дифференциации при действии УФ-радиации, что представляет не только существенный академический интерес, :м имеет также важное прикладное значение.

Выявление особенностей механизмов репарации и репликации ДНК в клетках высшей организации важно не только для лучшего понимания генетических основ канцерогенеза, старения, но и для правильной интерпретации явлений возникновения наследственных заболеваний и патологических состояний с наследственной предрасположенностью.

Изучение указанных процессов и изыскание путей воздействия на их развитие чрезвычайно важно в связи с направленной трансформацией зухариотической клетки и профилактикой мутагенного действия факторов внешней и внутренней сред организма. В настоящее время затронутым вопросам придается особое значение учитывая состояние постоянной изменчивости в окружающей среде фона излучений, качественных и количественных характеристик мугагенов химической и биологической природы.

С отмеченной точки зрения представляет несомненный интерес определение закономерностей поведения репарирующих систем с помощью математического моделирования.

Основные положения диссертации, выносимые па защиту:

- состояние систем репарации ДНК в клетках, раличающихся по степени дифференциации (нейробластомы и фибробластов мыши) при действии УФ-радиации

- особенности репликации ДНК и митотический цикл в УФ-облученных вышеназванных клетках

- математический анализ полученных результатов и математическая модель репаративного ответа клеток при прохождении митотического цикла.

Структура диссертации. Диссертация представленна на 125 страницах

русского текста, состоит из оглавления, введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов собственных исследований (5 глав), выводов, списка цитированной литературы (27 русских и 131 иностранных источников), 11 рисунков, 17 таблиц и списка использованных

4

сокращений.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Клетки и их культивирование. Для исследования были выбраны культуры клеток нейробластомы (субклон 1Ч-2а опухоли С-1300) и фибробластов (линия ) мыши. Клетки Ы-2а, эксплантированные из нейроэктодермалъной онухоли, сохраняют способность к спонтанному проявлению ряда специфических признаков, присущих зрелому нейрону (электрически возбудимые мембраны, высокая активность ацетилхолинэстеразы, образование нейритонодобных отростков и т.д.) (Игнатова, 1984). При этом Ы-2а сохраняют также способность к пролиферации. Линия - перевиваемые клетки фибробластов из

подкожной соединительной ткани мыши линии СЗН. Клетки культивировали на среде Игла с 10% сывороткой крови крупного рогатого скота.

УФ-облучение проводили в монослое в кварцевых флаконах при помощи лампы БУФ-60 (254 нм) и мощьностью дозы 0.25 Дж/м'с"1.

Выживаемость клеток определяли по критерию образования колоний.

Митотическнй цикл исследовали методом проточной цитометрии (Кириллова и др., 1985). . . .

Определение молекулярного веса вновь синтезируемой ДНК.

Лизис и центрифугирование клеток. В работе . использован метод ультрацентрифугирования в щелочном градиенте сахарозы. Клетки, в логарифмической фазе роста промывали свежей средой и сразу (ПРР) или через п ч после облучения (ОП) импульсно метили 3Н-тимиднном (10-15 мкКю/мл) в течении 1 ч. 104-10' клеток лизировали на дне центрифужных стаканов в течение 1 ч в 0.2 мл детергента, состоящего из 0.5 Н ЫаОН, 1% додецилсульфата 0.2% дезоксихолата N3, . 0.005 М и 0.5М ЭДТА.

Центрифугирование проводили в изокинетических градиентах (5-29.0%) сахарозы (состав щелочного градиента: 0.9 М NaCl; 0.1М NaOH; 0.001 М ЭДТА, pH 12) 90 мин, 20"С, 42000 об/мин на ультрацентрифуге Beckman L2-65 в роторе SW-65. Градиенты фракционировали по времени на бумажные

л

фильтры FN-12. Подсчет радиоактивности проводили в стандартном толуоловом сцшщиляторе на счетчике "Beckman 1S-8100". Расчет молекулярных весов (MB) ДНК проводили по методу (Studier, 1965).

Bu.i, пиление УФ-иядуцированных ПД из ДНК. Клетки в логарифмической фазе роста метили 3Н-тимидином (10 мкКю/мл) в течение 2 суток. Меченую среду заменяли свежей, монослой клеток (без среди) облучали УФ-светом в дозе 10 Дж/м2 и продолжали инкубацию в течение 6-20ч при 37°С. ДНК выделяли фенольным методом в модификации (Lehmann, Kiik-Bell, 1978). 100 мкл УФ-эндонуклеазы, выделенной из М. luteus (Томилин, 1974). добавляли к 100 мкл ДНК и инкубировали 30 мин. при 38°С, затем наслаивали на изокинетический градиент сахарозы. Условия центрифугирования: 32000 об/мин, 20аС, 90 мин. Количество ПД определяли как сайты, специфичные к. УФ-эндонуклеазе, по формуле:

Л' = 2[1 /(Л/|с)0 -1 /(Л/»р)к ], (1)

где (MwХ-средневесовые MB ДНК контрольных клеток; (Mw)„ - средневесовые MB ДНК УФ-облученных и инкубированных с ферментом клеток Реплнкативнын синтез ДНК исследовался методом оценки синтеза ДНК по включению •'Н-тимидина в клегки, предварительно меченые |4С-тимидином. В различные сроки после УФ-облучения во флаконы-дубликаты добавляли 3Н-тимидин (10 мкКю/мл) па 30 мин и выдерживали при 37СС. Далее клетки промывали ледяным раствором Хенкса и лизнровали в течение 12 ч (0,8мл детергента/фл), лизаты фракционировали на бумажные фильтры FN-12 и, высушив, промывали обычным способом. Подсчет радиоактивности проводили в стандартном сцинциляторе на счетчике "Beckman" IS-8100.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выщспленне УФ-ипдуцырованпых пиримндшдовых димеров из ДНК и летальное действие УФ-радиацип. Известно, что при действии УФ-

излучения основными летальными повреждениями, образующимися в ДНК,

*

являются циклобутановые пиримидиновые димеры (ПД) (Bohr, 1994; Gurzadyan, 1996). Элиминация ПД из ДНК УФ-облученных клеток N-2a и Ьгл определялась УФ-эндонуклеазой из M.luteus на наличие сайтов, чувствительных к ферменту. На рис.1 представлены седнментограммы ДНК из клеток клонов N-2a и облученных в дозе 10 Дж/м2 и затем выдержанных в ростовой среде при 37°С в течение 6 и 20 ч. Профили седиментации ДНК клеток, обработанных ферментом через 0 ч и 6 ч после воздействия УФ-лучами практически совпадают. При увеличении времени инкубации до 18-20 ч наблюдается небольшой сдвиг сендиментограмм ДНК в сторону тяжелых фракций, что свидетельствует о незначительном уменьшении эндонуклелзочувствителышх участков а ДНК клеток исследованных линий.

Рис.1. Седиментация ДНК УФ-облученных (10 Дж/м2) клетках !Ч-2а и

По оси абсцисс-номера фракций (от дна), по оси ординат-радиоактивность, % от общей 1- ДНК до инкубации с УФ-эндонуклеазой; 2 - ДНК после инкубации с ферментом, 6 ч; 3 - ДНК после инкубации с ферментом, 20 ч.

Для количественной оценки полученные профилограммы математически обрабатывались, для каждой из них определялся МВ (Мнг) и вычислялось его среднее значение для группы опытов.

Показано, что количество эндонуклеазочувствительных сайтов при дозе облучения 5 и 10 Дж/м2 равняется, соответственно, 410" и 9108 (Lehmann, Kirk-Bell, 1978; Filon et al, 1995). Б исследованных линиях, при дозе 10 Дж/м2 обработка УФ-эндонуклеазой вызывает, в среднем, 5-6 разрывов на 10*Д ДНК

л

(формула 1). Спустя 6 ч после УФ-облучения количество сайтов, чувствительных к УФ-эндонкулеазе такое же, что и непосредственно после облучет... Инкубация клеток в течение 20 часов приводит к небольшому уменьшению числа ПД (N = 4.4 на 108Д). Следовательно, через 20 ч после воздействия УФ-лучами в клетках исследованных линий происходит лишь незначительное (10-15%) удаление ПД из ДНК и в общем виде кривые выщепления димеров из ДНК клеток N-2a и LM совпадают,

Следовательно, клетки N-2a и L)>v практически не выщепляют ПД. Новый цикл репликации начинается на ДНК с повреждениями. Это позволяет предположить, что для обеспечения жизнеспособности клеток недостаточность эксцизионного пути репарации в клетках должна быть компенсирована высокоэффективными механизмами пострепликатнвной и (или) репликативпой репарации ДНК.

Выживаемость. Чтобы оценить значение различных механизмов репарации ДНК в резистентности клеток к УФ-радиации, было необходимо исследовать летальное действие этого агента.

В большинстве случаев зависимость гибели клеток млекопитающих, от дозы повреждающего воздействия характеризуется Б —образной кривой, имеющей резко выраженное плечо (Спивак и др., 1997). Это означает обратимость некоторой доли летальных повреждений. Экспоненциальный

100

10

. -2

Рис. 2. Выживаемость клеток N-23 (1) и (2) при УФ-облучении. По оси абсцисс -доза УФ (Дж/м2),по оси ординат выживаемость, %.

0.1

0

характер кривых, наблюдается для клеток, чувствительных к данному агенту и свидетельсвует о меньшей способности к восстановлению от сублетальных повреждений. Кривые выживаемости, N-28 и рис. 2, практически не различаются и имеют Б — образный вид, характерный для устойчивых клеток.

л

Эффективность клонирования для клеток Ы-2а и составляла,

соответственно, 43 и 65 %. Следовательно, клетки Ы-2а и являются- УФ-резистентными по критерию выживаемости.

Таким образом, в резистентных к действию УФ-радиации клетках нейробластомы N-23 и фибробластах Ь,м мыши практически не происходит удаления из ДНК основных летальных фотопродуктов - ПД. Названные линии клеток могут служить удобной моделью для изучения особенностей пострепликативных механизмов репарации ДНК в клетках различной степени дифференциации при депйствии ДНК-тропных факторов УФ-типа.

2. Постреплнкатнвная репарация ДНК. Феномен ПРР ДНК состоит в восстановлении МВ вновь синтезированной ДНК, сниженного в результате наличия на ДНК повреждений. В наших опытах профили седиментации ДНК

1Ч-2а

Л*

_ ^ » • ф.

и

10 20

Рис. 3. Седиментация ДНК клеток нейробластомы (N-23) и фибробластов

мыши, импульсно меченых непосредственно после Уф-облучения (20 Дж/м2) По оси абсцисс - номера фракций (от дна); по оси ординат -радиоактивность, % от общей. 1 - без облучения; 2 - облучение; 3 -облучение, инкубация 1ч; 4 - облучение, инкубация 4 ч.

УФ-облученных (10, 20 и 40 Дж/м2) клеток двух линий №2а и сдвигались в сторону низких фракций , рис. 3.

Относительное снижение МВ ДНК (ц) после повреждающего воздействия по отношению к контролю оценивали по формуле (2).

Я-(Л/,1,НМ'У)°.Ю0%, (2)

(Л/и-),

где (Мм)к - МВ ДНК необлученных, - МВ ДНК поврежденных клеток.

Относительное снижение (|л) МВ ДНК, зависящая от дозы облучения в Ы-2а меньше, чем в 1Ч29 при каждой дозе УФ, т. е. наиболее короткие фрагменты ДНК образуются в клетках

Таблица. 1. Относительное снижение (ц) и эффективность восстановления (Э„) МВ ДНК в клетках нейробластомы (К-2а) и фибробластов ([-329)

Клон Доза УФ (Дж/м2) ц% Эв

Время инкубации (ч)

I 3

! Ы-2а 10 18 91 -

20 27 78 111

40 46 - 13

10 23 57 107

20 38 38 79

40 48 - 7

При последующей инкубации клеток в ростовой среде МВ вновь синтезированной ДНК достигает МВ ДНК необлученных клеток, рис.3. Однако, нарастание МВ в двух линиях клеток происходит с неодинаковой скоростью и выше в клетках пейробластомы, рис. 5.

Расчеты показали, что линии клеток различаются и по эффективности восстановления (Э.), табл, 1.

■ " 100%- (3)

(Мп>\ - (Л/н>)0

где (Мл)в - МВ ДНК поврежденных клеток после инкубации^

Рис. 4. Кривые нарастания MB дочерней ДНК клеток нейробластомы (N-2a) и фибробластов (L)M) мыши, облученных УФ-светом (20 Дж/мг). По оси абсцисс -

л

время после облучения(ч), по оси ординат - Мц/Ш6 Д.

Если при дозе УФ 10 Дж/м2 в клетках N-2a восстановление MB завершается через 1ч после импульсного мечения, то в клетках для полной репарации дочерней нити требуется Зч. Изучение кинетики ПРР ДНК в клетках N-2a и показало, что эффективность репарации ДНК в

исследованных клонах существенно различается, таблица 1.

Как указывалось в обзоре литературы, одним из вероятных механизмов репарации вновь синтезированной ДНК является репарация пострепликативных пробелов (Lehman 1972; Bohr V.A.,1994). В данной работе среднее число пробелов (X) на единицу MB во вновь синтезированной ДНК определялось по формуле (1).

Математический анализ полученного экспериментального материала с точки зрения гипотезы образования пострепликативных пробелов показал, (I^hmann, 1972, 1995) что процесс ПРР в двух исследованных клонах носит экспоненциальный характер и зависимость восполнения пробелов в ДНК от времени инкубации клеток может быть выражена формулой (4):

Х=Х0ет' (4)

где X, - среднее число пробелов ДНК, синтезированной непосредственно после облучения, m - показатель, характеризующий интенсивность заполнения пробелов (интенсивность ПРР), t - время после УФ-облучения (мин).

Экспоненциальная зависимость, как известно, характерна для кинетики ферментативных процессов в одно- и многокомпонентных системах (Яковлев, 1993). Расчеты показали, что процесс ПРР ДНК в каждом из клонов в полулогарифмической системе координат хорошо апроксимируется прямыми, рис.5. Обоснованность такой апроксимации подтверждается пересечением

прямых в одной топко па оси абсцисс (при 1=0). Это означает одинаковое начальное число пробелов ДНК, синтезированной непосредственно после облучения в двух исследованных клонах. Расчеты показали, что интенсивность репарации - та - в клетках М-2а и Ц-,а существенно различается и меньше в

л

клетках Для экспоненциальной функции справедливо соотношение:

ЛХ/Х =т ,

— = -/яЯ0е"°* =~тЛ , (5)

Л

где АХ - в нашем случае среднее число пробелов, заполненных в единицу времени.

Так как т не зависит от времени, то если справедливо наше предположение об экспоненциальном характере процесса ПРР ДНК, следует сделать вывод, что относительная доля пробелов, заполняющихся в 1 мин остается постоянной в течение всего процесса репарации. Т.е. среднее число заполняющихся пробелов в данную минуту пропорционально общему числу пробелов, имеющихся в это время.

г Рис. 5. Зависимость числа пробелов во

вновь синтезированной ДНК клеток нейроблас-томы (Ы-2а) и фибробластов мыши от

времени инкубации после УФ-облучения 20 Дж/м*. По оси абсцисс - время после облучения (ч), по оси ординат - число пробелов 1д X 109.

! 4

Таблица 3. Параметры ПРР ДНК УФ-облученных (20 Дж/м2) клеток Ы-2а и 1,т

Клон Ы-2а 1-929

ш 0.0.25 0.012

х° - 42.510" Д

Экспонциальная зависимость, в большинстве слуаев . характерна для процессов, включающих несколько составляющих, скорости которых различаются и определяются утлом наклона касательных. В начале процесса

доминируют быстрые компоненты, действие которых, однако, вскоре заканчивается. И, по-видимоиу, именно этим определяются различия в снижении МВ ДНК облученных клеток после импульсного мечения (1 ч) в двух исследованных линиях. Можно предположить, что клетки Ы-2а обладают

4

быстрым, за время импульсного мечения, механизмом восстановления вторичных повреждений ДНК, в отличие от клеток Ьт

Следовательно, приведенные результаты по исследованию ПРР ДНК, различной степени дифференциации более всего объяснимы моделью, согласно которой дочерняя ДНК в УФ-облученных клетках синтезируется с пробелами, а восстановление МВ ДНК осуществляется их репарацией.

Таким образом, в УФ-облученных клетках фибробластов 1<т синтезируется ДНК более низкого МВ, чем в клетках нейробластомы Ы-2а. В ходе процесса репарации МВ дочерней ДНК двух клонов достигает уровня МВ контрольных клеток с различной скоростью: клетки 1Ч-2а обладают быстрым механизмом ПРР и эффективность ПРР ДНК в них выше. Математический анализ экспериментального материала показал, что результаты нашей работы свидетельствуют в пользу гипотезы образования постренликативных пробелов.

3. Репликация ДНК и ее синтез через длительное время после действия УФ-лучей или обход повреждений.

Репликация ДНК УФ-облучение ингибирует общую скорость репликативного синтеза ДНК вследствие блока инициации ее репликации на уровне целых кластеров репликонов и элонгации цепей ДНК Согласно полученным данным, в течение 1-2 ч. после действия УФ-лучей (ЮДж/м2) происходило подавление скорости синтеза ДНК в обеих линиях. При 2 ч инкубации клеток наблюдалось восстановление, которое к 3-му ч составляло примерно 70% по сравнению с контролем. В клетках N-28 восстановление синтеза ДНК отсутствовало на протяжении 5 ч. Различия в восстановлении скорости репликации ДНК могут быть объяснены неодинаковой чувствительностью клеток к летальному действию УФ-лучей и отклоненями в системах репарации ДНК. Было показано, что обе линии являются резистентными к действию УФ-света и по критерию выживаемости, в них практически не функционирует

механизм ЭРПД. Таким образом, клетки 1М-2а проявляют радиочувствительный синтез ДНК в отличие от Ц^д. Полученные результаты могут быть объяснены особенностями структурно-функциональной организации процессов репарации и репликации ДНК в клетках нейробластомы Ы-2а.

Обход повреждений. В клетках млекопитающих с неудаленными ПД через длительное время после облучения синтезируется ДНК с МВ, не отличающимся от МВ контроля. Способность клеток Ы-2а и Ь,» к синтезу ДНК в обход неудаленным повреждениям исследовалась нами через 3 и 18 ч после УФ- облучения в дозах 10 и 20 Дж/м2. В клетках Ы-2а через 3 ч после облучения в дозах 10 и 20 Дж/м2 наличие ПД препятствует элонгации дочерних нитей ДНК. МВ ДНК через 3 ч после облучения практически такой же, что и непосредственно после действия УФ, рис.б.

Рис.6. Седиментация ДНК клеток, импульсно меченных через Зч после действия УФ (10 Дж/м2). По оси абсцисс - номера фракций (от дна), по оси ординат - радиактивность, % от общей. 1-ДНК без УФ; 2,3 -УФ , импульсное печение О и 3 ч, соответственно. В клетках профили седиментации ДНК через 3 ч после УФ (1 ОДж/мг) мало отличаются от контрольных, что свидетельствует о способности клеток к беспрепятственному синтезу ДНК. При дозе УФ 20 Дж/м'' повреждения ДНК частично преодолеваются механизмом ОП.

Эффективность синтеза ДНК, определяемая по формуле 3, составляет 60%. Исследование синтеза ДНК через более длительный период инкубации -18ч-показало, что в клетках обоих клонов синтезируется ДНК с той же величиной MB, что и в контрольных. Это могло бы быть результатом элиминации ПД в

л

течение времени до импульсного мечения, однако, результаты по ЭРПД противоречат этому. Механизм ОП в настоящее время неясен. Наряду с предположением о конформационном исправлении некодирующего повреждения (Buhl et al., 1974) существует также гипотеза репликативного преодоления блока синтеза ДНК (Purk,Cleaver, 1979а). Исходя из этой гипотезы следует допустить, что ПРР ДНК и ОП по сути один и тот же процесс. Однако, такому объяснению противоречат данные, приведенные в настоящей работе. Можно предположить, что ОП и ПРР ДНК осуществляются разными механизмами. С этим выводом согласуются данные о механизмах "раннего" и "позднего"способов репарации дочерней ДНК в УФ-облучепных клетках сирийского хомячка (Doniger, DiPaolo, 1980).

Таким образом, клетки нейробластомы N-2a, в отличие от фибробластов не способны к беспрепятственному синтезу ДНК через длительное время после действия УФ-лучей.

Включение 'Н-тнмидппа в ДНК клеток пол влиянием дсРНК. Двуспиральные РНК (дсРНК) известны как индукторы интерферона, стимуляторы первичного и вторичного иммунного ответа, модуляторы ряда биохимических реакций. Нами исследовались особенности влияния дсРНК (25, 50, 100 мкгр/мл) на синтез ДНК исследуемых клеток при действии УФ-радиации. Согласно полученным данным происходит ингибирование синтеза ДНК адекватно увеличению концентрации дсРНК. Включение ^Н-тимидина в ДНК клеток N-2a, предварительно инкубированных с дсРНК и затем облученных УФ (5-10 Дж/м'), практически не отличалось от таковых без облучения.Результаты по изучению выживаемости клеток в присутствии дсРНК (50 мкгр/мд) свидетельстуют о повышении эффективности клонирования примерно на 15-17%, а их устойчивости к действию УФ приблизительно на 20-23%. Объяснения полученных фактов нуждаются в проведении специальных исследований. Результаты исследования»

предполагают регуляторную роль дсРНК на процессы клеточной активности.

Особый интерес вызывают иммунофилины, выделенные в последнее время из гипоталамуса крупного рогатого скота (Gurvits et al., 1995; Galoyan,

1997). Иммунофилины относятся к категории протеинов, активных в

*

комплексообразовании с различными соединениями иммуносупрессорного действия (Radamyi et al., 1994) и способны вовлекаться во всевозможные реакции организма. Наши исследования, проведенные в опытах in vivo со срезами мозговой ткани и мембранами эритроцитов в присутствии синтетических N-терминальных фрагментов пептида иммунофилина 1-9 и 1-15, позволили проследить отчетливо проявляющееся дозозависимое перегруппирование всего фосфолипидного спектра в изученных системах.

4 Клеточный цикл в УФ-облученных клетках. Известно, что при УФ-облучении изменяется митотический цикл клеток млекопитающих, при этом наиболее чувствительной оказывается фаза S. По нашим данным рассчитанные значения продолжительности отдельных фаз митотического цикла G,, S и G2 + M составляли 8±1.2, 8.7±0.6 и 3.3±0.6 ч для клеток и 13.3+1.7, 10.9±0.8 и 7.3±0.8 для клеток N-2a соответственно. На рис. 7. приведено относительное содержание клеток в фазах G,, S и G,+ М в различные сроки после облучения в дозах 5 и 10 Дж/мг. Каждая точка на графике представляет долю клеток, находящихся в соответствующих фазах G,, S и G2-t-M, определенных с помощью компьютерного анализа гистограмм содержания ДНК. Из данных рис.7 следует, что при дозе 5 Дж/м2 не происходит сколько-нибудь заметных изменений при прохождении всех фаз клеточного цикла. Кривые свидетельствуют, что через 4-8 ч после облучения в дозе 10 Дж/м'происходит небольшое увеличение доли клеток, находящихся в фазе S (45 и 53% по сравнению с 42% в контроле), с соответствующим уменьшением числа клеток в С,-фазе. Через 12 ч гистограммы ДНК не отличаются от гистограмм, характерных для необлученных культур. Это подтверждается данными, полученными при использовании колцемида, рис.7 (кривые 3-5). Наблюдаемое одинаковое уменьшение числа клеток, находящихся в фазах G, и S, и соответственно, одинаковое накопление в фазе G, + М клеток, обработанных колцемидом, как необлученных, так и

Рис. 7. Относительное содержание клеток фибробластов мыши 1-429 в фазах й,, 5 и С, + М в различное время после облучения без обработки и при обработке клеток колцемидом непосредственно перед облучением. По оси абсцисс - время после облучения, ч; по оси ординат - доля клеток, %. Клетки обработаны колцемидом в концентрации 0,25 мкг/мл. 1,2 - облучение в дозах 5 и 10 Дж/м2, соответственно; 3 - колцемид;

4,5 - колцемид, облучение в дозах 5 и 10 Дж/м2 соответственно. Рис.8. Относительное содержание клеток пейробластомы Ы-2а в фазах С,, Б и С2 Н- М - в различное время после облучения без обработки и при обработке клеток колцемидом (0,25 мкг/мл).

По оси абсцисс - время после облучения, ч; по оси ординат - доля клеток, %. 1,2 - облучение в дозах 5 и 10 Дж/м2 соответственно; 3 - колцемид; 4,5 - колцемид, облучение в дозах 5 и 10 Дж/м2 соответственно.

облученных в фозе 5 Дж/м', свидетельствуют об устойчивости клеток Накопление клеток в фазе Б после облучения в дозе 10 Дж/м2 приводит к заметному замедлению накопления клеток в фазе С,4-М (приблизительно на 3 ч) при добавлении колцемида к облученным клеткам, рис.3.4.2 (кривые 3 и 5). Выход клеток из фазы С, в фазу Б не замедляется и наблюдается (10

Дж/м') одинаковое уменьшение числа клеток в фазе G„ рис.7 (кривые 3 и 5).

На рис.8 приведены аналогичные данные для клеток N-2a, которые в отличие от резистентных к УФ-свету клеток оказались УФ-

чувствительными при прохождении цикла: после облучения клеток в дозе

л

5 Дж/м2 уже через 4 ч (вплоть до 12 ч) наблюдается накопление клеток в фазе S. Максимальное число их колеблется в пределах 44% через 8 ч (ср. с 37% в контроле), с уменьшением доли клеток в фазе G,. Через 16 ч гистограммы ДНК не отличаются от гистограмм, характерных для необлученнмх' культур, рис. 8. [кривые 1). При облучении клеток в дозе 10 Дж/м2 доля клеток в фазе S составляет около 50% через 8-12 ч после облучения. Через 20 ч гистограммы ДНК приближаются к контрольным, рис.8 (кривые 2). При добавлении колцемида к облученным культурам блок в фазе S становится более отчетливым: накопление клеток в фазе G2 замедляется при облучении. С увеличением дозы облучения увеличивается задержка в накоплении клеток. Кроме того, следует отметить, что при облучении в дозе 10 Дж/м2 замедляется выход клеток из фазы G, и уменьшается число клеток, идущих по циклу.

Полученные результаты свидетельствуют о зависимости изменений в распределении клеток но фазам митотического цикла. Задержки в продвижении клеток на стадиях G, и S приводят к существенному замедлению перехода клеток в фазу G2 + M. Накопление клеток N-2a в фазе G, 4 .V] начинается лишь через 8 и 12 ч соответственно. Таким образом, клетки нейробластомы N-2a более чувствительны к действию УФ-света по критерию восстановления митотического цикла по сравнению с клетками

Выше нами было показано, что в N-2a в отличие от проявляется дефект обхода повреждений через 3 ч после УФ. Дефект в репарации поврежденной ДНК может быть причиной замедленного продвижения клеток по циклу в фазе G,. Возможно, что клетки клона N-2a не способны узнавать и отвечать на сигналы от поврежденной ДНК, на которые клетки линии Ln) отвечают в фазе G, на уровне регуляции перехода из фазы G! в фазу S.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о положительной корреляции между изменением фазы репликатинного синтеза ДНК при УФ-облучении и способностью к беспрепятственному синтезу ДНК

на поврежденной матрице через некоторое время после УФ-облучения.

Полученная положительная корреляция кажется не случайной, поскольку может отражать возможные предмутационные и потенциально канцерогенные изменения ДНК, возникающие при действии УФ-света и

л

происходящие в выживших клетках Ы-2а в ходе репликации ДНК на поврежденной матрице. Не исключено, что оба показателя являются отражением одного и того же ответа клеток млекопитающих на действие УФ-света.

Математическая модель репаративного ответа клеток при прохождении мптотпческого цикла. Проблема регуляции клеточного цикла является одной из центральных в биологии. Механизм этой регуляции работает таким образом, что продолжительность клеточного цикла оказывается весьма вариабельной даже у клеток одной популяции. Механизм этой вариабельности взаимосвязан с процессами клеточной пролиферации, а также репликации, репарации и транскрипции ДНК.

Важным ответом клетки па повреждения ДНК является задержка продвижения клеток по циклу в в, и, в основном Б, что дает время д\я возможной репарации ДНК до встунления клеток в следующую стадию. Есть основания предпологать, что именно н этих фазах происходят ключевые регуляторные события, определяющие дальнейшее течение клеточного цикла. Поэтому в современных исследованиях регуляции клеточного цикла особое внимание уделяется кинетике выхода клеток из фаз С, и Э и молекулярным механизмам репарации и репликации ДНК.

На основании проведенного в работе анализа, предлагается рассматривать молекулярный вес IV = \У(() ДНК как решение дифференциального уравнения

¡1IV

от—= -»»40 +(2ИЪ+/>(</))

с начальным условием

ЩТ,) = \Ув ■

Здесь Г, есть длительность фазы С,, а а = а(<1) есть некоторый положительный коэффициент, являющийся функцией от </. Величина р(и)

задается следующим соотношением

¿м)

Р('1)=УУ0:

\-е-й1

«

где АТ=Т2-Т, (Т2 есть длительность фазы G, +S). Решением дифференциального уравнения является функция

WU) = -(щ + P{d))e~('-r^a + (21 v, Y p{d)).

В работе получена формула для определения задержки Z- Z{d) клеточного цикла в зависимости от дозы облучения А

d. .

Z(d) = ocln-

аш

На основании экспериментальных данных имеем: для Ь,,,: 7, =8, Г, = 16.7, А Г= 8.7; для N-23: Г, = 13.3, 7^ = 24.2, АТ= 10.9;

Беря эти данные за основу, в работе получены следующие расчетные формулы:

для (при <*„, = 40).

г(^) = а(й).1п-^--8.7,

1- — 40

где

а (Л) = 0.052*/+ 0.784;

для N-23: (при с/ы = 35).

- а(</)•/&-^--10.9 ,

! _ ± 35

где ' 1 '

а(</) = 0.076*/ + 1.015 .

Таблица .Численные данные для некоторых знамений дозы УФ-облучения Л

й т

I™ <*м = 40 Ы-2а, <4, = 35

5 0.52 4.62

7.5 1.75 6.76

10 3.02 9.04

12.5 4.31 11.38

15 5.64 13.80

17.5 7.01 16.28

20 8.43 18.88

22.5 9.91 21.61

25 11.47 24.52

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Клетки нейробластомы Ы-2а и фибробластов Ьга мыши являются резистентными к действию УФ-радиацин и практически не различаются по критерию выживаемости.

2. В клетках [М-2а равно как и в клетках не происходит выщепления из ДНК основных летальных фотопродуктов - димеров пиримидиновых оснований.

3. Пострепликативная репарация ДНК после УФ-облучения имеет место в обоих исследованных линиях. Эффективность и скорость процесса существенно различаются: они выше в клетках Ы-2а.

4. Математический анализ фактического материала показал, что процесс

пострепликативной репарации характеризуется экспоненциальной

#

зависимостью. Это свидетельствует в пользу гипотезы образования "пробелов".

5. Установлено отсутствие способности к беспрепятственному синтезу ДНК на поврежденной матрице клеток !\!-2а в отличие от Цм.

6. Равная выживаемость клеток исследованных линий обусловлена взаимной компенсацией двух различных механизмов: пострепликативной репарации

ДНК и синтеза ДНК в обход неудаленным повреждениям, что свидетельствует о репарационной природе последнего.

7. Клетки N-2a более чувствительны к действию УФ-лучей по критерию восстановления митотического цикла и репликативного синтеза ДНК по

л

сравнению с клегками

8. Под влиянием дсРНК происходит ингибирование синтеза ДНК адекватно увеличению концентрации на фоне повышения эффективности клонирования и выживаемости клеток.

9. Разработана математическая модель репаративного ответа УФ-облученных клеток при прохождении митотического цикла.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ПД - пиримидиновые димеры

ЭР - эксцизионная репарация

ПРР - пострепликативная репарация

ОП - синтез ДНК в обход повреждений

MB - молекулярный вес

Д - дальтон

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Karageuzyan K.G., Galoyan А.А., Hovsepyan L.M., Karageuzyan M.K., Manoukyan Z.M., Hovakimyan S.S., Quinn P.J. The effekt cf n-terminal frgments of immunophilin on photolipid composition of rat brain //Molekular Membrane Biology , 1996. V.13., P. 49-51.

2. Manukyan Z.M., Manukyan К.1., Karageuzyan K.G. Replication of DNA in the mouse neuroblastoma and fibroblasts cells after UV-irradiation //Abstracts of the Intern. Small Conf. on Brain and Immune Sysem, Yerevan, Dilidjan, 1997., P. 27.

3. Karageuzyan K.G., Zakharyan R.A., Manukyan K.L., Manukyan Z.M. 3H-thymidine incorporation in DNA cells of mouse neuroblastoma under double spiral effect //Abstracts of the Intern. Small Conf. on Brain and Immune Sustem, Yerevan, Dikijan., 1997., P. 21.

*

4. Манукян З.М. Репликация ДНК в клетках нейробластомы и фибробластов мыши после УФ-облучения //Материалы конференции, посвященной 30-и летию со дня основания Института Молекулярной биологии НАН РА, Ереван, 1997., С. 37.

5. Манукян З.М., Манукян К.Л., Захарян Р.А., Карагезян К.Г. //Материалы конференции, посвященной 30-и летию со дня основания Института Молекулярной биологии НАН РА, Ереван, 1997., С. 30.

6. Манукян З.М., Карагезян К.Г. О выщеплении УФ-индуцированных пиримидиновых димерои из ДНК клеток нейробластомы и фибробластов мыши //Биологический журнал Армении, 1998. N1.

7. Манукян З.М., Шукурян Ю.Г., Карагезян К.Г. Математическая модель репаративного ответа УФ-облучениых клеток различной степени дифференциации //Биологический журнал Армении, 1998, N1.

8. Manukyan K.L, Manukyan Z.M., Kirillova T.V., Karageuzyan K.G. DNA repair and cell cycle in UV-irradiated mouse fibrolasts and neuroblastoma cells //J. Molekular and Chemical Neuropathology, 1998, (in press).

U 1ГФ П Ф nur

UniujliG uiGquiû muniúGuJu]ipi)bL l. nituipiui5iuGni;>uiljuiqnijG äuimjuquijpüLuü i|Guiuiupuip uiqqbgnipjniGp 0-"ljíi>-|i tpimmgiJuiöpujj]iG U .f>niül]g[in(¡iLn huiuiljmpjniGGbplt

ITljGbpfi ps^mjjiü qóbpji i]pui 1)ш1лшрш0 hbinujqnmnipjniGGbp|i ujpnjniGpGlpp N-2a -ûlijpnp^uuiniîmjli U Ls29 -4>tippnp^uinGUp|i 'l"bí<>-fi nbiquipujg|iuij|i b nbiqililjiugliuij|i i]pm 6umuiquijpmjliG qnpönGfi uiqqbgmpjiuG duiùuiGuiL{ ijlpujimï ЬЦ uipôuiGiuqpijujà npn¿uilj|i uiuupplipnipjniüübpli üuiujiü:

UniuyJiG luüquid фпрй L uipiJUi итшдфий IjtiGumpmümlimG bpUnijpGlîp|i, qiluunjnpimqtiu pyli?Gbp[i ilpinnuijilj glil|||i tuGgüuiG uinuiGáGuihiuml}ntpjmGGbp|i, йштЬйшиф^шЦшй îSnqlniuiJnpiîmG tipuiqnpàniiî: Ujq Ipuupuligmpjuiúp шпшЦЦ i5L£> hhiniuppppnipjnpG tiG GhplpujuigGmtf niimpuiiïuiûiu2uil]iuqnijG ÖLuniiiqujjpiliujü luqqbgmppuG GUppn quipquujnq \uiuuGûGiuhuun.limpjmGGbpp ТЬГО"-]« пьи\шршу[1ш][1 U nliqifiliuigliiuj]i 1|рш: »J.bpp G;>i]iudp ntqniulj]i 1)шир}ш0 t tmljmptinuiJilj p^Ji^Glipti йиришшЦширид mpiuGu:}>npüuig]iuij]i Ь opqmû[iqù]i GbppjiG U шртшр^й üjijunJuijpli üniuiiuqbG luqquiljGbpIi uiqqUiJnipjmG IjiuGJuujpqbilij üJi^ngummüGbpli l(uiqiliul)bpujiïmli libui: \r2ijwö тЬишЦЬифд, uiGlpuuljuiû, hhinaippppntpjmG bG Gbpljujjujgûniiï nbu|uipuig{inû liuidujljujpqbp|i opli(iui;u^mipjmGGbp]i munníGuiulipmiSübpp iïuipbiîuim]ilpulpuG tfnqbiuinpiSuiG úbpnqGbp|i l)JipuintfuiG liji^ngmj: