Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие алкилирующих агентов и ионизирующей радиации на клетки человека с наследственными нарушениями репарации ДНК

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Действие алкилирующих агентов и ионизирующей радиации на клетки человека с наследственными нарушениями репарации ДНК"

На правах рукописи

РГБ ОД УДК 57Л346 616-056.7

г 7 ОПТ 1398

СПИВАК Ирина Михайловна

ДЕЙСТВИЕ АЛКИЛИРУЮЩИХ АГЕНТОВ И ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА С НАСЛЕДСТВЕННЫМИ НАРУШЕНИЯМИ РЕПАРАЦИИ ДНК

03.00.25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург; и в отделе радиобиологии Стокгольмского университета (Шзеция)

Научные руководители: доктор.биологических, наук., проф.

В.М.Мнхельсон, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург,

РЬ О , доцент А.Э.Кольмян, Стокгольмский университет, Швеция.

Официальные оппоненты

доктор биологических, наук , проф.

11. В Ломил ин, Институт цитологии РАН,

Санкт-Петербург.

доктор медицинских наук, член-корр. РАМН, проф. К. П.Хансон , Научно-исследовательский институт онкологии имени Н И. Петрова РАМН, Санкт-Петербург.

Ведущее учреждение.

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино,

Защита состоится 1998 года в № часов на заседании

Диссертационного совета Д.002 73.01 Института цитологии РАН

по адресу. 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан "34щтября

1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

Л.Н.Писареии

ВВЕДЕНИЕ

Изучение механизмов репарации ДНК является одной из важнейших областей клеточной биологии. Только нормальное функционирование этих репарирующих систем обеспечивает устойчивость клеток к облучению и действию химических агентов (Жестяников, 1979), стабилизирует генетический аппарат клетки при его нормальном функционировании - репликации и рекомбинации, то есть способствует поддержанию генетической стабильности клетки и обеспечению ее жизнедеятельности. Повреждения, возникшие в структуре ДНК и не подвергшиеся процессу репарации, неизбежно приводят к нарушению в других системах клетки, для которых ДНК служит источником и хранителем информации.

Одним из перспективных подходов к изучению репарационных процессов в ДНК является исследование мутантов с нарушениями тех или иных этапов репарации - процесса достаточно сложного и многообразного, к тому же неравномерно изученного. Если основные генетические механизмы эксцизионной репарации ДНК уже поняты, то процессы восстановления двунитевых разрывов и шире - репарации повреждений после гамма-облучения остаются недостаточно ясными. Таким образом, изучение мутантов с нарушениями процессов репарации ДНК от повреждений после гамма-облучения, особенно у человека, открывает перспективы не только для расшифровки механизмов репарации ДНК в клетках человека, что является главной задачей этого исследования, но и помогает пониманию генетических основ канцерогенеза и старения. Это также важно для выяснения роли репарации ДНК в нормальной жизнедеятельности клетки.

Сейчас существует достаточно большое количество клеточных штаммов человека, для которых описана их повышенная чувствительность к ионизирующему облучению и радиомиметикам (Lehmann, 1996; Zdzienicka, 1995). Именно сравнительное их изучение позволило в последнее время достичь значительного прогресса в этой области. В коллекции нашей лаборатории имеется ряд подобных штаммов, и подробное их описание и введение в международный научный обиход представляется нам необходимым.

Актуальность проблемы.

Все изученные нами клеточные линии имеют несколько повышенную чувствительность к гамма-облучению и действию таких радиомиметиков как алкилирующие агенты - эпоксиды.

Для двух из четырех изучавшихся болезней - синдрома Вернера и атаксии-телеангиэктаЗии - характерно то, что белок, кодируемый геном, с которым связывают данное заболевание, имеет геликазный домен. В случае исследованной нами пигментной ксеродермы, относящейся к группе С, белок, отвечающий за это заболевание, имеет убихитин-подобный N-терминальный домен и является аналогом дрожжевого белка RAD23, который облегчает связывание белка RAD14 с комплексом TFIIH. При этом ео всех клеточных линиях от больных ХРС наблюдается измененная Q1 АТФаза, которая имеет невысокую, но явную геликазную активность. При введении "нормальной" Q1 АТФазы в клетки ХРС дефект эксцизионной репарации не корректируется (Masutani et al., 1994). Каким образом происходит изменение этой АТФазы и может ли ее геликазная активность быть связана с чувствительностью наших клеток к ионизирующей радиации и эпоксидам, остается неясным. К тому же, в данном конкретном случае, мы, вероятнее всего, имеем дело еще с одной мутацией, кроме ХРС, с которой и связана повышенная чувствительность к ионизирующей радиации у данной больной. При этом надо заметить, что другие больные пигментной ксеродермой, у которых описана повышенная радиочувствительность, относятся к другой группе комплементации - G, при которой иногда наблюдается фенотип, характерный для синдрома Коккейна Нужно учесть и то, что синдром Коккейна связан с комплексом TFIIH, и оба эти заболевания имеют дефект в репарации, связанной с транскрипцией

Синдром Коккейна, изученный нами, относится к группе комплементации А, и белок CSA, показывающий крайнюю эволюционную консервативность, вероятно, является белком-переносчиком внутриклеточных сигналов, способный связывать различные белки между собой с образованием крупных мультибелковых комплексов (Henning et al., 1995). При этом белок CSA всегда участвует в репарационных процессах, объединившись с белком CSB, который имеет геликазный домен (Troelstra et al., 1992). Белок CSB оказался функциональным гомологом белкового фактора, связывающего транскрипцию и репарацию у E.coli (Selby and Sanear, 1993), и вместе с белком CSA играет

особую роль в привлечении белков эксцизионной репарации в район остановившейся транскрипции (Hanavalt, 1992).

Таким образом, все изученные нами клеточные линии либо сами несу г измененные белки, имеющие геликазную активность, которые или являются продуктом гена, ответственного за данное заболевание (AT, WS), или каким-то образом обязательно меняются именно при данной форме заболевания (01 АТФаза в клетках ХРС), либо дефектный в данной клеточной пинии белок прочно связывается с другим, имеющим геликазную активность (CSB/CSA комплекс), причем повреждение любого из этих белков приводит к одному и тому же заболеванию - CS.

Изучение целой панели клеточных линий от больных с дефектами репарации может служить моделью для исследования путей, которыми реализуется действие мутантных белков в клетке.

Так как почти все эти болезни связаны с преждевременным старением и ранней смертью, подробное исследование репарации в них представляет интерес и для понимания механизмов старения. Сопоставление данных по репарации в неиммортализованных диплоидных фибробластах и лимфобластоидных(иммортализованных)клеточных линиях,полученных от одних и тех же больных,может прояснить вопрос о том, какие именно признаки кроме ограничения числа делений, зависят от иммортализации.

Эпоксиды являются алкияирующими агентами прямого действия, мутагенный эффект которых сильно варьирует в зависимости от объекта. Обширная сводка сравнительной токсичности различных эпоксидов была сделана Эренбергом и Хусейном еще в 1981 году (Ehrenberg and Hussain, 1981) и Гири в 1992 (Giri, 1992). Наиболее изученным из эпоксидов является этиленоксид (ЕЮ), его действие подробно описано в обзоре Деларко (Dellarco et al., 1990) Этиленоксид широко используется в химической промышленности и известен как агент, активно загрязняющий окружающую среду и возможный канцероген (см. обзоры у Kolman et al,, 1986, Florak and Zielhius, 1990). В статье Нигрена с соавторами (Nygren et ft., 1994) детально описано образование разрывов под действием этиленоксида в нормальных человеческих диплоидных фибробпастах при использовании различных методов. Пропиленоксид (РО) и эпихлорогидрин (ЕСН) являются производными этиленоксида и. как и этиленоксид, широко используются в химической промышлености (подробный обзор см, Kolman and Dusinska, 1995). Известно, что ЕЮ способен вызывать мутации в ГГФРТ-локусе в нормальных фибробластах человека при небольших

дозах 2.5-10 мМ/час (Kolman et at., 1992). Изучение действия эпоксидов на большой панели клеточных линий, как диплоидных неиммортализованных фибробластов, так и лимфобластоидных, имеет принципиальное значение для углубленного исследования механизмов их действия на клеточном уровне.

Для более глубокого изучения механизмов и белков, вовлеченных в репарацию ДНК после гамма-облучения были предприняты попытки влиять на репарационный ответ с помощью введения экзогенной рекомбиназы и предварительного изменения конформации хроматина облучением в малой дозе (1-5сГр).

Цели и задачи исследования. Итак, целью исследования является изучение действия алкилирующих агентов и гамма-лучей на клетки больных с наследственными дефектами репарации ДНК. При этом ставятся следующие задачи:

1. Дальнейшее изучение линии XP2SP, двойная чувствительность которой к УФ- и гамма-облучению была описана Михельсоном (Михельсон, 1981) для уточнения ее чувствительности не только к гамма-облучению, но и к радиомиметикам.

2. Исследование репарации после гамма-облучения и действия гаммамиметиков в клетках CS1SP, взятых от больной с синдромом Коккейна, так как данные о радиочувствительности на клеточном уровне при этом заболевании достаточно противоречивы.

3. Атаксия-телеангиэктазия - заболевание достаточно изученное и характеризующееся на клеточном уровне повышенной радиочувствительностью (Jorgensen and Shiloh, 1996). Интересным является каждый отдельный описанный случай, так как клетки могут различаться по своей чувствительности. Таким образом, для уточнения особенностей именно нашего случая - AT2SP -было необходимо провести исследование чувствительности клеток этого штамма не только к гамма-облучению, но и к различным гаммамиметикам.

4. Подробное изучение чувствительности клеточного штамма PR3SP к гамма-облучению и действию радиомиметиков, так как влияние подобных агентов на репарцию в клетках больных прогерией изучено недостаточно. Было бы интересно уточнить, относится ли наша больная прогерией к синдрому Вернера или это какая-либо другая форма лрогерии взрослых.

5. Изучение влияние иммортализации на репарацию ДНК от однонитевых разрывов, так как для двух больных - пигментной ксеродермой и прогерией взрослых - нами были получены лимфобластоидные клеточные линии, иммортализованные вирусом Эпштейн-Барра (Михельсон и др., 1993; Наседкина и др., 1997), которые мы использовали для сравнительного изучения репарации в "смертных" и "бессмертных" клеточных линиях.

6. Изучение возможности влиять на репарацию в клетках человека после гамма-облучения с помощью введения в облученные клетки экзогенной рекомбиназы - RecA белка E.coli для исследования участия рекомбинации в ликвидации однонитевых и двунитевых разрывов ДНК.

7. Исследование роли информационного состояния ДНК для репарации повреждений, то есть возможную вовлеченность в этот процесс геликазной активности в клетках, на модели, разработанной совместно с Беляевым (Belyaev et al., 1996), включающей предварительное гамма-облучение диплоидных фибробластов человека малой дозой.

Научная новизна полученных результатов.

Полученные нами результаты окончательно подтвердили повышенную чувствительность к ионизирующей радиации клеток больной пигментной ксеродермой, как диплоидных фибробластов XP2SP, так и лимфобластоидных XP2SP(L). Причем показана повышенная чувствительность этих клеток как по критерию выживаемости (XP2SP), образования однонитевых разрывов (XP2SP(L>) и их ликвидации (и диплоидные фибробласты и лимфобластоидные клетки). Показано, что изученные нами дефекты репарации не связаны с иммортапизацией клеток.

Новыми являются сведения о повышенной чувствительности клеток CS1SPK ионизирующему облучению и действию зпоксидов. Особенно интересными оказались данные об их пониженной способности (по сравнению со всеми остальными изученными линиями) ликвидировать однонитевые разрывы ДНК, образующиеся после действия пропиленоксида, зпоксида, связывающегося с ДНК наименее прочно.

Подробно описана репарация в клеточной линии AT2SP, которая по своей чувствительности к гамма-облучению и действию эпоксидов с достаточными на то основаниями отнесена к группе АТ-вариант. Изучение репарации в клетках PR3SP впервые показало их повышенную чувствительность к гамма-облучению

и действию эпоксидов. Причем эта повышенная чувствительность была описана и в диплоидных фибробластах PR3SP и в лимфобластоидных иммортализованных клетках PR3SP(L). Повышенная чувствительность к гамма-облучению и двум из изученных эпоксидов мы наблюдали только по критерию выживаемости клеток. Но после действия этиленоксида ни те,ни другие клетки не способны ликвидировать однонитевые разрывы, образующиеся в ДНК, причем со временем количество разрывов может даже возрастать (в лимфобластоидных клетках), а не уменьшаться. То есть этот дефект репарации ДНК от разрывов не может быть скорректирован иммортализацией клеток.

Впервые было показано, что RecA белок бактерии E.coli способен при введении в клетки человека с помощью липосом участвовать в процессах репарации ДНК после гамма-облучения (Spivak et al., 1991; Спивак и др., 1991). Таким образом, была подтверждена роль рекомбинации в этих процессах - в ликвидации как однонитевых, так и двунитевых разрывов ДНК.

Показано, что изменение конформации хроматина при облучении клеток влияет на их выживаемость. Причем эта зависимость носит не однозначный характер, а является циклической и зависит как от типа клеток, так и ör дозы облучения (Belayev et al.,1996).

Практическая ценность работы.

Полученные в работе экспериментальные результаты расширяют и углубляют представления о характере и отчасти о механизмах действия ионизирующего облучения и радиомиметиков-эпоксидов на клетки человека и закономерностей репарации поврежденных клеток на уровне ДНК. Показана решающая роль процессов репарации в ликвидации разрывов ДНК после облучения и обработки эпоксидами.

Результаты работы существенны также для понимания генетических основ канцерогенеза и старения. В частности, полученные данные о том, что дефекты репарации ДНК в клетках от больной PR3SP, имеющей признаки преждевременного старения, не комплементируются иммортализацией этих клеток. При трансформации только снимается ограничение пролиферации (лимит Хейфлика), характерное для нетрансформированных клеток, но это происходит в любых клеточных штаммах, а не только прогерийных. Таким образом, можно предположить, что даже при снятии эффекта ограниченности

делений клеточной популяции мы не уберем другие признаки старения клеток и подобный путь не является панацеей для человечества.

Эпоксиды - опасные поллютанты и это еще раз подтверждено на клеточной модели, содержащей несколько разных штаммов клеток от больных с различными дефектами репарации ДНК. С методической точки зрения использование подобного набора клеточных штаммов может служить удобной и незаменимой моделью для испытания других химических агентов на канце-рогенность и мутагенность.

Подробное описание клеточных штаммов, полученных от больных в России, может быть в дальнейшем использовано для создания банка данных о мутациях, распространенных в нашей стране, и их сравнения с ранее описанными. Это важно для понимания этиологии данных заболеваний и возможных перспектив генной терапии.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены на XVII Генетическом конгрессе в 1993 году в Бирмингеме (Англия), в 1994 году на I създе ВОГИС в Саратове и на 3-ей конференции Европейского общества аналитических исследований клеточной патологии в Гренобле (Франция), в 1995 году на ежегодной встрече токсикологов Северной Европы в 1995 году в Тампере (Финляндия), в 1996 году на 9-ом международном конгрессе по генетике человека в Рио-де-Жанейро (Бразилия), а также были неоднократно обсуждены на научных семинарах института цитологии РАН и департамента радиобиологии Стокгольмского университета.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена настраницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего публикаций. Диссертация иллюстрирована Зб рисунками и 1 таблицей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе были использованы клеточные линии, как полученные от больных с различными генетическими заболеваниями, так и имеющиеся и официально зарегистрированные в банках клеточных культур Института цитологии РАН и Стокгольмского университета.

Не1_а - перевиваемая клеточная линия, полученная из соединительной ткани опухоли матки. Предоставлена банком клеточных культур Института цитологии РАН.

\/Н-10 - фибробласты крайней плоти мальчика 11 лет. Используется в исследованиях в качестве клеток здорового донора. Широко используется в работах по радиобиологии (ВаэНоуа е1 а!., 1994; Ыудгеп е1 а)., 1994;). Нами получена от доктора Ады Колман, доцента кафедры радиационной биологии Стокгольмского университета, Швеция (Ко1тап е1 а1„ 1992).

Клетки СЭ13Р - фибробласты, полученные от больной М. Семья живет в отдаленном таджикском кишлаке на территории Узбекистана. Родители -двоюродные сибсы. Из 8 беременностей только двое здоровых детей. Три закончились выкидышами на середине срока, один мальчик умер в младенчестве (детально не обследован), двое последних детей - мальчик и девочка -больны. На момент обследования жива только девочка 15 лет, рост 89 см. Лицо старческое, с резко запавшими глазами. Выраженное помутнение роговиц. На лице грубый фотодерматоз с участками гиперпигментации. Тонус мышц несколько снижен. Интеллект заметно снижен, но девочка активная, проявляет интерес к окружающему, поведение адекватное обстановке. Речь очень невнятная. У ее недавно умершего в 17 лет брата были сходные симптомы. Похожие признаки описывались и у больных из семей дальних родственников (Ханнанова, 1986). Исследуемый нами случай относится к группе комплементации А (Плескач и др., 1996). В фибробластах С313Р не было обнаружено существенных различий в замедлении репликативного синтеза ДНК .. после гамма-облучения по сравнению с клетками здорового донора (ВагепГеМ е[ а!., 1995). К сожалению, в 1992 году, когда были начата работа по получению лимфобластоидных линий, этой больной уже не было в живых.

Клетки ХР2ЭР получены от больной Н. Больная родилась в 1955 году, в Новгородской области, в деревне, расположенной далеко от крупных дорог и

железнодорожных путей, которая может считаться географическим изолятором.Ее родители находятся в отдаленном родстве, фенотипически нормальны. Клинические симптомы являются классическими для пигментной ксеродермы: многочисленные ярко окрашенные веснушки, нарушение пигментации на теле, сухая кожа с резкими Рубцовыми изменениями. Практически полная слепота, появившаяся в результате двустороннего помутнения роговицы. В 1988 году больной была удалена щитовидная железа с развившейся опухолью. Она умерла в 1992 году в возрасте 37 лет от рака лимфатических узлов (вероятно, вторичного). В нашей лаборатории эта больная изучалась с 1968 года. При этом на клеточном уровне была обнаружена чувствительность как к ультрафиолетовому, так и гамма-облучению лимфоцитов периферической крови (Михельсон и Айказян., 1972). С помощью лаборатории профессора Боотсмы (Роттердам) для этой формы пигментной ксеродермы была установлена группа комплементации - С (Плескач и др., 1996). В клетках XP2SP были обнаружены повышенный уровень аберраций хромосом, как спонтанных, так и вызванных рентгеновским облучением, а также дефект репарации ДНК от гамма-индуцированных однонитевых разрывов (Михельсон и Томилин, 1979; Mikhetson, 1979). В фибробластах XP2SP показано также замедление репликативного синтеза ДНК после гамма-облучения, в отличие от клеток здорового донора (Barenfeld et а!., 1986; Баренфельд и др., 1994). Другая подобная больная пигментной ксеродермой с перекрестной чувствительностью к ренгеновскому излучению, обнаруженная позже в Англии, относилась к другой группе комплементации - G (Lehman et al., 1982). В 1992 году, незадолго до ее смерти, из лимфоцитов периферической крови больной XP2SP были получены лимфобластоидные линии (Наседкина и др., 1997).

Клетки PR3SP получены от больной М. Больная родилась в 1958 году в Армавире. Родители фенотипически здоровы. Прогерия взрослых (возможно, синдром Вернера) была диагностирована у нее з возрасте 17 лет. В возрасте 22 лет выглядела по меньшей мере на 40, на лице множественные морщины, мочки ушей сильно удлинены (это позволяет нам предполагать, что эта форма несколько отличается от классического синдрома Вернера). больная замужем, имеет двоих нормально развивающихся детей. Первичные фибробласты способны в культуре не более чем к 10-15 удвоениям (Михельсон и др., 1984). Кроме диплоидных фибробластов, из лимфоцитов этой больной получена лимфобластоидная клеточная линия.

Клетки АТ2ЭР получены от больного С. Мальчик 4 лет был обследован с подозрением на заболевание в связи с возможным усыновлением. Родился в Ленинграде. Сведений о родителях не имеется. Клинически диагностируется небольшая атаксия, на коже лица и рук многочисленные телеангиэктазии. В лимфоцитах показано наличие радиорезистентного синтеза ДНК (Хомасуридзе и др., 1991). Диплоидные фибробласты были получены для уточнения диагноза методами клеточной радиобиологии.

Клетки 5вР (лимфобластоидные) получены от здорового донора - женщины, относящейся к той же возрастной группе, что и больные ХР2ЭР и РР^ЗвР. Использованы в качестве контроля в опытах с лимфобластоидными линиями.

Получение диплоидных фибробластов. У пациента с помощью бритвы или специального экстрактора берется кусочек кожи с соединительнотканным слоем площадью не более 0.5 см2. Максимально измельчается с помощью бритвы или ножниц в бессывороточной среде. Переносится во флакон Карреля. Через 10-15 минут (когда маленькие кусочки кожи осядут) один край флакона приподнимается и фиксируется в таком положении, чтобы прикрепившиеся кусочки остались непокрытыми средой. Флакон помещают в С02—инкубатор. Через сутки флакон осторожно возвращают в горизонтальное положение и добавляют немного свежей среды с сывороткой. Инкубируют 2-4 недали, ожидая выход фибробластов из кожи на дно флакона. В дальнейшем культивируются обычным путем.

Получение лимфобластоидных линий методом трансформации с помощью вируса Эпштейн-Барра. Для трансформации используются лимфоциты периферической крови человека. У пациента из вены берут 15 мл крови, добавляют гепарин в количестве 20 ед/мл и разбавляют пробу двойным объемом фосфатного буфера. Центрифугируют в градиенте РюоП-Нураяие и дважды отмывают в культуральной среде ЯРМ1 1640 с 2% фетальной сыворотки. Для удаления эритроцитов клетки в течение 10 минут ресуспендируют в растворе, состоящем из 9 частей 0.83% ЫН4С1 и 1 части 2.06% триса (рН 7.2). После гемолиза лимфоцитов к суспензии клеток добавляют 5-кратный объем среды и центрифугируют 10 минут при скорости 1200 об/мин. Полученные лимфоциты подсчитывают и инкубируют 2-2.5 часа в среде, содержащей вирус Эпштейн-Барра. Культуру вируса получают из лини клеток зеленой мартышки В-95 и очищают ультрацентрифугированием. Число вирусных частиц определяют экспериментально. После инкубации лимфоциты дважды отмывают от содержащей вирус среды и переносят в ИРМ! 1640 с 10%

сыворотки и циклоспорином, который является селективным супрессором Т-лимфоцитов. Клетки рассевают в 96-луночную плату, по 300 ООО клеток на одну лунку, и инкубируют в течение 2-3 недель в С02-термостате. Этого срока достаточно для того, чтобы успешно трансформированные клетки дали активно растущий клон.

Клонирование клеток и изучение выживаемости при различных воздействиях. Диплоидные фибробласты растут на среде Р-10 или ОМЕМ с добавлением 10% фатальной сыворотки. Лимфобластоидные линии обычно ведут на специальной среде Р*РМ1 1640 с тем же количеством фетальной сыворотки. Для изучения эффективности клонирования фибробластов и их выживаемости после действия различных агентов клетки высевают на чашки Петри или флаконы Карреля в количестве 100-1 ООО клеток на флакон и культивируют в течение 2 недель с повышенным до 15-30% содержанием сыворотки. Через неделю инкубации среду меняют на свежую.

Получение липосом. Липосомы получают из смеси лицетина, холестерина и дицетилфосфата в пропорции 7:2:1. Смесь этих липидов переносится в колбу с округлым дном и растворяется в пятикратном объеме эфира (лицетин используется ампульный). Затем эфир вместе с возможными загрязнениями испаряется на роторном испарителе, а на дне колбы остается липидная пленка, которую растворяют в бессывороточной среде или в растворе Хенкса и добавляют равное количество эфира. Полученный раствор липидов обрабатывают ультразвуком в течение минуты с частотой 20 Мгц. Если озвучивание прошло успешно, то раствор перестает расслаиваться и выглядит однородным. Озвученную смесь медленно испаряют на роторном испарителе до тех пор, пока мы не увидим процесса обращения фаз - перехода геля в золь. Именно в этот момент необходимо добавить в раствор белок, для того, чтобы он оказался внутри образующихся липосом. Чтобы окончательно избавиться от эфира,раствор липосом нужно досушить на вакуумном испарителе. Полученные липосомы контролируют под микроскопом. Липосомы сохраняют свою устойчивость не более 15 часов при температуре +4 градуса, поэтому их желательно готовить непосредственно перед проведением опыта. Длительное хранение липосом возможно в жидком азоте. Липосомы могут быть использованы для трансф.екцию в клетки как белков, так и ДНК (в этом случае их приготовление немного модифицируется) и являются, по нашему мнению, наиболее щадящим и эффективным способом трансформации.

RecA белок получали как описан о у Коттерилла с соавт. (Cotterill et at., 1982).

Иммунологическое исследование RecA белка было осуществлено с помощью непрямой иммунофлюоресценции. Предварительно в лаборатории акад. Кордюма в Киевском институте молекулярной биологии и генетики были получены кроличьи лоликлональные антитела к RecA белку E.coli и меченные флюоресцеином-изотиоцианатом ослиные антитела к кроличьему глобулину.

Метод щелочного раскручивания ДНК с последующим разделением на колонках с гидроксилапатитом был описан Фридбергом и Ханавальтом в 1980 году (Friedberg and Hanavalt, 1980). Нами использован в модификации Анстрема и Эриксона 1981 года (Ahnstrom and Erixon , 1981). В основе метода лежит способность ДНК раскручиваться в щелочной среде,начиная с концов или мест разрывов. Предварительно помеченные 1кбк 14С-тимидином интактные или подвергнутые воздействию клетки после отмывки запивают 0.03М NaOH в 0.15М NaCI на 30 минут. Затем щелочь нейтрализуют 0.02М NaH2P04*H20 и пробы озвучивают ультразвуком в течение 10 с при 20 Мгц. Добавляют 2.5% SDS и разделяют однонитевую и двунитевую ДНК на колонках с гидроксилапатитом. Количество ДНК в пробе определяют на счетчике в специальном сцинцилляторе. Количество разрывов определяется по формуле -log(ds/(ds+ss)), где ds - количество радиоактивности во фракции двунитевой ДНК, a ss - во фракции однонитевой ДНК. Эта формула в общем виде была предложена Фридбергом и Ханавальтом (Friedberg and Hanavalt, 1980) ssb/109 = К log F(ds), где F(ds) = ds/(ds+ss), а К может быть от -6 до -12 в зависимости от условий эксперимента. В наших опытах условия были подобраны таким образом, что К= -10. Следовательно, по оси ординат на графиках указано количество однонитевых разрывов на 108 дапьтон ДНК, находящейся в пробе.

Облучение проводилось на гамма-источнике l37Cs с мощностью дозы 10.8 Гр в минуту, на льду (чтобы предотвратить немедленную репарацию разрывов).

Обработка клеток зпоксидами проводилась во флаконах Корреля в вытяжном шкафу в бессывороточной среде в течение часа. Предварительно эпоксиды были разведены в фосфатном буфере.

Этиленоксид и эпихлорогидрин были получены от фирмы Fluka (Швейцария), а пропиленоксид - от фирмы Merc (Германия).

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Репарация ДНК в клетках, полученных от больных с различными

наследственными заболеваниями после у-облучения и обработки алкилирующими агентами прямого действия - эпоксидами (этилоноксидом, пропиленоксидом и эпихлорогидрином)

Клетки от больных с различными наследственными нарушениями репарации ДНК являются удобными природными моделями для изучения этого процесса. Для многих заболеваний эти дефекты достаточно подробно изучены на молекулярном и генетическом уровнях. Эти сведения подробно изложены в литературном обзоре. В нашзй лаборатории имеется обширная коллекция клеточных культур, как выделенных нами самими штаммов диплоидных фиб-робластов кожи и лимфобластоидных клеточных линий из трансформированных лимфоцитов, так и полученных из других лабораторий, занимающихся сходной тематикой. Мы использовали только те клеточные штаммы, которые были получены в России. Больные подробно описаны в разделе "Материалы и методы". Нами были выбраны клеточные линии ХР2ЭР, С313Р, АТ25Р, РР^ЗБР и лимфобластоидные линии, полученные от больных ХР2БР(1) и РЯ35Р(1-). В качестве здорового донора использовались фибробласты \/Н-10 и лимфобластоидная линия 55Р(1_).

Исследования проводились в два этапа, сначала на лимфобластоидных клетках, затем попарно на диплоидных фибробластах ХР2БР с С31ЭР и РКЗЭР с АТ2ЭР. Таким же образом мы будем описывать представленные результаты.

При гамма-облучении клеток ХР2БР(1), РНЗБР(1) и 53Р(1.) мы наблюдаем образование однонитевых разрывов ДНК, количество которых возрастает пропорционально дозе облучения. При этом количество разрывов, образующихся в клетках ХР2ЭР(1.), существенно превышает количество разрывов, образующихся как в контрольных клетках, так и в клетках РЯЗЗР(1). Несмотря на такую разницу, воссоединение всех образовавшихся однонитевых разрывов происходит очень быстро и одновременно; почти все они исчезают через 30 минут после облучения, только количество разрывов, которое сохраняется через 30 минут в клетках ХР2БР(Ц незначительно, но достоверно превышает контрольный уровень. В клетках РНЗБР(1.) количество нерепарированных разрывов достоверно не отличается ни от количества разрывов, сохранившихся в ХР23Р(Ц, ни от собственного контрольного уровня, ни от количества разрывов в контрольной линии. Подобную разницу мы отмечаем только при репарации

после облучения в дозе 20 Гр. После облучения в дозе 25 Гр достоверных различий в репарации менаду клетками больных и здорового доноров не обнаруживается.

Подобную же динамику образования однонитевых разрывов мы наблюдаем в этих клетках после обработки их этиленоксидом. Количество разрывов возрастает в зависимости от дозы ЕЮ и соответствует результатам, ранее полученным на диплоидных фибробластах VH-10 (Nygren et at., 1994). При попытке исследовать репарацию в этих клетках после обработки ЕЮ мы столкнулись с непредвиденной реакцией. Количество однонитевых разрывов не только не уменьшалось за время инкубации, но даже несколько повысилось и сохранялось на этом уровне в течение суток. Количество разрывов в клетках PR3SP(L) держалось на более высоком уровне, чем в клетках XP2SP(L) и 5SP(L). Таким образом, лимфобластоидные клетки оказались неудачной моделью для изучения репарации ДНК после действия эпоксидов, так как при подобной постановке опыта мы ее практически не наблюдаем. Вероятно, это связано с повышенной чувствительностью именно лимфоцитов периферической крови или лимфобластоидных клеток по сравнению с диплоидными фибробластами. Сходные данные приводятся в литературе.

При исследовании диплоидных фибробластов XP2SP, CS1SP, AT2SP, PR3SP и VH-10 мы наблюдали достоверное снижение выживаемости после действия ионизирующей радиации в дозах 1-4 Гр во всех рассмотренных штаммах, полученных от больных, по сравнению с контролем. Выживаемость исследовали классическим методом подсчета колоний. Этот метод считается наиболее чувствительным среди используемых (Wollen et al., 1983). Наиболее сниженной, как этого и следовало ожидать, оказалась выживаемость клеток AT2SP. Несколько выше - выживаемости XP2SP, CS 1 SP и PR3SP. Данные представлены на рис.1 и 2.

Несмотря на большое снижение выживаемости AT2SP, она все же существенно выше, чем это обычно описано для AT (Cole and Arlett, 1994; Cox et al., 1978; Friedberg et al., 1979). При гамма-облучении в дозах от 5 до 25 Гр наблюдается четкая дозовая зависимость образования однонитевых разрывов ДНК в клетках всех исследованных штаммов, при этом частота этих разрывов в клетках больных XP2SP, CS1SP, AT2SP и PR3SP достоверно не повышена по сравнению с VH-10.

Доза облучения (Гр) Рис 1. Выживаемость клеток больных пигментной ксеродермой и синдромом Коккейна после гамма-облучения .

Дола облучения (Гр) Рис 2. Выживаемость клеток больных прогерией и атаксией - телеанппкташи после гамма - облучения.

Однако при исследовании репарации мы наблюдаем достаточно четкие различия в динамике этого процесса в разных штаммах. Клетки здорового донора \/Н-10 уже через 60 минут полностью освобождаются от однонитевых разрывов - их уровень в этих клетках возвращается к исходному и остается таким же в течение А часов, пока ведется наблюдение. Так же ведут себя клетки РИЗБР. В клетках СЭЧЭР закрытие однонитевых разрывов происходит медленнее, чем в контроле, только через 2 часа возвращаясь к нативным показателям.

Подобным же образом, но еще медленнее, репарация протекает в клетках АТ28Р - здесь возвращение количества однонитевых разрывов к исходному уровню и завершение репарации происходит только через 4 часа.

В клетках ХР2БР репарация по этому критерию является не только значительно замедленной, как у АТ2БР и С518Р, но и неполной. Через 60 минут количество однонитевых разрывов снижается в 2.5 раза и сохраняется на этом уровне все время последующего наблюдения: даже через 4 часа после

-1ь-

облучения процесс воссоединения однонитевых разрывов в клетках ХР2БР остается незавершенным и количество сохраняющихся разрывов в 4 раза пре-

Время репарации (мин)

Рис 3. Удаление однонитевых разрывов в клетках бальных пигментной ксеродермой и синдромом Коккейна после облучения в дозе 20 Гр.

При сравнении этих данных с полученными на лимфобластоидных клеточных линиях видно, что клетки РЯЗБР и РЯЗБР^) реагируют на гамма-облучение одинаково по критериям образования и ликвидации однонитевых разрывов, практически не отличаясь в обоих случаях от клеток здорового донора. Клетки ХР2ЭР и ХР23Р(1_) ведут себя несколько по-разному: диплоидные фибробласты оказались более чувствительными к радиации и в меньшей степени способными ликвидировать однонитевые разрывы ДНК. Возможно, это связано с трансформированностью лимфобластоидных клеток. С другой стороны, лимфоциты обычно более чувствительны к различным повреждающим воздействиям, чем диплоидные фибробласты. Повышенная чувствительность нетрансформированных лимфоцитов больной, от которой были получены линии ХР2БР и ХР2вР(1-), по критерию ликвидации однонитевых разрывов показана в нашей лаборатории (Михельсон и др., 1985)

Действие эпоксидов исследовали на тех же клетках. После обработки их этиленоксидом (ЕЮ) в концентрациях от 2.5 до 15 мМ в течение 1 часа выживаемость клеток различных штаммов существенно различалась. От-

носительное количество образовавшихся колоний С513Р практически совпало с количеством образовавшихся колоний клеток здорового донора \/Н-10. Клетки же ХР2ЭР были существенно чувствительнее по этому критерию, на рис.4 это отчетливо видно.

Еще большая чувствительность наблюдалась у штаммов РР^ЗБР и АТ2БР (рис.5): клетки РЯЗЭР продемонстрировали на порядок более высокую чувствительность к ЕЮ по этому критерию, чем клетки здорового донора \Л-М0, а клетки АТ2ЭР при концентрации 5 и 10 мМ/час показали практически те же результаты, что и РЯЗБР, а после обработки их ЕЮ в концентрации 15 мМ вообще оказались неспособны образовать ни одной колонии.

При обработке клеток ЕЮ в концентрациях от 5 до 30 мМ/час наблюдается прямая зависимость количества образующихся однонитевых разрывов от дозы эпоксида во всех исследованных штаммах клеток, как это уже было ранее показано Нигреном с соавторами для клеток \/Н-10 (Мудгеп вХ а1., 1994). При этом не выявлено существенных различий по количеству образовавшихся разрывов между здоровым и больными донорами. Достоверных различий между количеством разрывов после обработки клеток ХР2БР, С31ЭР и \/Н-10 ЕЮ в концентрации 25 и 30 мМ/час, нет. При изучении разрывов в клетках РКЗБР и АТ25Р мы эти концентрации уже не использовали. Для исследования репарации нами были выбраны меньшие дозы - 5мМ/час, 7.5мМ/час и ЮмМ/час. При обработке клеток ЕЮ в концентрациях 5 мМ и 7.5 мМ полной ликвидации образовавшихся разрывов в клетках ХР2БР в течение 20 часов не происходит. Хотя процесс репарации начинается уже через 2 часа после обработки, но оставшееся количество разрывов втрое превышает нативный уровень.

В клетках С51вР и Х/Н-10 после их обработки ЕЮ в концентрации 5 мМ/час процесс репарации начинается через 2 часа после воздействия, идет параллельно и завершается - в отличие от ХР2БР - через 20 часов. После обработки ЕЮ в концентрации 7.5 мМ/час ликвидация однонитевых разрывов во всех этих клеточных штаммах также проходит одновременно и более активно, чем в штамме ХР2ЭР, но через 20 часов не завершается, останавливаясь почти на том же уровне, как и у ХР2ЭР.

Таким образом, способность освобождаться от однонитевых разрывов ДНК в клетках зависит от дозы' эпоксида, и их относительная чувствительность по этому критерию соответствует относительной чувствительности по критерию выживаемости.

Рис 4. Выживаемость клеток бальных пигментной Рис 5. Выживаемость клеток больных

ксеродермой н синдромом Кохкейна после обработки прогериен и атаксией - телеангюктиен после этиленоксидом. обработки эткленоксидом.

Для штаммов АТ2БР и РИЗБР это наблюдение сохраняется. Их способность ликвидировать однонитевые разрывы после обработки ЕЮ в концентрации 5 мМ/час еще ниже (рис. 6). При этом через 20 часов количество сохранившихся однонитевых разрывов в штамме АТ2ЭР соответствует таковому в штамме ХР2БР, а в клетках РР?ЗЭР практически сохраняется на том же уровне, что и сразу после обработки. К тому же в клетках РКЗБР через 2 часа после обработки количество однонитевых разрывов не только не уменьшается, а наоборот - возрастает. То есть какие-то латентные повреждения становятся настоящими разрывами. В клетках АТ2БР в течение первых 2 часов изменения количества разрывов не происходит и их ликвидация начинается позже. После обработки этих клеток ЕЮ в концентрации 10 мМ/час различия динамики репарационного процеса в клетках АТ2БР и РКЗЭР несколько сглаживаются. Количество разрывов, образовавшихся в штамме РЯЗЗР сразу после обработки 10 Мм ЕЮ, несколько меньше, чем в штамме АТ2ЭР, но их количество через 2 часа после инкубации несколько возрастает, хотя и не так резко, как в случае репарации после обработки 5Мм ЕЮ, В штамме АТ2БР через 2 часа количество однонитевых разрывов уже начинает понемногу сокращаться. Через 4 часа начинает уменьшаться количество разрывов и в клетках РРЗБР. Но и через 20 часов репарация не завершается,

причем а клетках РР^ЗБР количество однонитевых разрывов превышает контрольный уровень в 15 раз, а в клетках АТ2БР приблизительно в 10 раз. Данные, представленные на рис. 6 и 7, показывают, что с увеличением

Время репарации (час)

Рис 6 и 7. Удаление однонитевых разрывов в клетках больных прогерией и атаксией-телеангизетазией после обработки 5 мМ/час (вверху) и 10 мМ/час (внизу) этиленоксидом.

концентрации этиленоксида большинство повреждений проявляется сразу, причем в более чувствительном штамме - в данном случае РЯЗБР - какое-то количество повреждений все же остается латентным, проявляясь только через 2 часа после обработки, но и в этом случае с увеличением концентрации ЕЮ количество латентных повреждений уменьшается. Хотелось бы подчеркнуть обнаруженную разницу в процессах репарации после обработки ЕЮ в диплоидных фибробластах РЯЗЭР и ХР2БР и лимфобластоидных клеточных линиях, полученных от тех же больных. Образовавшееся сразу после обработки клеток количество однонитевых разрывов практически одинаково в обоих случаях, но репарации ДНК в лимфобластоидных клетках не только не

происходит за 24 часа, но нет даже намека на какую-либо тенденцию к ней Количество разрывов в РЯЗЗР(1_) за это время возрастает вдвое, а в клетках ХР23Р(Ц на 30 процентов. Таким образом, способность лимфобластоидных клеток к ликвидации однонитевых разрывов ДНК, вызванных этиленоксидом существенно ниже чем диплоидных фибробластов, полученных от тех же больных.

Действие пропиленоксида и эпихлорогидрина гораздо менее изучено, чем действие этиленоксида. При изучении разрывов, образующихся в ДНК после действия этих агентов, было показано, что эпихлорогидрин на порядок более токсичен, чем этиленоксид и пропиленоксид (Ко1тап е* а!., 1997). Все изученные нами диплоидные фибробласты, полученные от больных, показывают гораздо более высокую чувствительность к этим агентам по критерию выживаемости, чем клетки здорового донора. Наиболее чувствительными оказываются, как и в случае с этиленоксидом, клетки АТ28Р, выживаемость которых после обработки РО в дозе 20 мМ/час не достигает и 1% от контрольной, тогда как в клетках здорового донора эта цифра - 23%. Следующим по чувствительности является штамм РИЗвР, способный образовать после обработки этой же дозой около 3% колоний. Клетки ХР2ЭР и СЭ18Р также показывают высокую чувствительность к этому агенту, не менее, чем вдвое большую по сравнению с клетками здорового донора. Количество однонитевых разрывов, образующихся в этих клетках после их обработки пропиленоксидом, показывает зависимость от дозы, при этом после обработки в дозах менее 20 мМ/час это количество очень близко во всех изученных штаммах, хотя в ХР2БР и С81БР оно достоверно несколько выше, чем в трех других. Но после обработки клеток в дозе 20 мМ/час количество разрывов, образовавшихся в штаммах РИЗвР и АТ2ЭР, достоверно ниже, чем в штаммах ХР2ЭР, СЭ1ЭР и УН-Ю. Подобные различия могут быть просто индивидуальными в данных исследованиях, а могут свидетельствовать об образовании в клетках РЯЗБР и АТ23Р при большой дозе мутагена преимущественно иных повре>вдений, чем разрывы.

Исследование динамики ликвидации однонитевых разрывов показывает, что наиболее чувствительным по этому критерию среди изученных штаммов является С513Р. На рис. 8 отчетливо видно, что после обработки клеток в дозе 5мМ/час кривые располагаются с достоверными различиями одна от другой, выше всех идет С518Р, через 20 часов превышая контрольный уровень почти в 4 раза. Клетки ХР2ЭР также не достигают к этому времени контрольного уровня разрывов, но превышают его только вдвое. После обработки клеток 10 мМ РО в

течение часа, клетки здорового донора также сохраняют через 20 часов несколько больше разрывов, чем было до обработки.

Время репарации (час)

Рис. 8 и 9. Удаление однонитевых разрывов в клетках больных пигментной ксеродермы и синдромом Кокквйна после обработки 5 мМ/час (вверху) и 10 мМ/час (внизу) пропипеноксидом.

На рис. 9 видно, что клетки больных ХР2БР и СБ15Р и при этой дозе существенно чувствительнее по этому критерию, чем клетки здорового донора, но при этой дозе реакция ХР2БР и СЭ15Р совпадают, то есть репарационные механизмы в клетках ХР2БР уже не способны справляться лучше, чем при меньшей дозе.

В клетках АТ28Р и РЯЗвР картина такая же, как и в клетках здорового донора, и достоверных различий между ними не обнаружено. Отдельно хотелось бы обратить внимание на то, что в клетках здорового донора \Ж-10 после обработки их пропиленоксидом в дозе 10 мМ/час мы наблюдали

некоторую задержку репарации в течение первых 4 часов после обработки, хотя на конечный результат это влияния не оказало. Сопоставляя эти данные с данными по выживаемости, можно предположить, что репарация в клетках здорового донора идет несколько медленнее на первом этапе (задержка репаративного синтеза в нормальных клетках), но зато более точно, что позволяет большему числу клеток выжить и образовать колонии.

Все наши данные подтверждают представление о том, что ликвидация однонитевых разрывов после воздействия эпоксидов занимает не менее 20 часов и идет гораздо медленнее, чем после гамма-облучения, когда примерно половина разрывов бывает отрепарирована уже в течение первых 10 минут (Kysela et al., 1993; Weibezachn and Coquerelle, 1981).

Эпихпорогидрин - наиболее токсичный эпоксид из изученных нами. Дозы, которые мы выбрали для исследований, на порядок ниже, чем те, которые были использованы при работе с этиленоксидом и пропиленоксидом (Kolman et al., 1997). Все изученные нами штаммы клеток больных проявили повышенную чувствительность к эпихлорогидрину по критерию выживаемости по сравнению с клетками здорового донора. Но между собой они также имели достоверные различия. Самыми чувствительными оказались клетки штамма AT2SP, выживаемость которых после обработки их ЕСН в дозе 2 мМ/час была в 10 раз ниже, чем в клетках здорового донора. Клетки PR3SP оказались чувствительнее контрольных более, чем в 3 раза. Клетки, полученные от пациента CS1SP, показали вдвое большую чувствительность, чем клетки здорового донора. Наименее чувствительными к эпихлогидрину были клетки XP2SP, которые после обработки их ЕСН в дозе 0.5 мМ/час оказались способны образовать относительно тот же процент колоний, что и клетки VH-10. Только при больших дозах их чувствительность была выше контрольной, при дозе 1 мМ/час была еще несколько ниже, а при дозе 2 мМ/час совпадала с таковой CS1SP. Количество однонитевых разрывов, образующихся в клетках всех изученных штаммов, имеет выраженную зависимость от дозы эпоксида, что, впрочем, было характерно для всех изученных нами мутагенов. При этом количество однонитевых разрывов, образующихся в клетках XP2SP и CS1SP достоверно выше, чем в клетках здорового донора. В клетках PR3SP и AT2SP для доз 0.5 и 1 мМ/час различия не наблюдаются, а при дозе 2мМ/час однонитевых разрывов даже несколько меньше, чем в контроле. Для изучения репарации однонитевых разрывов нами была выбрана доза 1 мМ/час. При сравнении картины освобождения ДНК клеток от этих разрывов видно, что только клетки штамма

С81БР после 20 часоа инкубации сохраняют вдвое большее количество нерепарированных однонитевых разрывов ДНК по сравнению с интактным уровнем. Во всех остальных штаммах - ХР2БР, АТ28Р, РР^ЗЭР - через 20 часов уровень разрывов снижается практически до контрольного. Таким образом, клетки С51вР оказываются наиболее чувствительными по этому критерию к действию эпихлорогидрина, как и к действию пропиленоксида.

Из полученных результатов можно сделать следующие выводы:

1. Подтверждена повышенная чувствительность штамма ХР23Р и лимфобластоидной линии ХР23Р(Ц к действию гамма-облучения.

2. Показано, что эта чувствительность не зависит от иммортализации.

3. Выявлена повышенная чувствительность ХР2ЭР к действию эпоксидов по критерию выживаемости.

4. Выявлена повышенная чувствительность штамма СБЧвР к гамма-облучению и действию эпоксидов. Эта чувствительность особенно выражена по сравнению с другими штаммами по критерию ликвидации разрывов после действия пропиленоксида и эпихлорогидрина. Таким образом показана пониженная способность клеток этого штамма к репарации ДНК от однонитевых разрывов.

5. Показано, что штамм АТ2вР относится к группе, описанной в литературе как АТ-варизнт, по критерию выживаемости и репарации ДНК от однонитевых разрывов последействия гамма-облучения и эпоксидов.

6. Подтверждена предполагавшаяся ранее чувствительность клеток штамма РЯЗБР к гамма-облучению и действию гаммамиметиков-эпоксидов по критерию выживаемости.

7. Показана повышенная чувствительность клеток РЯЗЭР и РИЗБР^) к действию этиленоксида по критерию выживаемости (РЯЗЗР), образования однонитевых разрывов (Р(ЧЗЗР(1-)) и их ликвидации. Эта чувствительность не зависит от иммортализации клеток, то есть не связана с "преждевременным старением".

Участие рекомбиназ в процессах репарации после гамма-облучения.

Для более детального изучения молекулярных механизмов ликвидации двунитевых разрывов ДНК мы исследовали возможную модификацию репарационнного ответа клеток человека с помощью рекомбиназ. Было изучено влияние на выживаемость клеток после гамма-облучения RecA белка Escherihia coli, активно участвующего в процессах репарации и рекомбинации данного микроорганизма.

В этих опытах были использованы клетки HeLa и ингибиторы репарации кофеин и 3-аминобензамид. Оба вещества сами по себе в используемых нами количествах для клеток не токсичны. Также нетоксичны сами по себе липосомы и белки - RecA E.coli и бычий сывороточный альбумин, взятый для контроля. Самым сложным моментом было введение полученного и очищенного в соответствии с ранее описанными методами (Weinstock et al., 1979; Cotterill et al., 1982) RecA белка в ядра клеток. Белок помещали в специально приготовленные липосомы на стадии их формирования, суспензию липосом добавляли в ростовую среду во флаконы с растущими клетками. Методом непрямой иммунофлюоресценции нами было показано, что белок, помещенный в липосомы, проникает в цитоплазму и ядра клеток. Иммунофлюоресценцию мы смотрели, фиксируя клетки через 24 часа после их обработки нагруженными белком липосомами. Светимость цитоплазмы и ядер по сравнению с контролем резко повышена. В ядрах наблюдаются ярко сверкающие ядрышки и нити хроматина, то есть RecA белок обнаруживается в первую очередь ассоциированным с хроматином. Наиболее ярко флюоресцировали ядра клеток, находящихся на ранней стадии интерфазы. Флюоресценция прогрессивно снижается с переходом клеток в профазу митоза. Одновременно с этим резко возрастает интенсивность флюоресценции цитоплазмы. Это позволяет нам предположить, что RecA белок избирательно активно связывается с хроматином и может как-то участвовать в его функционировании. Подобные же результаты были получены группой сотрудников Киевского института молекулярной биологии и генетики (совместно с которыми проводилась данная работа) при введении в клетки HeLa плазмиды, содержащей клонированный поп-норазмерный ген гесА Е. coli под собственным промотором (Шпилевая и др., 1991). RecA белок начинает синтезироваться в течение суток после ведения плазмиды и также обнаруживается ассоциированным с хроматином.

При введении ЯесА белка с помощью липосом в обработанные ингибиторами репарации клетки НеЬа в течение 24 часов с их последущим гамма-облучением мы наблюдали значительное восстановление выживаемости облученных клеток по сравнению с таковой после совместного действия ингибиторов и облучения. Этот результат сохранялся и в том случае, если обработка кофеином проводилась после облучения в течение 8 часов. Результаты приведены на рис.10._

Доза облучения (Гр)

Рис. Ю.Влиякие на выживаемость гамма-облученных клеток Не La обработки их ингибиторами репарации ДНК ЗАБ (6мМ) - А, н кофеином (5мМ)-В в течение 24 час. до облучения и введения в них ЯесА-белка Е. coli,

!. -Контроль,

К. - Обработка ингибитором.

III. - Обработка ингибитором и RecA-белком в липосомах,

На этом рисунке отчетливо видно, что выживаемость клеток HeLa, обработанных ингибиторами репарации кофеином или 3-аминобензамидом и облученных в присутствии RecA белка, введенного с помощью липосом, приближается к выживаемости клеток, облученных бездействия ингибиторов, то есть в клетках HeLa в присутствии экзогенного RecA белка восстанавливается подавленная ингибиторами репарация ДНК. Причем этот эффект сильнее выражен в клетках, обработанных кофеином, чем в клетках, обработанных 3-аминобензамидом.

Из результатов этой главы можно сделать следующие выводы:

1. В процессы репарации ДНК вовлечены рекомбиназы, причем они принимают участие в репарации и однонитевых,и двунитевых разрывов ДНК

2. Подавленная ингибиторами репарация ДНК может быть восстановлена введением экзогенной рекомбиназы - RecA белка E.coli.

3. Эффект восстановления подавленной репарации сильнее при использовании кофеина, чем 3-аминобензамида. Это связано с тем, что кофеин подавляет как репарацию двунитевых, так и однонитевых разрывов ДНК, а 3-аминобензамид - только однонитевых.

4. Рекомбиназы крайне эволюционно консервативны, и этим объясняется то, что белок, полученный из бактерии, способен выполнять сходную функцию в клетках человека.

Роль информационного состояния хроматина в процессах репарации ДНК

поело гамма-облучения.

Для репарации ДНК в клетках человека также очень важно ее функциональное состояние в момент повреждающего воздействия. В опытах, проведенных на человеческих диплоидных фибробластах УН-Ю, было показано, что при гамма-облучениии клеток в малых дозах (5сГр) наблюдается некоторое изменение вязкости лизатов клеток. Эта вязкость прямо зависит от конформационного состояния хроматина, в свою очередь определяемого молекулярным весом ДНК и количеством связанных с ней белков. Этот параметр измеряется с помощью сверхчувствительного эластовискозиметра. сделанного в России по специальной разработке (Ве1ауеу е1 а!., 1992, 1993). Наиболее выраженными изменения вязкости ДНК были через 40 минут после облучения дозой 5сГр. Таким образом, нами было выбрано время инкубации меноду малой и большой дозами облучения.

Для того, чтобы максимально сократить время облучения, нами были использованы два источника с мощностью дозы 0.64Гр/мин и 11Гр/мин, то есть различающиеся в 17 раз. Нами было показано, что выживаемость клеток \/Н-10 зависит от мощности дозы при облучении. Чем ниже мощность дозы, тем

больше относительное количество выживших клеток. В опытах с предварительным облучением клеток в малой дозе мы выбрали дозу 2сГр как еще более убедительную, чем бсГр. При исследовании выживаемости клеток, облученных дважды, мы не наблюдали какой-либо однозначной зависимости реакции клеток от сенсибилизирующего облучения. В контроле (то есть клетки были облучены лишь в малой дозе 2сГр) эффективность клонирования на 15% выше, чем в интактных клетках. Для дозы 0.5 Гр предварительное облучение является также адаптивным, то есть повышает выживаемость клеток почти на 15%. Также адаптивный эффект мы наблюдаем при последующем облучении клеток \Ж-10 дозой 2.5 Гр (20%). После облучения дозой 2Гр эффект, сохраняя свой знак, резко возрастает и достигает величины 51%. Для дозы 1Гр этот эффект является противоположным, усиливающим последующее действие радиации на 10%.

Для доз 1.5Гр и ЗГр достоверного изменения выживаемости не обнаружено.

ч-■-I-1-1---1-'-1-■-1—■—г

/К

/.....У

06^-Г-,-1-,-,-.-,-,-,-,-,-■----Г-

6 .5 1 1.5 г 2.5 3

Доза облучения (Гр)

Рис. 11. Эффект предварительного облучения клеток УН- ¡0 в дозе 2 сГр на их выживаемость после облучения большими дозами.

На рис. 11 показано относительное изменение выживаемости клеток, предварительно облученных одной и той же малой дозой (2сГр), а затем -разными большими дозами, в зависимости от величины второй дозы. При однократном гамма-облучении клеток большой дозой мы наблюдаем эффект

изменения вязкости, зависящий от дозы. Вязкость лизатов клеток, как и выживаемость после подобного комбинированного гамма-облучения, меняется неоднозначно.

Процессы относительного изменения как вязкости лизатов, так и выживаемости клеток носят циклический характер, но не всегда согласуются друг с другом (Ве1ауеу е1 а!., 1996). Эти данные были повторены в трех сериях независимых опытов.

Эти результаты позволяют сделать следующие выводы:

1. Выживаемость диплоидных фибробластов человека зависит от мощности дозы облучения. При более высокой мощности дозы процент выживших и образовавших колонии клеток ниже.

2. Малые дозы облучения, такие как 1-5сГр, меняют вязкость лизатов клеток, которая прямо связана с информационным состоянием хроматина.

3. При предварительном облучении в малой дозе с последующим (в момент наибольшего конформационного изменения) облучением в обычных дозах мы наблюдаем изменение выживаемости клеток по сравнению с теми, которые не были подвергнуты предварительному облучению.

4. Эти изменения носят циклический характер и не могут быть однозначно объяснены сенсибилизирующим или адаптивным влиянием малой дозы.

-2У-

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

1. Показана повышенная чувствительность линии XP2SP к радиомимети-кам - эпоксидам и подтверждена повышенная чувствительность к ионизирующей радиации по критериям выживаемости и ликвидации однонитевых разрывов ДНК.

2. Показана повышенная чувствительность линии CS1SP к ионизирующему облучению и действию эпоксидов, особенно пропиленоксиду, что отличает ее от других линий.

3. Показана пониженная выживаемость клеток линии PR3SP при действии ионизирующей радиации и эпоксидов. Особенно резко повышена чувствительность клеток к этиленоксиду, в первую очередь по критерию ликвидации однонитевых разрывов ДНК. В то же время репарация ДНК от однонитевых разрывов после гамма-облучения не нарушена.

4. Показана повышенная чувствительность линии AT2SP к действию ал-килирующих агентов • эпоксидов, особенно этиленоксида.

5. Показано, что по критериям выживаемости и ликвидации однонитевых разрывов ДНК после ионизирующего облучения линия AT2SP относится к группе АТ-вариант.

6. Лимфобластоидные линии, полученные от тех же больных, что и диплоидные фибробласты, более чувствительны к действию повреждающих агентов.

7. Пониженная репарация ДНК в клетках человека после гамма-облучения может быть скорректирована введением экзогенной рекомбиназы -RecA белка Escherihia coli.

8. Процесс репарации ДНК после гамма-облучения зависит от того, какова конформация хроматина в момент облучения, причем эта зависимость носит циклический характер.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Спивак И.М., Костецкий И.Е, Шпилевая С.П., Кордюм В.А., Жестяников В.Д. 1991. Восстановление RecA белком Escherichia coli выживаемости у-облученных клеток HeLa сниженной ингибиторами репарации ДНК кофеином и 3-аминобензамидом. Цитология. 33:103-109.

2. Шпилевая С.П., Костецкий И.Е., Столяр Т.В., Лихачева Л.И., Жарова Л.1\, Спивак И.М., Жестяников В.Д., Кордюм ВЛ., Иродов ДМ 1991. Взаимодействие RecA белка с хроматином ядер (цитологический аспект). Биополимеры и клетка. 7:54-59.

3 Spivak I. М., Kosfetsky I.E., Shpilevoya S.P., Kordyum V.A., Zhestyanikov У.D. Caffeine-induced reduction of survival of y-irradiated HeLa cells and the reversal of the caffeine effect by Escherichia coli RecA protein. 1991. Mutat. Res. 246:103107.

4. Belayev I. Ya., Spivak I. M., Kolman A., Harms-Ringdahl M. 1996.Relatioship between radiation induced adaptive response in human fibroblasts and changes in chromatin conformation. Mutat. Res. 358:223-230.

5. Спивак И. M., Шескач H.M., Михельсон B.M., Боотсма Д.. Кольлшн Л.Э. 1997. Пониженная выживаемость и дефект репарации ДНК в клетках больных пигментной ксеродермой и синдромом Коккейна при действии лучевых и химических мута!енов. Цитология. 39:420-434.

6. Наседкина Т. В., Кузмимова А.Е., Сурков С.А., Плескач //.М.. Прокофьева В.К., Спивак И.М., Михельсон В.М., Полетаев А.И. 1997. Получение и анализ лимфобластоидных клеточных линий от больных пигментной ксеродермой и прогерией. Цитология. 39:809-821.

7. Kolman A., Spivak /., ¡\aslund Af., Duiinsha M. and Cedervall В. 1997 Propylene Oxide and Epichlorohydrin induce DNA strand Breaks in huimn diploid fibioblasti, Enviroment. Mol. Mutagen. 30:40-46.

8. Спивак И.М., Хомасурчдле М.М. 1998. Чувствительность клеток больных атаксией-телеангиэктазией к действию лучевых и химических мутагенов. Цитология.

9. Спивак ИМ. 1998. Генетические заболевания с первичными и вторичными дефектами репарации ДНК. Цитология,

Ю. Spivak I.M., Nasedkina Т. И, Prokofieva V.V., Plekach А'. М., Polesskaya A.N., Surkov S.A., Mikhelson V.M., Poletaev A.I. 1993. Unusual forms of Xeroderma pigmentosum in Russia. 17 International Congress of Genetics, Vol. of Abstracts. Birmingam. (N. 37) p 202.

1 ^.Михельсон B.M., Наседкина T.B., Плескан H.M., Спивак И.М., Сурков С.А., Полетаев А.И. 1994. Стабильные лимфобластоидные клеточные линии от больных редкими наследственными заболеваниями человека. Генетика. Том 30, приложение.Материалы 1-го съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС) стр.102.

12. Nasedkina Т., Penyaeva А„ Spivak !., Procofieva f., Pleskash A'., Surkov S., Mikhelson V., Poletaev A. 1994. UV-sensitivity of lymphoblastoid cell line from tho patients with Xeroderma pigmentosum, studied by means of flow cytometry Analit Cell. Pathol., v.6, N.3, p.189.

13 .Spivak L, Mikhelson V. M. and Kol man A. 1995. Studies of DNA strand breaks and their repair induced by carcinogenic epoxides in human fibroblasts with deficient repair capacities. XII Scandinavian Workshop on In Vitro Toxicology. 21-24.9 Tampere, Finland. Abstracts, p. 101.

14 Mikhelson V.M., Procofieva V.V., Pleskash N.M., Spivak l.M. 1996. Increased sensitivity of ceils and DNA from patients with special form of inherited progeiia to ionizing radiation, brazilian J. of Genet., v. 19, N.2 - suppl. p.175. (Program and abstracts of 9th international Congress of human Genetics, 13-23 august 1996, Rio de Janeiro, Brazil).

Ошсчитипо и типографии ПИЯФ ¡'АН 18ÍÍ350, Гатчина Лсшпи-радснои «Пл., Орлова роща Зак. 385, тир. 100, уч -тл.л. 1,2; 10.IX. ¡998 г.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Спивак, Ирина Михайловна, Санкт-Петербург

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи УДК 577.346.616-056.7

СПИВАК Ирина Михайловна

ДЕЙСТВИЕ АЛКИЛИРУЮЩИХ АГЕНТОВ И ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА С НАСЛЕДСТВЕННЫМИ НАРУШЕНИЯМИ РЕПАРАЦИИ ДНК

03.00.25 - клеточная биология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители.

доктор.биологических, наук., проф. В.М.Михельсон, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Ph.D., доцент А.Э.Кольман, Стокгольмский Университет, Швеция.

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 4

Глава 1. Обзор литературы. Генетические заболевания 11

с первичными и вторичными дефектами репарации ДНК

1.1. Эксцизионная репарация нуклеотидов 12

1.2 .Пигментная ксеродерма 15

1.3. Трихотио дистрофия 3 О

1.4. Синдром Коккейна 37 1.5 .Репарация двунитевых разрывов ДНК 48

1.6.Атаксия-телеангиэктазия 58

1.7.Анемия Фанкони 80

1.8. Синдром Блюма 8 5

1.9.Прогерии 92

1.9.1.Синдром Вернера 93

1.9.2.Синдром Хатчинсона-Гилфорда 97 Глава 2. Материалы и методы. 101

2.1 .Клеточные культуры 101

2.2 .Получение диплоидных фибробластов 104

2.3 .Получение лимфобластоидных линий 104

2.4.Ведение клеток, их клонирование и изучение выжи- 105 ваемости

2.5. Получение липосом 105

2.6. Получение RecA-белка 106

2.7. Иммунологическое исследование ЯесА-белка 106

2.8. Метод щелочного раскручивания ДНК с последую- 107 щим разделением на колонках с гидроксилапатитом

2.9 Повреждающие воздействия на клетки 108

2.10. Статистическая обработка результатов. 108

Глава 3. Результаты и обсуждение 110

3.1. Репарация ДНК в клеточных штаммах, полученных 112

от больных с различными наследственными заболеваниями после гамма-облучения и обработки ал котирующими агентами прямого действия - эпоксидами (этиле-ноксидом, пропиленоксидом и эпихлорогидрином)

3.2. Участие рекомбиназ в процессах репарации после 167 гамма-облучения.

3.3. Роль конформационного сосотояния хроматина в 178 процессах репарации ДНК после гамма-облучения.

Выводы 187

Заключение 189

Литература 190

ВВЕДЕНИЕ

Изучение механизмов репарации ДНК представляет несомненный интерес для клеточной биологии. Только нормальное функционирование этих репарирующих систем обеспечивает устойчивость клеток к облучению и действию химических агентов (Жестяников, 1979), стабилизирует генетический аппарат клетки при его нормальном функционировании - репликации и рекомбинации, то есть способствует поддержанию генетической стабильности клетки и обеспечению ее жизнедеятельности. Повреждения, возникшие в структуре ДНК и не подвергшиеся процессу репарации, неизбежно приводят к нарушению в других системах клетки, для которых ДНК служит источником и хранителем информации.

Одним из перспективных подходов к изучению репарационных процессов в ДНК является исследование мутантов с нарушениями тех или иных этапов репарации - процесса достаточно сложного и многообразного, к тому же неравномерно изученного. Если основные генетические механизмы эксцизионной репарации ДНК уже поняты (Sanear, 1996), то процессы восстановления двунитевых разрывов и шире - репарации повреждений после гамма-облучения - остаются недостаточно ясными. Таким образом, изучение мутантов с нарушениями процессов репарации ДНК от повреждений после гамма-облучения, особенно у человека, открывает перспективы не только для расшифровки механизмов репарации ДНК в клетках человека, что является главной задачей этого исследования, но и помогает пониманию генетических основ канцерогенеза и старения. Это также важно для выяснения роли репарации ДНК в нормальной жизнедеятельности клетки.

Сейчас существует достаточно большое количество клеточных штаммов человека, для которых описана их повышенная

чувствительность к ионизирующему облучению и радиомиметикам (Lehmann, 1996; Zdzienicka, 1995). Именно сравнительное их изучение позволило в последнее время достичь значительного прогресса в этой области. В коллекции нашей лаборатории находится некоторое количество подобных штаммов, и подробное их описание и введение в международный научный обиход представляется нам необходимым.

Эпоксиды являются алкилирующими агентами прямого действия, мутагенный эффект которых сильно варьирует в зависимости от объекта. Обширная сводка сравнительной токсичности различных эпоксидов была сделана Эренбергом и Хусейном еще в 1981 году (Ehrenberg and Hussain, 1981) и Гири в 1992 (Giri, 1992). Наиболее изученным из эпоксидов является этиленоксид (ЕЮ), его действие подробно описано в обзоре Деларко (Dellarco et al., 1990). Этиленоксид широко используется в химической промышленности и известен как агент, активно загрязняющий окружающую среду и возможный канцероген (см. обзоры у Kolman et al., 1986; Florak and Zielhius, 1990). В статье Нигрена с соавторами (Nygren et al., 1994) детально описано образование разрывов под действием этиленоксида в нормальных человеческих диплоидных фибробластах при использовании различных методов. Пропиленоксид (РО) и эпихлорогидрин (ЕСН) являются производными этиленоксида и, как и этиленоксид, широко используются в химической промышленности (подробный обзор см. Kolman and Dusinska, 1995). Известно, что ЕЮ способен вызывать мутации в ГГФРТ-локусе в нормальных фибробластах человека при небольших дозах -

2.5-10 мМ/час (Kolman et al., 1992). Изучение действия эпоксидов на большой панели клеточных линий, как диплоидных неиммортализованных фибробластов, так и лимфобластоидных,

имеет принципиальное значение для углубленного исследования механизмов их действия на клеточном уровне.

Для более глубокого изучения механизмов и белков, вовлеченных в репарацию ДНК после гамма-облучения были предприняты попытки влиять на репарационный ответ с помощью введения экзогенной рекомбиназы и предварительного изменения конформации хроматина облучением в малой дозе (1-5сГр).

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

¡.Дальнейшее изучение линии XP2SP, двойная чувствительность которой к УФ- и гамма-облучению была описана Михельсоном (Михельсон, 1981) для уточнения ее чувствительности не только к гамма-облучению, но и к радиомиметикам.

2.Исследование репарации после гамма-облучения и действия гаммамиметиков в клетках CS1SP, взятых от больной с синдромом Коккейна, так как данные о радио чувствительности на клеточном уровне при этом заболевании достаточно противоречивы.

3. Атаксия-телеангиэктазия - заболевание достаточно изученное и характеризующееся на клеточном уровне повышенной радио

I

чувствительностью (Jorgensen and Shiloh, 1996). Интересным является каждый отдельный описанный случай, так как клетки могут различаться по своей чувствительности. Таким образом, для уточнения особенностей именно нашего случая - AT2SP - было необходимо провести исследование чувствительности клеток этого штамма не только к гамма-облучению, но и к различным гамма-миметикам.

4.Подробное изучение чувствительности клеточного штамма PR3SP к гамма-облучению и действию радиомиметиков, так как влияние подобных агентов на репарцию в клетках больных прогерией изучено недостаточно. Было бы желательно уточнить,

относится ли наша больная прогерией к синдрому Вернера, или это какая-либо другая форма прогерии взрослых.

5.Изучение влияние иммортализации на репарацию ДНК от однонитевых разрывов, так как для двух больных - пигментной ксеродермой и прогерией взрослых - нами были получены лимфобластоидные клеточные линии, иммортализованные вирусом Эпштейн-Барра (Михельсон и др., 1993; Наседкина и др., 1997), которые мы использовали для сравнительного изучения репарации в "смертных" и "бессмертных" клеточных линиях.

6.Изучение возможность влиять на репарацию в клетках человека после гамма-облучения с помощью введения в облученные клетки экзогенной рекомбиназы - Ree А белка E.coli для исследования участия рекомбинации в ликвидации однонитевых и двунитевых разрывов ДНК.

7.Исследование роли конформационного состояния ДНК для репарации повреждений, то есть возможную вовлеченность в этот процесс геликазной активности в клетках, на модели, разработанной совместно с Беляевым (Belyaev et al., 1996), включающей предварительное гамма-облучение диплоидных фибробластов человека малой дозой.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные нами результаты окончательно подтвердили повышенную радио чувствительность клеток больной пигментной ксеродермой, как диплоидных фибробластов XP2SP, так и лимфобластоидных XP2SP(L). Причем показана повышенная чувствительность этих клеток как по критерию выживаемости (XP2SP), образования однонитевых разрывов (XP2SP(L)) и их ликвидации (и диплоидные фибробласты и лимфобластоидные клетки).

Показано, что изученные нами дефекты репарации не связаны с иммортализацией клеток.

Новыми являются сведения о повышенной чувствительности клеток CS1SP к ионизирующему облучению и действию эпоксидов. Особенно интересными оказались данные об их пониженной способности (по сравнению со всеми остальными изученными линиями) ликвидировать однонитевые разрывы ДНК, образующиеся после действия пропиленоксида, эпоксида, связывающегося с ДНК наименее прочно. Эти данные заслуживают отдельного обсуждения.

Подробно описана репарация в клеточной линии AT2SP, которая по своей чувствительности к гамма-облучению и действию эпоксидов с достаточными на то основаниями отнесена к группе АТ-вариант (ссылка).

Изучение репарации в клетках PR3SP впервые показало их повышенную чувствительность к гамма-облучению и действию эпоксидов. Причем эта повышенная чувствительность была описана и в диплоидных фибробластах PR3SP и в лимфобластоидных иммортализованных клетках PR3SP(L). Повышенная чувствительность к гамма-облучению и двум из изученных эпоксидов мы наблюдали только по критерию выживаемости клеток. Но после действия этиленоксида ни те ни другие клетки не способны ликвидировать однонитевые разрывы, образующиеся в ДНК, причем со временем количество разрывов может даже возрастать (в лимфобластоидных клетках), а не уменьшаться. То есть этот дефект репарации ДНК от разрывов не может быть скорректирован иммортализацией клеток.

Впервые было показано, что RecA белок бактерии E.coli способен при введении в клетки человека с помощью липосом участвовать в процессах репарации ДНК после гамма-облучения (Spivak et al., 1991; Спивак и др., 1991). Таким образом была подтверждена роль

рекомбинации в этих процессах - в ликвидации как однонитевых, так и двунитевых разрывов.

Показано, что изменение конформации хроматина при облучении клеток влияет на их выживаемость. Причем показано, что эта зависимость носит неоднозначный характер, а является циклической и зависит как от типа клеток, так и от дозы облучения.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Полученные в работе экспериментальные результаты расширяют и углубляют представления о характере и отчасти о механизмах действия ионизирующего облучения и радиомиметиков-эпоксидов на клетки человека и закономерностей репарации поврежденных клеток на уровне ДНК. Показана решающая роль процессов репарации в ликвидации разрывов ДНК после облучения и обработки эпоксидами.

Результаты работы существенны также для понимания генетических основ канцерогенеза и старения. В частности, полученные данные о том, что дефекты репарации в клетках от больной Р1138Р, имеющей признаки преждевременного старения, не комплементируются иммортализацией этих клеток. При трансформации только снимается ограничение пролиферации (лимит Хейфлика), характерное для ^трансформированных клеток, но это происходит в любых клеточных штаммах, а не только прогерийных. Таким образом можно предположить, что даже при снятии эффекта ограниченности делений клеточной популяции, мы не уберем другие признаки старения клеток, и подобный путь не является панацеей для человечества.

Эпоксиды - опасные поллютанты и это еще раз подтверждено на клеточной модели, содержащей несколько разных штаммов клеток от больных с различными дефектами репарации ДНК. С методической

точки зрения использование подобного набора клеточных штаммов может служить удобной и незаменимой моделью для испытания других химических агентов на канцерогенность и мутагенность.

Подробное описание клеточных штаммов, полученных от больных в России, может быть в дальнейшем использовано для создания банка данных о мутациях, распространенных в нашей стране и их сравнения с ранее описанными. Это важно для понимания этиологии данных заболеваний и возможных перспектив генной терапии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы работы были представлены на XVII Генетическом конгрессе в 1993 году в Бирмингеме (Англия), в 1994 году на I съезде ВОГИС в Саратове и на 3-ей конференции Европейского общества аналитических исследований клеточной патологии в Гренобле (Франция), в 1995 году на ежегодной встрече токсикологов Северной Европы в 1995 году в Тампере (Финляндия), в 1996 году на 9-ом международном конгрессе по генетике человека в Рио-де-Жанейро (Бразилия), а также были неоднократно обсуждены на научных семинарах института цитологии РАН и департамента радиобиологии Стокгольмского Университета.

Глава 1. Обзор литературы. Генетические заболевания с первичными и вторичными дефектами репарации ДНК

Тридцать лет назад Setlow и Carrier (1964) описали эксцизионную репарацию УФ-повреждений у E.coli и таким образом показали, что репарация ДНК имеет фундаментальное значение для клеток и организмов. Исследования последних лет подтвердили, что компоненты репарационной системы также участвуют на клеточном уровне в транскрипции, репликации и рекомбинации. В человеческом организме они также вовлечены в защиту против опухолеобразования, иммунный ответ и различные аспекты дифференцировки и развития. У всех организмов существует серия процессов, позволяющих им или удалять почти все мыслимые типы повреждений ДНК, или проявлять толерантность к тем повреждениям, которые не удалось удалить до наступления репликации. Различные типы химических повреждений удаляются с помощью различных механизмов. Модифицированные основания ДНК убираются с помощью эксционной репарации оснований, которая подробно разобрана в свежих обзорах (Doetsch and Cunningham, 1990; Sancar, 1996). Специальная система существует и для репарации неспаренных оснований. На ней мы тоже не будем останавливаться подробно и только сошлемся на обзор Колоднера (Kolodner, 1996). Пиримидиновые димеры, основные повреждения ДНК, вызываемые УФ-лучами, репарируются с помощью более сложной и многоступенчатой системы эксцизионной репарации нуклеотидов, на которой мы подробно остановимся. Ионизирующая радиация вызывает изменения оснований ДНК, а также разрушает физическую структуру фосфодиэфирного скелета, индуцируя одно- и двунитевые разрывы. Эти последние требуют специальной

репаративной системы, которая также будет обсуждена. Из-за обилия материалов и в силу интересов исследования, мы ограничимся эукариотами.

1.1. Эксцизионная репарация нуклеотидов.

За последние 10-15 лет многие гены, участвующие в ЭР у эукариот,

изолированы из почкующихся дрожжей Saccaromyces cerevisiae, из делящихся дрожжей Saccaramyces pombe, и из клеток млекопитающих (преимущественно грызунов и человека). Главное, связанное с этим открытие - высокое структурное и функциональное постоянство этих генов у столь разных организмов, которое можно распространить на всех эукариот. Вывод о том, что механизм ЭР сходен, если не идентичен, у всех видов, означает, что данные, полученные на одних организмах, можно смело приложить к другим.

Прежде чем углубляться в подробности, неизбежно придется остановиться на вопросах номенклатуры. Хорошо известен тот печальный и неизбежный опыт, что мутанты и соответствующие им гены приходится обозначать до того, как становятся понятны их структура и функции, к тому же в разных областях (разные объекты) складываются свои системы номенклатуры. Это часто приводит к путанице, и гены репарации ДНК не являются в этом смысле исключением. У дрожжей соответствующие гены обозначаются у S.serevisise и у S.pomba как Rad и rad, но их порядковые номера не совпадают. (Например, ген Rad3 S.serevisea и ген rad3 S.pomba - совершенно разные, а гомологом гена Rab3 является ген radl5). У млекопитающих обозначение репарационных мутантов и генов имеют разное происхождение. В экспериментах на клетках грызунов были выделены мутанты, относящиеся к 11 группам комплементации и имеющие различные дефекты ЭР, а человеческие гены,

комплементирующие эти мутанты, обозначили ERCC (Excision Repair Cross Complementing) 1-11. У человека же соответствующие мутанты были получены от больных с генетическими нарушениями репарации -пигментной ксеродермой (ХР), синдромом Коккейна (CS) и три-хотиодистрофией (TTD). Различные группы комплементации этих штаммов

были обозначены в соответствии с источником их получения: ХР-А (B,C,D,E,F,G), CS-A, CS-B, TTD-A, а их гены - ХРА, ХРВ и т.д. До сих пор дискутируется наличие большего числа групп комплементации, например, у синдрома Коккейна (Lehmann, 1995). Когда вс�