Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Радиоадаптивный ответ в лимфоцитах человека и его модификация

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Радиоадаптивный ответ в лимфоцитах человека и его модификация"



Российская Академия Наук

Институт общей генетики им Н. И. Вавилова, РАН

На правах рукописи

Цховребова Лейла Вахтанговна

УДК. 575.224.232:612.112:577.346.017.4

РАДИОАДАПТИВНЫЙ ОТВЕТ В ЛИМФОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА И ЕГО МОДИФИКАЦИЯ.

03.00.15-генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998 г

Работа выполнена в Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова, РАН. Научный руководитель: кандидат медицинских наук Г.П. Македонов

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, профессор Ф. И. Ершов; доктор биологических наук, профессор А. П. Акифьев

Ведущая организация:

Институт химической физики им. Н. И. Семенова, РАН.

Защита диссертации состоится "....." ............... 1998 г. на заседании

специализированного совета при Институте общей генетики, РАН по адресу: г. Москва, ул. Губкина, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики, РАН.

Автореферат разослан "....."............ 1998 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук Г. Н. Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Адаптация, ее пределы и механизмы на протяжении многих лет, особенно, если речь идет о человеке, остается одной из самых существенных биологических проблем. Особенно актуально эта проблема звучит в настоящее время, когда в результате технологического прогресса в биосфере (среде обитания человека) возросло число и размеры стрессовых факторов, к которым относятся и факторы, вызывающие наследственные и злокачественные изменения клеток. В последние 10-15 лет исследование и понимание этой проблемы перешло на принципиально новый уровень в связи с открытием так называемых, регулонов, представляющих собой группы генов, выражение которых происходит координирование в ответ на то или иное стрессовое воздействие. К числу наиболее известных и изученных относятся т.н. БОБ-ответ, обнаруженный в клетках прокариотов и элементы которого присутствуют и в клетках эукариотов, в том числе в клетках млекопитающих. Адаптивный ответ в отношении действия алкилирующих мутагенов, группа генов теплового шока и генов, выражение которых связано с возникновением в клетках свободных радикалов кислорода. В результате индукции этих генов существенным образом меняется клеточный метаболизм, поскольку они включены в контроль таких важных процессов, какими являются репарация, репликация и рекомбинация ДНК, метилирование ДНК, индукция профагов, мутагенез, клеточное деление, в случае многоклеточных организмов - регуляция гормональной активное™ и т.д. Без сомнения, к выше перечисленным явлениям относится также радиоадаптивный ответ, заключающийся в уменьшении чувствительности клеток к действию ионизирующей радиации по критерию величины выхода хромосомных аберраций, в результате предварительного воздействия ионизирующим излучением в существенно меньших по величине дозах. Актуальность исследования радиоадаптивного ответа тем более очевидна, т.к. это явление впервые продемонстрировано в клетках человека. Однако, несмотря на то, что сам факт существования радиоадаптивного ответа в настоящее время не вызывает сомнений ^01^1998/, его механизм остается неизвестным. В настоящей работе впервые для исследования механизма радиоадаптивного ответа использовались клетки доноров, страдающих четырьмя наследственными заболеваниями. При исследовании механизмов генетических процессов и их значимости наиболее продуктивным, до настоящего времени, и перспективным, по крайней мере, в ближайшем будущем является метод анализа мутантов, дефектных по отдельным этапам изучаемого процесса. Этот метод чрезвычайно интенсивно используется в модельных системах любой ¡¡ложности, начиная от микроорганизмов и заканчивая высшими, в том

числе млекопитающими. Однако, понятны те трудности, с которыми мы сталкиваемся, когда речь идет о человеке. В работе использованы клетки больных гомоцистинурией, шизофренией, синдромом Элерса - Данлоса, синдромом Марфана, которые, как ранее было показано /Засухина и др,1982, БтеЬсЫкоуа й а1Д987/ являются дефектными в отношении процесса репарации ДНК, поскольку в литературе интенсивно обсуждается вопрос о роли этого процесса в развитии радиоадаптивного ответа ЛУоН¥,1978; \Vojewodska е1 а1,1995/.

В условиях, когда практически вся популяция человека, в большей или меньшей степени, подвергается мутагенному воздействию в результате загрязнения окружающей среды не требует специального обоснования актуальность проблемы особенностей действия мутагенов и, в частности, ионизирующего излучения в малых дозах, особенно если речь идет о человеке.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в исследовании механизма радиоадаптивного ответа в отношении индуцированных квантами хромосомных аберраций в лимфоцитах

человека с использованием клеток клинически здоровых доноров и страдающих наследственными заболеваниями, клетки которых дефектны по отдельным этапам процесса репарации ДНК. В процессе работы решались следующие конкретные задачи:

1 .Исследование частоты и спектра индуцированных квантами и 8-метоксипсораленом структурных мутаций хромосом в лимфоцитах здоровых доноров и страдающих различными наследственными синдромами.

2.Исследование адаптивного ответа и защитного действия интерферона в лимфоцитах клинически здоровых доноров и доноров, страдающих различными наследственными синдромами при индукции хромосомных аберраций ¿Г- лучами в дозе 2 Гр и 8 - метоксипсораленом активированным УФ - светом.

3.Проведение сравнительного анализа радиоадаптивного ответа и защитного эффекта интерферона в условиях раздельного и совместного их протекания в лимфоцитах человека по отношению к индуцированным хромосомным аберрациям.

4.Исследование особенностей протекания радиоадаптивного ответа у лиц, постоянно проживающих в условиях повышенного фона радиации в результате аварии на ЧАЭС.

Научная новизна. В работе впервые исследованы особенности радиоадаптивного ответа в клетках доноров, страдающих следующими наследственными синдромами: гомоцистинурия, шизофрения, синдром Элерса - Данлоса, синдром Марфана. В результате установлено, что в случае гомоцистинурии оказывается полностью подавленным

радиоадаптивный ответ. В этом же исследовании показано отсутствие корреляции между эффективностью репарационного процесса и наличием либо отсутствием радиоадаптивного ответа, который, по-видимому, осуществляется на предшествующей репарации первичных повреждений ДНК стадии, а именно, на этапе индукции первичных повреждений ДНК.

Проведенный в работе сравнительный анализ механизма радиоадаптивного ответа и защитного действия интерферона показал, что эти два события не являются независимыми в клетке, напротив, радиоадаптивный ответ феноменологически подобен одной из двух, "нерепарационной" компоненте защитного действия интерферона. Последний наряду с этой "нерепарационной" компонентой включает в себя и компоненту, связанную с эффективностью процесса репарации ДНК.

Практическая значимость. Ряд полученных в работе результатов имеют непосредственное отношение к проблеме количественной оценки потенциальной генетической опасности и популяционного риска для человека в условиях загрязнения окружающей среды различными факторами физической и химической природы, многие из которых являются мутагенами и канцерогенами. К этим результатам относится сам факт наличия и практически постоянный уровень радиоадаптации по отношению не только к индуцированным ионизирующим облучением хромосомным аберрациям, но и к аберрациям, возникающим на базе моноаддуктов и межнитевых сшивок ДНК при действии 8 - МОП активированного УФ - светом. К результатам такого рода относятся также высокий полиморфизм популяции человека по типу и наличию либо отсутствию радиоадаптивного ответа. Причем, получены указания на то, что длительное проживание в условиях повышенного радиоактивного фона способствует фенотипической реализации этого полиморфизма, в результате его уровень возрастает.

Самостоятельное практическое значение имеет характеристика наследственных дефектов у лиц, страдающих исследовэдшыми в работе синдромами по уровню мутабельности и защитному действию нтерферона, а также наличию либо отсутствию радиоадаптивного ответа. Особый интерес в этом плане представляет собой, по-видимому, гомоцистинурия, в случае которой наследственный дефект прямо или косвенно, но полностью блокирует протекание радиоадаптивного ответа.

Полученные цитогенетические характеристики исследованных наследственных синдромов могут быть использованы для проведения дифференциального диагноза различных заболеваний.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены в качестве тезисов на I съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС) в г. Саратове (1994), в качестве доклада на 3-ем съезде по радиационным исследованиям (радиобиология,

радиоэкология, радиационная безопасность) в г. Москве (1997) и на межлабораторном семинаре по Генетической безопасности в Институте общей генетики им.Н.И.Вавилова, Москва, май 1998г.

Публикации. Основные материалы исследований, представленные в диссертационной работе, изложены в шести публикациях: двух тезисах докладов и четырех журнальных статьях.

Структура и объем диссертации. Материал диссертации, состоящей из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, экспериментальной части, обсуждения, заключения и выводов, представлен на 145 машинописных страницах, включая 9 таблиц и 5 рисунков. Список литературы включает 48 наименований работ отечественных и 180 наименований работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Объекты исследования: В экспериментах использовали лимфоциты периферической крови здоровых взрослых доноров и детей, кровь детей из загрязненных радионуклидами районов, пациентов с гомоцистинурией, шизофренией, синдромом Элерса - Данлоса и Марфана.

Клетки культивировали по методу Хангерфорда (Hungerford et al, 1965). Окраску препаратов производили 3% водным раствором красителя Гимзы на фосфатном буфере pH = 6,8.

Методы исследования: 1. Анализ аберраций хромосом;

2. Определение соотношения метафаз I и II циклов для контроля скорости прохождения клетками митотического цикла, окрашенных по методике FPG; 3. Радиоавтография с использованием ЗН - тимидина.

При анализе структурных мутаций хромосом на каждый вариант эксперимента, считали по 250 - 300 метафаз, содержащих 46 хромосом.

Часть работы по анализу аберраций хромосом на метафазных пластинках была выполнена с использованием системы анализа изображения, аналогичной "IBAS" из Института молекулярной биологии /Muravenko, Fedotov et al,1997/.

Использованные вещества: фитогемааглютинин фирмы "ПанЭко" или "Difco Р", человеческий лимфобластоидный интерферон "Sigma", США, удельная активность 1х106ИЕ/мг белка, в дозе 50 ИЕ/мл. ЗН - Thd (НПО "ГИБХ") и ЗН-Thd с удельной активностью 1,2 ТБк/мМ в дозе 2,5 кБк/мл (0,1 мК/мл). Рентгеновские лучи (190 кВ, фильтр Си-2мМ) в дозе 0.05 Гр при мощности облучения 0.0143 Гр/мин и ¿f- кванты (Со 60) в дозе 2 Гр при мощности дозы 6 Гр/мин на установке "ГУПОС", ИОГен, РАН и на установке "ГУБЭ" при мощности дозы 40 Рад/мин. Был использован фотомутагенный агент 8 - метоксипсорален ( 8 - МОП) фирмы "Sigma", США, в концентрации 40 мкг/мл. Фотоэмульсия типа М (ГосНИИхимфотопроект).

Все эксперименты были проведены по одинаковой схеме. Через 4 часа после стимуляции ФГА в среду культивирования вносили ЗН - тимидин или «г-ИФ либо клетки облучали рентгеновскими лучами. Через 20 часов, т.е. до облучения клетки отмывали раствором Хэнкса и облучали £ квантами в дозе 2Гр. либо вносили 8 - МОП и после инкубации с мутагеном в течение 1ч при температуре 37® С облучали в течение 3 сек. УФ - светом с длипой волны больше 300 нм облучателем ОКН-11, снабженным специальным фильтром. Эта обработка получила обозначение "ПсУФ". Клетки, в которых планировалось перевести часть моноаддуктов 8 - МОП в межнитевые сшивки подвергались повторному облучению тем же облучателем в течение 60 секунд после индукции МА. Эта обработка получила обозначение "ПсУФ+УФ". За 2 часа до фиксации в среду вносили колцемид, затем в течение 15 проводили обработку гипотоническим раствором и фиксировали клетки на 54 часу культивирования.

Радиоавтографическая методика была использована нами для изучения включения ЗН - тимидина в 01 - периоде митотического цикла. Для приготовления радиоавтографических препаратов пользовались методическими указаниями Э. Роджерса /Роджерс,1972/.

Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Цитогенетнческое действие ¿"-лучей в клетках клинически здоровых

доноров и пациентов с различными наследственными синдромами.

При сравнении цитогенетического эффекта лучей в клетках

клинически здоровых доноров и пациентов с различными наследственными синдромами оказалось, что частота хромосомных аберраций в случае гомоцистинурии, синдрома Марфана, шизофрении статистически значимо превосходит таковую у здоровых доноров (табл 1). Исключение составляют больные синдромом Элерса - Данлоса. У этих пациентов наблюдается значимое уменьшение уровня мутабельности, учитываемое по тотальному выходу хромосомных аберраций, индуцируемых радиацией. Как

правило, принято считать, что дефектность по репарации приводит к уменьшению эффективности этого процесса и, соответственно, увеличению числа доживших до стадии реализации предмутационных повреждений ДНК, что приводит к увеличению регистрируемого выхода мутаций, в данном случае хромосомных аберраций. Понятно, что наблюдаемое у больных с синдромом Элерса-Данлоса снижение частоты индуцированных хромосомных аберраций по сравнению с таковой у здоровых доноров не может определяться дефектом и, соответственно, снижением эффективности процесса репарации ДНК. Напротив, наблюдаемое снижение выхода хромосомных аберраций может быть обусловлено

"интенсификацией репарационного процесса либо увеличением эффективности процесса предотвращающего поражение ДНК. На наш взгляд, более интересным кажется предположение, что в клетках человека существует активная и относительно независимая в плане генетической детерминации функция, определяющая возникновение хромосомных аберраций, которая в клетках с этим синдромом является нарушенной. Фактически речь идет о существовании в клетках эукариотов особого процесса, получившего в 60-ые годы следующее название-реализация предмугационных повреждений ДНК и, который, как показано в многочисленных исследованиях того периода времени, непосредственно не связан с репарационным процессом.

Наряду с изменением тотального выхода хромосомных аберраций для синдрома Марфана, гомоцистинурии и шизофрении характерно изменение спектра хромосомных аберраций за счет увеличения доли аберраций хромосом хроматидного типа. Это изменение спектра может определяться уменьшением эффективности репарационного процесса и, соответственно, увеличением доли первичных повреждений ДНК, доживших до стадии эффективного расщепления хромосомы, когда в качестве единицы при образовании хромосомных аберраций выступает не хромосома в целом, а каждая ее хроматида.

В случае синдрома Марфана удается выявить даже на относительно небольшой выборке полиморфизм по чувствительности клеток к воздействию облучения по критерию выхода структурных мутаций

хромосом.

Таблица 1. Частота и спектр аббераций хромосом, индуцированных облучением в лимфоцитах клинически здоровых доноров и пациентов с различными наследственными синдромами.__

Клеток с Аббераций Доля аббераций Доля аббераций

аберрациями хромосом на хроматидного хромосомного

хромосом (%) 100 клеток типа(%) типа(%)

Здоровые 51.2±1.0 73.5±1.7 5 95

доноры

ГЦУ 65.8±1.9 118.Ü4.4 29 89.1

III 64.6±2.0 114.5±4.4 14.5 85.5

э-д 31.6±1.7 42.5±2.3 3.3 96.7

CM-I б2.9±2.7 147.8±3.8 28.8 71.2

CM-II 90±1.7 365±13.5 24.6 75.4

см-ш 49.0±2.8 76.3±6.2 11.8 88.2

Примечание: ГЦУ - гомоцистинурия; Ш - шизофрения; Э - Д - Элерса -Данлюса; СМ - синдром Марфана. I, И, III - обозначены группы пациентов синдрома Марфана.

Эффект интерферона на цитогенетическое действие ft- лучей.

С момента первых публикаций, касающихся наличия у ИФ антимутагенной активности, появилось большое количество работ, как в отношении генных мутаций, так и в отношении хромосомных аберраций, выполненных на различных клеточных линиях человека и млекопитающих и подтверждающих существование этого явления /Lazutka,1997; Isogai and Suzuki, 1994/. В результате сам факт наличия у ИФ способности снижать цитогенетический эффект радиации и химических мутагенов в настоящее время не вызывает сомнений. Однако, механизм генетической детерминации этого эффекта ИФ остается неизученным. В этой связи при изучении антимутагенного эффекта ИФ в отношении ¡f- индуцированных хромосомных аберраций в клетках здоровых доноров и пациентов с различными наследственными синдромами оказалось, что относительное уменьшение общего выхода хромосомных аберраций при введении ИФ в случае всех изученных нами наследственных синдромов уменьшается по сравнению с таковым в клетках клинически здоровых доноров. Если у здоровых доноров при введении ИФ "снимается" 80% индуцированного - лучами цитогенетического эффекта, то в случае гомоцистинурии только 30%. Для других исследованных синдромов также характерно снижение антимутагенного эффекта ИФ, однако, в меньшей степени. Полученные результаты показывают, что эти синдромы прямо либо косвенно связаны с процессами, определяющими антимутагенный эффект ИФ.

Тот факт, что как в клетках клинически здоровых доноров, так и в клетках доноров с изученными нами наследственными синдромами, кроме синдрома Марфана, при действии ИФ в одинаковой степени уменьшается выход аберраций хромосом хромосомного и хроматидного типов, по видимому, свидетельствует о том, что эффект ИФ связан с теми стадиями общего процесса мутирования, которые предшествуют стадии формирования и реализации индуцированных jf- лучами

первичных повреждений ДНК. Такими стадиями являются стадии возникновения первичных повреждений ДНК и стадия репарации. Это заключение согласуется с многочисленными выводами, имеющимися в литературе /Isogai and Suzuki,1994/, посвященной антимутагенному эффекту ИФ. Однако, в случае синдрома Марфана ситуация иная. В данном случае для клеток с синдромом Марфана характерно избирательное снижение выхода мутаций хроматидного типа практически до уровня контроля. Пациентов с синдромом Марфана отличает необычно высокий уровень аберраций хроматидного типа, который наблюдается как в контроле, так и при воздействии радиации. Одна из возможностей для объяснения этого явления заключается в том, что при действии ИФ, по-видимому, происходит компенсация этого эффекта, связанного уже с

"этапом реализации и формирования различных типов хромосомных аберраций.

Другая возможность может быть связана с тем, что при действии ИФ меняется спектр индуцированных радиацией первичных повреждений ДНК таким образом, что уменьшается доля первичных повреждений на базе которых формируются аберрации хроматидного типа.

Эффект предобработки ЗН-тимидином на цитогенетическое действие лучей.

При исследовании адаптирующего эффекта ионизирующего излучения в качестве первого, адаптирующего воздействия, как правило, выступает либо редкоионизирующее излучение в малых дозах (0.1-10 рад), либо культивирование клеток с ЗН - тимидином в течение продолжительного времени. В подавляющем большинстве экспериментов нами использован в качестве адаптирующего фактора ЗН - тимидин. Полученные результаты при исследовании адаптивного ответа в отношении цитогенетического эффекта лучей в клетках здоровых доноров и доноров, страдающих различными наследственными синдромами представлены в табл. 2.

Относительная величина адаптивного ответа (КЗ), измеряемая по суммарному выходу аберраций хромосом (как хромосомного, так и хроматидного типов) в клетках здоровых доноров и пациентов, страдающих различными наследственными синдромами, за исключением двух случаев, не зависит от общего уровня мутабельности и составляет 0.52 - 0.57. Исключением являются синдром Марфана П-й группы и гомоцистинурия. Однако, в случае синдрома Марфана речь идет лишь об одном пациенте, для которого характерен чрезвычайно высокий уровень индуцированных лучами хромосомных аберраций, что затрудняло

их количественный учет. Для представителей других групп, входящих в синдром Марфана (I и ПГ) увеличение коэффициента защиты по сравнению с вышеуказанными границами колебания (0.52 - 0.57) не наблюдалось. В связи с этим мы считаем преждевременным акцентировать внимание на этом факте, касающемся одного пациента.

Для всех пациентов, страдающих гомоцистинурией характерно отсутствие влияния предобработки ЗН - тимидином на частоту аберраций хромосом, индуцированных последующим действием квантов, т.е.

отсутствие адаптивного ответа. Не исключено, что в случае гомоцистинурии мы сталкиваемся с наследуемым дефектом в генах, которые включены в контроль адаптивного ответа на том или ином этапе. Другая особенность адаптивного ответа в группе пациентов с наследственными синдромами по сравнению со здоровыми донорами связана с изменением соотношения между аберрациями хромосом хроматидного и хромосомного типов, индуцированных лучами.

Таблица 2. Влияние предобработки ЗН - тимидином на частоту и спектр аберрации хромосом, индуцированных облучением (2Гр) в лимфоцитах клинически здоровых доноров и пациентов с различными наследственными синдромами.________

ЗН Клетки с Абер. на Доля абер. Доля абер. Коэффиц иент защи ты

тимидин абер. (%) 100 клеток хромат, типа хромое, типа Общий абер. хромат, типа абер. хромое, типа

ЗД - 51.2 ± 1.0 73.5±1.7 5 95 0.52 0.08 0.54

+ 29.3±0.9 З5.б±1.2 9.5 90.5

ГЦУ - 65.8±1.9 118.1±4.4 24.5 75.5 0.06 0.29 0.00

+ 59.3±2.0 111.0±4.3 18.5 81.5

ш - 64.6±2.0 114.5±4.4 14.5 85.5 0.53 0.70 0.51

+ 40.5±2.0 53.5±3.0 9.4 90.6

э-д - 31.6±1.7 42.5±2.3 3.3 96.7 0.57 0.36 0.58

+ 14.5±1.3 18.2±1.5 5.0 95.0

CM-I - 62.9±-2.7 147.8±3.8 28.8 71.2 0.52 0.65 0.46

+ 54.8±2.8 71.5±2.7 21.1 78.9

СМ-II - 90.0±1.7 365.0±13 24.6 75.4 0.73 0.60 0.77

+ 60.0±2.8 99.0±5.6 36.4 63.6

СМ - III - 49.0±2.8 76.3±6.2 11.8 88.2 0.52 0.27 0.55

+ 28.0±2.5 36.6±4.3 18.0 82.0

Примечание: ЗД - здоровые доноры; ГЦУ - гомоцистинурия; Ш - шизофрения; Э - Д - Элерса - Данлюса; СМ -синдром Марфана. Знаки "+" и "-" обозначают варианты эксперимента с предобработкой ЗН - тимидином или без предобработки.

Наиболее ярко эта особенность выражена в клетках пациентов, страдающих шизофренией и синдромом Марфана. Для этих двух синдромов характерно преимущественное снижение аберраций хроматидного типа в результате адаптации, тогда как для здоровых доноров адаптивный ответ в основном связан с уменьшением частоты аберраций хромосомного типа. Таким образом, полученные результаты показывают, что в результате адаптации снижается выход аберраций хромосом как хроматидного, так и хромосомного типов. Причем, как и в случае с ИФ относительная величина адаптивного ответа в отношении аберраций хроматидного типа возрастает по мере увеличения доли аберраций этого типа в спектре индуцированных ¿'-квантами

структурных мутаций хромосом.

Сравнение защитных эффектов интерферона и адаптивного ответа.

Дополнительные аргументы в пользу вывода о зависимости адаптивного ответа и защитного действия ИФ могут быть получены при сравнении величин этих эффектов у здоровых доноров и в клетках пациентов с наследственными синдромами. Результаты этого сравнения показывают, что, во-первых, уровень защитного эффекта при адаптации во всех случаях оказывается либо ниже (здоровые доноры, Элерс - Данлос, гомоцистинурия), либо, по крайней мере, не превосходит (шизофрения, синдром Марфана) соответствующий уровень защитного эффекта ИФ. Это касается аберраций обоих типов. Во-вторых, в клетках пациентов, страдающих гомоцистинурией адаптивный ответ отсутствует. Однако, при введении ИФ наблюдается снижение, хотя и в меньшей степени, выхода аберраций хромосом, индуцированных лучами. И, наконец, в случае с синдромом Марфана I, когда количественно защитные эффекты адаптации и ИФ совпадают в пределах точности эксперимента, в обоих случаях наблюдается преимущественное снижение частоты аберраций хроматидного типа по сравнению с аберрациями хромосомного типа. Результаты качественного и количественного сравнения эффекта ИФ и предобработки ЗН - тимидином, строго говоря, позволяют предположить, что в основе защитного действия рассматриваемых двух факторов лежат общие механизмы. Однако, адаптация касается лишь части процессов (защитных механизмов), индуцируемых ИФ.

Эффект ИФ в условиях адаптации и без нее.

Очевидно, что при решении вопроса о зависимости либо независимости действия двух модифицирующих факторов существенные результаты могут быть получены в экспериментах по совместному их действию. Оказалось, что при действии ИФ в условиях адаптации уровень снижения выхода аберраций хромосом фактически идентичен таковому при введении ИФ без

Таблица 3. Влияние предобработки X - лучами"(0,05 Гр) и/или интерфероном на частоту" и спектр аберраций хромосом, индуцированных - облучением в лимфоцитах клинически здоровых доноров.__

X- лучи ИФ Клетки с абер.(%) Абер. на 100 клеток Доля абер. хромат, типа Доля абер. хромое, типа Коэффиц Общий иент защи абер. хромат, типа ты абер. хромое, типа

- - 69.9+3.2 103.5+7.2 3.9 96.1

+ - 44.5+3.5 64.0+5.7 4.7 95.3 0.38 0.25 0.39

- + 26.0+3.1 114.5+4.4 3.3 96.7 0.71 0.75 0.70

+ + 30.0+3.2 42.5+2.3 2.8 97.2 0.66 0.75 0.65

Примечание: Знаки "+" и "-" обозначают предобработку X - лучами либо интерфероном или отсутствие таковой.

Таблица 5. Защитные эффекты предобработки клеток ЗН - тимидином на мутагенное действие - излучения в репарационно - полноценных и в репарационно - дефектных клетках._____

Здоровые доноры Гомоцистинурия Синдром Марфана Шизофрения Синдром Элерса-Данлюса

Радиоадаптивный ответ + - + + +

Репарация + - - - -

адаптации (табл. 3). Причем это касалось защитного эффекта как в отношении аберраций хромагидного, так и хромосомного типов. В целом, полученные результаты указывают на то, что эффекты снижения выхода аберраций хромосом, обусловленные введением ИФ с одной стороны и адаптирующим воздействием ЗН - тимидина с другой, не могут рассматриваться как независимые.

Адаптивный ответ при действии 8 -метоксипсоралена (8-МОП) активированного УФ - светом.

Хорошо известно, что эффективность репарации и процессов, приводящих к формированию хромосомных аберраций, зависит от типов индуцированных первичных повреждений ДНК. Принято считать, что при действии радиации хромосомные аберрации возникают на базе разрывов ДНК /Македонов, Тарасов,1972; Ка1а^ап е1 а1,1980/. Для других мутагенных факторов химической или физической природы, например УФ - света, в основе возникающих хромосомных аберраций лежат другие типы повреждений ДНК (димеры, моноаддукты, межнитевые сшивки). В случае активированного УФ - светом 8 - МОП в ДНК хромосом формируются моноаддукты и межнитевые сшивки ДНК. Причем соотношение между этими двумя типами первичных повреждений ДНК можно регулировать экспериментально изменением режима светового воздействия. Нами использован вариант светового воздействия, обеспечивающий высокий выход межнитевых сшивок ДНК, заключающийся в двойном облучении УФ - светом.

В результате было установлено (табл. 4), что в условиях адаптации, как и в случае ионизирующего излучения цитогенетический эффект активированного УФ - светом 8 - МОП значимо уменьшается. Это показано на примере клинически здоровых доноров и доноров, страдающих синдромом Марфана, тогда как в клетках пациентов, страдающих гомоцистинурией этого уменьшения частоты индуцированных хромосомных аберраций мы не наблюдаем, т.е. адаптивный ответ отсутствует. Таким образом, на качественном уровне мы имеем полный параллелизм защитного эффекта адаптации в отношении хромосомных аберраций, индуцированных ^- облучением, с одной стороны, и 8 -МОП, с другой. Однако, если в случае ионизирующего излучения цитогенетический эффект и, соответственно, его снижение в результате адаптации касается преимущественно аберраций хромосомного типа, то в случае с 8 - МОП речь идет преимущественно об аберрациях хроматидного типа и, более того, хроматидных транслокациях.

Обращает на себя внимание то, что при разных мутагенных нагрузках и, соответственно, разных уровнях общей мутабельности при действии 8 -МОП, а также при радиационном воздействии в клетках здоровых доноров

Таблица 4. Влияние предобработки ЗН - тимидином на частоту и спектр аберраций хромосом, индуцированных 8 -метоксипсораленом, активированным УФ - светом, в лимфоцитах клинически здоровых доноров и пациентов с различными наследственными синдромами._____

ЗН Клетки с Абер. на Доля абер. Доля абер. Коэффи циент защи ты

тимидин абер. (%) 100 клеток хромат, типа хромое. Общий абер. хромат, типа абер.

Делец Обмен типа Делец Обмены хромое, типа

1 - 37.5 45.0±.4.7 16.7 50.0 33.3 0.51 -0.12 0.76 0.45

+ 20.0 22.1±3.3 38.0 24.0 38.0

2 - 18.3 19.9±1.8 31.7 50.2 18.1 0.12 -0.05 0.19 0.20

+ 17.7 17.7±1.6 37.3 46.3 16.4

3 - 14.2 17.5±2.9 38.9 37.1 24.0 0.54 0.63 0.77 0.05

+ 8.0 8.0±2.0 31.2 18.8 50.0

4 - 12.5 15.0±2.7 16.7 50.0 33.3 -0.33 -1.92 0.28 -0.28

+ 20.0 20.0±3.2 36.5 27.0 36.5

Примечание: 1 - здоровые доноры; 2 - гомоцистинурия; 3 - синдром Марфана I - группа; 4 - здоровые доноры из Брянской области.

и пациентов с отсутствием дефекта по индукции адаптивного ответа уровень снижения цитогенетического эффекта количественно во всех случаях остается одинаковым и составляет примерно половину эффекта. Таким образом, наличие либо отсутствие, и степень защиты в условиях адаптации, по-видимому, не зависит от уровня мутагенной нагрузки, а также от типов индуцированных первичных повреждений ДНК. Более того, поскольку эффективность репарационного процесса в отношении таких разных первичных повреждений ДНК, каковыми являются разрывы ДНК, межнитевые сшивки ДНК и моноадцукты резко различается, то кажется вероятным, что адаптивный ответ не связан с модификацией репарационного процесса, заключающегося в уменьшении числа первичных повреждений ДНК после их индукции мутагенами. Во всяком случае при облучении лимфоцитов, находящихся в 01 - периоде митотического цикла, возникающие повреждения превращаются в хромосомные аберрации, по крайней мере, преимущественно до фазы эффективного расщепления хромосом на две хроматиды. В случае с 8 -МОП ситуация принципиально иная - большая часть индуцированных в ДНК повреждений "доживают" до стадии эффективного расщепления хромосом и позднее реализуются в аберрации хромосом хроматидного типа. Понятно, что эффективность репарационных процессов рассмотренных выше первичных повреждений ДНК, индуцируемых радиацией и 8 - МОП принципиально неодинаковая. И тем не менее наблюдается параллелизм в эффекте адаптации в рассмотренных случаях. Это приводит к заключению о том, что, по-видимому, механизмы адаптации, по крайней мере в основном, не связаны с модификацией репарационного процесса.

Адаптивный ответ и антимутагенное действие интерферона в лимфоцитах детей, проживающих на загрмзпы,,«^ радионуклидами территориях в результате аварии на ЧАЭС.

Специальный раздел работы посвящен исследованию особенностей адаптивного ответа и защитного действия ИФ у детей, проживающих на территориях, загрязненных радионуклидами в результате аварии на ЧАЭС. Поскольку величина дозы как редкоионизирующего излучения, так и ЗН -тимидина, необходимая для индукции адаптивного ответа, достаточно мала, априорно нельзя было исключить, что повышенный фон радиации способен влиять на протекание процессов, которые в конечном счете изменяют эффективность мутационного процесса. В первую очередь это касается индуцибельных процессов, к числу которых относятся: адаптация к последующему действию квантов и защитные эффекты ИФ.

Полученные результаты позволили выявить гетерогенность популяции человека в отношении способности к индукции адаптивного ответа и

защитному эффекту ИФ. В целом по этим показателям анализируемая популяция детей может быть представлена тремя группами. Первая группа, состоящая из трех человек, характеризуется отсутствием защитного эффекта ИФ и увеличением, а не снижением чувствительности к мутагенному действию ¿г- лучей в условиях адаптации. У четырех пациентов, входящих во вторую группу, наблюдается нормальный по величине защитный эффект ИФ, но для них характерным является практически полное отсутствие эффекта адаптации. И, наконец, третья группа представлена донорами, у которых не нарушены ни адаптивный ответ ни защитное действие ИФ. Следует сказать, что в литературе имеются лишь одиночные сообщения о пациентах, у которых адаптивный ответ отсутствует, либо адаптация приводит не к защитному, а к сенсибилизирующему эффекту в отношении последующего облучения /8ЬасИеуД994/. В наших экспериментах у клинически здоровых доноров удалось выявить лишь 2 случая, когда эффект адаптации ЗН - тимидином отсутствовал. Интересно, однако, что в одном из них речь идет о сыне ликвидатора, подвергшегося радиационному воздействию. По-видимому, обсуждение природы указанной выше гетерогенности в популяции человека в настоящее время кажется преждевременным. Однако, на феноменологическом уровне полученные результаты показывают, что популяция человека является гетерогенной по способности индуцировать адаптивный ответ и защитный эффект ИФ и, кроме того, условия на территориях, загрязненных радионуклидами способствуют фенотипической реализации этой гетерогенности.

ОБСУЖДЕНИЕ

Возможный механизм радиоадаптациии в отношении индуцированных

редкоионюирующим облучением структурных мутаций хромосом.

В настоящее время твердо установлено, что возникновение индуцированных мутаций хромосом представляет собой многоэтапный процесс, включающий в себя этап формирования первичных повреждений ДНК, этап репарации молекулы ДНК, несущей повреждение и, наконец, этап реализации исходных первичных повреждений либо трансформированных в ходе репарации, либо репликации ДНК в уже необратимые структурные мутации хромосом. Каждый из этих этапов имеет свое ферментативное обеспечение, детерминируемое генетически. Уже достаточно давно стало ясно, что процесс репарации имееет несколько относительно независимых путей. Наряду с конститутивными процессами в клетках как про, так и эукариотов имеются и индуцибельные типы репарационного процесса. Причем, доля последних (индуцибельных процессов) по отношению к конститутивным меняется в зависимости от дозы индуцирующего их фактора, в качестве которого, в частности может выступать и сам мутагенный фактор.

Несмотря на то, что механизм формирования (реализации) хромосомных аберраций на базе индуцированных первичных повреждений ДНК, имеющих характер предмутаций, остается до конца не выясненным, в настоящее время, многочисленные результаты, полученные на феноменологическом уровне еще в 60 - 70-ые годы, показали возможность изменения эффективности процесса реализации предмутаций, т.е. изменение вероятности их реализации в форму цитологически регистрируемых хромосомных аберраций. И, наконец, результаты, полученные в последние годы не оставляют сомнений в том, что частота индуцированных в ДНК первичных повреждений также зависит от ферментативной активности ряда энзимов к числу которых относятся, например, супероксиддисмутаза, каталаза и т.д. По своей природе эти ферменты являются индуцибельными/de Toledo, 1995/. Причем в качестве их индукторов могут выступать активные (радикальные) формы кислорода и, соответственно, агенты, индуцирующие такие радикалы, к числу которых относятся и ионизирующие излучения. Таким образом, имеющиеся в настоящее время результаты показывают, что модификация мутационного процесса в результате использования специальных модификаторов и изменения величины и способов подачи мутационной нагрузки может происходить не только на этапе репарации ДНК, но также и на других этапах - этапе возникновения первичных повреждений и этапе реализации их в необратимые мутации.

Существенно также отметить, что многие типы индуцибельных процессов влияют на эффективность мутагенеза. Так, например, при протекании SOS - индуцибельной репарации, по крайней мере, в клетках прокариотов, возникают генные мутации на базе повреждений ДНК, индуцированных при действии УФ - лучей, ионизирующего облучения и самых разнообразных химических агентов. В этом случае мы сталкиваемся с активным ферментативно обеспеченным мутагенным процессом, существующим в клетках прокариотов и, возможно, в той или иной форме в клетках эукариогов. Напротив, так называемый адаптивный ответ при действии алкилируюших агентов, система оксигенного шока и, наконец, явление радиоадаптации в клетках человека относятся к антимутагенным процессам. Однако, если в случае адаптивного ответа для алкилирующих агентов антимутагенная функция реализуется на стадии репарации, то в случае оксигенного шока на стадии предотвращения поражений ДНК.

Явление радиоадаптации обнаружено, как уже говорилось, Olivieri с соавторами в 1984г на лимфоцитах человека и заключается в возникновении резистентности в результате воздействия редкоионизирующего излучения ( ¿f- кванты ; X - лучи; ЗН - тимидин) в малых дозах порядка 0.1 - 10 сГр по отношению к цитогенетическому эффекту последующего воздействия радиацией в дозах, превышающих

адаптирующую в 100 и более раз. Для объяснения этого явления в настоящее время выдвинут ряд гипотез. В большинстве случаев уменьшение выхода индуцированных хромосомных аберраций в результате радиоадаптации клеток связывают с индукцией дополнительного пути репарации и за счет этого, увеличения общей эффективности этого процесса ЛУо1£Г,1998/. К сожалению, до сих пор не существует сложившейся терминологии при описании мутационного процесса в клетках эукариотов, особенно если речь идет об индукции хромосомных аберраций. Еще до открытия явления репарации ДНК было обнаружено такое явление как пострадиационное восстановление /Лучник, 1966/, сформулирована концепция потенциально мутагенных повреждений, введены понятия реализации первичных повреждений ДНК и т.д. Позже, в связи с открытием процесса репарации молекулы ДНК по отношению к различным типам первичных повреждений ДНК сложилась другая терминология. Вместе с тем очевидно, что само явление репарации ДНК материализует ранее сформулированные феноменологические представления. Некоторые из них - "воостановление" и "реализация" потенциальных повреждений не тождественны процессу репарации ДНК, особено если речь идет о регистрации этого процесса конкретными методами - измерение числа одно и двунитевых разрывов, числа мутационных аддуктов, репарационного синтеза ДНК и т.д. Отсутствие четкой терминологии, в частности, использование термина "цитогенетическая репарация", введенного Вольфом при описании радиоадаптивного ответа, на наш взгляд приводит в некоторых случаях к неразберихе в терминах, к подмене понятий. Фактически термин "цитогенетическая репарация" отражает лишь факт снижения частоты хромосомных аберраций в адаптированных клетках и включает в себя ранее введенное понятие "восстановление" и "реализация" первичных повреждений ДНК и, кроме того, как было сказано выше, это явление может быть также обусловлено изменением числа и типов индуцированных в молекуле ДНК первичных повреждений.

Несмотря на то, что уменьшение частоты возникновения хромосомных аберраций в условиях адаптации касается не только ионизирующего излучения, но и некоторых химических мутагенов, большинство работ тем не менее, посвящено исследованию радиационных эффектов Яки5Ыта,1995/. В настоящее время стала популярной точка зрения, что хромосомные аберрации при действии ионизирующего излучения возникают в результате индукции в ДНК двунитевых разрывов . В связи с этим, основное внимание уделяется возможной связи репарации именно этого типа первичных повреждений ДНК и радиоадаптивного ответа Л\^с£к,1995/. Тем не менее, на наш взгляд, не только не получены убедительные доказательства такого рода связи, но ряд данных, в

частности, представленных в данной работе свидетельствуют об отсутствии корреляции между эффективностью процесса репарации ДНК и радиодаптивным ответом.

Несмотря на то, что механизм радиоадаптивного ответа остается до настоящего времени неизвестным, при его исследовании получены ряд экспериментальных результатов, которые не может игнорировать ни одна из гипотез, призванных объяснить механизм этого явления. К результатам такого рода, в частности, относится существование начального периода между адаптирующим воздействием и регистрирующими эффект воздействиями, равного 4 часам /БЬаШеу е1 а1,1987/, а также тот факт, что подавление синтеза белков в этот период приводит к подавлению развития адаптивной реакции лимфоцитов. В результате можно заключить, что развитие адаптивного ответа требует ферментативного обеспечения и синтез соответствующих ферментов является индуцибельным. Если использовать метод аналогии, то "хорошими" кандидатами среди известных в настоящее время энзимов для обеспечения радиоадаптивного ответа могут оказаться ферменты, которые индуцируются при оксигенном шоке такие как супероксиддисмутаза, каталаза, глютатион-пероксидаза и т.д. Ряд полученных в настоящем исследовании результатов также указывают на то, что радиоадаптивный ответ в лимфоцитах человека, по крайней мере, в основном определяется на стадии индукции первичных повреждений ДНК. В пользу этого заключения свидетельствуют факта уменьшения выхода аберраций хромосом как хроматидного, так и хромосомного типов в условиях адаптации практически в одинаковой степени в клетках клинически здоровых доноров и людей, страдающих различными наследственными заболеваниями, несмотря на существенные различия у этих групп доноров по общей мутабельности. На это же указывают результаты количественного и качественного анализа данных, полученных при исследовании адаптивного ответа в отношении эффекта ^квантов и 8 - МОП, активированного УФ - светом.

С другой стороны, анализ литературных данных и полученные нами результаты не подтверждают выдвинутый рядом авторов тезис о связи РАО с эффективностью репарации молекулы ДНК /\Vojcik й а1,1995/. В таблице 5 качественно представлены суммарные результаты об отсутствии связи между двумя этими явлениями. Видно, что наличие либо отсутствие адаптивного ответа непосредственно не связано ни с эффективностью отдельных звеньев репарационного процесса (репаративный сшггез, реактивация вируса, репарация однонитевых разрывов), ни с так называемой цитогенетической репарацией, по определению Вольфа, эффективность которой при фиксированной дозе радиации определяет уровень цитогенетического эффекта.

Сравнение радиоадаптивного ответа и защитного эффекта интерферона показало, что последний по величине либо больше, по крайней мере, не меньше эффекта адаптации. При чем даже в случае гомоцистинурии наблюдается, хотя и меньший по величине, защитный эффект интерферона. Уже эти факты позволяют предположить, что защитный эффект интерферона обусловлен влиянием, по крайней мере, на два процесса, лишь один, из которых, блокирован в клетках больных гомоцистинурией и, который определяет также развитие адаптивного ответа. В литературе накопилось достаточно данных о том, что защитный эффект интерферона связан с увеличением эффективности процесса репарации ДНК. Однако, это совсем не означает, что защитный эффект интерферона полностью обусловлен влиянием на репарационный процесс. Наряду с влиянием на репарацию, введение интерферона приводит к индукции другого процесса, не связанного с репарацией, но влияющего, в конечном счете, на частоту индуцированных хромосомных аберраций. Этот процесс может быть связан с этапом поражения ДНК и именно эта компонента модифицирующего действия интерферона может оказаться определяющей и в случае адаптивного ответа. Дополнительные аргументы в пользу этой точки зрения получены в работе при исследовании цитогенетического действия квантов в условиях адаптации и при введении

интерферона. Проведенный анализ показал, что уменьшение уровня мутаций в результате адаптации и при введении интерферона не могут рассматриваться как независимые события.

Известно, что поражение ДНК при действии ионизирующей радиации происходит в результате протекания двух основных процессов. Во-первых, в результате прямого взаимодействия квантов излучения с ДНК и, во-вторых, путем образования активных радикалов при взаимодействии с водой и кислородом, и последующем поражении ДНК этими радикалами. При этом в ДНК возникают разные спектры первичных повреждений ДНК, которые имеют разную судьбу и, в конечном счете, с разной вероятностью приводят к образованию структурных мутаций хромосом. В условиях адаптации, когда индуцируется синтез ферментов антиоксидантной защиты происходит полное или частичное "гашение" радикалов. Однако, эффективность этого процесса в общем случае различна для разных радикалов, в частности, для свободных радикалов и радикалов, находящихся в структуре ДНК ("мишенных" радикалов). В результате при адаптации меняется не только число возникающих в ДНК первичных повреждений, но и их соотношение. Это в свою очередь может влиять не только на общий уровень частоты хромосомных аберраций, но и на их спектр, соотношение аберраций хромосомного и хроматидного типов. По-видимому, с последним случаем мы сталкиваемся при действии активированного УФ - светом 8 - МОП в режиме, обеспечивающем

максимальный выход межнитевых сшивок ДНК, когда при введении интерферона доля межнитевых сшивок уменьшается.

На протяжении всего развития генетики как науки исследование мутантов, дефектных по отдельным этапам, в частности, репарации являлось основным для выяснения природы функции отдельных генов и понимания механизма процессов детерминацию которых осуществляют эти гены. Несмотря на громадные успехи в технологии исследований, достигнутых в последние годы, этот метод не потерял значения и сегодня. В этой связи особый и специальный интерес представляют собой данные по характеристике наследственных синдромов, в нашем случае в отношении их мутабельности при действии радиации и влияние на нее радиоадаптации и интерферона.

Полученные нами ранее и в данной работе результаты показывают, что наследственные дефекты исследованных нами синдромов в большей или меньшей степени сказываются на уменьшении эффективности отдельных этапов репарации ДНК. Однако, даже в случае гомоцистинурии, когда нарушена репарация как по УФ-, так и по типу и полностью

- отсутствует радиоадаптивный ответ, наблюдается, хотя и в меньшей степени, защитный эффект интерферона, который, по-видимому, связан со стимуляцией репарационного процесса. Таким образом, даже в случае этого заболевания речь идет не о полном блоке процесса репарации, а о дефекте лишь отдельных звеньев, когда неповрежденными оказываются этапы репарации, модифицирующиеся при введении интерферона. Тем не менее, в случае этого заболевания речь идет о генетическом дефекте, имеющем плейотропный характер, поскольку, наряду с подавлением отдельных этапов репарации, оказывается нарушенным и радиоадаптивный ответ, связанный в основном с этапом поражения ДНК.

Интересные результаты получены при анализе дефекта в синдроме Элерса - Данлоса, в случае которого оказывается сниженной мутабельностъ хромосом при действии ионизирующей радиации. Не исключено, что в данном случае мы сталкиваемся с генетическим дефектом процесса, обусловливающего формирование хромосомных мутаций, подобного процессу образования генных мутаций в условиях протекания SOS -индуцибельной мутагенной репарации в клетках прокариотов.

ВЫВОДЫ

1. Результаты, полученные при сравнении эффектов радиоадаптации клинически здоровых доноров и пациентов, страдающих различными наследственными синдромами, изучаемыми в работе, а также сравнение адаптивного ответа при индукции хромосомных аберраций /[- квантами и 8 - МОП, активированным УФ - светом, показывают, что адаптивный

ответ не связан с модификацией процесса репарации, протекает на стадии этапа поражения ДНК и заключается в изменении числа и спектра возникающих индуцированных повреждений ДНК.

2. Полученные в работе результаты свидетельствуют в пользу того, что защитный эффект интерферона связан с модификацией, по крайней мере, двух этапов общего процесса возникновения хромосомных аберраций -увеличение эффективности процесса репарации и уменьшение числа возникающих при действии радиации первичных повреждений ДНК.

3. Проведенное количественное и качественное сравнение защитного эффекта интерферона и радиоадаптивного ответа, а также данные, полученные при исследовании цитогенетического эффекта ¿'-квантов в условиях адаптации и введении интерферона показывают, что эти явления не являются независимыми. Вероятно, радиоадаптивный ответ представляет собой "нерепарационную" компоненту защитного действия интерферона.

4. Среди исследованных наследственных синдромов, дефектных по отдельным этапам репарационного процесса обнаружено, что в случае гомоцистинурии генетический дефект определяет не только изменение эффективности репарации ДНК, но и приводит к отсутствию развития радиоадаптивного ответа и, по-видимому, затрагивает этап возникновения индуцированных мутагенами первичных повреждений ДНК. В случае других синдромов (шизофрения, синдром Марфана, синдром Элерса -Данлоса) радиоадаптивный ответ оказывается ненарушенным. Однако, полученные данные указывают, что в случае синдрома Элерса - Данлоса может быть подавлен процесс формирования хромосомных аберраций на базе возникающих при действии ионизирующего излучения повреждений ДНК.

5. Обнаружена гетерогенность (полиморфизм) популяции человека по способности к индукции радиоадаптивного ответа. Причем, количественная оценка этого полиморфизма может указывать на то, что условия повышенной загрязненности радионуклидами в результате аварии на ЧАЭС, способствует его фенотипической реализации.

Основные положения диссертации опубликованы в работах:

1. Македонов Г.П., Цховребова Л.В., Якубовская Е.Л. Модифицированный микроядерный тест в лейкоцитах человека. В сб.: Экологические проблемы горных территорий. Тезисы докладов участников I Международной конференции. Владикавказ, 1992, с.336.

2. Македонов Г.П., АлехинаН.И., Цховребова Л.В., ЗасухинаГ.Д. Сравнение эффективности антикластогенного действия интерферона и адаптивного ответа. Радиобиология, 1993,33, 2, 256-264.

3. Македонов Г.П., Цховребова Л.В.

Цитогенетическое исследование радиоадаптивного ответа в репарационно-дефектных клетках человека. Материалы I съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), Саратов. Генетика (прилож), 1994, 30, с.94.

4. Цховребова JI.B., Македонов Г.П., Львова Г.Н., Чекова В.В., Максимова Т.Н., ЗасухинаГ.Д.

Радиоадаптивный ответ в лимфоцитах больных шизофренией. Радиационная биология. Радиоэкология, 1995,35, 5,665-669.

5. Македонов Г.П., Цховребова JI.B., Унжаков C.B., Семячкина А.Н., ВасильеваИ.М., ЗасухинаГ.Д.

Радиоадаптивный ответ в лимфоцитах детей, проживающих на территориях, загрязненных радионуклидами в результате аварии на ЧАЭС. Радиационная биология. Радиоэкология, 1997,37,4,640-644.

6. Македонов Г.П., Цховребова Л.В., Васильева И.М., Засухина Г.Д. Радиоадаптивный ответ и антимутагенное действие интерферона в клетках человека имеют общие пути защиты клеток от гамма-радиации. Доклады Академии Наук РАН, 1998,359,6,1-3.