Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние тактивина на структурные и функциональные свойства плазматических мембран лимфоцитов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние тактивина на структурные и функциональные свойства плазматических мембран лимфоцитов"

РГ Б ОД

I1'л 1 ' '

На правах рукописи

МОШКОВСКАЯ ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ ТАКТИВИНА НА СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН ЛИМФОЦИТОВ

(03.00.02 — биофизика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической медицины МЗ и МП РФ

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Азизова O.A.

доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАМН Арион В.Я.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Петрунии Д.Д.

кандидат биологических наук Осипов А.Н.

Ведущее учреждение • биологический факультет Московского государственно университета им.М.В.Ломоносова

Зашита диссертации состоится "/" /ti\tPn J 1995г. в "¿0часов на заседании специализированного ученого совета Д.084.66.01 при институте физико-химической медицины МЗ и M1I РФ по адресу: 119828, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1-а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института физико-химической медицины МЗ и МП РФ

Автореферат разослан "ЛР" 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Мурина М.А.

ОБЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время не подвергается сомнению центральная роль тимуса в процессах созревания и дифференцировки Т-лимфоцитов (Арион В.Я и др., 1981, L.Lefrancois et al., 1994). Удаление тимуса животным во взрослом состоянии приводит к ряду нарушений, обозначаемых как вторичный иммунодефицит. Многочисленные эксперименты, проведенные на лабораторных животных и клинические испытания показали, что Тактивин способен нормализовать вышеупомянутые нарушения (Арион В.Я., 1981, Арион В.Я., 1989). Было установлено, что препарат проявляет иммунобиорегуля-торные свойства в отношении лимфоцитов Т-ряда. Однако, до настоящего времени остаются невыясненными молекулярные механизмы, посредством которых осуществляется это воздействие. В частности, не было изучено, какое влияние Тактивин оказывает на плазматические мембраны Т-лимфоцитов. В связи с этим, представлялось актуальным исследовать действие препарата на структурные и функциональные свойства плазматических мембран лимфоцитов. Следует отметить, что функциональную активность лимфоцитов в эксперименте, как правило оценивают по их способности развивать ответ на митогены типа Конканавалин А (Кон А). Известно, что после взаимодействия активатора Кон А с рецепторами клеточной поверхности, инициируется целый каскад биохимических процессов (McDonald A.D., 1986, Crabtree G.R., 1994). С другой стороны в ряде работ было продемонстрировано, что уменьшение "микровязкости" плазматических мембран и увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ ([Са2"1"];) в лимфоцитах являются одними из самых ранних событий при митогенной стимуляции (Rozengurt Е., 1986, Berridge M.I., 1993). Однако, оставался невыясненным вопрос о том, какой вклад вносят различные биохимические процессы в развитие этих событий. Исследование ранних этапов активации лимфоцитов может внести существенный вклад в решение актуальной проблемы, связанной с выяснением молекулярного механизма действия иммуномодулятороп, в том числе, и Тактивина.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение изменений структурных и функциональных свойств плазматических мембран лимфоцитов, вызываемых развитием иммунодефицитного состояния (ИДС) и выяснение того, как влияет на эти изменения иммунорегуляторный препарат Тактивин.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

-4!. С помощью меч ода спиновых зондов изучить структурные изменения в плазматических мембранах лимфоцитов, возникающие в результате развития ИДС у лабораторных животных и у людей, с различными патологиями.

2. Используя метод спиновых зондов, выяснить, к каким изменениям в функциональной активности плазматических мембран лимфоцитов, будет приводить развитие ИДС у лабораторных животных и у людей, с нарушениями иммунной системы.

3. Исследовать какое влияние будет оказывать Тактивин на изменения структурных и функциональных свойств плазматических мембран лимфоцитов, вызванные развитием ИДС у лабораторных животных, в опытах in vitro.

4. Сравнить биорегуляторное действие Тактивина на структурные и функциональные свойства плазматических мембран лимфоцитов при развитии ИДС у лабораторных животных в опытах in vitro и in vivo.

5. На примере таких патологий, как аутоиммунный тироидит и рассеяинный склероз, проследить иммунокоррегирующес воздействие Тактивина на структурные и функциональные свойства плазматических мембран лимфоцитов.

6. С помощью метода спиновых зондов исследовать роль различных биохимических процессов в изменении "микровязкости" плазматических мембран лимфоцитов на ранних этапах их активации Кон А.

7. Используя флуоресцентный зонд квин-2/AM, изучить вклад различных биохимических процессов в Кон А-индуцированное увеличение [Ca2+]¡ в лимфоцитах периферической крови человека.

Научная новизна. С помощью метода спиновых зондов впервые обнаружено, что развитие иммунодефицитного состояния у животных (тимэктомия) и у людей (аутоиммунный тироидиг, рассеянный склероз) приводит к нарушениям в структурной организации плазматических мембран лимфоцитов, проявляющимся в уменьшении "микровязкости" фосфолипидного бислоя. Эти нарушения, в свою очередь, приводят к угнетению функциональной активности лимфоцитов.

Впервые продемонстрировано, что биорегуляторное воздействие Тактивина направлено непосредственно па плазматическую мембрану лимфоцитов и приводит к нормализации как структурных, так и функциональных свойств. Причем, впервые было установлено, что положительное воздействие препарат оказывает на эти свойства плазматических мембран лимфоцитов в опытах и in vitro, и in vivo.

Впервые было показано, что проведение иммунокоррегуруюшей терапии Тактивином. приводит к нормализации не только иммунологических показателей, а также структурных и функциональных свойств плазматических мембран лимфоцитов больных аутоиммунным тироидитом и рассеянным склерозом.

Более того, впервые было изучено в динамике изменение "микровязкости" мембран лимфоцитов больных аутоиммунным тироидитом. Обнаружена корреляция между изменением "микровязкостц" мембран лимфоцитов и иммунологическими параметрами. Показано, что изменение в мембранах лимфоцитов регистрируется раньше, чем изменение иммунологического статуса, определяемое иммунологическими методами.,

Практическое значение работы. Результаты данной работы позволяют расширить представление о молекулярных механизмах действия Тактивина на лимфоциты, что может быть использовано для определения эффективности проведения иммупокоррегирующей терапии при ряде патологий, связанных с развитием ИДС. Кроме того, данное исследование может быть основой для разработки экспресс-метода диагностики ИДС.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на: IV Всесоюзной конференции по патологии клетки (Москва, 1987), VI Международном симпозиуме по ЭПР-спектроскопии в биохимии, молекулярной биологии и медицине (Чехословакия, 1988), VII и VIII Всесоюзных конференциях "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1989 и 1990), Всесоюзной конференции "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эффек-торные клетки" (Суздаль, 1989). Кроме того, результаты исследований обсуждались на научных конференциях НИИ ФХМ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, 2 статьи находятся в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, описания результатов исследования (5 глав), обсуждения и выводов. Перечень цитируемой литературы включает 247 источников: 87 отечественных и 160 зарубежных. Диссертация содержит 27 рисунков и 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В эксперименте использовали лимфоциты периферической крови человека, выделенные по методике (Воут, 1968). Для создания модели иммунодефи-цитпого состояния мышам линии С57В1/6 (самцы, вес 16-18 г., возраст 6-8 недель) удаляли тимус (тимэктомия). Через 7-10 дней после операции выделяли лимфоциты селезенки по методике (Натвич Дж.Б. и др., 1980) с некоторыми модификациями.

Инкубацию лимфоцитов с Тактивином и все спектральные измерения проводили при физиологической температуре (37°С).

С помощью спинового зонда 5-доксилстеариновой кислоты регистрировали изменения структурных свойств плазматических мембран лимфоцитов. Эти

изменения оценивали, рассчитывая параметр упорядоченности спинового зонда (S), характеризующий состояние "микровязкости" плазматических мембран лимфоцитов. Параметр S может принимать значения от 0 до 1, причем, чем больше S, тем больше "микровязкость" плазматических мембран. Спектры ЭПР записывали на радиоспектрометре 'Varían Е-4" (США).

Измерения [Ca2+]¡ были проведены с использованием известных методик (Tsicn et al. 1982) на спектрофлуориметре "Hitachi F-4000" (Япония).

Определение сывороточной тимической активности (СТА) проводили как описаио в работе Саниной И.В. (1985) с использованием мышей линии С57В1/6. Сывороточную тимическую активность и тимэктомию проводили совместно с к.б.н. И.В.Зиминой и мл.н.с. О.Б.Сысоевой.

Иммунокоррегирующая терапия Тактивином больным аутоиммунным тироидитом и рассеянным склерозом проводилась в течение 7 дней по схеме 1,2,3,5,7-ой день по 1,0 мл 0,01 % раствора подкожно. Диагноз и лечение проводилось к.м.н. Петуаиной H.A. и Сакаевой H.A. в клинике Медицинской академии им. Сеченова.

Статистическая обработка цифрового материала была проведена по стандартной программе выявления достоверных различий между средними по критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

Глава 1. Исследование роли различных биохимических процессов в изменении "микровязкости" плазматических мембран лимфоцитов на ранних стадиях активации.

Прежде чем приступить к решению основных задач диссертационной работы, связанных с изучением влияния Тактивина на структурные и функциональные свойства плазматических мембран лимфоцитов, необходимо было найти такой методический подход, который позволил бы регистрировать изменения в этих свойствах. С одной стороны, известно, что с помощью метода спиновых зондов можно получать информацию не только об ориентации и подвижности жирнокислотных цепей фосфолипидов в мембране, но и о тонких структурных изменениях, происходящих в микроокружении зонда при действии целого ряда факторов. С другой стороны, в большинстве работ функциональную активность лимфоцитов оценивают по их способности развивать ответ на митогены типа Кон А. Следует отметить, что уже в первые минуты после связывания Кон А с рецепторами клеточной поверхности, в плазматических мембранах лимфоцитов индуцируется целый ряд биохимических процессов, сопро-

вождагощихся изменением "микровязкости" фосфолипидного бислоя. Эти изменения можно регистрировать с помощью метола спиновых зондов.

На рис.1 представлен график изменения параметра упорядоченности (Б) спинового зонда З-доксилстеариновой кислоты в плазматических мембранах лимфоцитов от времени действия Кон А. 0.62

3 5

о

0

1 I о

3-

о

ТЭ

о; §•

с

а 5

С!

г

4 о.

0.60

0.58

0.56 -

т

12

Время действия, мин. Рис.1 Изменение параметра упорядоченности (Б) 5-доксилстеариновой кислоты в плазматических мембранах лимфоцитов периферической крови человека при действии Конканавалина А -5 мкг/мл.

Как видно из графика, в первые 5 минут действия ми-тогена, происходит уменьшение параметра упорядоченности. Другими словами, Кон А в первые минуты действия, вызывает уменьшение

".микровязкости" плазматических мембран лимфоцитов. Как уже отметалось, сразу после связывания индуктора активации с рецепторами, в плазматических мембранах запускается целый каскад биохимических процессов. С помощью ингибиторного анализа, мы изучали, какой вклад вносят различные биохимические процессы в наблюдаемое нами изменение "микровязкости" плазматических мембран лимфоцитов на ранних стадиях активации. Результаты экспериментов представлены в таблице 1.

Как видно из представленных результатов, в плазматических мембранах лимфоцитов, преинкубированных с ингибиторами различных биохимических процессов, не наблюдали уменьшения значения параметра 5 после 5 минут действия Кон А. Кроме того, обращает на себя внимание тот факт, что отсутствие во внеклеточной среде Са2+, приводило к более слабым изменениям параметра упорядоченности по сравнению с контролем (таблица 1).

Таким образом, в результате исследования роли различных биохимических процессов в изменении "микровязкости" плазматических мембран лимфоцитов периферической крови человека на ранних этапах их взаимодействия с Кон А было обнаружено, что все изученные процессы, такие, как активация фосфолипазы А?, метаболизм арахидоновой кислоты, генерация циклических нуклеотидов, а также функционирование цитоскелетной системы вносят определенный вклад в уменьшение "микровязкости" фосфолипидного бислоя в первые минуты мигогеппой стимуляции лимфоцитов.

Таблица /. Действие агентов модифицирующих индуцированное Конканавалином А изменение "микровязкости" плазматических мембран лимфоцитов

эо

Агент Мишень действия Эо ^КонА после 5 мин. действия КонА

Контроль 0,615+0,004 0,570±0,003

Среда без Са2+ 0,612±0,003 0,598±0,002

4-бромфенацилбромид Ингибитор Фосфолипазы А2 0,592±0,002 0,603±0,004

Аспирин Ингибитор циклооксигеназы 0,608±0,003 0,614+0,003

Нордигидро1 уаярстиковая кислота Ингибитор липоксигеназы 0,610+0,004 0,612±0,003

Форсколин Активат ор аденилатциклазы 0,590±0,002 0,595±0,004

Цитохалазин Б Ингибитор микрофиламентов 0,602+0,003 0,605+0,002

Колхицин Ингибитор микротрубочек 0,585+0,004 0,587±0,004

Глава 2. Исследование Кон А-индуцироваипых С'а2+-сигналов в лимфоцитах периферической крови человека па ранних этапах активации.

Как уже отмечалось, ионы Са2+ играют важную роль в передаче внутриклеточных сигналов (Berridge, 1987, 1993). Ключевым событием, сопровождающим это участие, является повышение внутриклеточной концентрации Са2+ ([Са24"];) (ОпгШет е1 а!., 1989). Известно, что увеличение [Са2+]| при митоген-ной стимуляции лимфоцитов обусловлено как входом Са2+ из внеклеточной среды, так и мобилизацией Са2+ из внутриклеточных депо (ОеИапс1, 1988). Кроме того, многочисленные эксперименты указывают, что большинство биохимических процессов, активируемых на ранних стадиях взаимодействия мито-гена и лимфоцитов, протекают с участием Са2+. Однако, несмотря на значительные успехи, достигнутые в изучении молекулярных механизмов, участвующих в генерации Са-сигналов, многие вопросы остаются невыясненными. В частности, остаются неясными механизмы усиления входа Са2+, а также роль различных биохимических процессов, индуцируемых стимулом, в формировании ионных сигналов.

Для выяснения вопроса, как будет сказываться на генерации Са-сигнала отсутствие Са2+ во внеклеточной среде, изучали изменение [Са2+]| в лимфоцитах периферической крови человека при действии Кои А в Са2+-содержащей среде и в бсскальцисвом буфере. На рис.2 показана кинетика изменения [Са2+]; в лимфоцитах под действием Кон А в стандартной среде (1) и в буферном растворе, несодержашем Са2+ (2).

Максимальное увеличение [Са2+]^ наблюдалось через 2-3 минуты после добавления Кон А, затем [Са2+]; медленно снижалась до нового уровня, несколько превышающего исходный. На рисунке видно, что Са2+-ответ на Кон А, наблюдаемый в бсскальциевой среде, составляет 30% от ответа в стандартной срсдс. Это подтверждает тот факт, что повышение [Са2+]1, вызываемое Кон А, является следствием как входа ионов Са2+ из внеклеточной среды, так и их мобилизации из внутриклеточных депо.

Для выяснения вопроса, участвуют ли Са2+-каналы в транспорте Са2+ из внеклеточной среды в лимфоциты, изучали влияние на генерацию Са-ответа блокатора Са2+-каналов верапамила. Результаты экспериментов представлены в таблице 2.

[Са21, нМ

300-

200-

100- ¿¿ьмкцЪ

2

1

1мин.

Рис.2 Повышение внутриклеточного Са2+ ([Са2+]|) в лимфоцитах периферической крови человека под действием Кон А (10 мкг/мл) в Са2+ -содержащей среде (1) и в буферном растворе, содержащем 1 мМ ЭГТА (2). Стрелками отмечены моменты добавления Кон А.

: Как видно верапамил дозозависимо ингибирует повышение [Са2+]| как в стандартной среде, так и в среде, не содержащей Са2+. Такое совпадение эффектов может указывать, с одной стороны на то, что верапамил одновременно способен подавлять как вход Са2+ из внеклеточной среды, так и мобилизацию этих ионов из внутриклеточных депо, с другой стороны, возможно влияние самого блокатора на механизмы, регулирующие оба пути поступления Са2+. Например, в нейтрофилах верапамил вызывает повышение внутриклеточного уровня цАМФ, приводя к ингибированию генерации Са2+-сигналов.

Как отмечалось выше, на ранних этапах взаимодействия митогена с лимфоцитами, в клетках инициируется целый каскад биохимических процессов. Большинство из этих процессов протекают с участием Са2+. Для выяснения вопроса, какой вклад в увеличение [Са2+]| вносят такие процессы, как высвобождение арахидоновой кислоты и дальнейший ее метаболизм по липоксигеназно-му и циклооксигеназному пути изучали изменение [Са2+]; в Кон А-индуцированных лимфоцитах в присутствии ингибиторов: 4-бромфенацилбромида - блокатора фосфолипазы Ат (частично фосфолипазы С), нордигидрогуаяретиковой кислоты (НДГА)- блокатора липоксигеназного окисления арахидоновой кислоты и индометзципа - блокатора циклооксиге-назного окисления арахидоновой кислоты. Результаты экспериментов пред-

ставлены в таблице 2. Как видно, инкубация клеток с 4-бромфенацилбромидом приводит к практически полному ингибированию Са2+-сигнала. Кроме того, НДГА при концентрации 20 мкМ полностью подавляет Кон А-индуцировнный Са2+-ответ. В тоже время, действие индометацина намного слабее (таблица 2).

Таблица 2. Действие агентов, модифицирующих индуцированный Кон-канавалином А Са2+-сигнал в лимфоцитах периферической крови человека.

Агент Концентрация, мкМ Мишень действия Увеличение [Са2+],, % от контроля

Среда Хен-кса бескальциевый буфер

Верапамил 29 58 116 Блокатор Са2+-каналов 65,3+5,5 53,8+8,1 35,1±4,5 64,1+6,1 56,3+7,4 34,5+5,1

Форсколин 1 Активатор аденилатциклазы 0 0

Нордигидрогу-аяретиковая кислота 10 20 Блокатор липоксигеназы 35,2+5,3 4,3+4,1 -

Индометацин 10 Блокатор циклооксигеназы 79,9+8,2 —

4-Бромфена-цилбромид 20 Блокатор Фосфолипазы Аг 3,2±2,5 —

В предыдущей главе было показано, что увеличение внутриклеточной сонцентрации цАМФ является отрицательным сигналом на ранних этапах ми-0 ген ной стимуляции лимфоцитов. Интересно было посмотреть, влияет ли почтение уровня цАМФ на генерацию Са-сигнала. Для этого изучали действие 1Ктиватора аденилатциклазы форсколина на увеличение [Са2+]| в Кон А-шдуцированных лимфоцитах. Результаты экспериментов представлены в таб-1ице 2. Как видно, форсколин полностью подавляет Са-сигнал как в стандарт-юй среде, так и в бескальциевом буфере. Следовательно, повышение уровня щутриклеточного цАМФ подавляло Са2+, обусловленный как входом, так и тобилизацией Са2+ из внутриклеточных депо.

Таким образом, в результате экспериментов по изучению Кон А-[ндуцированных Са-сигналов в лимфоцитах периферической крови человека ¡ыло обнаружено, что в увеличении [Са2+]| принимают участие такие процес-

сы, как активация фосфолипаз А2 и С, липоксигеназное окисление арахидоно-вой кислоты, а также генерация циклических нуклеотидов.

Глава 3. Структурные и функциональные свойства плазматических мембран лимфоцитов в норме и при развитии ИДС и влияние на них Тактивина в опытах in vitro.

Для создания вторичного иммунодефицита у мышей удаляли тимус (тимэктомия). Используя спиновый зонд 5-доксилстеариновую кислоту, определяли параметр упорядоченности (S), характеризующий "микровязкость" плазматических мембран лимфоцитов селезенки интактных и гимэктомирован-ных мышей. Результаты экспериментов представлены на рис.3. Следует отметить, что параметр S может принимать значения от 0 до 1. При S-1 фосфоли-пидный бислой максимально упорядочен, а при S=0 "микровязкость" плазматических мембран минимальна. Следовательно, плазматические мембраны с меньшей "микровязкостью" характеризуются меньшими значениями параметра S. На рис.3 начальные точки кривых - это значения параметра упорядоченности, характеризующие "микровязкость" плазматических мембран лимфоцитов селезенки интактных (кривая 1) и тимэктомированных (кривая 2) мышей.

Видно, что значения параметра в случае интактных животных больше по сравнению со значениями этого показателя для бестимусных мышей.

Таким образом, плазматические мембраны лимфоцитов, не прошедших всех стадий дифференцировки в отсутствии тимуса, характеризуются

меньшей "микровязкостью" по сравнению с лимфоцитами, выделенными из селезенки интактных животных.

Можно ожидать, что наблюдаемые нами изменения структурных свойств плазматических мембран при тимэк-томии, повлекут за собой на-

0.58

со

3

S -

и

о

ж

г ш 0.5 В —

я-

о

<о

в;

а

о

с

а 0.54 —

Е

а>

г

га -

а

to

с

0.52 —1

0 4 8 1

Время, мин.

Рис.3 Изменение параметра упорядоченности (Э) 5-доксилстеариновой кислоты при действии Конканавалина А в плазматических мембранах лимфоцитов селезенки интактных (1) и тимэктомированных (2) мышей.

рушения и их функциональных свойств.

Для оценки функциональной активности изучали изменение параметра упорядоченности 8 при действии Коп А. Результаты экспериментов представлены на рис.3. Как видно, в случае лимфоцитов селезенки шггактных животных, в плазматических мембранах регистрировали уменьшение параметра Б в первые минуты действия митогена (кривая I). В тоже время, в плазматических мембранах лимфоцитов, выделенных из селезенки тимэктомированных мышей, при действии Кон А практически никаких изменений не наблюдали (кривая 2),

Таким образом, в плазматических мембранах лимфоцитов селезенки бсс-тимуспых животных Кон А не индуцирует процессы, приводящие к уменьшению "микровязкости" фосфолипидиого бислоя, что свидетельствует о не способности этих клеток развивать ответ на митоген. Другими словами, тимэкто-мия приводит к нарушению функциональных свойств плазматических мембран лимфоцитов.

Возникает вопрос: будет ли инкубация лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей с Тактивином восстанавливать нарушения в структурных и функциональных свойствах плазматических мембран этих клеток?

Для ответа на этот вопрос лимфоциты инкубировали с препаратом в течение 40, 80, 120 и 160 минут и затем регистрировали значения параметра упорядоченности 8. Результаты экспериментов представлены на рис.4.

&&38&Й - тимэитомия

0 40 80 120 160 время инкубации с Тактивином, мин.

Рис.4 Изменение параметра упорядоченности (Б) 5-доксилстеариновой кислоты в плазматических мембранах лимфоцитов селезенки интактных и тимэктомированных мышей после инкубации с Тактивином.

Как видно, после 40 минут инкубации "микровязкость" плазматических мембран характеризуется значениями параметра Б, несколько превышающими

пормальные. Причем, более даительные времена инкубации приводят к аналогичному эффекту.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было обнаружено, что после 40 минут инкубации лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей с Тактивином "микровязкость" фосфолипидного бислоя этих клеток увеличивается практически до нормальных значений.

Можно ожидать, что эти структурные изменения при действии Тактивина, в свою очередь повлекут за собой коррекцию функциональных свойств плазматических мембран лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей.

Для юго, чтобы выяснить, будет ли Тактивин восстанавливать функциональную активность плазматических мембран лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей, изучали изменение параметра S при действии Кон А после инкубации этих клеток с препаратом.. Результаты экспериментов представлены на рис.5.

Как видно, в том случае, когда клетки не инкубировались с Тактивином, не наблюдали изменение параметра S при действии Кон А (рис.5А). Однако, инкубация лимфоцитов с препаратом уже в течение 40 минут приводила к тому, что в плазматических мембранах этих клеток регистрировали некоторое уменьшение параметра S при действии Кон А (рис.5Б). Более того, при увеличении времени инкубации до 80 минут, интенсивность уменьшения этого показателя возрастала (рис.5В).

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было установлено, что Тактивин восстанавливает нарушения структурных и функциональных свойств плазматических мембран лимфоцитов, вызванные развитием ИДС у мышей.

Глава 4. Исследование действия Тактивина на структурные и функциональные свойства плазматических мембран лимфоцитов селезенки интактных и тимэктомированных мышей в опытах in vivo.

Следует отметить, что всс представленные в предыдущей главе результаты по изучению влияния Тактивина на структурные и функциональные свойства плазматических мембран лимфоцитов интактных и тимэктомированных мышей были получены в опытах in vitro. Однако, как известно, этот препарат давно и успешно применяется в клинической практике при лечении различных патологий, связанных с нарушениями Т-звена иммунитета. И, с этой точки зрения, интересно было посмотреть, какое влияние будет оказывать Тактивин на структурные и функциональные свойства плазматических лимфоцитов селезенки интактных и тимэктомированных мышей в опытах in vivo.

со

Рис.5 Изменение параметра упорядоченности (Б) 5-доксилстеариновой кислоты при действии Конканавалина А в плазматических мембранах лимфоцитов селезенки интактных (Норма) и тимэктомированных мышей до инкубации с Тактивином (А) и преинкубированных сТакгивином 40 мин. (Б); 80 мин. (В); 120 мин. (Г); 160 мин. (Д).

Препарат вводили в виде одноразовой инъекции, в количестве 5 мкг в 0,25 мл физиологического раствора на мышь. Через 24 часа определяли параметр упорядоченности 5-доксилстеариновой кислоты в плазматических мембранах лимфоцитов селезенки (Бц) и сывороточную тимическую активность (СТА), характеризующую уровень тимических факторов в крови. Результаты экспериментов представлены в таблице 3.

Как видно, оба показателя до введения животным Тактивина характеризовались более низкими по сравнению с нормой значениями. Однако, уже одноразовая инъекция приводила к тому, что значения СТА изменялись практически

до нормы, а значения 5у достигали несколько больших по сравнению с нормой величин.

Таблица 3. Параметр упорядоченности 5-доксилстеариновой кислоты в мембранах лимфоцитов селезенки (во) и уровень сывороточной ти-мической активности (СТА)* тимэктомированных мышей до и после коррекции Тактивином.

Мыши СТА, ¡оо 2 Эо

Интактные 6 0,571±0,002

Тимэктомированые до 2 0,545+0,003

коррекции Тактивином

Тимэктомированные после 5-6 0,598+0,003

коррекции Тактивином

' Сывороточная тимическая активность, определяемая в данном тесте, аналогична сывороточному типическому фактору Баха

0.60 -1

0 <о

1

с

I

о

г

0.56

0.52Г

1 ■ норма

2 - тимэктомия (ТЭ)

3 - ТЭ + Тактивин

4 а

время действия Кон А, мин.

12

Рис.6 Изменение параметра упорядоченности (Б) 5-доксилстеариновой кислоты при действии Конканавалина А в плазматических мембранах лимфоцитов селезенки интактных (1) и тимэктомированных мышей, не получавших (2) и получавших (3) одноразовую инъекцию Тактивина.

Следует напомнить, что тимэктомия вызывает изменения не только СТА и "микровязкости" плазматических мембран лимфоцитов селезенки, но и оказывает угнетающее действие на функциональную активность этих клеток. Возникает вопрос, будет ли инъекция Тактивина восстанавливать и функциональные свойства плазматических мембран лимфоцитов селезенки бестимусных животных? Для ответа на этот вопрос регистрировали изменение параметра Б при действии Кон А. Результаты экспериментов

представлены на рис.6.

Видно, что уже одноразовая доза препарата приводила к тому, что Кон Л вызывал изменения в плазматических мембранах лимфоцитов селезенки тимэк-томированных мьгшей (кривая 3), аналогичные тем, которые наблюдались в случае интактных животных (кривая 1). В тоже время, митоген не индуцировал подобные изменения в плазматических мембранах лимфоцитов, выделенных из селезенки мышей, не получавших Тактивин (кривая 2).

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было обнаружено, что Тактивин способен нормализовать структурные и функциональные свойства плазматических мембран лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей не только действуя in vitro, но и in vivo.

Глава 5. Структурные и функциональные свойства плазматических мембран лимфоцитов периферической крови человека в норме и при развитии ИДС и их коррекция Тактивином.

Для того, чтобы выяснить, будет ли Тактивин влиять па структурные свойства плазматических мембран лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, изучали изменение параметра S при действии Тактивина. Результаты экспериментов представлены на рис.7 (кривая 2).

Как видно, препарат практически не вызывал изменения значений параметра упорядоченности спинового зонда в плазматических мембранах. Следует отметить, что увеличение дозы препарата и времени инкубации не приводило к заметным изменениям "микровязкости" фосфолипид-ного бислоя. Однако, возможно Тактивин оказывал влияние на функциональные свойства плазматических мембран , не вызывая изменений в их структурной организации? Для выяснения этого вопроса инкубировали лимфоциты с Тактивином и затем изучали изменение параметра S при действии Кон А. Как видно на рис.7, после 40

Время, мин.

Рис. 7 Изменение параметра упорядоченности (Б) 5-доксилстеариновой кислоты в плазматических мембранах лимфоцитов периферической крови человека при действии Конканавалина А (1); Тактивина (2); Конканавалина А после инкубации лимфоцитов с Тактивином (3).

ми нут инкубации с препаратом, регистрировали изменение параметра Б при действии Кон А (кривая 3), аналогичные тому, которое наблюдается в плазматических мембранах лимфоцитов, не инкубированных с Тактивином (кривая 1).

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было обнаружено, что Тактивин пс влияет на структурные и функциональные свойства плазматических мембран лимфоцитов периферической крови здоровых доноров.

Что же будет наблюдаться при исследовании структурных и функциональных свойств плазматических мембран лимфоцитов больных с нарушениями Т-звена иммуните? В экспериментах использовали лимфоциты, выделенные из крови больных аутоиммунным тироидитом. Как известно, развитие этого заболевания сопровождается нарушениями в количественном соотношении Т-хслперов и Т-супрессоров, снижением функциональной активности Т-лимфоцитов, определяемой в иммунологических тестах и др. Интересно было посмотреть, будет ли эта патология приводить к нарушениям структурных свойств плазматических мембран лимфоцитов. Для этого определяли параметр Бо и уровень СТА до лечения Тактивином (начальные точки на рис.8). Как видно, оба показателя характеризуются более низкими по сравнению с нормой значениями. Будет ли проведение иммунокоррегирующей терапии приводит к нормализации этих параметров?

■о

а

О

£ о. Е

О) £

0.61 -|

0.60

0.53 ->

I 1 1 1 I 1 Г О 4 В 12

Время, недели

4 а 12

Время, недели

Наши данные свидетельствуют, что через 2 педели после окончания курса

Рис.8 Изменение параметра упорядоченности (Б) 5-доксилстеариновой кислоты в плазматических мембранах лимфоцитов [А] и уровня сывороточной тимической активности (СТА) [Б] у больных аутоиммунным тироидитом после окончания курса лечения Тактивином

лечения оба показателя достигают нормальных значений (рис.8). Однако, с уве-

личением времени, прошедшего после завершения инъекций, наблюдается снижение их значений. Обращает на себя внимание гот факт, что ухудшение в состоянии больных на уровне плазматических мембран регистрируется несколько раньше (рис.8А), чем иммунологическим методом (рис.8Б).

Таким образом, было обнаружено, что развитие аутоиммунного тироиди-та сопровождается нарушениями структурных свойств плазматических мембран лимфоцитов, проведение курса лечения Тактивииом приводит к нормализации этих нарушений.

Будут ли при аутоиммунном тироидите наблюдаться нарушения функциональных свойств плазматических мембран лимфоцитов и какое влияние на эти нарушения будет оказывать Тактивин? Для ответа на этот вопрос изучали изменение параметра Б при действии Кон А до и после проведения иммунокорре-гирующей терапии. Результаты экспериментов представлены на рис.9

и 0.62 —1 а" 6

0.60

0.58

0 5 в

норма

о 5 ю

Время действия Кон А, мин.

0.62-

0.60-

0.58-

0.56 -1

0.58

до печения

8 ю

2 месяца после приема Тактивина

0.60 ■

0.58-

0.56 ->

1 недели госле приема Такпвина

П—' I

В 10

4 месяца после приема Тактивина

"1 10

Рис.9 Изменение параметра упорядоченности (Б) 5-доксилстеариновой кислоты в плазматических мембранах лимфоцитов здоровых доноров и больных аутоиммунным тироидитом до и после курса лечения Тактивином

Как видно, до проведения курса лечения, не регистрировали изменение 5 при действии Кон А (рис.9А). Однако, через 2 недели после приема препарата, наблюдали изменение параметра Б при действии Кон А (рис.9Б), аналогичное тому, которое регистрировали в лимфоцитах здоровых доноров (рис.9 норма). Следует отметить, что способность лимфоцитов развивать ответ на митоген несколько снижалась при увеличении времени, прошедшего после окончания курса лечения (рис.9В и 9Г).

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было установлено, что развитие аутоиммунного тироидита приводит к нарушениям структурных и функциональных свойств плазматических мембран лимфоцитов, а также к снижению уровня СТА в крови больных. Однако, проведение иммунокорре-гирующсй терапии Тактивином нормализует эти нарушения. Обнаруженное снижение показателей при увеличении времени, прошедшего после окончания приема препарата, подтверждает целесообразность повторных курсов лечения Тактивином.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Результаты, полученные в наших экспериментах, свидетельствуют, что развитие ИДС, вызванное тимэктомией у животных и аутоиммунным тироиди-том у людей, приводит к снижению, по сравнению с нормой, значений параметра Б, характеризующего состояние "микровязкости" плазматических мембран лимфоцитов. Чем же может быть вызвано то обстоятельство, что плазматические мембраны лимфоцитов при ИДС обладают меньшей, по сравнению с нормой, "микровязкостью"? Можно предположить, что причина заключается в нарушениях в процессах созревания и дифференцировки Т-лимфоцитов, вызванных развитием ИДС. Эти нарушения приводят к тому, что в клеточной суспензии, с одной стороны, происходит увеличение содержания незрелых Т-лимфоцитов, а, с другой стороны, уменьшение соотношения Т/В лимфоцитов, за счет снижения общего количества Т-лимфоцитов. Отсутствие на клеточной поверхности незрелых Т-лимфоцитов маркеров Т-ряда и специфических рецепторов может приводить к юму, что плазматические мембраны этих клеток будут обладать меньшей "микровязкостью", по сравнению с Т-лимфопитами, прошедшими все стадии созревания и дифференцировки. Кроме того, увеличение содержания в клеточной суспензии В-лимфоцитов, плазматические мембраны которых, как показано в работе (Добрецов и др., 1980) характеризуются меньшей, по сравнению с Т-лимфоцитами "микровязкостью", может так же вносит определенный вклад в наблюдаемое снижение значений параметра Б при развитии ИДС.

Накопление незрелых Т-лимфоцитов и уменьшение соотношения Т/В лимфоцитов приводя! и к тому, что не наблюдается изменения "микровязкости" плазматических мембран лимфоцитов при их взаимодействии с Кон А. Резуль-

таты, представленные в главе 1, свидетельствуют, что в первые минуты мито-генной стимуляции, происходит уменьшение "микровязкости" плазматических мембран. Первым и необходимым условием для запуска целого каскада биохимических процессов, вносящих свой вклад в это уменьшение "микровязкости", является связывание активатора со специфическими рецепторами. Отсутствие эт их рецепторов, вызванное нарушениями в процессах созревания и дифферен-цировки приводят к не способности и лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей, и лимфоцитов периферической крови больных аутоиммунным ти-роидитом развивать ответ на Кон А.

Как свидетельствуют полученные результаты, Тактивип способен восстанавливать вышеупомянутые нарушения структурных свойств плазматических мембран лимфоцитов. Причем, нормализующее действие препарата было обнаружено и, в случае лимфоцитов селезенки бестимусных животных, и, в случае лимфоцитов периферической крови больных аутоиммунным тироидитом. Следует отметить, что положительный эффект был выявлен как в опытах in vitrd, так и in vivo. Инкубация клеток с Тактивином и проведение иммунокорреги-рующей терапии приводило к увеличению "микровязкости" практически до нормальных значений. Можно предположить, что это увеличение связано с синтезом и экспрессией на клеточной поверхности рецепторов, характерных для зрелых Т-лимфоцитов. Это предположение подтверждается данными других авторов о том, что не только Тактивин (Arion V.Ya., 1989), но и другие препараты тимуса (Goldstein et al., 1981) способствуют синтезу и экспрессии ряда рецепторов.

То обстоятельство, что после инкубации лимфоцитов с Тактивином и проведения курса лечения препаратом, наблюдается изменение "микровязкости" плазматических мембран при действии Кон А, является также подтверждением того, что Тактивин инициирует синтез и экспрессию на клеточной поверхности специфических рецепторов. Связывание Кон А с этими рецепторами запускает актнвационные процессы, сопровождающиеся уменьшением "микровязкости" плазматических мембран.

ВЫВОДЫ

1. С помощью метода спиновых зондов показано, что значения параметра упорядоченности 5-доксилстеариновой кислоты, характеризующего состояние "микровязкости" плазматических мембран лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей, меньше, чем у интактных животных. Эти нарушения структурных свойств плазматических мембран являются одной из причин угнетения их функциональной активности.

2. Обнаружено, что инкубация лимфоцитов селезенки бестимусных мышей с Тактивином приводит к нормализации как структурных, так и функциональных свойств плазматических мембран этих клеток.

-223. Установлено, что одноразовые инъекции Тактивина тимэктомирован-iibLM мышам приводят к нормализации как структурных, так и функциональных свойств плазматических мембран лимфоцитов селезенки этих животных.

4. Обнаружено, что одноразовые инъекции субфракциями Тактивина приводят к нормализации структурных свойств плазматических мембран лимфоцитов селсзспки, однако, их действие на функциональные свойства неоднозначно.

5. С помощью метода спиновых зондов показано, что развитие таких патологий, как рассеянный склероз и аутоиммунный тироидит приводит к нарушениям структурных и функциональных свойств плазматических мембран лимфоцитов периферической крови.

6. Установлено, что проведение курса лечения Тактивином приводит к нормализации как структурных, так и функциональных свойств плазматических мембран лимфоцитов периферической крови. Кроме того, в случае аутоиммунного тироидита было обнаружено, что ухудшение в состоянии больных на уровне плазматических мембран регистрируется несколько раньше, чем иммунологическими методами.

7. С помощью метода спиновых зондов было показано, что в уменьшение "микровязкости" плазматических мембран лимфоцитов периферической крови после связывания рецепторов клеточной поверхности с Кон А, вносят вклад все изученные биохимические процессы, индуцированные на ранних этапах активации.

8. С помощью флуоресцентного зонда квин-2/AM было обнаружено, что основной вклад в Кон А-индуцированное увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ па ранних этапах активации вносит вход Са2+ из внеклеточной среды. Кроме того, было продемонстрировано, что в развитии Са-ответа на митоген принимают участие такие биохимические процессы, как активация фосфолипаз А-2 и С, генерация циклических нуклеотидов, липоксигеназное окисление арахидоновой кислоты.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мошковская Е.Ю., Азизова O.A., Арион В.Я. Исследование взаимодействия Тактивина с мембранами лимфоцитов. 1У Всесоюзная конференция по патологии клетки. 25-27 ноября 1987, Москва. Тезисы докладов. Москва, 1987, с.5.

2. Мошковская Е.Ю., Азизова O.A., Арион В.Я., Санина И.В. Исследование действия субфракций Тактивина на лимфоциты селезенки мышей методом спиновых зондов. У11 Всесоюзная конференция "Магнитный резонанс в биологии и медицине". Май 1989, Звенигород. Тезисы устных сообщений и стендовых докладов. Черноголовка, 1989, с. 199-200.

3. Мошковская Е.Ю., Азизова O.A. Изучение ранних стадий активации лимфоцитов периферической крови человека методом спиновых зондов. Роль продук-

тов метаболизма арахидоновой кислоты. УН Всесоюзная конференция "Магнитный резонанс в биологии и медицине". Май 1989, Звенигород. Тезисы устных сообщений и стендовых докладов. Черноголовка, 1989, с.201.

4. Азизова O.A.. Мошковская Е.Ю., Арион В.Я., Портнова А.П. Исследование методом спиновых зондов действия Тактивина па мембраны лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей // Биологические мембраны, 1989, т.6, N11, с.1203-1207.

5. Гуковская A.C., Пулидо У.А., Мошковская Е.Ю., Борин M.JI., Азизова O.A. Роль липоксигеназного пути в генерации Са2+-снгнала в лимфоидных клетках. Всесоюзная конференция "Механизмы действия медиаторов и гормонов на эф-фекторные клетки". Суздаль, 1989. Тезисы докладов. С.53.

6. Арион В.Я., Мошковкая Е.Ю., Азизова O.A., Зимина И.В. Восстановление Тактивином и его субфракциями структуры мембран сплеиоцитов тимэктоми-рованных мышей У/ Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1990, N7, с.53-57.

7. Мошковская Е.Ю., Борин M.JI., Гуковская A.C., Азизова O.A. Свойства Конкаиавалип А-индуцированных сигналов в лимфоцитах периферической крови человека // Биологические мембраны, 1990, т. 7, N7, с. 750-754.

8. Мошковская Е.Ю., Азизова O.A., Ариоц В.Я. Исследование методом спиновых зондов действия Кон А и иммунорегулятора Тактивина на мембраны лимфоидных клеток. У111 Всесоюзная конференция "Магнитный резонанс в биологии и медицине". Май 1990, Звенигород. Тезисы устных сообщений и стендовых докладов. Черноголовка, 1990, с. 15.

9. Мошковская Е.Ю., Азизова O.A. Исследование методом спиновых зондов структурных свойств плазматических мембран Кон А-индуцированных лимфоцитов // Биофизика, 1995, (в печати).

10. Арион В.Я., Мошковская Е.Ю., Азизова O.A., Сакаева H.A. Восстановление Тактивином структурных и функциональных свойств плазматических мембран лимфоцитов больных с ИДС // Иммунология, 1995, (в печати).