Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Перекисное окисление липидов и структурно-функциональные характеристики мембран лимфоцитов у подростков и молодых людей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Перекисное окисление липидов и структурно-функциональные характеристики мембран лимфоцитов у подростков и молодых людей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу"

На правах рукописи

<°гв од

/ У':'. ; ;

РЫЖОВА Лариса Михайловна

ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И СТРУКТУРНО-

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕМБРАН ЛИМФОЦИТОВ У ПОДРОСТКОВ И МОЛОДЫХ ШОДЕЙ С ОТЯГОЩЕННОЙ НАСЛЕДСТВЕННОСТЬЮ ПО АТЕРОСКЛЕРОЗУ

03.00.04 - биохимия 14.00.06 - кардиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск - 2000

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте кардиологии Томского научного центра СО РАМН и Сибирском государственном медицинском университете.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Филиппов Г.П.

Научный консультант.

доктор биологических наук, профессор

Суханова Г.А.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Лишманов Ю.Б. Тюкалова Л.И.

Ведущая организация:

Институт биохимии СО РАМН (г.Новосибирск)

Защита состоится «'Дх>> 2000 г.

в _ часов на заседании дйссертационного совета Сибирского

государственного медицинского университета Д 084.28.01 (634050, г. Томск, Московский тракт 2).

С диссертацией можно ознакомится в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (634050, г. Томск, пр. Ленина, 107).

Автореферат разослан << /¿А

2000 г.

Учёный секретарь диссертационного совета: доктор медицинских наук, профессор л л Кравец Е.Б.

Г

Р /{/О. ¿/о, о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема атеросклероза как морфологической основы сердечнососудистых заболеваний, и в первую очередь, ишемической болезни сердца (ИБС), является одной из наиболее актуальных в современной медицине. В последнее время эти заболевания все чаще встречаются у людей молодого возраста.

По мере усложнения условий проведения профилактических мероприятий становится целесообразным использовать те подходы, которые акцентируют внимание на малых субпопуляциях с высоким генетическим риском. Следовательно, необходимо обратить внимание на разработку методов идентификации групп высокого риска. В связи с этим, большой интерес вызывает изучение биохимических процессов, которые лежат в основе развития атеросклероза.

Атеросклероз - это «бессимптомная» болезнь на протяжении длительного времени, которая, вероятно, начинается уже в детском возрасте. Подростки из семей, в которых у одного из родителей верифицирован атеросклероз, как правило, имеют нарушения обмена липидов и липопротеинов (Доборджгинидзе Л.М. и др., 1988; Филиппов Г.П., Ковалев И.А. и др., 1998; Edwards K.L, 1999), углеводного обмена (Ganong B.R., Bell R.M. 1995), системы иммунитета (Кондратьева Е.И., 1989, Кравец Е.Б., 1989), обмена микроэлементов (Драганов В.В., 1974; S. Novakova et all, 1983).

Изучая метаболизм липидов у детей на протяжении длительного времени можно выяснить, какие именно факторы, и в какой последовательности приводят к формированию атеросклероза. Поэтому, ранняя диагностика необходима как для оценки индивидуального риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, так и для выяснения роли каждого неблагоприятного фактора из их совокупности приводящей к развитию атеросклероза.

У больных атеросклерозом наблюдаются существенные изменения в процессах свободно-радикального окисления липидов (Коган А.Х. и др. 1997; Меньшикова Е.Б., 1997). В сыворотке крови происходит накопление промежуточных и конечных продуктов перекисного окисления липидов, перекисно-модифицированных липопротеинов, снижается антиокислительная активность липидов. Между тем, причины и молекулярные механизмы интенсификации свободно-радикальных процессов в патогенезе атеросклероза не ясны. Возможность глубокого анализа роли процессов ПОЛ в атерогенезе представляется при их изучении у детей с неблагоприятным семейным анамнезом по атеросклерозу и их родителей.

С другой стороны, процессы иммунного воспаления сопровождают развитие атеросклеротической бляшки (Климов А.Н., Никульчева Н.Г. 1995). Клеточная кооперация Т, В-лимфоцитов и макрофагов в субэндотелиальном пространстве служит пусковым фактором накопления модифицированных липопротеинов в очаге атеросклеротического поражения (Писаревский П.В., 1995; Нагорнев В.А., 1997). В связи с этим, актуальным является исследование структурно-функциональных характеристик мембран лимфоцитов.

Изучение свободно-радикальных окислительных процессов сыворотки и лимфоцитов крови у детей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу способствует более глубокому пониманию фундаментальных механизмов формирования сердечно-сосудистой патологии, выявлению критериев формирования групп с высоким риском развития атеросклероза, .

Цель работы

Изучить структурно-функциональные характеристики мембран лимфоцитов и процессы перекисного окисления липидов у детей с наследственной предрасположенностью к развитию атеросклероза.

Задачи исследования:

1. Изучить липидный спектр сыворотки крови подростков и молодых людей, с неблагоприятным семейным анамнезом по атеросклерозу.

2. Изучить содержание продуктов перекисного окисления липидов, антиокислительную активность липидов и активность антиоксидантных ферментов в сыворотке крови подростков и молодых людей, с неблагоприятным семейным анамнезом по атеросклерозу, и их родителей.

3. Изучить содержание продуктов перекисного окисления липидов, антиокислительную активность липидов и активность антиоксидантных ферментов в лимфоцитах крови подростков и молодых людей, с неблагоприятным семейным анамнезом по атеросклерозу, и их родителей.

4. Изучить содержание основных фракций липидов плазматической мембраны лимфоцитов крови подростков и молодых людей, с неблагоприятным семейным анамнезом по атеросклерозу, и их родителей.

5. Изучить показатели, характеризующие структурно-функциональное состояние плазматических мембран лимфоцитов - отношение нейтральных и полярных липидов, трансмембранную асимметрию и активность 5'-нуклеотидазы у подростков и молодых людей, с неблагоприятным семейным анамнезом по атеросклерозу, и их родителей.

Научная новизна

Впервые представлена характеристика процессов перекисного окисления липидов в сыворотке и лимфоцитах крови подростков и молодых людей с неблагоприятным семейным анамнезом по атеросклерозу. Выявлены достоверные корреляционные связи между содержанием диеновых коныогатов, скоростью накопления малонового диальдегида, антиокислительной активности липидов, активностью каталазы, супероксиддисмутазы, в плазме, в сыворотке, и лимфоцитах крови.

Новыми являются данные, характеризующие структуру и функциональную активность липидного бислоя плазматических мембран лимфоцитов крови подростков и молодых людей, у одного из родителей которых верифицирован атеросклероз. У больных атеросклерозом (особенно у мужчин) и у юношей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу в

плазматических мембранах лимфоцитов было обнаружено увеличение содержания насыщенных фракций фосфолипидов (фосфатидилхолина и сфингомиелина), уменьшение содержания лекгоокисляемых фракций фосфолипидов (фосфатидилинозитола и фосфатидилэтаноламина), а также увеличение содержания холестерола. У женщин боьных атеросклерозом и девушек с отягощенной наследственностью по атеросклерозу качественных изменений в плазматических мембранах лимфоцитов меньше, чем у мужчин и юношей, но они подобны. Во всех обследуемых группах снижена активность 5'нуклеотидазы.

В работе дана комплексная характеристика связи между изменениями процессов перекисного окисления липидов в сыворотке и лимфоцитах крови с изменениями показателей, характеризующих липидный бислой плазматических мембран. Увеличение скорости накопления малонового диальдегида в лимфоцитах и снижение антиокислительной активности липидов в сыворотке крови сопровождается увеличением трансмембранной асимметрии, повышением содержания фосфатидилхолина и снижением количества фосфатидилэтаноламина в составе мембран лимфоцитов крови больных атеросклерозом, и что особенно важно, подростков и молодых людей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу. Обнаруженные изменения у подростков и молодых людей с отягощенным анамнезом подобны таковым у больных атеросклерозом, что подтверждает преемственность и кумулятивность нарушений метаболизма на различных уровнях, которые можно выявить на доклиническом этапе развития.

Практическая значимость

В результате проведенных исследований выявлено нарушение регуляции процессов перекисного окисления липидов сыворотки и лимфоцитов крови. Углублены представления о патогенетических механизмах развития атеросклероза. Получены сведения необходимые для более полной оценки индивидуального риска развития атеросклероза. В

качестве дополнительных высокоинформативных принципов формирования групп высокого риска развития атеросклероза предложено использование антиокислительной активности липидов сыворотки крови, скорости накопления малонового диальдегида в лимфоцитах, трансмембранной асимметрии фосфатидилэтаноламина плазматических мембран лимфоцитов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Апробация работы

Основные положения доложены и обсуждены на международном симпозиуме «Биоантиоксидант» в рамках международной выставки «Медицина и охрана здоровья. Медтехника и аптека» (Тюмень 16 - 19 сентября 1997г), на 4-ой международной конференции по профилактической кардиологии (Канада, Монреаль 29 июня - 3 июля 1997г), на XVI международном конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Мексика, Мехико 19-24 октября1997г), на XIII международном конгрессе по кардиологии (Бразилия, Рио-де-Жанейро 26 - 30 апреля 1998г), на научно -практической конференции по программе «С1Ж>1» (Россия, Оренбург 15-18 сентября 1998г), на 1 Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, посвященной 100-летию со дня рождения А.Л.Мясникова (Москва, 5-8 июня 1999г). Апробация диссертации по месту выполнения работы состоялась на заседании ученого совета НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН 17 мая 2000 г.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 164-х страницах машинописного текста, иллюстрирована 29-ю таблицами и 28-ю рисунками. Библиография включает 150 литературных источника, из которых 98 - отечественных и 52 -иностранных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При отягощенной наследственности по атеросклерозу у подростков и молодых людей наблюдается активация свободнорадикального окисления и уменьшение антиокислительной активности липидов в лимфоцитах и сыворотке крови.

2. В плазматических мембранах лимфоцитов подростков и молодых людей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу увеличивается содержание холестерола, фосфатидилхолина и лизофосфолипидов, снижается количество фосфатидилэтаноламина и фосфатидилинозитола, в результате чего изменяется трансмембранная асимметрия липидного бислоя и снижается активность 5'-нуклеотидазы.

3. Показатели скорости накопления малонового диальдегида лимфоцитов и антиокислительная активность липидов сыворотки крови рекомендуются для оценки степени индивидуального риска развития атерогенных нарушений.

Материал и методы исследования

В соответствии с целью исследования проведено обследование 392 человек: 113 больных атеросклерозом в возрасте 30 - 59 лет, из них 13 женщин. У всех пациентов клинические проявления атеросклероза выявлены в возрасте до 50 лет, 142 подростка и молодых людей от 10 до 29 лет, один из родителей которых имел клинически выраженную форму ИБС на фоне атеросклероза коронарных артерий. Дети с отягощенной по атеросклерозу наследственностью не имели хронических заболеваний в стадии обострения на момент обследования. При анализе медицинских карт установлено, что пациенты не имели заболеваний, которые могли привести к вторичной дислипопротеинемии или отрицательно сказаться на состоянии иммунитета и перекисного окисления липидов (ПОЛ). Пациенты в течение 3 месяцев не болели и не подвергались профилактическим прививкам. Контрольную группу составили 138 практически здоровых детей, подростков, взрослых людей без

хронических заболеваний и не имеющих атеросклероза у родственников в анамнезе тех же возрастных групп.

В качестве материала исследования использовали сыворотку, плазму, лимфоциты крови и плазматические мембраны лимфоцитов.

В сыворотке крови пациентов, определяли содержание общего холестерола, холестерола липопротеинов высокой, низкой и очень низкой плотности, триацилглицеролов ферментативным методом на автоанализаторе FP-901 «Лабсистем» с использованием реактивов фирмы «Сагтау» (Польша). Определение проводили на базе клинико-диагностического отделения НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН.

Лимфоциты выделяли в градиенте плотности фиколл-верографин (р=1,072). Плазматические мембраны лимфоцитов выделяли разделением в двухфазной системе декстран Т500 - полиэтиленгликоль 6000 (Финдлей, Эванс, 1991). Липиды мембран лимфоцитов экстрагировали хлороформ/ метанольной смесью. Трансмембранную асимметрию фосфолипидов (ФЛ) плазматических мембран определяли по степени связывания фосфатидилэтаноламина с 2,4,6 тринитробензолсульфокислотой (ТНБС). Разделение фосфолипидов и нейтральных липидов проводили методом тонкослойной хроматографии, в системе растворителей хлороформ/метанол/ледяная уксусная кислота/вода (60:25:1:4) для фосфолипидов и гексан/диэтиловый эфир/метанол/вода (90:20:1:1) для нейтральных липидов. Активность 5'нуклеотидазы определяли по количеству неорганического фосфата, образующегося при гидролизе 5'АМФ (Денисова С.Г. 1974).

В сыворотке и лимфоцитах крови определяли скорость накопления малонового диальдегида (МДА) при индукции ионами Fe2+ (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972), антиокислительную активность (АОА) липидов (Левицкий А.П., Шафран Л.М., 1985). Активность катапазы определяли по степени гидролиза перекиси водорода (Королюк М.А., 1988),

супероксиддисмутазы (СОД) по степени ингибирования автоокисления адреналина (Брусов A.C. и др., 1976). Содержание диеновых коньюгатов проводили методом спектрофотометрии в УФ-области (Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983) в плазме крови.

Экспериментальные данные обрабатывали с помощью методов вариационной статистики, представлены в виде величин средних значений каждого показателя и стандартных отклонений. Проверка нормальности проведена с помощью показателей асимметрии и эксцесса. Для оценки статистической достоверности использован t- критерий Стьюдента при условии нормального распределения выборочных данных. В случае ненормального распределения использовали непараметрический критерий Ван-дер-Ваардена. Корреляционный анализ проводили с помощью пакета программ «STAHSTIKA 5.0»

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что у подростков и молодых людей из группы наследственного риска развития атеросклероза, происходят нарушения метаболизма липидов. Эти изменения при сравнении с контрольными группами характеризовались нарушениями транспорта триацилглицеролов и холестерола в составе липопротеинов, в основном, низкой плотности (рис.1). Вместе с тем, при сравнении значений характеризующих нормальный спектр липидов разных возрастных групп по данным ВОЗ (Batetta) с выявленными изменениями у подростков и молодых людей, с отягощенной наследственностью по атеросклерозу, можно видеть, что показатели липидного спектра последних укладываются в рамки нормальных значений. Поэтому выявленные нами изменения липидного спектра у подростков и молодых людей, родители которых болеют атеросклерозом, можно охарактеризовать как начальные этапы атерогенеза, либо как меньшую биологическую вариабельность этих показателей. В

последнем случае это может быть обусловлено наследственными факторами синтеза липопротеинов. Меньшая биологическая вариабельность может выражаться в синтезе фракций липопротеинов низкой плотности, обогащенных холестеролом, и это может являться базой для развития атеросклероза. Для более точного ответа на этот вопрос необходимо проведение обширных клинико-эпидемиологических исследований липидного спектра подростков и молодых людей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу. В любом случае, очевидно, что показатели липидного спектра не могут являться достаточным прогностическим критерием в оценки риска развития атеросклероза.

Цш

Ж

девушки

01

он

ЯШ

Рис. 1. Показатели липидного спектра сыворотки крови:

I - подростков и молодых людей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу; II-контрольных групп;

Ш - нормативные показатели Всемироной организации здравоохранения.

* - достоверность отличий от контрольного уровня (р<0,05).

Большие изменения были выявлены со стороны процессов перекисного окисления липидов крови и регуляторных систем, контролирующих этот процесс.

При обследовании детей, подростков и молодых людей из семей с неблагоприятным семейным анамнезом по атеросклерозу были получены данные свидетельствующие о нарушении процессов перекисного окисления липидов в сыворотке крови. Результаты представлены на рисунке 2.

%

80 60-| 40 20 -I 0 -20 -40 -60

ТГ

□ юноши до 18

□ юноши 19-29 □девушки до 18 □девушки 19-29

ДК С-МДЛ АОА СОД Каталаза

Рис.2 Показатели перекисного окисления липидов в сыворотке крови детей и молодых людей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу в % по отношению к контрольному уровню. * - достоверность отличий от контрольного уровня (р<0,05).

Нарушения процессов свободно-радикального окисления (СРО) липидов были выражены в увеличении скорости» накопления малонового диальдегида после индукции ионами Ре2+. Скорость накопления МДА в крови увеличивается как у юношей, так и девушек во всех возрастных группах. При этом в плазме крови молодых людей содержание диеновых коньюгатов не отличается от значений в группе сравнения. У девушек с отягощенным анамнезом по атеросклерозу наблюдалось снижение содержания диеновых коньюгатов в плазме крови (рис.2). АОА липидов сыворотки крови у подростков и молодых людей снижалась, однако значимые изменения наблюдались только у юношей.

В сыворотке крови подростков и молодых людей, родители которых болеют атеросклерозом, в обеих возрастных группах наблюдалось увеличение

активности каталазы. Активность супероксиддисмутазы в младших возрастных группах юношей и девушек не отличалась от значений в группе сравнения. Следует отметить, что СОД и каталаза являются координированными ферментными системами, причем продукты одной системы являются ингибиторами другой. То есть АФК снижают активность каталазы, а перекиси обладают ингибирующим влиянием по отношению к СОД. Повышение активности каталазы на фоне стационарной активности СОД связано с образованием и окислительным разложением гидропероксидов.

В сыворотке крови юношей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу обнаружены прямая корреляционная связь между активностью каталазы и АОА липидов (г=0,78, р<0,01) и обратная корреляция между активностью каталазы и содержанием ДК (г= - 0,57, р<0,05). То есть увеличение активности каталазы способствует увеличению резервной мощности неферментативной антиокислительной защиты и уменьшению количества сопряжённых двойных связей. В сыворотке крови девушек с отягощенной наследственностью по АС обнаружена прямая корреляционная зависимость между уровнем ДК и АОА липидов (г=0,99, р<0,05). То есть увеличение количества ненасыщенных липидов сыворотки крови, способных отдать Н+ для восстановления свободных радикалов приводит к увеличению количества сопряжённых двойных связей.

Согласно полученным данным, активация перекисного липидов в крови подростков и молодых людей, с отягощенной наследственностью по атеросклерозу, происходит на этапе распада гидропероксидов, при увеличении доступности их ионам металлов переменной валентности. То есть однажды запущенный процесс наработки АФК самоускоряется и разветвляется преимущественно за счёт неферментативных механизмов.

Таким образом, активация процессов перекисного окисления липидов в крови детей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу происходит в результате повышения доступности и способности липидов в липопротеинах

подвергаться окислению. Само по себе это не приводит к появлению большого количества активных форм кислорода. Поэтому антиоксидантные системы длительное время способны компенсировать такое состояние. Но со временем снижается эффективность механизмов СРО липидов, которое приводит к еще большему увеличению количества перекисно-модифицированных липопротеинов.

Свободно-радикальные окислительные реакции протекают не только в липопротеинах, но и в клетках крови и эндотелия. В связи с этим нами были исследованы особенности процессов перекисного окисления липидов в лимфоцитах крови людей контрольных групп, у больных атеросклерозом и подростков и молодых людей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу. Результаты исследования представлены в табл. 1, на рис. 3 и 4.

Следует отметить, что динамика возрастных изменений скорости накопления МДА в лимфоцитах крови контрольных групп не зависит от пола, однако у девушек и женщин данный показатель в целом имеет более высокие значения, чем у юношей и мужчин в каждой возрастной группе соответственно. Динамика изменений АОА липидов в лимфоцитах крови людей контрольных групп не имеет значимых половых различий и поддерживается практически на одном уровне на протяжении 50 лет жизни. Следует обратить внимание на реципрокный характер возрастных изменений активности СОД в лимфоцитах крови контрольных групп женского и мужского пола. Динамика изменения активности каталазы в лимфоцитах крови людей контрольных групп не зависит от пола и значимо не различается в каждой возрастной группе.

В лимфоцитах крови больных атеросклерозом мужчин по сравнению с контрольной группой отмечается увеличение скорости накопления МДА в группе 30 - 39 лет, практически неизменный уровень этого показателя в группе 40 - 49 лет и снижение скорости накопления МДА в группе больных мужчин 50 - 59 лет (рис.3).

Таблица 1

Показатели перекисного окисления липидов в лимфоцитах крови детей,

подростков и взрослых людей контрольных групп

Возрастные Скорость накопления Антиокисли- Супероксид- Каталаза

группы, лет МДА тельная активность дисмутаза

нмоль/час»мг белка нэкв/мин«мг белка ЕД/мин»мг белка мккат/мг белка

Юноши 2,61+0,34 1,44±0,21 2,33+0,19 2,32+0,29

10-18 (п=5) (п=5) (п=5) (п=5)

(Р7<0,05) (Р!<0,05) (р.<0,05)

Юноши 2,79+0,19 1,80+0,21 2,04+0,11 2,54+0,34

19-29 (п=14) (п=8) (п=11) (п—16)

(Р2<0,05)

Мужчины 3,34±0,23 1,89+0,19 2,01±0,11 2,67 ±0,30

30-39 <п=7) (л=6) (п=4) (а=5)

(р9<0,05) (Рз<0,05) (р,<0,05) (Рз<0,05)

Мужчины 3,58+0,39 1,63+0,07 1,92±0,22 3,35+0,31

40-49 (п=6) (п=7) (п=4) (ч=6)

(р4<0,05) (р4<0,05) (р4<0,05)

Мужчины 4,07±0,32 1,54+0,17 1,32±0,10 2,85±0,25

50-59 (п=3) (п=3) (п=3 (п=3)

(р„<0,05) (Р5<0,05) (Рп<0,05)

Девушки 3,97±0,24 1,46±0,17 2,30±0,29 2,21±0,30

10-18 (п=б) (п=7) (п=7) (п=6)

(Р5<0,05) (Р5<0,05)

Девушки 4,52±0,25 1,53+0,13 2,64+0,17 2,75+0,13

19-29 • (п=7) (п=6) (п—6) (п=7)

(Р8<0,05) (р»<0,05)

Женщины 4,30±0,33 1,63+0,10 2,88+0,26 3,06+0,41

30-39 (п=11) (л=8) (п=7) (п=9)

Женщины 4,47±0,20 1,75+0,20 3,08±0,32 2,62+0,31

40-49 (п=19) (п=5) (п=7) (п=5

(Рих0,05) (рб<0,05) (р»<0,05) (Рб<0,05)

(Рю<0,05) (р,о<0,05)

Женщины 4,21+0,34 1,24+0,11 2,77+0,29 1,96±0,24

50-59 (п=Н) (п=6) (п=4) (п=5)

Примечание:

(р,<0,05)— достоверность различий между юношами 10 - 18 и 19 - 29 лет (р2<0,05) - достоверность различий между юношами 19-29 лет и мужчинами 30-39 лет (р3<0,05) - достоверность различий между мужчинами 38-39 и 40-49 лет (р4<0,05) - достоверность различий между мужчинами 40-49 и 50-59 лет (р5<0,05)-достоверность различий между девушками 10-18 и 19-29 лег (рй<0,05) - достоверность различий между женщинами 40-49 и 50-59 лет (р7<0,05) -достоверность различий между девушками и юношами 10-18 лег (р¡<0,05) - достоверность различий между юношами и девушками 19-29 лет (Р9<0,05) - достоверность различий между мужчинами и женщинами 30-39 лет (рю<0,05) - достоверность различий между мужчинами и женщинами 40-49 лет (Р1 ¡-<0,05) - достоверность различий между мужчинами и женщинами 50-59 лет

В лимфоцитах крови женщин, больных атеросклерозом отмечается увеличение скорости накопления МДА по сравнению со здоровыми женщинами в обеих возрастных группах, но наиболее выраженные изменения

происходят только в группе 50 - 59 лет. АОА липидов в лимфоцитах крови больных атеросклерозом мужчин и женщин всех возрастов меньше контрольных значений. Активность СОД в лимфоцитах крови больных мужчин и женщин ниже контрольного уровня, также во всех возрастных группах. Активность каталазы значительно превышает контрольный уровень во всех возрастных группах мужчин и женщин, больных атеросклерозом, что является адаптивным фактором.

% 650

550 ■

450 Шмулмины 30 - 39

350 ■ - Шмужмны 40-49

250 ■ 0 мужчины 50-59

М женщины 40 - 49

150 - В женщины 50 - 59

50 - Щ

-50 -

-150 ■

С-МДА

АОА

сод

Каталаза

Рис.3. Показатели перекисного окисления липидов в лимфоцитах крови больных атеросклерозом в % по отношению к контрольному уровню. * - достоверность отличий от контрольного уровня (р<0,05).

У больных мужчин обнаружена прямая корреляционная зависимость между скоростью накопления МДА и антиокислительной активностью липидов (г=0,75, р<0,001) и обратная зависимость между скоростью накопления МДА и активностью каталазы (р= - 0,99, р<0,05).

Таким образом, в лимфоцитах крови больных атеросклерозом выявлены многочисленные изменения показателей перекисного окисления липидов, характерные для окислительного стресса.

Также как у больных атеросклерозом, в лимфоцитах детей, с неблагоприятным семейным анамнезом по данному заболеванию, были обнаружены значительные изменения в реакциях свободно-радикального окисления (рис. 4).

% 40 0 300 -200 100 о -100

С-МДА

АОА

И юноши до 18 П юноши 19-29 И девушки до 18 □девушки 19-29

СОД

Каталаза

Рис.4. Показатели перекисного окисления липидов в лимфоцитах крови детей и молодых людей с отягощённой наследственностью по атеросклерозу в % по отношению к контрольному уровню. * - достоверность отличий от контрольного уровня (р<0,05).

И у девушек и у молодых людей эти изменения были выражены в увеличении скорости накопления МДА (особенно у юношей), снижении АОА липидов (наиболее выражено у юношей 19-29 лет) и значительном увеличении активности каталазы в лимфоцитах крови.

Были обнаружены половые и возрастные отличия показателей ПОЛ в лимфоцитах крови людей с отягощенным анамнезом (табл.2).

В лимфоцитах крови юношей и девушек с возрастом увеличивается скорость накопления МДА, причём у девушек изменения более выраженные, и значительно превышают таковые у юношей. АОА липидов в лимфоцитах крови юношей и девушек с отягощенным анамнезом по атеросклерозу с возрастом увеличивается. И у девушек, и у молодых людей эти изменения были выражены в увеличении скорости накопления МДА (особенно у юношей), снижении АОА липидов (наиболее выражено у юношей 19-29 лет) и значительном увеличении активности каталазы в лимфоцитах крови.

Таблица 2

Показатели перекисного окисления липидов в лимфоцитах крови юношей и

Возрастные группы, лет Скорость накопления МДА Антио кислительная активность Супероксид-дисмутаза Катал аза

нмоль/ч«мг белка нэкв/мин»мг белка ЕД/мин»мг белка мкат/мг белка

Юноши 10-18 4,38±1,09 (п=11) 1,13±0,08 (п=11 (РК0.05) 2,13+0,28 (п=9) (Pi<0,05) 9,05±1,46 <п=11)

Юноши 19-29 4,77±0,41 (п=17) 1,62+0,11 (п=10) 1,77±0,22 (п=12) 8,99+1,03 (п=18)

Девушки 10- 18 4,21±0,72 (п=б) (Р2<0,05) 0,94+0,12 (п=5) 1,83+0,12 (п=6) (Р2<0,05) 8,76+1,55 (п=10) (Р2<0,05)

Девушки 19-29 5,83+0,31 (п=10) 1,09±0,09 (п=9) (Рз<0,05) 1,43+0,31 (п=9) 10,73±0,71 (п=11)

Примечание:

^<0,05) - достоверность различий между юношами 10-18 и 19 -29 лет (р2<0,05)-достоверность различий между девушками 10-18 и 19-29 лет (р3<0,05)-достоверность различий между юношами и девушками 19-29 лег

В лимфоцитах крови молодых людей и девушек, с неблагоприятным семейным анамнезом по атеросклерозу с возрастом активность СОД уменьшается. Снижение активности этого фермента на фоне выявленного увеличения скорости накопления МДА и увеличения активности каталазы, скорее всего, свидетельствует о преобладании не ферментативного образования большого количества пероксидов, которое прогрессирует с возрастом. То есть, происходит неспецифическое ингибирование активности СОД пероксидами. С точки зрения развития свободно-радикальных окислительных реакций, разнонаправленные возрастные изменения активности каталазы и супероксидцисмугазы в лимфоцитах является маркером дисбаланса ферментативной антиоксидантной защиты.

В результате исследований было установлено, что нарушение процессов регуляции ПОЛ и их интенсификация в лимфоцитах крови приводит к нарушениям липидного компонента мембран клеток. На рис. 5 представлены

результаты изучения состава фосфолипидов (ФЛ) плазматических мембран лимфоцитов больных атеросклерозом.

% 20 10 о -10-1

20 И—кЛ--- ЕЗ мужчины

---_ а женщины

ФХ+ФС СФМ

ФЭА ОФЛ

Рис. 5. Содержание основных фракций фосфолипидов в плазматических мембранах лимфоцитов больных атеросклерозом (в % по отношению к контрольным группам). * -достоверность отличий от контрольного уровня (р<0,05).

Сравнительный анализ показал, что в плазматических мембранах лимфоцитов больных атеросклерозом мужчин достоверно увеличивается содержание фракций фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилсерина (ФС) и сфингомиелина (СФМ), снижается уровень фосфатидилинозитола (ФИ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭА) по сравнению с аналогичными показателями в плазматических мембранах лимфоцитов мужчин контрольной группы (рис.5).

В плазматических мембранах лимфоцитов больных атеросклерозом женщин достоверно увеличивается содержание фракции ФХ+ФС. Помимо количественных изменений ФЛ плазматических мембран лимфоцитов у больных атеросклерозом обнаружено накопление лизофосфолипидов (ЛФЛ) (табл.3). Накопление ЛФЛ свидетельствует о преобладании катаболических реакций ФЛ и недостаточной их элиминации их мембран, что может привести к образованию небислойной гексагональной фазы и нарушению целостности мембран.

Таблица 3

Содержание основных фракций фосфолипидов (мкг/мг белка) в плазматических мембранах лимфоцитов больных атеросклерозом_

Показатели Мужчины (п=42) Женщины (п=5)

Фосфатидилхолин и фосфагидилсерин 125,06+1,26 118,87+5,88

Сфингомиелин 28,62+1,46 29,25±3,27

Фосфатидилинозитол 4,42+0,50 5,61+0,81

Фосфатидилэтаноламин 30,13+1,50 (р<0,05) 37,19+3,83

Общее содержание фосфолипидов 187,23+3,01 190,09+4,89

Лизофосфолипиды 1,57+0,13 (р<0,05) 1,98±0,21

На рис. 6 представлены результаты изучения состава ФЛ плазматических мембран лимфоцитов у детей и молодых людей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу. Нарушения состава ФЛ характеризуются изменениями подобными тем, что выявлены у больных атеросклерозом.

Так и у девушек и у юношей, один из родителей которых болеет атеросклерозом, в плазматических мембранах лимфоцитов было выявлено снижение содержания ФЭА. Известно, что ФЭА, обычно, имеет в своем составе две ненасыщенные жирные кислоты. Поэтому ФЭА является легкоокисляемым фосфолипидом. Увеличение количества активных форм кислорода, в первую очередь, будет приводить к перекисному гидролизу полиеновых жирно-кислотных ацилов легкоокисляемых фракций фосфолипидов, и в дальнейшем к снижению их содержания. Повышение количества липопероксидов в составе плазматической мембраны приводит к нарушению бислоя липидов.

ФХ+ФС СФМ

ФИ

ФЭА

ОФЛ

□ юноши Идевушки

Рис.б. Содержание основных фракций фосфолипидов в плазматических мембранах лимфоцитов юношей и девушек с отягощенной наследственностью по атеросклерозу (в % по отношению к контрольному уровню),* - достоверность различий р<0,05.

Для того, чтобы стабилизировать липидное озеро мембран в условиях липопероксидации происходит снижение содержания легкоокисляемых фракций фосфолипидов (ФЭА) и повышение уровня насыщенной фракции -ФХ, и холестерола (ХС). Именно такие изменения были выявлены в плазматических мембранах лимфоцитов молодых людей, один из родителей которых болеет атеросклерозом (рис.7).

Рис.7. Содержание общего холестерола, отношение холестерол/фосфолипиды, содержание модифицированного фосфатидлэтаноламина и активность 5'нуклеотидазы в плазматических мембранах лимфоцитов юношей и девушек с отягощенной наследственностью по атеросклерозу (в % по отношению к контрольному уровню),* -достоверность различий р<0,05.

Кроме того, в составе плазматических мембран лимфоцитов у людей с неблагоприятным семейным анамнезом по атеросклерозу были обнаружены ЛФЛ, которые отсутствовали в контрольной группе (табл.4).

Таблица 4

Содержание основных фракций фосфолипидов в плазматических мембранах

лимфоцитов людей с отягощённой наследственностью по атеросклерозу

Показатели Единицы измерения Юноши (п=40) Девушки (п=21)

Фосфатидилхолин и фосфатидил серии мкг/мг белка 115,53+1,39 И 0,31 ±1,94

Сфингомиелин мкг/мг белка 28,39+0,85 29,55+1,29

Фосфатидилинозитол мкг/мг белка 6,47±0,54 7,68±0,88

Фосфатидилэтаноламин мкг/мг белка 32,35+0,92 (р<0,05) 37,09+1,47

Общее содержание фосфолипидов мкг/мг белка 182,19±1,54 182,20±1,85

Лизофосфолипиды мкг/мг белка 0,51+0,08 0,45±0,05

Между показателями структурно-функционального статуса плазматических мембран лимфоцитов юношей и девушек с отягощённой наследственностью по атеросклерозу были обнаружены множественные корреляционные связи. Наиболее выраженные и устойчивые связи выявлены между общим количеством фосфолипидов и холестеролом (г=0,91, р<0,001) -юноши и (г=0,94, р<0,001) - девушки, общим количеством фосфолипидов и отношением ХС/ОФЛ холестеролом (г=0,97, р<0,001) - юноши и (г=0,70, р<0,05) - девушки , холестеролом и отношением ХС/ОФЛ (г= - 0,81, р<0,01) - юноши. Данные корреляции присутствуют у всех групп обследуемых людей, что, в общем, не удивительно. Показательными являются также отрицательные корреляционные связи между активностью 5'нуклеотидазы и уровнем суммарной фракции фосфатидилхолина и фосфатидилсерина (г= -0,60, р<0,05) - юноши, количеством фосфатидилэтаноламина (г= - 0,51, р<0,05) - юноши, ОФЛ (г= - 0,60, р<0,01) - юноши и ЛФЛ (г= - 0,42, р<0,05) -

юноши, так как эти фосфолипиды снижают активность мембраносвязанных ферментов.

Помимо этого были обнаружены корреляционные связи между скоростью накопления МДА в лимфоцитах и структурно-функциональными показателями плазматических мембран лимфоцитов юношей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу: ХС (г=0,87, р<0,001), ЛФЛ (г=0,97, р<0,01), активностью 5'нуклеотидазы (г= - 0,74, р<0,01). Полученные результаты, дают основание утверждать, что изменения состава липидов плазматической мембраны лимфоцитов у детей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу вызвано увеличением активности процессов перекисного окисления липидов. С целью подтверждения предположения мы провели рандомизацию групп детей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу в соответствии со значениями скорости накопления МДА в лимфоцитах крови детей контрольной группы.

юноши девушки

Рис. 8. Функциональные показатели плазматических мембран лимфоцитов подростков и молодых людей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу в зависимости от уровня скорости накопления МДА в лимфоцитах крови подростков и молодых людей контрольных групп, * - достоверность отличий от контрольного уровня (р<0,05).

В группе обследуемых детей и молодых людей, у которых скорость накопления МДА в лимфоцитах выше, чем в контрольной группе, у девушек и у юношей, было выявлено значительное увеличение соотношения холестерол/фосфолипиды, трансмембранной асимметрии и снижение активности 5'-нуклеотидазы (рис. 8).

В группе юношей и девушек с высоким генетическим риском развития атеросклероза, у которых содержание МДА в лимфоцитах меньше чем у детей контрольной группы, исследуемые показатели (ОХС/ОФЛ, ТМА и 5'нуклеотидаза) не отличались от контрольных значений.

Исследование скорости накопления МДА в лимфоцитах крови in vitro может быть предложено в качестве критерия формирования групп с высоким риском развития атеросклероза. Так как, в группах юношей и девушек, у которых в лимфоцитах крови скорость накопления МДА превышает контрольный уровень, увеличивается вязкость плазматических мембран, снижается функциональная активность.

Таким образом, проведенные исследования биохимических показателей групп детей, подростков и молодых людей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу дают возможность более глубокого понимания закономерностей формирования атеросклероза и способствуют определению ряда информативных критериев выявления отдельных групп с высоким риском развития атерогенных нарушений.

ВЫВОДЫ

1. Содержание холестерола в липопротеинах сыворотки крови подростков и молодых людей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу находится в пределах нормы и не определяет степень индивидуального риска развития атеросклероза.

2. В сыворотке и лимфоцитах крови больных атеросклерозом, подростков и молодых людей с отягощенным анамнезом наблюдается увеличение

скорости накопления малонового диальдегида, повышение активности каталазы, снижение активности супероксиддисмутазы и антиокислительной активности липидов, что свидетельствует об активации процессов перекисного окисления липидов.

3. В плазматических мембранах лимфоцитов больных атеросклерозом, подростков и молодых людей с отягощенной наследственностью, увеличено содержание насыщенных фракций фосфолипидов: фосфатидилхолина и фосфатидилсерина, отмечено накопление лизофосфолипидов. У юношей с отягощенным анамнезом и мужчин, больных атеросклерозом, снижено содержание легкоокисляемых фракций фосфолипидов: фосфатидилэтаноламина и фосфатидилинозитола на фоне повышения содержания холестерола.

4. Плазматические мембраны лимфоцитов юношей с отягощённой наследственностью и мужчин, больных атеросклерозом характеризуются нарушением трансмембранной асимметрии фосфолипидов, с перераспределением фосфатидилэтаноламина между внутренним и внешним монослоями.

5. При отягощённой наследственности, также как при атеросклерозе изменяется соотношение холестерола и фосфолипидов в плазматических мембранах лимфоцитов у лиц женского пола в результате увеличения содержания холестерола. У мужчин, больных атеросклерозом, подростков и молодых людей с отягощённой наследственностью по атеросклерозу этот показатель не изменяется.

6. Снижение активности 5'нуклетидазы в плазматических мембран лимфоцитов больных атеросклерозом, подростков и молодых людей с отягощённой наследственностью по атеросклерозу коррелирует с увеличением содержания холестерола, отношением холестерол/общие фосфолипиды и снижением трансмембранной асимметрии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При обследовании подростков и молодых людей из семей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу следует обращать внимание на показатели перекисного окисления липидов сыворотки и лимфоцитов крови. Наиболее информативными показателями для характеристики нарушений процессов перекисного окисления липидов являются: снижение антиокислительной активности липидов сыворотки и повышение скорости накопления малонового диальдегида в лимфоцитах крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Уровень липидов крови и функциональная активность моноцитов-макрофагов у лиц с отягощенной по атеросклерозу наследственностью //Актуальные проблемы кардиологии: Тез.докл.-Томск.,1997.-С. 113-114. (Соавт.: И.А. Ковалев, К.Б. Кутолин, Г.П. Филиппов).

2. ПОЛ в сыворотке крови как фактор риска у детей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу // Актуальные проблемы кардиологии: Тез.докл.-Гомск.,1997.-С. 115-116. (Г.А. Суханова, Г.П. Филиппов, К.Б. Кутолин, И.А. Ковалёв).

3. The serum lipids levels in children with a family history of coronary atherosclerosis. The Canadian Jornal of Cardiology (Abstracts from The 4th International Conference on Preventive Cardiology) 1997; Vol 13 Suppl B: Abstract № 1308, P. 349. (I.A.Kovalev.G.P.Filippov, I.V.Lusta, K.B.Kutolin).

4. Dinamics of changes of serum lipids levels in children with a family history of coronary atherosclerosis. The Canadian Jornal of Cardiology (Abstracts from The 4th International Conference on Preventive Cardiology) 1997; Vol 13 Suppl B: Abstract № 1309, P. 349. (G.P.Filippov, I.A.Kovalev, N.M.Zheltonogova, K.B.Kutolin).

5. . A role of immune processes in the induction of atherosclerosis: hereditary and age aspects. Abstracts from XVI Internatinal Congress of Allergology & Clinical Immunology, October 19-24 1997, Abstract № 337. (I.A.Kovalev, G.P.Filippov, K.B.Kutolin).

6. . ПОЛ в сыворотке крови у детей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу//Биоантиоксидант: Материалы Международного симпозиума в рамках международной выставки "Медицина и охрана здоровья. Медтехника и аптека". Тюмень:Изд-во Тюменского госуниверситета -1997 год- С.21 (Г.И. Суханова, Г.П. Филиппов, И.А. Ковалев, К.Б. Кутолин).

7. Динамика изменений липидного спектра сыворотки крови у детей из семей с отягощенной по атеросклерозу наследственностью // Актуальные проблемы кардиологии и сердечно-сосудистой хирургии. Первая ежегодная сессия Кемеровского кардиологического центра СО РАМН: Тез. докл. -Кемерово.,1997. - С.32 - 34. (Г.А. Суханова, И. А. Ковалёв, Г. П. Филиппов, К. Б. Кутолин).

8. . The Role of Circulating Immune Complexes in Early Stages of Atherosclerosis. Abstracts from The XIII World Congress of Cardiology, April 26-30 1998, Abstract № 0595. (Igor A. Kovalev, Gennadij P.Filippov, Konstantin B. Kutolin, Galina A. Sukhanova).

9. Основные подходы к профилактике сердечно-сосудистых заболеваний в семьях с отягощенной по атеросклерозу наследственностьк>//«С1№)1» Научно-практическая республиканская конференция. Совет директоров программы «CINDI». Оренбург, 15-18 сентября 1998 года. - С. 53-54. (И.А. Ковалев Г.П. Филиппов, К.Б. Кутолин, Г.И. Марцинкевич).

10. Functional state of blood lymphocyte plasmatic membranes in atherosclerosis patients an their children. Abstracts from The 1 st International Congress on heart disease-new trends in research, diagnosis and treatment, 1999; Abstract № 1528. (I.A.Kovalev, G.A.Sukhanova, G.P.Filippov).

11. Smoking among adolescent and its possible role in the pathogenesis of atherosclerosis. Abstracts from The 2 nd European Conference on Tobaco or Health and 1 st Iberoamerican Conference on Tobaco or Health, 1999; Abstract № 374 (presentation 135). (I.A.Kovalev, I.V.Sidletskaya, G.P.Filippov, G.I.Martsinkevich).

12. Липиды плазматических мембран лимфоцитов у больных коронарным атеросклерозом и их детей // Материалы 1 Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, посвященной 100-летию со дня рождения

А.Л.Мясникова. Москва, 1999, с.71. (Соавт.: И.В Маслова, И.А. Ковалев, Г.П. Филиппов).

13. Структурная характеристика лилвдной фазы мембран лимфоцитов у больных атеросклерозом и их детей // Вестник Аритмологии, 2000 № 12. -С. -118: Конгресс «Детская кардиология 2000». Тез. докл. Москва, 2000,1 -3 июня. (Соавт.: И.А. Ковалев, Г.П. Филиппов).

14. Липиды плазматических мембран лимфоцитов подростков и молодых людей с отягощенной наследственностью по атеросклерозу//Клин. лаб. диагностика. - депонирована на 2000 год. (Соавт.: Г.А. Суханова, И.А. Ковалев, Г.П. Филиппов).

5'АМФ - 5'аденозинмонофостат

ДК - диеновые коньюгаты

ИБ - ишемическая болезнь сердца

ЛФЛ - лшофосфолипиды

МДА - малоновый диальдегид

5'НК - 5'нуклеотидаза

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - суиерокиддисмутаза

СРО - свободно радткальное окисление

СФМ - сфингомиелин

ТНБС - тринитробензолсульфокислота

ФЛ - фосфолипиды

ФИ - фосфатидилинозитол

ФС - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭА - фосфатидилэтаноламин

Формат 60x84/16. Печать трафаретная. Объем 1 п. л. Тираж 100. Заказ 407. Лицензия ИД N5 01282 от 22.03.2000. ООО «Дельтаплан». 634064, Томск, ул. Пирогоаа, 10, оф 111.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ХС - холестерол

426551 Ж 204780