Влияние перекисного окисления липидов и холестерина на структуру и функционирование мембран и липопротеидов

Клебанов, Геннадий Иосифович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние перекисного окисления липидов и холестерина на структуру и функционирование мембран и липопротеидов
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние перекисного окисления липидов и холестерина на структуру и функционирование мембран и липопротеидов"

ч* 91У

ЛН1НИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

2-й МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫ!! МЕДИЦИНСКИ)! ИНСТИТУТ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА

На правах рукописи

УДК 612.041.1.: [611.018.53 + 612.123.]

КЛЕБАНОВ Геннадий Иосифович

ВЛИЯНИЕ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И ХОЛЕСТЕРИНА НА СТРУКТУРУ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ МЕМБРАН И ЛИПОПРОТЕИДОВ

03.00.04 — Биологическая химия 03.00.02— Биологическая физика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена па кафедре биофизики Медико-биологического факультета 2-го МОЛГМИ им. Н. И. Пирогова.

На уч н ы й консультант

акад. АМН СССР, профессор

Юрий Андреевич Владимиров.

Официальные оппоненты:

д. м. н. Людмила Георгиевна Коркина,

д. б. н., проф. Илья Ильич Иванов,

д. м. п., проф. Руслан Тимофеевич Тогузов.

Ведущее учреждение — Научно-исследовательский институт физико-химической медицины МЗ РСФСР.

Защита диссертации состоится « . . . »Л/ШЭЩР-*. 199 г. в «... » часов на заседании специализированного совета Д.084.14.03. прп 2-м МОЛГМИ им. Н. И. Пирогова по адресу: 117869, Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 2-го МОЛГМИ им. И. И. Пирогова.

Автореферат разослан «

У5

1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета Ц.084.14.03. при 2-м МОЛГМИ им. Н. И. Пирогова,

профессор П. X. Джанашия

1 :-OÉi¿Ak ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В работе представлены результаты исследования влияния перекисного окисления липидов ¡^изменения содержания холесте рина на структуру и функционирование модельньч., биологических мембран и липопротеидов. Интерес к этой проблеме обусловлен несколькими причинами:

1. Существует широкий круг патологий, возникновение и развитие которых взаимосвязано с изменением структуры, физического состояния липид-ного компонента мембран, нарушением регуляции мембраносвязашшх процессов ¡проницаемости для ионов и неэлектролитов, функционирования мембранных ферментов и рецепторов ( Лопухин и др. 1983).

2. Регуляция мембраносвязанных процессов кроме химических механизмов известных для немамбранных, водорастворимых систем, в значительной степени определяется уровнем физического состояния, микровязкостью ли-гаишой фазы мембран или ее обратной величиной, текучестью (Klmeiberger е.а.1972).

In vivo изменение кидкостного гомеостаза клеточных мембран и липопротеидов осуществляется за счет вклада нескольких факторов, среди которых наиболее важная роль принадлежит процессу перекисного окисления липидов (ПОЛ) и накоплению холестерина (Лопухин и др.1983).

Переписное окисление липидов является фундаментальным механизмом нарушения структуры и функции клеточных мембран (Владимиров 1972). Пе-роксидацил липидов мймбран и липопротеидов, с одной стороны, обладает свойствша диффузионно-контролируемого процесса (Иванов, 1988), а с другой - одним из последствий свободнорадикального окисления может быть увеличение полярности и мшсровязкости Липидной фазы (Dobretsov.1977).

При этом следует иметь в виду, что эффективность де" -твил ПОЛ на свойства мембран зависит от места локализации центров инициации процесса пероксидации. Все это позволяет,. выбирая различные способы инициации проследить как ПОЛ влияет на структуру, физическое состояние различных участке» мембраны и как это взаимосвязано с изменениями барьерной и матричной функций мембран.

Другим способом модификации структурированности липидной фазы мембран и хшонротеидов является изменение химического состава, в частности содернагдш холестерина (Papahadjopoulos е.а.,1974).

Характерной особенностью патологических процессов, сопровождающихся гиперхолэстеринемией, является активация процесса перекисного окисления липидов (Ланкин и др.1980). В этой связи важно было выяснить является ли

модификация мембран, вызванная действием ПОЛ и накоплением холестерина, независимыми событиями или они могут оказывать друг на друга какое-то влияние.

Увеличение скорости реакций пероксвдации липидов, отмечаемое при холестеринозах, обусловлено вкладом нескольких механизмов,среди которых значительная роль принадлежит активации фагоцитов , в частности, полиморфноядерных лейкоцитов крови, продуцирующих активные формы кислорода и другие прооксиданты, способные инициировать перекисное окисление липидов ( яге1зБ,198б). Это позволяет предположить, что ыезду перекисши окислением липидов и активацией ПМЛ, двумя свободнорадакальными процессами, существует определенная взаимосвязь, состоящая по-видимому в том, что:

а. стимуляция ПМЛ может вызывать при определенных условиях ПОЛ и

б. появляющиеся продукты ПОЛ могут увеличивать функциональный потенциал ПМЛ.

Все вышеизложенное и определило главную цель и основные задачи работы.

Цель работы: изучить влияние перекисного окисления липидов и изменения содеркания холестерина на структуру, физическое состояние и функционирование мембран и липопротеидов.

Основные задачи:

1.Изучить влияние перекисного окисления липидов на структуру, физическое состояние лшшдного бислоя и функционирование модельных мембран, мембран саркоплазматического ретикулума, а также полиморфноядерных лейкоцитов крови.

2. С помощью флуоресцентного и спинового зондирования изучить влияние увеличения содержания хох стерина на структуру и физическое состояние лшшдноЯ фазы ыодель«их и биологических мембран.

т. Определить характер влияния постепенного увеличения содержания холестерина на особенности мембраносвязаншх, диффузионно-контролируе-мых процессов: активность мембранных ферментов, электрическую стабильность мембран липосом, перекисное окислении липидов. Изучить взаимосвязь между содержанием холестерина, микровязкостыо мембран и функциональной активностью полиморфноядерных лейкоцитов крови в условиях атеросклероза и его осложнений.

4. Определить возможность и условия удаления стероида из липопроте идов, мебран липосом и эритроцитов с помощью холестерин-специфических

сорбентов.

5. Изучить динамику накопления холестерина и уровня процесса пере-., кислого окисления липидов в липопротеидах и клеточных мембранах при экспериментальной гиперхолестеринемии и у больных с патологиями, сопровок-дающимися увеличением содержания холестерина.

6. Полученные результаты и данные литературы обсудить с точки эре-, ния концепция о взаимосвязи процесса перекисного окисления липидов и накопления холестерина в липопротеидах и клеточных мембранах.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Перекисное окисление липидов мембран саркоплазматического рети-1 кулума (МСР), инициированное ультрафиолетовым облучением (УФ-ПОЛ) и ио-' нами двухвалентного келеза(Ре-ПОЛ) вызывав? структурно-функциональные изменения » МСР, вырааакциеся в:

а. увеличении пассивной проницаемости ионов Са2+ и уменьшении активности Са2+ аккумулирующей способности везикул СР,

б. увеличении микровязкости липидной фазы МСР и уменьшении вращательной подвижности Са -АТФазы.

Эф))зктшшость поврецдаодего действия УФ-ПОЛ на фушащоналыше параметры МСР и степень уменьшения подвижности бежа оказалась в 10-20 раз большей по сравнению с Ре-ПОЛ, в то время как увеличение микровязкости липидной фазы было пропорциональным накоплению ТБК-активных продуктов независим от способа инициирования пероксидации лшшдов.

Н£| основании полученных результатов высказывается предположение о том, что при УФ-ПОЛ происходит перекисное окисление пограничных или ану-лярных липидов, модификация которых определяет энер :ю активации Са -АТФазы и условия функционирования МСР.

Продукты перекисного окисления лшшдов, предпочтительно гидроперекиси, способны вызывать Са2+-зависимую предстимуляцию полшорфноядерных лейкоцитов крови.

2, По мере постепенного увеличения относительного содержали в мембранах холестерин способен формировать 2 пула молекул, различающихся ; по своему влиянию па структуру и физическое состояние липидной фазы мембран, доступности для холестерин-специфических сорбентов, вл пшю на ряд мембраносвязанных диффузионно-контролируемых функций. На первом этапе накопления холестерина до достижения определенного критического зна-

чения индекса ixc/фл молекулы стеровда формируют первый активный пул, в составе которого увеличение содержания холестерина сопровождается практически пропорциональным возрастанием микровязкости липидной фазы, инги-бированием активности мембранных ферментов, увеличением потенциала электрического пробоя мембран липосом, в сосааве этого пула стероид оказывается недоступным для холестерин-специфического сорбента. Дальнейшее увеличение содержания холестерина приводит наряду с активной формой к образованию второго, не активного пула, в составе которого холестерин не оказывает сколько-нибудь значительного влияния на структуру и функциональные свойства мембран, но эффективно удаляется из мембран при действии сорбентов.

3. Увеличение содержания холестерина в мембранах липосом приводило к ингибированию реакций перекисного окисления лшшдов при ixc/фл <0,5 и практически не изменяло состояния процесса ПОЛ при дальнейшем увеличении содержания стеровда ( lxc/фл > 0,5).

Совпадение характера влияния холестерина на микровязкость Оислоя « перекисное окисление мембранных лшшдов позволяет предположить, что холестерин тормозит развитие свободнорадикаль.чого окисления липидов мембран липосом за счет увеличения структурированности липидной фазы, т.е. его действия как "структурного антиоксиданта". in vivo в процессе развития алиментарной гиперхолестеринемии 'кроликов уже на ранних стадиях развития атеросклероза увеличение окисляемост!1: липопротеидов совпадает < возрастанием содержания холестерина и штиокислительного потенциал) плазмы крови. Инкубация клеток Aohoieplasma Laidlawii в среде с окисленными липидами сопровождалась значительным накоплением холестерина в клеточных мембранах на ранней логарифмической стадии роста клето: Acholeplasma Laidlawii. Все о,-о позволяет считать, что накопление хо лестерина, равно как увеличение синтеза и активности различных други инги"-лторов пероксидации липидов, является адаптационной реакцией орга низма на перекисный стресс, направленной на торможение процесса ПОЛ.

4. Одним из механизмов инициации ПОЛ in vivo в условиях холестери ноза является активация полиморфноядерных лейкоцитов крови. В мембранах ПЫЛ крови больных ИБС и ИМ несмотря на короткое время жизни в циркуляци происходит увеличение содержания холестерина и соответственно этому уве личение микровязкости липидной фазы мембран.Однако, в противоположное! другим видам мембраносвязанных , диффузионно-контролируемых процессе функциональная активность гранулоцитов в этих условиях увеличилась, чч

ь -

может быть.следствием экспрессии рецепторного ашарата ПМЛ. Полученные результаты позволили сформулировать основные положения механизма актива- -ции гранулоцитов в процессе возникновения и развития воспалительных заболеваний

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Установлено, что как УФ-ПОЛ так и Ре-ПОЛ вызывает структурно-функциональные изменения в мембранах саркоплаэмати-ческого ретикулума.

Впервые показано, что при УФ-ПОЛ эффективность инактивации Са2+-ак-гсумулирущей способности везикул СР и увеличение пассивного транспорта Саг+ а также степени уменьшения подвижности белка оказалась в 10-20 раз большей по сравнению с Ре-ПОЛ, в то время как увеличений микровязкости липидной фазы было пропорциональным накоплению ТБК-активных продуктов' независтш от способа инициирования перекисного окисления мембранных ли-' пидов. Полученные результаты позволяют высказать предположение о том, что при УФ-ПОЛ происходит перекисное окисление пограничных или анулярных липидовмодификация которых определяет' энергию активации Са2+-АТФазы и условия функционирования мембран саркоплазматического ретикулума.

Впервые показано, что продукты перекисного окисления липидов, предпочтительно гидроперекиси, способны вызывать быструю предстимуляцшо по-лиморфноядерных лейкоцитов крови, характеризующуюся экспрессией рецеп- , торного аппарата клеток, в частности, увеличением количества гс-рецепторов. Эффект предстимуляции гранулоцитов не зависел от действия ингибиторов синтеза белка в клетках.

Установлено, что по мере постепенного увеличения содержания холестерина ¡з мембранах и липопротеидах стероид способен формировать 2 пула молекул', различающихся по своему влиянию на структуру и ф. ^ическое состояние липидной фазы. На первом этапе накопления холестерина в мембранах до достижения определенного критического значения индекса 1хс/Дп молекулы стэроида формируют первый активный пул, в составе которого увеличение содержания холестерина сопровождается возрастанием микровязкости липидной фазы мембран липосом. Дальнейшее увеличение содержания холе^тери-; на приводит наряду с активной формой к образованию второго не активного; пула холестерина, в составе которого стероид не оказывает сколько-ни-! будь суцественного влияния на структуру и физическое состяние липидной; фазы мембран.

Впервые показано, что в составе активного пула А холестерин ингиби-!

рует функционирование мембранных ферментом, увеличивает потенциал электрического пробоя мембран липосом и тормозит перекисное окисление липидов, оказывается недоступным для холестерин-специфических сорбентов. В составе не активного пула Б холестерин ве оказывает сколько-нибудь существенного влияния на изучаемые диффузионно-контролпфуемывмембрашше процессы, но эффективно удаляется из мембран при действии сорбентов.

Совпадение характера влияния холестерина на мизсровязкость бислоя п neperaicHoe окисление липидов позволяет считать, что холестерш1 тормозит развитие свободнорадшсального окисления липидов мембран липосом за счет увеличения структурированности липидной фазь в качестве "структурного антиоксиданта", а накопление холестерина в ситуациях in vivo , равно как и увеличение синтеза и активности различных других ингибиторов перокис-ного окисления липидов, является адаптационной реакцией организма на пе-рекисный стресс, направленной на торможение процесса ПОЛ.

Впервые проведено систематическое исследование уровня функциональной активности полиморфноядерных лейкоцитов крови в _ условиях гипорхо-лестеринемии. Установлено, что в мембранах полиморфноядерных лейкоцитов ¡фови больных ИБС и ИМ происходит увеличение активности эндогенной СОД, содержания холестерина и соответственно этоглу, увеличение микровазкости липидной фазы мембран. Однако, в противоположность другим видам мембра-носвязашшх доффузиошю-контролируемых процессов функциональная активность гранулоцдтов крови в этих услрвиях увеличилась, что монет быть следствием экспрессии рецепторного аппарата ПМЛ. Получошше результаты позволили сформулировать основные положения двухстаднйнога механизма активации гранулоцитов в процессе возникновения и развития воспалительных заболеваний.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Получешше результаты и сделашко в работе выводы расширяют наши представления о роли модификации структуры и физического состояния липидной фазы мембран и липопротеидов в регуляции их основных функций.

Обнаруженные эффекты действия продуктов перекисного окисления липидов на предстимуляцшо полиморфноядерных лейкоцитов крови раскрывает особенности взаимосваязи двух свободнорадикальшх механизмов патогенеза ряда заболеваний: перекисного окисления липидов и активации ПЫЛ. Предсти-муляция ПМЛ продуктам! ПОЛ являетя звеном определенного порочного круга

влений¡продукты ПОЛ активируют ПШ1, а последние инициируют пероксцдацию ипвдов. На асновашш этих и ряда других экспериментальных данных сфор-уларовая двухстадийвый механизм активации ПШ1 в процессе возникновения : развития воспалительных заболевания.

Способность холестерина в зависимости от° его содержания и физи-! ю-химлческих свойств липидной фазы мембран и липопротеидов распреде- I 1яться на 2 пула, различающихся по своему влиянию на структуру и микро-! шзкость лштадноЗ фазы п регуляцию мембраносвязанных, диффузионно-конт-юлпруеь-ш: процессов, позволяет считать что накопление холестерина в шпопротеадах п ;,:е;.:бранах в процессе возникновения и развития атероск-троза и других заболеваний, характеризующихся гиперхолестеринемией, эазно как увеличение синтеза и активноссти других ингибиторов пероксида- • да ляшдов, является адаптационной реакцией организма на перекисляй I :тресс, направленной на тормонение процесса ПОЛ. !

Использованные в работе оригинальные флуоресцентные зонды ДМХ и МБА! 1Е1Ш1 пнрояое применение в исследованиях структурно-функциональных I зеоПств липопротеидов, мембран и клеток.

Подходы и .метода, разработанные для изучения перекисного окисления оштадов, активности гранулоцитов, защищенные соответсвупцими авторскими' звэдетельствами, нашли свое применение в лабораторной и клинической! практика для опроделепия огшсляемости липопротеидов, антиокислительной активности плазмы крдви, функциональной активности ШЛ с целью диффе-1 рэнциалъной диагностики, контроля за эффективностью терапии, определения прогноза офтальмологических и сердзчко-сосуддстых заболеваний, а так аэ определения эффективности и достато'рюсти лазерного облучения крови| больных ИБО и Ш, предварительного отбора и определения активности и; механизма действия препаратов-ингибиторов перекисного окисления липидов и активности ПМЛ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы докладывались и обсужд: лись на международных и всесоюзных симпозиумах и конференциях:

"Структурная лабильность мембран и ее роль в регуляции функциональной активности клеток" (Минск, 1974), "Перспективы Оиоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов" (Рига,1982), "Цитохром Р-450 и заищга внутренней среды человека"(Москва,1985), "Иммунология атероскле-: роза и ИБС"(Томск, 1985), "Биохемилюминесценция в медицине и сельском! хозяйстве"(Ташкент,1985), "Активные формы кислорода в биологических системах", (Варна, НРБ,1986), "Международная конференция по профилактической

кардиологии"(Москва,1987), "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине" (Рига, 1988), "Перекисное окисление лшшдов и антиоксидантная терапия при ИБО"(Горький,1988), "III Всесоюзная конференция Еиоантиокси-дант (Москва,1989), "ш Всесоюзное совещание по хемилюминесценции"(Рига, 1990), Международный симпозиум "Мононуклеарные фагоциты в норма i: при патологии"(Новосибирск,1991), а также ка 4 Международном биофизическом конгрессе(Москва,1972), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва,1983), 4 Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев,1988)

ПУБЛИКАЦИИ. Результаты исследования опубликованы в 71 работах i центральной отечественной и зарубежной научной печати, а также в материалах съездов и симпозиумов. Получено 7 авторских свидетельств на изобретения и 4 свидетельства на рационализаторские предложения отраслевогс значенния.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из 3 частей, 4 глав с ш жением результатов исследования, заключения, выводов по работе, библиог-. рафии. В приложении изложены материалы и методы исследования.

ЧАСТЬ I. ДЕЙСТВИЕ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ НА СТРУКТУРУ и ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МЕМБРАН.

Одним из ранних проявлений перекисного окисления липидов является нарушение проницаемости мембран для ионов и неэлектролитов ( Владимиров,1972).

Учитывая большую биологическую значимость ионов "кальция в регуляцш многих внутриклеточных процессов, а' также центральную роль Са в патофизиологии клетки ( Мусил,1985) в нашей работе была предпринята попытк; изучить характер влияния ПОЛ на структуру, физическое состояние липидно! фазы и параметры активн^о и пассивного транспорта ионов кальция чере: модельные и биологические мембраны.

В качестве объектов исследования в работе использовали липосом разного состава и мембраны саркоплазматичеекого ретикулума (МСР).

I.I Влияние ПОЛ на функциональную активность МСР.

Одним из способов инициации ПОЛ является УФ-облучение. Характерно чертой ПОЛ. инициируемого УФ-облучением является то, что этот процес ' является фотосенсибшшзированным (Рощупкин и др., 1979). В роли сенсиби

лизаторов иогут выступать различные хромэфорнне группы п в том число ; ароматические группы белков (Рощупкин и др., 1973).Эффективное фотоокис- ; лвниэ мембранных липидов в этом случае будет инициироваться в ближайшем микроокруженш белков, т.6. в области анулярных липидов, состояние которых и определяет энергии активации мембраносв.ч занных ферментов и рецепторов (Бап(1егшл е.а. ,1978).

В этой связи целью нестоящего раздела работы явилось изучение механизма повреждающего действия ПОЛ на структуру и функциональные проявления мембран СР с точки зрения локализации этого процесса в мембране.

Прежде всего било обнаружено, что (рис. I) инициирование как Ре-ПОЛ так и УФ-ПОЛ сопровождается ингибированием Сэ-несоса, что выражается в уменьшении активности Са2+-АТФазы, скорости активного транспорта кальция и отношения Са/АТФ. Одновременно отмечается увеличение накопления ТБК-активнш продуктов.

ВРЕМЯ, мин Доза УФ-облучення, эйн/м2 >

Рис I. Изменение параметров транспорта Са и накопление ТБК-ак^иввых продуктов ЫСР от времени инкубации в среде, содержащей Ре-аскорбвт (А-В) и дозы УФ-облучения (Г-Е). Кривые Г-2, Д-2,4, Е-З-УФ-обдучение в вакууме, Г-I, Д-1,3, Е-2 -облучение на воздухе.

Сопостоыюшш данных, представленных ва ргс.1, позволяет заклпчип что общая картина нарушений функциональных проявлений мембран CP tq УФ-облучении совпадает с действием на мембраны ?е-П0Л, что обусловле1 тем, что повреждение НСР при выбранных дозах УФ-оОлучення является р< зультатом инициации перекисного окисления лишдов. В пользу этого пре; положения свидетельствуй1 результаты экспериментов, в которых исслед< вали влияние кислородного эффекта и введения антиоксидантв ионолв П] УФ-облучении МСР. Вместе с тем представляло интерес количественно сопо< тавить эффективность действия ПОЛ мембран CP, инициированного ?е-а< корбатной системой и УФ-облучениеы в расчета на единицу образовавших! ТБК-активных продуктов.

нмоль/мг белк

о.

Рис 2. Изменение параметров транспорто ионов Ca щи Fe-ПОЛ (о) УФ-ПОЛ (© ) Кривая В-3 УФ-обдучение MCP в вакууме.

На рис.2 представлены зависимости активности Са2+-АТФазы, скором активного и пассивного транспорта Са^+ от накопления ТБК-активных про-

- Ц -

дуктов при ре-ПОЛ к УФ-ПОЛ. Видно, что имеются существенные количественные различия в эффективности действа ПОЛ. Одинаковое падение активности Саг+-АТФазы, скорости актизного и пассивного транспорта ионов кальция происходит в случае ?е-ПОЛ при скоплении ТБК-активных продуктов з [С-20 раз болы-ем, чем при УО-ПОЛ. Одной из причин обнаруженных различий меж--?? быть фстссексибилизкрованное перекисное окисление пограничных липпдсз, что в своя очередь приводит к кгг/екенив физического состояния к нзкс.чле-нию высскереактивных продуктов окисления липидов в блккайщем миксоскру-кекии фермента, для инактивации которого достаточно перекксной деградации небольшого пула близлежащих лиги дез. В случае ?е-ПОЛ окисление будет протекать равновероятно по всему объему липидной фазы MCP. Заметные нарушения работы Ca -АТСазы будут наблюдаться при более значительном накоплении продуктов ПОЛ в расчете на I кг липида или белка мембран, чом при УФ-ПОЛ.

1.2. Влияние перекисного окисления липидов на структуру к SH-rpym; мембран саркоплазматического ретикулума.

Для. изучения изменений мккровязкости лшшдной фазы MCP в процессе инициация ПОЛ использовали. измерение величины s-параметра сликозсгс зонда. Подвижность макромолекулы Са2+-АТФазы изучали с помощью измерения z-паргметра нитроксил-малеимидной спиновой метки, ковалентно связанной с тиоловыми группами фермента.

При измерении s-параметра спинового зонда, встроенного в 'мембраны СР (рис.ЗА) было обнаружено, что во-перрых, инициация ПОЛ сопровождается увеличением микровязкости липидной фазы мембран и во-вторых, это изменение физического состояния мембранных липидов происходит ¿.¿зависимо ст способа индукции ПОЛ.

При измерении величины z-параметра спиновой метки в зависк - сти от степени окисленности липидов мембран СР было обнаружено, что (рис.33} УФ-облучение MCP вызывает значительное изменение подвижности епкн-мечен-ного фрагмента белковой цепи Са2+-АТФазы, в то время как при Ре-ПОЛ' эти изменения незначительны. . Для выяснения возможной причины изменения ¡информационной подвижности Са2+-АТФазы при УФ-ПОЛ было проведено исследование нлилния УФ-облучения на величину z-параметра сшшсеой метки, связанной с Са2+-АТФазой MCP, в которой эндогенные липиды были замещен:; на синтетический фосфолипид дипальмитоиллецитин (ДПЛ). практически не

'Рис 3. Влияние УФ-ПОЛ (о) и ?е-П0Л (■*) на микрох?язкость (Б) стр-чтуру 12) ЫС?.

способный к перекисному окислении. Результаты эксперимента представлен в табл.1.

Видно, что УФ-обдучекш вызывает существенные изменения подашзюст спин-меченного фрагмента Се2+-ДТФазы'в ветивных МСР. в то время как ДЕЛ-замещйнных препаратах мембран формант на претерпевает cкoлькo-ш^бy^ заметных структурных пэрэстроак при тех еэ дозах УФ-облучешя.

Табл.1.

Изменение величины Z-параметра спиновой метки, связанной с Са2+- АТФазой MCP, в зависимости от дозы УФ-облучения

Доза УФ-облучения эйнштейя/м2 z-параметр в ЭПР спектрах

нативнке мембраны СР ДПЛ-звмещенные MCP

0 2,00 - 0,02 2,87 ± 0.07

0,09. 2.05 - 0,04 2,87 ± 0.06

0.16 2.15 - 0.04 2.88 ± 0.06

0.23 2.30 ± 0.03 2.88 - 0.08

При исследовании содержания БН-групп в молекуле Са2+-АТ0азы з зави-имости от количества накопленных ТБК-активных продуктов в МСР было об-арузкенс;, что как при Ре-ПОЛ, так и при УФ-ПОЛ наблюдается разрушение иоловыэ:. групп фермента. Однако, в случае уф-облучения окисление Н-групп идет более эффективней. Так, из 6 обнаруженных БН-групп аг+-АТФазы накопление, например 2 нмолей МДА на мг белка МСР сопровож-,ается окислением 1.25 и 2.25 ВН-групп при Ре-ПОЛ и УФ-ПОЛ соответствен-о.

Таким образом, ПОЛ вызывает увеличение пассивной проницаемости ио-:ов кальция, ингибирование Саг+-АТФазы и активного транспорта Са?+ !роме этого показано, что пероксидация мембранных липидов обладает во яств локальной специфичности: при УФ-облучении МСР 1.гоисходит пе-вкисная модификация пограничных липидов, состояние которых и определят условия функционирования мембран СР.

ЧАСТЬ II. ВЛИЯНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА НА СТРУКТУРУ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ' СВОЙСТВА МЕМБРАН И ЛИПОНРОТЕИДОВ.

Характерной особенностью алиментарной гиперхолестеринемк. (ГХЕ), 1авно как в клинике заболеваний человека, сопровождающихся холестерино-

зом,является активация ПОЛ, в частности, лаэспротеадов плазмы крови (Лопухин и др. ,1933). ). Следовательно, можно д»мгть, что между двумя этими фуодпмснтальнымл явлениями: ПОЛ и ГХЕ,- сопровождавдими возникновение и развитие атеросклероза, существует определенная взаимосвязь.

Основной целью дэнного раздела дассерта-д.ы било изучение влияния холестерина как In vitro так и In vivo на" структуру, физическое состояние и функциональные проявления мембран и лиаолротеядов.

I.i Влияние» холестерина на структуру и физическое состояние лилидного

Саслоя мембран.

На г.орвом этапе работы необходимо было выяснить как влия&т постепенное увеличение содержания холестерина на структуру и физическое состояние липидноа фазы модельных, и биологических мембран. Для рэвения поставленной задачи использовали метод флуорэсц&нтного и спинового зондирования .

Злияние холестерине на поступательное движение молекул в мембранах изучали*с пом-оцьв измерения экскмерязации гарена (Vanderkool е.а., 1974).

Рис 4 Влияние холестерина на зксимеризацаао (А) и относительное изменений аксзшэризацди (Б),1- натавныв лнпосош,2-лнпосомы, сформированные из окисленных фосфолшодов. Ixc/фл, коль/моль

Еило.обпаруаэно, что (рве.4 ) постепенное увеличение содержания холестерина в цембранах многослойных липосом в интервале значений индекса 1хс/фл< 0.5 сопровождается практически пропорциональным уменьшением эк-ся.:орлз8Циз пирэна. Дальнейшее увеличение содержания холестерина в мембранах до значения индекса 1хс/фл=05.-1.0 и более не приводило к сколько-нибудь значительному изменения зкеимеризации зонда. Обнаруженная за-коношзрность проявляется еще Солее наглядней при анализе уменьшения эк-симерззации пиропа по отношению к одинаковому приросту содержания холе старина в »©мбрапах липосом ( рис.4). Видно, что основной вклад в ограничение латеральной диффузии зонда вносят первые порции холестерина.

Такое неодинаковое влияние холестерина па физическое состояние фос-фолицндного бнслоя в зависимости от его содержания в мембранах можно рассматривать в качестве аялюстращш возмогшостп существования двух пу'лов холестерина. Когда содержание холестерина в мембранах липосом лежит в пределах ]хс/фл<0.5 он образует первый, так называемый активный пул А, в составе* которого стероид ограничивает ыолекулярную подвижность фосфоли-щдов л Оислое. Когда ге холестерина в мембранах липосом становится много (1хс/фл >0.5 ), оа формирует неактивный пул Б, представляющий по-видимому отдельные мшфообъекы, кластеры ( ЕаЬгеу е.а. ,1978), внутри которых стероид не способен оказывать влияние на подвижность молекул в би-

Рис 5. Влияние холестерина на величину Б-нараметра спинового' зонда

(1) и форму спектра лхманесценции флуоресцентного зопда до

(2)в мембранах липосом. 1хс/фл, моль/моль

Структурирующее влияние холестерина на молекулярную подвижное фосфолшшдов в бислое нашло свое отражение не только в уменьшении экс меризации пирена но и в изменении величины s-параметра спинового soi (рис.Б).

В наших экспериментах с использованием зонда ДЮС было рбнаружез что ( рис.5) увеличение содержания холестерина в мембранах липосом с< ровождается коротковолновым сдвигом спектра люминесценции зонда. П] чем, как и в случае пирена г 5-нитроксшщальмитата основное измене] формы спектра люминесценции ДЫХ наблюдалось в интервале значенией ивд< са lxc/фл < 0.5, а при дальнейшем увеличении содержания холестер] (ixc/фл >0.5) изменения в спектре люминесценции ДМХ были незначительна

Таким образам, с помощью метода флуоресцентного и спинового зон; рования удалось показать возможность распределения холестерина в зави< мости от его содержания в мембранах на 2 пула молекул, различении: между собой по своему влиянию на структуру и физическое состояние лит но.го бислоя.

2.2 Применение сорбентов для селективного удаления холестерина мембран и липопротеидов.

В нашей работе для дехолестеринезащш липопротеидов плазмы кро: мембран липосом и эритроцитов использовали холестерин-специфические о бенты, синтезированные в НШФХЫ Ш РСФСР пол руководством И. П. Аадриа вой.(Березин и др. 1980).

Прежде всего следовало выяснить в какой мере эффективность сорб: холестерина зависит от исходного содержания стероида в мембранах и . попротеидах. С этой целью сор"ции подвергали суспензию липосом и пла крови кроликов на разных сроках алиментарной гиперхолестеринемии. Б обнаружено, что ( рис.6)'обработка сорбентом суспензии-мембран липос содержащих холестерин в интервале значений индекса 1хс/фл<0.5 не при дила к уменьшению относительного содержания холестерина, в то время : для липосом с более высоким исходным содержанием холестер (1хс/фл>0.5) эффективность сорбции резко возрастала.

Аналогичные результаты были получены и при обработке плазмы кр кроликов (рис.6). •

Для оценки эффективности десорбции холестерина использовали мемб ны эритроцитов с разным содержанием холестерина. В случае интакт

- J7 -

ггроцитов и эритроцитов, обогащенных холестерином, било обнаружено, > (рзс.6) чем более мембраны эритроцитов были насыщены холестерином, а более эффективно протекала его десорбция. Обращает на себя внимание гот факт, что как у янтектных, так и у обогащенных эритроцитов индекс з/фл после обработки сорбентом не опускался ниже значения 0.6-0.7, что /словлено недоступностью оставшегося холестерина для сорбента.

плазма крови (1-1), мембран ляпосоы (А-2) и эритроцитов (Б) ИЗ СффоICtíüJHCС7Ь УДОЛЗЦиЛ стзрсвда ССрбЗиТСМ. -

Tí!кам образом, десорбция холестерина из липидной фазы липопротен-зв, выбран дигосон а эритроцитов становится заметной лишь при достиг»-ш определенного уровня содержания холестерина в них. Пул холестерина, зступвый для холестерин-специфического сорбента или холестерин-с/ссида-i , (Pal е.а.,1980) это одновременно пул, в составе которого молекулы гвронда не оказывай существенного влияния на изменение структурирэ-анноста лшщцной фази мембран.

2.3 Влияние холестерина на функциональную активность мембраносвя-зантах ферментов.

В этом разделе будут представлены результаты исследования физического состояния липидной фазы биологических мембран и активности мембра-носвязанных ферментов при изменении содержания холестерина как in vitro так и in vivo.

а. Мембраны эритроцитов.

В вашей работе влияние изменения содержания холестерина в мембранах эритроцитов оценивали с помощью измерения температурной зависимости активности Nat К+-АТФазы, построенной в координатах Аррениуса. Было обнару жено, что в случае нативных мембран эритроцитов, содержание холестерина в которых соответствует значению индекса 1хс/фл 0.9, температурная зави симость активности фермента линеаризуется с образованием излома при температуре около 20° С. Увеличение содержания холестерина в мембранах эритроцитов привело к сглаживанию температурной зависимости активности Nat К+-АТФазы, нивелируя энергию активации фермента во всем интервале используемых температур.

Обработка холестерин-обогащенных мембран эритроцитов сорбентом привела к дехолестеринезйции и восстановлению Аррениусовской зависимости активности фермента, появлению излома' при температуре около 20°С.

б. Мембраны тимоцитов.

Определение влияния холестерина на структуру и физическое состояние мембран т-лимфоцитов проводили путем измерения формы спектра люминесценции ДМХ и зкеимеризации пирена.

При использовании ДМХ было обнаружено, что ( рис.7) холестериноэ тимоцитов сопровождается коротковолновым сдаигом спектра флуоресценции зонда,связанного с плазматическими мембранами и мембранами липосом, сформированными из липидов клеточных мембран, который был практпческв пропорциональным до значения индекса 1хс/фл=0.6. при дальнейшем увеличении содержания холестерина изменений формы спектра люминесценции ДМХ не наблюдалось. Аналогичные результаты были получены и при измерении вксв-меризации пирена в плазматических мембранах тимоцитов.

На рис.7 представлены результаты исследования влияния холестериш на активность Na+ ,К+-АМазы и 11бг+-АТФазы мембран тимоцитов. Видно, чте по мере увеличения относительного содержания холестерина в мембрана; клеток в интервале значений индекса 1хс/фЛ =0.3-0,6 наблюдается угнете-

пив активности На+,К+-АТФазы, которая при дальнейшем увеличении содержания стероида выходит пэ стадию насыщения, с другой стороны, инкубация т-лямфоцитов с лнпосомама не содержащими холестерин, привала к уменьшении содержания стероида в плазматических мембранах клеток с 1хс/фл 0.48±0.02 до 0.28-0.01 и увеличению активности На+,К+-АТФази на 40%. В

противоположность этому активность дерзания холестерина не зависела

Ц^+-АТФазы мембран тимоцитов от со-

^мо^зэг

^за^г,

548

5 -

А * Б ^о-о

I -0.81 /

\ -0.6 ]У

V -0.4 /\\

/ 2

0.2 . -^-п-^Г-Я-гггтг

- 1.6

0.6 б^

1.4

0.6

1.2

1хс/фл

Рве 7. Влияние холестерина на структурно-функциональные свойства мембран тимоцитов. А-1 активность Ка+,К+-АТФазы, А-2 -активность Н^+-АТФазы, Б-1 изменение формы спектра ЛЕминесценции ДОХ, Б-2,3 -эксимеризация пирена в мембранах V липосомах, сформированных из липидов мембран тимоцитов.

в.Мембраны клеток АсЬо1ер1азаза ДМИачуП. В работе использовали ге-ролонтологическуш модель старения клеток АсЬо1ер1аз:Ез 1аШ.а*11. При этом была поставлена задача проследить взаимосвязь мовду накоплением холестерина в мембранах клеток А.1а1с11алг11 в процессе роста и старения в резных экспериментальных условиях и структурно-функциональными свойствами клеточных мембран. Было обнаружено, что (рис.8) в процесса роста клеток на фоне практически пропорционального увеличения содержания холе сто-

рина в период от 24 до 80 часов динамика вксамеризадаа гщрвна в шшзыа тических мембранах и лнпосомах, сформирован]ее из липидов плазматически мембран, носит двухфазный характер.

?47C/F392 •1.4

1.0 -

0.6 -

Ixc/фл

0.6

0.4

0.2

Рис 8. Изменение содержания холестерина (I), ¡эффективное^ эксимзризацаи пирена в мембранах (2) и лшосомах (3, сформированных из мембранных лийидов, в. зешге&мости oí возраста iuistok Acholeplasma laidlesli, 1хс/фл,шя&/иочь

При исследовании активности мэмбраносвязашш Н^-ИЛШги в ИАШ-дэ-гидрогенази в зависимости от возраста культуры бит обтpyssao, что i период роста культуры с 12 до 20 часов актнввоеуь обош £¿p¿»stob увеличивается, достигая максимума в период с 18 до ?Л адеоз, 8 дэл&о ейчянаеч снижаться. Аналогичные, по характеру результата Шш оощч&ю в щ?з До-пользованиа протеолипосом, полученных' пузш рэкозструкцда «змбранно! Н^-АТФазы на лшосомах.

Таким образом,, способность холестерина и на 2 пулг

получило свое отражение на особенностях фуш&ощ&зёзгя иеыбраносьлзан-ных ферментов как tn vitro так и In vivo. Bese ywjmsws содержания холестерина в интервале концентраций, формированию актив-

юго пула ¿.паблвдается ограничение латеральной н вращательной диффузии зондов н пнгкОированнв функциональной активности мембранных ферментов. Когда ев происходят образование пуле Б, в составе которого стероид не оказывает влияния па молекулярную подвижность фосфолшгадных молекул, эф-®окт действии холестерина на активность мембраносвязанных ферментов исчезает.

2.4 Влияние холестерина на перехисное окисление липндов мембран липосом

. Перекнсное окаслвнне лнпндов мембран липосом инициировали ионами двухвалентного полоза а системой ксантан-ксантшоксидаза. Определение уровня ПОЛ проводили путем измерения интенсивности хемилшинесценцни и количества ТБК-вктстиыг продуктов.

Peo 9. Влияние холестерина на перекиснов окисление лшщдов мембран липосом. I- интенсивность хвмилшинесцвнцин,. 2- колн^ство ТБК-активных продуктов. Ixc/фл, моль/моль.

Било обнаружено, что (рас.9) по мере увеличения содержания толвсте-рзна в мембранах лшосом максимальная хштенспвность медленного свпения хвмялтяпзсцеццаз (Н) умонызаотся до значений индекса Ххс/фл <0.5, а то время как в интервале значений индекса 1хс/фл>0.5-0.8 интенсивность хе-

милюминесценции остается неизмешюй.

Наблюдаемое в зксперименте уменьшение H является скорее всего следствием холестерин-зависимого торможения реакций перекисного окисления липидов, поскольку, во-первых, уменьшение интенсивности свечения ' сопровождается изменением и других параметров хемилшшесценции и j во-вторых, по мере увеличения содержания холестерина в мембранах липосом' происходит уменьшение количества образовавшихся ТБК-активных продуктов, характер которого полностью совпадает с изменением параметров хемилюми-несценции (рис.9). Аналогичные результаты были получены и при инициировании ПОЛ мембран липосом системой ксантин-ксантиноксидаза. I

Наиболее вероятно, что ингибирующее действие стероида на пероксида-> цию структурированных лшшдов состоит в модификации физического состоя- ! ния липидной фазы. Действительно, величина коэфициента латеральной диф-; Фузии пирена, рассчитанного по его эксимеризации в мембранах липосом, изменяется таким «е образом, что и параметры ПОЛ.

Следовательно, на уровне простых физико-химических моделей ( мембраны липосом) холестерин за счет своего структурирующего аффекта ингиби-. рует перекисное окисление мембранных липидов. Важно подчеркнуть, что свойством "сруктурного антцоксиданта" холестерин обладает только лишь до определенного предела своего содержания в мембранах.

2.5 Влияние холестерина на электрическую стабильность мембран

липосом.

В работе предпринята попытка -выяснить каким образом изменяется электрическая стабильность мембран липосом при постепенном увеличении< содержания холестерина.С этой целью измеряли величину диффузионного потенциала пробоя мембран липосом с разным содержащими стероида. Было обнаружено, что по мере' увеличения-содержания холестерина в мембранах липосом потенциал пробоя увеличивается с 157 мв в отсутствии стероида до 166 мв при значении индекса lxc/фл- 0.5. Дальнейшее увеличение содержания стероида в мембранах липосом изменений величины потенциала пробоя не вызывало.

Чтобы ответить на вопрос каким образом изменение свойств мембраны влияет на распределение холестерина между двумя пулами, измеряли зависимость потенциала пробоя и эксимеризации пирена от содержания холестерина в мембранах липосом, модифицированных ПОЛ. Перекисное окисление липидов

юдит к двум основным аффектам:

!НИ2ешш потенциала пробоя во всем интервале содержания холестерина и "напылению предельного количества мембранного холестерина,после доста ш которого дальнейшее увеличение его содержания ухе не влияет на стрическую стабильность бислоя. *

Это предельное значение индекса 1хс/фл для дадкфгцпрованных ПОЛ 5ран, найденное как при измерении потенциала пробоя, так и эффективен эксимеризации пирена (рис.4) оказался равным 0.3-0.4.

Таким образом, показано, что холестерин и ПОЛ противоположным обра -влияют на электрическую стабильность мембран лилосом. Это позволяет проложить, что увеличение содержания холестерина монет носить защит-характер и быть ответом на воздействия, приводящие к снижению элект-зской стабильности кембран. До тех пор, пока встраивание холестерина ровокдается изменение:.! структурированности лшшдной фазы, холестерин пятствует нарушении целостности мембран. Но как только стероида стаится иного и он формирует домны кластеризованного холестерина, е таве которого сн не способен оказывать влияния вд на физическое сое-ш!9 лшшдаой фазы, ни на потенциал пробоя, влияние перокиспого окис-ия лшшдов становится превалирующим и как следствие величина потешщ-пробоя снижается.

6 Перекисное окисление лшшдов липопротевдов при гшерхолестершекии

В нашей работе была предпрглшта попытка проследить за динамикой со-жания холзсторшш и уровня реакций ПОЛ мембран и липопротевдов с ис-[ьзованием двух патологических моделей:алиментарной ГХЕ кроликов и фения культуры клеток Ас1ю1ер1азта 1аШа«И.

а. Алиментарная гиперхолзстеринемия кроликов. При исследовании дошки содержания холестерина и ПОЛ з процессе развития алиментарной ГХЕ ■ )ликов было обнаружено, что ( рис.10) увеличение содержания холестери-в сыворотке и апо-ь-липопротоздзх происходит параллельно возрастанию генсивности хемилюмикеецзкщпг выделенных ого-ъ-липепротеидов, что мор быть следствием двух причш!: увеличения окисляэмосга липидов лилоп-сеидов и/или увеличения количества выделяемых из сыворотка лшопрогеп-з.В пользу первого предположения свидетельствует увеличение так ■ назимой нормированной хемилшинесценции, приведенной к единице концентр.-) и апо-Ь-липолпротепдов.

Вагшо подчеркнуть, что аналогичные свойства проявляют апо-Ь-лш ротонда, выделенные из плазш крови лздей с патологшши, сопрововдапда ■ ся ГХЕ. лп. ХС си

Рис 10. Изменение содержания холестерина в сыворотке ( апо-Ь-липопротеидах (2) и нормированной хемилшинэсцен апо-Ь-липопротеидов (3) в процессе рагвигия алиментар гиперхолестеринемии кроликов.

Иг-", в процессе развития алиментарной ГХЕ кроликов, особенно ранних сроках развития атеросклероза, наблвдается увеличение окисляем та лнпидов лнпопротеидов и рост содержания холестерлна, которые " за выходят на стадию насыщения.

б. Холесториноз мембран клеток Acholeplasma la'dlawll. Кгточни холестерина в мембранах клеток Acholeplasma laidlnwil является стер лнпопротеидов сыворотки, вносимой в питательную с]юду ( Razin е.а.,19 В связи с атим представлялось интересным выяснить .№кое влияние мо оказать инициация перекисного окисления липвдов сиворотки питатель среда на накопление холестерина в мембранах клеток A. laldlawll. этою использовали сыворотку, предварительно обработанную УФ-облучени

тепешг окисленпости липидов сыворотки судами по накоплению в ней ^-активных продуктов.

Было обнаружено, что в лагари^мнческай фазе роста контрольной куль->ы, находящейся в контакте с необлученной сывороткой, относительное (враание холестерина в мембранах клеток минимально и составляет значв-I индекса 1хс/фл=0.2-0.3, а при дальнейшем росте меток увеличивается, ;тпгая значения индекса 1хс/фл=0.7.

Посев клеток, в среду с окисленной сывороткой приводит к накоплении тестерина в ранней логарифмической фазе роста: значение индекса ixc/фл зличилось с 0.3 до 1,2. Мокно думать, что накбплепие холестерина г ябранах клеток A.laidlarcii в латентной и ранней логарифмической фазе звитая является реакцией меток на неблагоприятные условия внешней эды, способствущие активации ПОЛ. Увеличение содержания мембранного лестерипа является следствием активации метаболизма клеток. ■

Собственные результаты а данные литературы свидетельствуют о том, о увеличение содериавия холестерина, отмеченное в ряде хронических па-логий, a такте при действии фяаЕко-хиярюсюа факторов внешней среда онизируицзя радиация, отравления хлорорганическими соединениями и др.) >кет выступать в роли адаптационной реакции оргапизма, направленной иэ щиту лшцщой фазы от перзкисноЯ модификации мембрап и липэпротеддов.

Таким образом, сопостовляя результаты влияния холестерина на ПОЛ )дельпых мембран in vitro и взаимосвязь между содзркаиегд холестерина и »роксидацпей липидов in vivo мохаю заключить, что состояние реакций ПОЛ шспротевдов и клеточных мембран есть результат суперпозиции двух про -;ссов:

а. увеличения эффективности инициация перекисного окисления за счет эста количества радикалов-инициаторов и

0. лпгиблровзния процесса ПОЛ за счет увеличения синтеза и актив-: эсти эндогенных ацтиокспдантов, включая холестерин.

ЧАСТЬ III. ПРОДУКЦИЯ AKTlíBKHX ФОРМ КИСЛОРОДА ПОЖЮ№ЮЯДЕРШШ ЖПСОЩТАШ КРОВИ БОЛЬНЫХ ИШШЧЕСКОИ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА И ИНФАРКТОМ МИОКАРДА.

В заключительной части работы изучались свойства полимор&юядершг', ©йкоцитов (НМЛ) крови в основном при патологиях, характеризующихся ПСЕ.

В связи с этим возникает вопрос: могут ли короткоаивущие гращ^ ты быть клетками-мишенями для холестерина и если да, то каким об{ встроенный холестерин может влиять на микровязкость липидной фа: функциональную активность ПМЛ?

3.1 Влйяние активации ПМЛ на инициирование ПОЛ мембран липосом,

Стимуляция ПМЛ, равно как и других фагоцитов, сопровождается у! чением продукции АФК и других прооксидантов, способных инициировать (СаШахЧ е. а.,1985) В этой связи важно было выяснить при каких усл< этот процесс идет с максимальной эффективностью?

С этой целью была проведена серия опытов, в которых липосомы < ляли от ПМЛ диализной мембраной и измеряли накопление ТБК-активных дуктов в суспензии липосом (табл.2).

Табл.2.

Влияние стимуляции ПМЛ на накопление ТБК-активных продуктов в мембранах липосом.

Состав суспензии МДА

Внутри диализного мешка Вне диализного мешка нмоль/мл

Раствор Хенкса ПМЛ + зимозан Раствор Хенкса ПМЛ ГШ + зимозан ПМЛ + зимозан ГШ + зимозан Липосомы Липосомы Липосомы Липосомы + №е-АДФ) Липосомы + (Ре-АДФ) Липосомы + (Ре-АДФ) Липосомы + (Ре-АДФ) + СОД Липосомы + (Ре-АДФ) + катализа ПМЛ + зимозан + (Ре-АДФ) 0..049 - О.ООЗ 0.060 ± 0.003 0.050 ± 0.001 0.057 ± 0.002 0.113 1 0.005 0.042 - 0.002 0.043 ± 0.005 0.051 1 0.003

Данные, приведенные в табл.2., свидетельствуют о тон, что АФК, общие ся при стимуляции 1Ш, на вызывают прироста ТБК-иктивных продук-мембранах липосом. И только в том случае, когда были созданы усло-1ля образования гидроксилышх радикалов при введении в суспензию'jk--[ комплексов ионов келеза с АДФ была обнаружена значительная актива--ЮЛ. Супероксиддисмутаза и каталаза предотвращали пероксидацию мзмб-IX липидов, если их добавляли в суспензию липосом перед стимуляцией

3.2 Лшинол-завясЕмая хемилшшесценция ШЛ.

В работе была поставлена задача изучить как изменяется уровень циональной активности и каков механизм активации ГШ, выделенных пз фэраческой крови здоровых людей, Сольных шемической болезнью сердца фарктом миокарда, a Taitas в но скольких экспериментальных патологи-, их моделях. Функциональную активность ШЛ изучали путем измерения уллрованной люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛХЛ). Было обнаружено, что максимальная интенсивность ЛХЛ нейтрофилов я больных ИМ значительно превыэает величину Хл-ответа ШЛ крови !ных ИБС п доноров.

Увеличение функциональной активности граяулоцитов в циркуляции пе-фической крови, обнаруженной при патологических состояниях организма зт быть следствием нескольких причин:

увеличения активности фзркентов,участвующих в реализации респиратор э взрыва ШЛ.

увеличения количества я аффинности рецепторов на поверхности ГЕЛЛ, изменения конной проницаемости я в том числе ионов кальция, изменения физического состояния лшшдкой фазы мембран ШЛ, уменьЕения активности ферментов-перехватчиков АФК: СОД, каталазн и др

3.3 Изменение физического состояния мембран ШЛ.

Целью данного раздела работы было изучение содержания холестерина, ического состояния мембран и сопастовлениз с параметрами функциокаль-t ектзвдастз IШ крова здоровых людей* а таюэ больных ИБС и ИМ.'

Било обяаругазно, что ( твбл.З) в норма содержание холестерина ь «бранах 1Ш соответсвует значению индекса ixc/фл = 0.5 (макоп

е.а.,1972). В ПМЛ крови больных ИБС содержание холестерина увеличивав! (тхс/фл возрастает до 0.66) на фоне практически постоянства содержат Оосфолипидов. в случае ПМЛ, выделенных из крови больных ИМ обнаруже увеличение абсолютного количества как холестерина, так и фосфолшшдс за сч_т которых по-видимому и происходит некоторое уменьшение велич! индекса ххсУфл то отношению к гранулоцитам больных ИБС.

При исследовании микровязкости клеточных мембран было обнаруже! что величина s-параметра спинового зонда в ПМЛ крови доноров par 0.730, в ПМЛ крови больных ИБС - 0.809. Иными словами, увеличение соде кания холестерина в мембранах гранулоцитов при ИБС находит свое отра! rate в изменении микровязкости клеточных мембран. В случав ПМЛ кроь больных ИМ величина s-параметра спинового зонда оказалась равной 0.824

Одной из основных причин увеличения функциональной активности пат логически модифицированных ПМЛ является значительная (более чем в раз) экспрессия трансмембранных Fc-рецепторов, способных формировать г пограничных липидов. Следовательно, можно думать, что более чем 50-крг ное увеличение количества Рс-рецепторов и соответсвенно этому возраст нив доли структурированных липидов может быть причиной увеличения сре неклеточной микровязкости мембран ПМЛ крови больных МЫ.

Таким образом, показано, что хроническое повышение содержания з лестерина в плазме крови больных ИБС и ИМ сопровождается холестерином циркулирующих ПМЛ и увеличением микровязкости липидной фазы мембран. I других клеток-Крови подобная ситуация' характеризуется ингибироваш многих мембраносвязанных процессов. В случав же ПМЛ, выделенных из крс больных с выраженной ГХЕ, оказалось, что их функциональная активность меньше-нормальных клеток, а значительно выше. Это кожет быть обусловлю тем, что наряду с накоплением холестерина в процессе развития ИБС в с ганизме возникают все признаки воспаления, сопровоадаюциеся повышеш функционального статуса циркулирующих клеток и выбросом в циркулт крови новых более активных ПМЛ, содержащих на поверхности большее koj чество рецепторов, вклад которых в активацию перекрывает ингибируш эфХект встроенного в мембраны холестерина. .

Табл..З.

Изменение состава, физического состояния мембран и свойств рецепторного аппарата ПМЛ.

Пациенты £Хс] нмоль/107 ПИЛ даз ЕМОЛЬ/1О7 ПМЛ 1хс/фл моль/ моль s-параметр Í Число , мест - связи . ФИТЦ- . • ИК

до сти муляции после сти мулящш

Доноры П=10 26.6-5.2 53.7-6.3 0.49± 0.01 0.730± 0.003 0.7610.005 71.4-7.4

ИБ0,п=9 39.5-5.9 59.8-9.9 06б± 0.01 О.БОЭ* 0.002 0.836± 0.002 133-34

КМ,п=12 51.2-14.9 98.5-25.6 0.520.06 0.824-О.ООб 0.885* О.ООб 6334-1 Об

3.4 Функциональная активность ПМЛ и экспрессия поверхностных

рецепторов.

Для того, чтобы оценить вклад рецепторного аппарата ПМЛ в процесс активации клеток было изучена способность нейтрофилов крови здоровых людей,вольных ИБС и ИМ связывать иммунные комплексы, меченные фпуоресцеин изотиоционатом (ФИТЦ-ИН), взаимодействующие с ПМЛ через рс-рецепторы (Ьев11е е.а.,1934).

Для выявления количественных закономерностей взаимодействия ИК гранулоцитамя определяли влияние различных концентраций стимулятора интенсивность флуоресценции ФИТЦ-ИК связанных с поверхностью ПМЛ здо] вих людей , больных ИБС и ИМ (рис.11). Видно, что по мере увеличения I личостп меченного лиганда интенсивность флуоресценции суспензии гра! лоцитов возрастает во всех трех группах клеток. Однако, в случае ИМ а сабность ПМЛ связывать ФИТЦ-ИК значительно выше. Полученные результ! пряного титрования пересчитывали в двойных обратных - координатах Било < нарушено, что (табл 3) при Ш число тст связывания стимулятора бо.

Рис II. Зависимость интенсивности флуоресценции НМЛ крови здоро лвдей (I), (Зольных ИБС (2) и инфарктом миокарда (3) концентрации ФИТЦ-ИК.

Таким образом, сопостовляя полученные результат можно заключи что между величиной Хл-ответа ГШ крови здоровых лвдей, больных ИБС и и экспрессией рецепторного аппарата существует вполне удовлетворитель корреляция: гранулоциты, обладающие большой функциональной активное содержат на поверхности значительно больше специфических рецепторов

специфических мест связывания стимулятора. Это означает, что события, нисходящие в организме больного значительно увеличивают функциональней генциал НМЛ. Обнаруженные изменения функциональных свойств ПМЛ могут гь следствием несколких причин: л

а. ответа клеток, т.е. увеличения активности циркулирующих ШЛ нг. '¿ант возникновения патологии и

б. ответа организма, выражающегося в появлении з ¡спекуляции кровч лее активной популяции гранулоцитов.

' Способность циркулирующих ШЛ при определенных условиях изменять ой функциональный статус получило название предстимуляции или :оНт11 е.а.,1983).

3.5 Влияние продуктов перекисного окисления лшмдов ка предсткмуллци» шлиморфноядерных лейкоцитов крови.

Хорооо известно, что воспалительные заболевания, протекащкэ в ус )вяях увеличения функциональней активности ЕМЛ, характеризуются актив?; ;ей ПОЛ. Это предполагает, что между двумя этими свободнорадикальшг.и эоцассами существует определенная взаимосвязь. Действительно, было по ■ ззано, что стимуляция 1Ш инициирует ПОЛ. Но возможно, что продукты по-зкисного окисления могут оказывать влияние на функционирование НМЛ. Лл^ роверки этого предположения было изучено влияние продуктов перокяснчго кислекия липздов мембран липосом на предсткмуляцию ШЛ. .

Было обнаружено. что предкнхубация гранулоцитов с окисленными липо-омами приводила к 2-3 кратному увеличению ХЛ-ответа ЕМЛ на последующую ткмуляцжо опсонизированиым замозаном. Кроме этого оказалось, что среда, нкубация в которой НМЛ приводит к максимальному Хл-ответу, содержит на-болькее хохяестза гксрояерекисей, которые встраиваясь в клеточные вмбраш способ г.; ?о*яг«гев8?ь конную проницаемость, в том числе Са Лебедев к др.,!::-';;,«* является одним из основных этапов предстимуля ^ ПУЛ.

Для определения -влияя/л продуктов ПОЛ на экспрессию 5Гс-рецепторо1> ¡роводшга анализ связывания ФЙТЦ-ИК с поверхностью ПМЛ,обработавшие про-¡уктагя! перекисного окисления мембранных ляпвдов. Было обнаружено, чт-; Ю мин прединкубации ПШИ в срадв с концентрацией {Щ=15.Ю""5 М сопроопк дается увеличением числа мест связывания ЙЙЦ-ИК примерно в 2 раза.

Увеличение количества поверхностных рецепторов. В процессе предстч

.'¿ляцж ПМЛ не является следствием активации биосинтеза белка, поскольку г"'^дегше в среду прединкубации циклогексемида в концентрации 30 М Н£ лгззывало влияния на параметры предстимуляцки гранулоцитов.

Таким образом, продукты перекисного окисления липидов, предпочти-:елыю гидроперекиси, обладают способностью к предстимуляции гранулоци-чов, которая характеризуется увеличением функционального потенциала клеток, .выражающегося в увеличении Хл-ответа на стимуляцию и соответственной экспрессией поверхностных рецепторов, не связанной с активацией био-сиитеза белка.

3.6 Гетерогенность гранулоцитов.

Для выявления гетерогенности популяций ПУЛ в остром периоде КМ определяли способность отдельных гранулоцитов связывать ФИТЦ-ИК и восста-иашшьзть нитросиний тетразолий (НОТ) в окрашенный продукт- диформазан.

При исследовании способности ПМЛ крови здоровых людей связывьш Ф1'.''Щ-ИК было обнарукено, что распределение клеток по интенсивности флуоресценции связанного маркера представляет собой одномодальную зависимость. Максимальное количество клеток (38.6*3.3 %) находились в интерва-.'¡о с 'интенсивностью флуоресценции 40-80 отн. ед-ц. Цитофлуориметрическое исследование ПМЛ крови больных Ш показало, что распределение клеток пс их интенсивности флуоресценции носит бимодальный характер с максимумами в интервале 40-80 и 160=200 отн. ед-ц, на которые приходилось 14.8*5.7 н 16.2-2.4 % клеток соответственно. Кроме того было обнаружено небольшое количество ПМЛ, способных связывать в десятки раз большее количество ФИТЦ—ПК, чем в норме.

Аналогичные по характеру данные были получены и помощью -подсчета количества гранул диформазана, образовавшихся в ПМЛ при окислении НОТ. Иными словами, в остром периоде ИМ в циркуляции крови на фоне общага лейкоцитоза появляется группа нейтрофилов, обладающая большим функциональным потенциалом.

Таким образ~м, механизм увеличения функциональной активности НМЛ крови в процессе возникновения и развития различных воспалительных заболеваний включает в себя по крайней мере 2 стадии:

I. Уке на первых этапах возникновения нэкрозв, первичного цикла шемии- реперфузии в циркуляторном русле монет появляться ряд веществ способных предстимулировать гранулоциты: фрагменты южплемента, иммунные

комплексы, и в том числе продукты ПОЛ. В результате в циркуляции появляются предстимулировакные гранулоциты с большим количеством рецепторов не ' поверхности, т.е. с более высокой функциональной активностью.

2. Увеличение мощности респираторного взрыва ГО/Л приводит к возрастанию продукции АСК и других биологически активных вецеств. способяих выступать з качестве инициатора выброса клеток из депо, вследствие чэго возникает нейтрофильный лейкоцитоз с появлением субпопуляций весьма лк-тивных ПМЛ в цяркуляторном русле.

Активированные гранулоциты инфкльтруются в очаг воспаления, где рп~ ализуя свой максимальный потенциал не только очйцают зону некроза от погибших клеток, но и взаимодействуя с клетками пограничной области в ряде случаев приводят к расширению зоны некроза.

Ингибкрование гиперактивности ПМЛ, особенно в,острый период госпь-ления за счет перехвата АФК, хелатирования ионов железа, уменьшения агрегации и адгезии клеток, защита лиахдной фазы мембран от действия ПОЛ -все это открывает обнадеживающие перспективы в терапии ряда воспалл-тельных заболеваний.

вывода

I. При исследовании действия перекисного окисления липвдов.шлвдии • рованного УФ-облучением (УФ-ПОЛ) и системой Ре-аскорбат (ге-ПСЛ) пэ функционирование и структуру мембран саркоплазматического ретикулумя (МСР) было показано, что:

а. эффективность поврездащего действия УФ-ПОЛ на функциональную . активность МСР в 10-20 раз выше по сравнению с Ре-ПОЛ,

б. ПОЛ приводило к увеличению мякровязкости лкпидной Фазы МСР независимо от способа инициирования пероксидации, в то время как степеш. уменьшения подвижности Са2+-АТФазы при УФ-ПОЛ оказалась значительно-большей (около 20 раз) чем при ре-ПОЛ,

в. замена эндогенных- лтшдов МСР на дипальмитоиллецитин (ДШ1) предотвращала действие УФ-ПОЛ на конформационнун подвижность Са +-АТФззи.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при УФ-ПОЛ мог происходит пзрекисяая модификация пограничик ляпидов, состояние ко?-.;.> определяет энергию активации Са2+-АТФазы а условия функционирования мс: .

2. Показано, что продукты ПОЛ, предпочтительно гидроперекиси, спо coriMj вызывать предсткмуляцию (priming) гранулоцитов, которая выражаете, в 2-3 кратном увеличении Хл-ответа клеток на стимуляцию и соответсвущи увеличением количества Рс-рецепторов на поверхности нейтрофилов.

. 3. С помощи флуоресцентного и спинового зондирования Сыло показа :ю, что при увеличении содержания холестерина в мембранах липосом, эрит роцитов, тимоцитов и клеток A.iaidlawii стероид распределяется мекд двумя пулами: пул А - активный холестерин, увеличивающий микровязкость структурированность липидной фазы и пул Б - в составе которого молекул холестерина не оказывают сколько-нибудь существенного влияния на структ; ру лшщщого бислоя. Количество мембранного холестерина, при которс; происходит формирование пула Б, в исследованных мембранах лежит в преде ;iax значений индекса 1хс/фл=0.5-1.0 и определяется составом и физически состоянием липидного ко;.шонента. ПОЛ в мембранах липосом приводило : уменьшению количества холестерина, относящегося к пулу А

4. Исследовали влияние холестерина ка мембраносвязанные диффузион ко-коатролируемые процессы: активность Нэ+.К+-АТФазы мембран эритроцито: »1 глмоцитов, Н+-АТФазы и NADH-дегидрогеназы мембран клеток A.laidlawi «гличину потенциала электрического пробоя мембран липосом. Показано, чт но мере увеличения содержания холестерина активность ыембраносвязанны 1ормвнтов уменьшалась, а величина потенциала пробоя увеличивалась д достижения определенного критического количества холестерина, которо оказалось равным содержанию стероида в пуле А. Исследованные параметр; функциональной активности мембран оставались постоянными при дальнейше: увеличении содержания холестерина.

5. Ё мембранах полимбрфноядерных лейкоцитов (ПМ) крови больных ише мяческой болезнью сердца (ИБС) обнаружено достоверное увеличение содер кашя холестерина по отношению к ПМЛ здоровых людей и соответсвенно Згвеличение микроьязкости липидной фазы мембран. Хл-ответ на стимуляци гранулоодтов крови больных ИБС и ИМ превышал Хл-ответ Ш5Л крови доноров Стимуляция ШЛЯ- сопровождалась быстрой активацией эндогенной СОД. Обнару жено, что ГШ крови больных ИМ обладает значительно большим колич8ст ром(более чем в 50 раз) Рс-рецепторов по сравнению с нормой.

6. Изучено влияние холестерина на ПОЛ мембран липосом. Увеличение дергания холестерина в пределах пула А сопровоздалось ингнбированнем Л. Дальнейшее увеличение содержания холестерина на скорость реакций Л мембран липосом нз влияло. „

7. С помощью холестерин-специфических сорбентов.проводили дехолес-ринезацию липопротоэдов плазмы крови, мембран липосом п эритроцитов, держащих различное количество холестерина. Во всех случаях сорбция ¡иводила к полному удалению холестерина пула Б.' 'Если же в процессе »рбции захватывалась молекулы стероида из пула А, наблюдалось уыеньглв-te микровязкости мембран- липосом и восстановление излома при температу-1 около 20° С на Аррениусовской зависимости активности на+,К+-АТФазы ¡мбран эритроцитов. ;

8. Изучали взаимосвязь процессов ПОЛ и накопления холестерина в ли- ■ dпротеидах и клеточных мембранах Ln vivo. На ранних стадиях алиментар-эй ГХЕ кроликов увеличение содернания холестерина в липопротеидах шло зраллэльно возрастанию их окислявмости. Инкубация меток A. laidiawii в . реде, содержащей продукты ПОЛ, сопровоздалось более чем трехкратным вэличением содержания холестерина в клеточных мембранах на ранней лога-ифмлческой стадии роста культуры клеток.

9. Совокупность полученных результатов и данных литературы позволл-т считать, что ПОЛ и накопление холестерша являются ванными механизма-л нарушения структуры и функции лшшдного компонента липопротоидов и неточных мембран в патологии. Поврекдащеа действие ПОЛ обусловлена ко-ификациеа барьерной и мзтричной функций мембран, в частности, нарупени-¡м транспорта ионов кальция, а действие холестерина - торможением ди£Фу-_ шонно-кантролируеишх мембраносвязанных процессов. Эти явления взаимос-¡язаны: холестерин ингибирует ПОЛ и защищает мембраны от последствий дезоксидации липидоп, а активация ПОЛ в организме вызывает накопление стероида . Можно предположить, что накопление холе стерши, равно как и уве-шченпе синтеза и активности других ингибиторов окисления липидов. tn rivo - это ответ организма на усиленна свободнорадякальных процессов.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сороковой В.И., Добрецов Г.Е..Клебанов Г.И..Владимиров I 3-метоксибензантрон - флуоресцентный зонд, чувствительный к конформ! онным перестройкам в белках.// Биофизика.-1974.-Т.19.No.1.-С. 30-

2.Никушкин Е.В..Клебанов Г.И..Изучение температуро-зависимых i формационных переходов белков методом флуоресцентных зондов.// Биоф! Ka.-I976.-T.2I.No4- С.619-623.

3. Клебанов Г.И.,Таршис М.А.,// Структурная динамика липидов мембранный транспорт// В сб.:"Роль изменений структуры мембран в клет ной патологии"/ М.2-Й МОЛГМИ им. Н.И. Пирогова.- 1977.-Т.72, С.92-125

4. Никушкин Е.В..Клебанов Г.И..Владимиров Ю.А.. Изучение фазе переходов модельных и биологческих мембран // Биофизика.-1977.-1 No6-C.1049-1055. '

5. Владимиров Ю^А..Сергеева Н.С.,Рубцов Б.В.. Клебанов Г.И. Влш валиномицина на фазовое состояние и пассивную проницаемость для ис Са"+ мембран из искусственных фосфолипидов. //Биофизика.-1977.-Т.22. - С.948-949.

6 Dobretsov G.E.Petrov V.A..Mlshijev V.I..Klebanov G.I.,Vladlml iu.A. 4-Dimethylaminochalcone and 3 -me t ho xy b enz an t hro r le as fluorec probes to study biomembranes I. Spectral Characteristics // Sti biophisica.-197*7• V.65 N2.-p.91-98

7. Клебанов Г.И..Поглазов А.Ф..Никушкин Е.В.,Шубин М.В..Рубцов Е Владао.. з Ю.А. Температуро-зависимые функциональные изменения мемс саркоплазматического рётикулума.// Биофизика.-1979.-Т.24,No4-C.699-7С

8. Мишиев В.И..Аршинов В.Ю..Клебанов Г.И..Владимиров Ю.А..Гете генность фосфолипидных мембран, выявляемая методом флуоресцентных с дон.// Биофиз*и<а.-1979.-Т.24,No 3.-С.546-547.

S. Владимиров Ю.А.,Сергеева Н.С.,Рубцов В.В., Клебанов Г.И. Влия ■члшюмицша на структурные и функциональные изменения мембран сарв ..'¿зматического рётикулума.//Биофизика.-1978.-Т.23.-No 1 .-С.165-166.

10. Клебанов Г.И.,Никушшн E.B..Владимиров Ю.А. Температуро-зависи структурные перестройки мембран саркоплазматического ретикулума/.'

1изика.- 1978.- Т.23, No 2.-С. 261-265.

11. Рубцов Б.В.,Ружицкий А.О., Клебанов Г.И..Седов A.M., Владимиров. . Действие тритерпеновых глшсозвдов морских беспозвоночных на пронк-адсть модельных и биологических мембран.// Изв. АН СССР. сер. биол.-3.- NO З.-С. 402-406.

12. Сергеева Н.С..Клебанов Г.И..Козлов Ю.П..Ситковсгай? М.В. Влияние канавлина А на адсорбцию ионов кальция лимфоцитами.// Биофизика.-0.- Т. 25.No 25.-С.508-509.

13. Ситковский М.В..Сергеева Н.С., Белявский М.А., Клебанов ..Козлов Ю.П., Увеличение связывания кальция лимфоцитамим под влиянн-митогенных лектинов.// Биофизика.-1981.-Т.26, No 12.-С.358-359.

14. Миииев В.И. .Красова Е.И..Кузьмин A.B., Таршис. U.A.. Клебаиог-. Влияние фазовых переходов на проницаемость мембран клеток, aidlawii.// В кн. "Биофизика мембран"/ М..Наука.-1981.- а.39-46.

15. Клебанов Г.И., Сороковой В.И..Нйкушкин Е.И..Владимиров Ю.А. пературо-зависимые перестройки мембран митохондрий.// В кн."Биофизикп бран"/ М. Наука. 1981. С. 46-52.

16. Никушкин Е.В..Клебанов Г.И..Шубин М.В..Владимиров Ю.А. Роль фа ых переходов лшшдов в регуляции функциональной активности мембран коплазматического ретикулума.// В кн."Биофизика . мембран"/ I.3C.53-58.

17. Tarshls U.A..Ladygina V.P..Uigushina V.L., Klobanov ..Hakovskaya Y. Interaction of Acholeplasma laidlawil cells with зе spleen lymphocytes// . Zbl.Bakt. Hyg. J.Abt.. g.-1981.-A-250.-p.153-166.

Клебанов Г.И..Шерстнев М.П.,Анкундинов И.В..Сакенин Г.М..Владимиров . Влияние холестерина на перекионое окисление липидов.// В сб. "Тез. :л. I Всесоюзного биофизического съезда"./ M.I982. Т.I,С.187.

19. Сакенин Г.И.,Клебанов Г.И..Шерстнев М.П.Ди B.C..Торховгкал .., Касаткина Л.И..Владимиров Ю.А. Гетерогенность холестерина в мзчб-:ах.// В сб.:"Тез. дога. I Всесоюзного биофизического съезда"/ и. 12.Т. I .С. 157.

20.'Клебанов Г.И., Сакенин Г.И..Шерстнев М.П..Андрианова И.П., Серию В.И., Стручков П.В..Владимиров Ю.А.Селективное удаление холосто -[а при гемосорбции на различных сорбентах.// Вопр.мед. химии.-1982.

- за -

■йо 5.-С.131-133.

21. Лопухин Ю.Ы., Ыолоденков Ц.Н., Сергпешсо В.И.. Клебанов Г.И |Ъерстнав М.П. Хешипемпнесцонция апо-ъ-липопротеидов при экспериментал: ной гиперхолестериыеыги у кроликов.// Балл. эксп. биол. и мед.-1982.-' 93.N0 л.-С. Ю1-Ю2.

22. Лопухин Ю.Ц..Владимиров Ю.А., Цолоденков Ы.Н., Клебанов ,Г.И Сергиешсо В.И..Торховская Т.К., Носкова Я.М., Наумов А.В., Максим« А.И.Шерстнев М.П. Хемшшдше сцэнцпя лншпротеидов сыворотки крови, выда ленных ультрацентрзгфугпрованием и осаздением в присутствии гепарина кальция.// Вопр. мед. тиш.-1Э83.-Т.29, Но 1.-С. 61-63.

■23. Лопухин Ю.Ц., Владимиров Ю.А..Молоденков М.Н.,Клебан< Г.И. .Сергиешсо В.И Наумов А.В. .Максимов В.А. .Шерстнев М.П. Регистрам хешшшнесценвди составных частей сыворотки крови в присутствии двухв. лентного железа.//Билл, акспер. биол. и мед.-1983.-Т.95. но 2.-С. 61-6!

24. Капиталов Л.Б.,Ладыгина В.Г..Муханкин А.И.,Клебанов Г.И. .Кул; кова С.Н. Накопление холестерина в мембранах Ас1го1ер1аБта 1а1<11аи11 стационарной с2юзе роста культуры.//Биохимия.-1983.-Т .48,Но II 0.1930-1935* • '

25.Рубцов Б.В.,Клебанов Г.И..Рукицкий А.О..Владимиров Ю.А. Орава нпе действия УФ-облучения и ре-индуцированного ПОЛ на мембраны сарко: лазнатического роликулума.// Изв. АН СССР, сер. биол.-1934.-Но: -С.299-302.

26. Корочкин II.Н., Клебанов Г.И., Чукаева И.И., Александров А.А Туркменова Э.М.,Арутюнов Г.Л. Хемилюминесценция лейкоцитарной массы диагностике острого инфаркта миокарда.// Тер.архив.- 1934.-Т.56, N0 I -0.29-31.

27.Григорьев П.П.,Клебанов Г.И..Яковенко Э.П..Шерстнев М'.П.,Устин< А.В., Ти, шшя Ю.О. Перекисное окисление липидов мембран гепатоцитов п. хронических заболевания-печени.// В сб.:яТэз. докл. III Всесоюзного съезда гастроэнтерологов"/ М. 1984. С. 19-21.

28. Капитанов А,Б., Иванова В.Ф., Муханкин А.И., Ладыгина В,Г.,До( рынина О.В.,Кл~банов Г.И., Сагешш Г.И.. Арчаков А.И. Изменение акти поста ферментов плазматических мембран в процессе роста культуры клет< АсПо1ер1авт^ 1а1с11агс11.//Биохимия.-1984.- Т.49.Й0 II.- С.1747-1753.

29. Рубцов Б.В.,Клебанов Г.И., Заморин О.В.,Владимиров Ю.А. Влияш ПОЛ, индуцированного УФ-облучением на Са -АТФазу мембран саркоплазма-тического ретикулума.//Изв. АН СССР,сер. биол.-I984.-N0 4.-С. 624-626.

30. Лапшин Е.Н., Добрецов Г.Е..Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А.Декол гирукцее влияние холестершга на бислой из общих яичных фосфолшш .//Биофизика.- I9S3.~T.28.Ho 5.-С.752-755.

31. Клебанов Г.И., Ыерстнэв Ы.П. Гиперхолестерипешш в патогенез:: росклароза/ М.ВНИШИ.1983. 74.

32. Klebanov G.I. ..indrianova I.J?.,Lapuk Ja.I. Тле removal о! leatого1 iron rsenbranss and lipoproteins by mean of • specyiic bants.// In:"Cytochrcn P-450 and protection oi humf.n iroment.All-union conference. Abstr./ M. 1985.~p.166.

33.Клебанов Г.М. .Турю'енова Э.М.. Крзйшша M.B., Чукаова И.И.. Ксюш И.!.!., Владимиров Ю.А.Механизм активации фагоцитоза ГШ хсрови при

и инфаркте миокарда.// В сб.:"Иммунология атеросшюроза и i"/Томск.-I985.С.53-54.

34 Клебанов Г.И.,Иванова Л ЛЬ, Туркменова Э.Н..Владиьшров'Ю.А. Вли -:е холе?стерли на физическое состояние и функционировавшее мембран !*оштов.//Биофизика.-IS3S.-T.3:, 1Ю I.-C. 73-78.

35. Шарсшзв У.П., Клсбспоз Г.И., Влади,шров D.A. Алтиокислителыш! 'пвность синтетических глнцэрсфосЕолщшдов.//К. физ. хшпи.-1885.-i9,iio.9.-С.2283-2286.

36. Рубцов Б.В.,Клебанов Г.И., Владимиров"!). А., Влияние ПОЛ па сос пгае SH-групп мембран сархоплазматического ретшсулума.// Изв. All СССР, ). 0::ол.- IS05.-i;o I.-C. 157-160.

37. Корочгаш LU.i., ЧукаоЕа И.И., Клебанов Г.И., Литвинова С. tl., )бле уя современно!! диагностики инфаркта миокарда.//Сов. медицп .-IS85.-MO 12.- С.3-8.

38. Бабаяна А.Р..ЗдановскиЗ P.M.. Клебанов Г.И., Перекисяое окисле-в апо-ь-лгаюпротеядов при поздних токсикозах беременности.// Акушере з и гинекология.-1986.- По 4.-С.32-34.

ЗЭ. Андрианова И.П..РабовскиП А.Б..Клебанов Г.И.,Сп9вак Т.И.Л'урк-зова 3.U., Самойлова Р.А. .Давидович Ю.А. .Роговдш С.В. Использование зцкфического сорбента для дехолестеринезации мембран и лштопротеи-3.//БКОЛ. нембраш.- 1986.-Т. Э.Ко 9.-C.S3I-S35.

40. Benov L.C. .Vladirairov Yu.A., Klebanov <J.I.,Eochev P.O. .R'inarm R. Effect of oxidized phospholipids on ,the chemiluminescencfi o> nozan-activated leukocytes.// In: "Activated oxigen specion ological systems"/ Varna, Bulgaria.-1986.p.25.

41. Рубцов Б.В., Клебанов Г.И.. Максина А.Г., Владимиров Ю.А. Вжа

_ 4U_

mie ПОЛ на на структуру мембран саркоплазматического ретикулума.// АН СССР.сер бИ0Л.-1986.-Ш 3.-С.465-469.

42. Клебанов Г.И..Париев О.М..Туркменова Э.М..Владимиров Ю.А. гае холестерина на электрическую стабильность мембран липосом.// мембраны.- 1986I-Т. 3. NO II.-C.II62-II58.

43. Марзоев А.И., Клебанов Г.И.. Шерстнев м.П., Андргаценко A.I рекисное окисление липидов сыворотки крови кроликов с различными оидными состояниями.// Вопр. мед. химии.- 1985.-Т.31,No 2.-С. 14—I"!

44. Ковалевский Е.И..Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О., Бабе И.В.,Гусева., Комаров О.С. Антиоксидантная активность фармаколога препаратов, применяемых для лечения глаз.// Вестник офтал! гии.-1987.-Т.103,N0 4.- С. 48-51.

45. Клебанов Г.И..Туркменова Э.М..Крейнина М.В.,Чукаева И.И.,* кин И.И., Владимиров Ю.А.Гетерогенность рецепторного аппарата пол! ноядерных лейкоцитов крови.//Биол. мембраны.-1987.-Т.4, No 3

С.1084-1092.

46. Корочкий И.И., Чукаева И.И., Клебанов Г.И. Роль хемилюмшн цки лейкоцитарной массы в прогнозировании мер вторичной профилакт! больных ИБС.// Тез. докл. Международной конференции по профилактю кардиологии./ M. 1987.С.231.

47. Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В.,Комаров О.С..Клебанов Г.И. < аятиокислительных свойств плазмы крови и фармакологических преп; методом хемилюминесценции.// В сб. : "Антиокислителыше системы орг; при експериментальной и клинической патологии"./ Свердловск.1987.С

48. Туркменова Э.М..Крейнина Ы.В., Чукаева И.П., Корочкин Клебанов Г.И..-Люминол-зависимая хемилюминесценция нейтрофилов больных ИБС и инфарктом миокарда.// В сб. :"Антиоютслите ль'ные с: организма при экспериментальнгой и клинической патологии.А ловск.1987.С.71-87.

49. Клебанов Г.И..Бабенкова И.В..Теселкин D.O. Оценка антиокислит свойств плазмы крови с применением желточных липопрогеидов.//Лабор дело.-1988.-'" ■> З.-С. 59-62.

50. Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О..Владимиров h.a. Ингибировани тиокислительной активности плазмы крови азидом натрия.//Биофи I938.-T.33,N0 3.-С.512-516.

51. Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А.,Бенов Л.Ц..Рибаров С.Р. И рованио перекисного окисления липидов мембран липосом активиров

«орфноядерными лейкоцитами крови.//Бюдл.эксперим.бкол. и мед.-£968. i.No 6.-С.674-677.

52. Клебанов Г.И.,Гусев Е.И..Кузнецов С.В..Крейнина М.В..Нифонтова , Ваколюк P.M. Функциональная активность полиморфноядерных лейкоци-крови при сосудистых поранениях головного мозга.//Клиническая меди-.-1988.- Т.66,Но 9.-С.82-85.

53. Крейнина М.В., Клебанов Г.И..Корочкин И.М.,Чукаева И.И.Дитви-G.H. Влияние циркулирующих иммунных комплексов на лшшол-зависимую

лишнесценцию полиморфноядерных лейкоцитов крови.//В со.:" Перекис- * окисление лшшдов и антиоксидантная терапий при ИБС"./Горький. I.e.21-30.

54. Клебанов Г.И..Теселкин Ю.О.,Груне К..Владимиров Ю.А. - Влияние гстерина на перекисное окисле те липидов мембран липосом.//Биол. 5раны.-1958.~ Т.5,Но II.-C.I072-I086.

55. Владимиров Ю.А.,Крейнина М.В..Клебанов Г.И.» Рибаров С.Р.,Вочев .. Бенов Л.Ц. Влияние окисленных, фзефолипидов липосомальных мембран активность полиморфноядерных лейкоцитов крови.//Виол. мембра-

-1988.-Т.5,No II.- С.1072-1086.

56. Клебанов Г.И., Крейнина М.В.,Позкн В.М.. Скуратовская С.Г..Ш--цова Г.А., Владимиров Ю.А. Динамика изменения функциональной актив-ти полиморфноядерных лейкоцитов крови собак при обратимой ишемии ми рда.//Бюлл. экспер. биол. и мед.-1988.-Т.106,No 9.-0.297-299.

57. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В..Теселкин Ю.О.,Комаров О.С.,Влади юв Ю.А. Роль активации полиморфноядерных лейкоцитов, крови в развитии шериментального увеита.//Вопр.мед.химии.-1988.-Т.34.моб.-0.128-1329.

58. Клебанов Г.И..Бабенкова И.В..Теселкин Ю.О.,Комаров 0.0.Влияние сиоксидантов на функциональную активность полиморфноядерных лейкоци-з крови и перекисное окисление липидов.// В сб.:" Тез.докл. 4 Всесо-аого съезда патофизиологов./ M.I989. Т.II.С.532.

59 Корочкин И.И..Чукаева И.И..Королев B.C..Литвинова С.Н..Клебанов И., Александров А.А.. Крейнина М.В. Информативность иммунологических казателей в различные сроки острого инфаркта миокарда.//Кардиоло-Я.-1989.-Т.29,Но 10.- С.37-40.

60. Крейнина М.В., Клебанов Г.И.. Кузнецов B.C..Ваколюк P.M.,Влади-ров Ю.А. Функциональная гетерогенность циркулирующих полиморфноядчргж 1Йкоцитов крови при остром инфаркте миокарда.//Бшл.экспер.биол. !Д.-1989.- Т.108, N0 12.-С. 673-675.

61. Клебанов Г.И.,Максина А.Г..Крейнина М.В..Дайняк Б.А.,Владиьа Ю.А. Изменение Физического состояния мембран в процессе стЕг,!уляцик пс мзрфпоадерных лейкоцитов крови.//Биол мембрана.-1990.-Т.7 ,НоЗ.-С.281-

62. Vladimirov Yu.Л.Ribarov S.R..Bochev P.G.,Benov Ъ.С.,К1еЪг G.I. Effect of' oxidized phospholipids on the ohemilumineoence nimozb .-activated leultooytes. //Gen. Physiol. Biophys. -1990.-V".9.

45-54.

63. Клебанов Г.И., Крейнина M.В., Чукаева И.И..Барбараш О.Л..Koj шш И.М., Владимиров Ю.Д., Изменение активности СОД в процессе стш} ции полиморфноядерных лейкоцитов крови.//Билл.эксперим. биол. мед.-1990.-Т.109, No 4.-С.334-336.

'64. Корочкпн И.М., Чукаева И.И..Литвинова О.Н..Клебанов Г.И.. Kp нинп Ы.В., Черняк В.Я. Ообешости иммунокомплексного процесса при фаркте миокарда.// Сов. медицина.-1990.-No 4.- С. 7-12.

65. Капитанов А.Б., Клебанов Г.И., Говорун В.М., Лскарова З.А., года Т.В., Зайцев И.Ф., Мухашскн А.И., Кулакова С.Н..Теселкин Ю.О. За самость изменения.относительного содержания холестерина в плазматичес мембранах клеток Aoholeplasma laidlawii от окислешюсти липидов сывор ни гштательной среды.//Биол. мембраны.-1990.-Т.7,No 5.-2.506-511.

66. Klebanov GЛ..Kreinina . M.V.,Naumov O.G.,Aptsia WJ3. .Kovalchtflc L.V., Vladimirov Yu.A.Phagocyte priming mechanism In:Abstr of Simp::"Mononuclear phagocyte system in normal pathologioal states./Novosibirsk.1990. p.64.

67 Kreinina M.V..Klebanov G.I.,Vladimirov Yu.A. Priming aotion lipid peroxidation product on phagocytes.//In: Abstr. Simp.:"Mononuclear phagocyte system in normal and pathological state Novosibirsk.-1990.p.76. . .

68. Корочкин И.М., Барбараш О.Л., Чукаева И.И.. Капустина Г.Ы..К банов Г. Беркенбаев Р.Ф.. Хамасех М.. Теселкин Ю.О., Виноградова И Влияние' низкоинтенсивного лазерного излучения на функциональную 'акт ность лейкоцитов и антиоксидантную систему крови при остром инфаркте окнрда.//Сов. медицина.- 1990.-No 5.-С.36-39.

69. Клебанов Г.И., Наумов О.Г., Владимиров Ю.А., Рибаров O.P., •нев'а В. Функциональная активность полиморфноядерных лейкоцитов крови

.кзопреналин-зависимой кардаомипатии крыс.//Билл, экспер. биол. и ме, j990.-T.II0.no 12.с.592-594.

70. Kovalch.uk b.V..Klebanov G.I.,Ribarov S.R.,Krein

Aptsiauri N.E.. Gankovskaya b.V. .ICaraseva M.V. .Shuikin-. Vladirairov Yu.A. Priming of phagocytes by cytokines an! •-soluble products of lipid peroxidation// Biomedical -1991 .-V.2,No 3.-p.11-21. #

71. Kovalchuk L.V..Klebanov G.I..Gankovskaya X.V..Aptsiauri ,Shuikina E.E. Complex of endogeneous cytokines regulated funotionaJ srties of phagocytes // Abstr. Constituent Congress of Int. ' Soc.for ^physiology /ii.1991 .P.176.

Авторские свидетельства на изобретения.

1. Лопухин Ю.М., Владимиров Ю.А., Ыолоденков Н.Н..Клебанов .Сергиенко В.И. Шерстнев М.П. Способ определения: хемилюминесценшит мы и сыворотки крови. Авторское свидетельство No 940062 от 17 ноября

I г.

2. Коган Э.М.,Андрианова И.П.«Гусев С.А., Ямсков И.А., Нлебано'. , Туркменова Э.М.«ПовалиЙ Т.М., Лапук Я.И.. Лопухин Ю.М. Способ сп-:ления холестерина. Авторское свидетельство No 1164600 от 16 мая 198.°

3. Ыолоденков М.Н.,Владимиров Ю.А.,Сергиенко В.И..Клебанов Г.И., данберг А.А., Шерстнев М.П. Способ диагностики фаз в течение острого «тонита. Авторское свидетельство No .1118353 от 16 ноября 1982 г.

4. Чукаева И.И,,Корочкин.И.И., Владимиров Ю.А..Клебанов. Г.И..Тур;--эва Э.М.. Шерстнев М.П.. Головлева И.Р. .Головлев М.В. Способ дш№--циалыюй диагностики инфаркта миокарда от хронических форм ишемичес-

болезга-i сердца. Авторское свидетельство No 1164396 от 21 декабре. 2 г.

5. Батраков С.Г., Придачина Н.Н., Рубцов Б.В..Теселкин Ю.О.,Новог-,ская Е.Д.. Чекасияа Б.В., Клебанов Г.И. .Владимиров Ю.А. Способ виде-ля 5-алкил(С1д- С25)-резорцинов. Авторское свидетельство No 413564 25 августа 1986.

6. Чапидзе Г.Э., Корочюш И.М., Капустина Г.М., Бохуа М.Р.. ¡сагишвили Л.А., Зубкова С.М..Чукаева И.И., Бабушкина Г.В.. Барбпрат I.. Теселкин Ю.О., Яроцкий В.Ю.. Клебанов Г.И. Способ лечения нести шной стенокардии. Авторское свидетельсьво No 1550673 от 28 кт:-:-.;: S8 г.

7. Клебанов Г.И..Формазюк В.Е., Виленская И.В.,Сергиенко В.К. сп -

соб моделирования увеит-вызванного помутнения хрусталика у млекога пцдх. Авторское свидетельство n0 1649601 от 9 июня 1989 г.

Подписано к печати 14.11.91 г. Тираж 100, зак. 1101 Типография Ш СССР

Информация о работе

Клебанов, Геннадий Иосифович
доктора биологических наук
Москва, 1991
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы