Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химические свойства мембран эритроцитов больных с острыми коронарными синдромами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические свойства мембран эритроцитов больных с острыми коронарными синдромами"

О Ой

2 О КТ 10Я:? МОСКОВСКИЙ ордена ЛЕНИНА,

ордена ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ и ордена ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.352.3

ШАРИФОВ ТЕЛЬМАН ШИРИН

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ БОЛЬНЫХ С ОСТРЫМИ КОРОНАРНЫМИ СИНДРОМАМИ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени каццидата физико-математических наук

Москва - 1995

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова и в Кардиологическом научном центре РАМН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Доктор физ.-мат. наук,

профессор Э. К. Рууге

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор физ.-мат. наук

Ю. М. Петрусевич Кандидат физ.-мат. наук А. А. Тимошин

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт химической физики РАН Защита диссертации состоится

./1ПО

в ] 7 час на заседании диссертационного совета К.053.05.77 в Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899 ГСП, Москва, Воробьёвы горы, МГУ, физический факультет, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан "

£

1995г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

О .А. Котельнико ва

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Способность эритроцитов (красных кровяных клеток) изменять свою форму и размеры играет огромную роль в функционировании человеческого организма. В норме эритроциты имеют форму двояко-вогнутого диска, что обеспечивает им наиболее выгодное соотношение поверхности к объему и позволяет легко пройти через капилляры. Хорошо известно, что при многих заболеваниях наблюдаются изменения размеров и формы эритроцитов, нарушение их деформируемости. Деформируемость эритроцитов, в свою очередь, определяется эластичностью и вязкостью их плазматических мембран. Показано, что существует взаимосвязь между физико-химическими характеристиками эритроцитов, структурой мембранных белков, белок-липидными взаимодйствиями и физическим состоянием липидных областей клеточных мембран. Определенную роль в патогенезе заболеваний сердечно-сосудистой системы играют отклонения от нормального функционирования эритроцитов, приводящие при острых коронарных синдромах к нарушению микроциркуляции крови в сердечной мышце.

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) занимает одно из первых мест по распрастраненности среди взрослого населения. В основе патогенеза и клинических проявлений ИБС лежит поражение коронарных сосудов атеросклерозом. При этом также наблюдается избыточное, по сравнению с нормой, количество холестерина в клетках крови. Это приводит к изменению физико-химических характеристик их мембран. В частности, может изменяться физическое состояние липидов мембран эритроцитов, что, в свою

очередь, влияет на микроциркуляцию крови в ткани миокарда. Микроциркуляция играет одну из ведущих ролей в механизме формирования инфаркта миокарда. Общепринято, что коронарный атеросклероз и ИБС сопровождаются значительными нарушениями реологических свойств крови, тем самым еще более усугубляя течение болезни. Однако механизм возникновения нарушений реологических свойств крови у больных ИБС во многом не ясен.

Еще в начале века были установлены клинико-патологические признаки двух основных проявлений ИБС - инфаркт миакарда и. стабильная стенокардия. Между ними распологался синдром, промежуточный по выраженности клинической симптоматики - так называемая нестабильная стенокардия. Нестабильная стенокардия представляет особый интерес среди проблем ИБС. Это обусловлено данными ряда исследований 70-х годов, показавших высокую частоту инфаркта миокарда (22% - 41%) и летальности (5% - 22%) среди контингента больных с нестабильной стенокардией на протяжении одного месяца наблюдения. Несмотря на совершенствование медикаментозной терапии и применение хирургических методов лечения у этих больных сохраняется вероятность развития осложнений и нередко наблюдается рецидив болевого синдрома.

Для того, чтобы оценить клиническое течение нестабильной стенокардии, ее прогноз и эффективность новых форм лечения, необходимо проведение исследований патофизиологии коронарного кровообращения и системной микроциркуляции в различных стадиях болезни. Повышенный интерес исследователей к изучению микроциркуляции у больных ИБС определяется фундаментальной ролью микроциркуляции и процессов транскапиллярного обмена.

посредством которых поддерживается метаболический н гемодинамический гомеостаз в организме.

Целью работы являлось сравнительное исследование физико-химических свойств мембран эритроцитов и характеристик липид-транспортной системы крови больных с острыми коронарными синдромами и контрольной группы лиц без признаков ИБС, а также изучение влияния созданных на основе декстрана синтетических иммуномодуляторов на молекулярную подвижность. липидов в мембранах эритроцитов.

Основными задачами исследования были:

1) Исследовать взаимосвязь между клиническими характеристиками нестабильной стенокардии (до и после лечения) и жидкостностью мембран эритроцитов. Провести сравнение с больными со стабильной стенокардией (до и после лечения) и" лицами контрольной группы без признаков ИБС.

2) Выявить взаимосвязь между жидкостностью мембран эритроцитов и липидно-белковым составом плазмы крови у исследованных групп пациентов.

3) Изучить влияние синтетических иммуномодуляторов на молекулярную подвижность липидов в мембранах эритроцитов.

Научная новизна. В диссертационной работе впервые с помощью ЭПР-спсктроскопии спиновых зондов и спектроскопии переноса насыщения проведено исследование физико-химических характеристик мембран эритроцитов человека при ИБС и острых коронарных синдромах. Показано существование различий в мировязкости липидных областей плазматических мембран эритроцитов больных с нестабильной стенокардией, больных со стабильной стенокардией и контрольной группы лиц без признаков ИБС. Методом ЭПР-спектроскопии переноса насыщения спиновых

зондов демонстрирована гетерогенность молекулярной упаковки липидов в плазматических мембранах эритроцитов. Показано, что мембраны эритроцитов больных с нестабильной стенокардией во время обострения болезни характеризуются меньшей жидкостностью во всем физиологически значимом интервале температур, чем мембраны эритроцитов лиц контрольной группы. Клиническая стабилизация состояния больных с нестабильной стенокардией, достигнутая в результате медикаментозной терапии, сопровождалась увеличением жидкостности липидов мембран их эритроцитов. В то же время при стабильной стенокардии микровязкость мембран эритроцитов не претерпевала существенных изменений в процессе лечения и оставалась близкой к норме.

Научно-практическая ценность. Проведенные исследования создают основу для понимания механизмов нарушения микроциркуляции крови в ткани сердечной мышцы. Результаты работы могут быть использованы в медико-биологических исследованиях, посвященных поиску новых путей медикаментозной терапии острой сердечной недостаточности.

Апробация работы и публикации. Основные результаты диссертации доложены на научном семинаре кафедры биофизики физического факультета МГУ, на XVII конгрессе Европейского кардиологического общества (Амстердам, 1995) и изложены в трёх публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащей 230 источников. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста и содержит 26 рисунков и 8 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре представлены литературные данные по следующим вопросам: 1. Ишемическая болезнь сердца, атеросклероз и микроциркуляция. 2. Особенности острых коронарных синдромов (стабильной стенокардии и нестабильной стенокардии). 3. Влияние изменений физико-химических свойств мембран эритроцтов на реологические свойства крови. 4. Иммуномодуляторы.

В четвертом пункте обзора обсуждены актуальность проблемы синтетических иммуномодуляторов в области создания препаратов против еще не побежденных инфекций и механизм их действия.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эритроциты выделялись из крови больных с нестабильной стенокардией (п=32), больных со стабильной стенокардией (п=27) и контрольной группы лиц без признаков ИБС (п=15). При взятии крови в качестве антикоагулянта использовали ЭДТА (1 мг/мл). Эритроциты промывали 10 шМ трис-НС1-буфере (рН 7,4), содержащего 0.9 % NaCl. Концентрация эритроцитов в среде инкубации составляла (4-6)* 10^ клеток/мл.

Концентрацию общего холестерина, триглицеридов и холестерина ЛПВП в плазме крови определяли на автоанализаторе Centrifchem-600 фирмы "Baker" (Англия) в отделе биохимии ГНИЦ профилактической медицины Минздрава РФ (рук. Н.В.Перова) с помощью диагностических приборов фирмы "Randox" (Англия). Содержание аполипопротеидов AI и В в сыворотке крови

определяли , на автоанализагоре Nephelometer-Analyzer фирмы "Behring" (ФРГ).

Диагностика и отбор исследуемых больных проводился врачами среди пациентов поступивших на лечение в отделение неотложной кардиологии КНЦ РАМН (рук. проф. М.Я.Руда). Физические характеристики мембран эритроцитов определяли, анализируя спектры ЭПР спиновых зондов 5- и 16-доксилстеаратов фирмы "Sigrria" (США). Концентрация зонда в суспензии клеток была (2-^10)* 10~3 М.

Спектры ЭПР-ПН ("90°, out-of-phase spectrum" (Hemminga et al., 1989)), как и обычные спектры ЭПР и вторые производные спектра поглощения ("0°, in-phase spectrum") были регистрированы на спектрометре Е-109Е фирмы "Varian" (США). При записи спектров ЭПР-ПН частота ВЧ модуляции была равна 50 кГц, а усилительный тракт оставался настроенным на 100 кГц. СВЧ мощность (70 мВт) была достаточна для полного насыщения сигнала ЭПР нитроксильных радикалов. Во время регистрации спектров образец со спин-мечеными эритроцитами находился в термостатированной кварцевой кювете в стандартном резонаторе Е-231. Температура образца стабилизировалась с помощью термоприставки Е-257.

Достоверность различия качественных показателей оценивали с использованием %г-критерия Стюдента. Для оценки достоверности динамики состояния больных использовался парный Т-критерий Вилкоксона. В таблицах приведены средние значения (»>) ± стандартные ошибки отклонения от среднего (SE). Представленные на рисунках температурные зависимости спектральных параметров построены с помощью графического редактора MicroCal Origin фирмы "MicroCal Software Inc." (США).

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Жидкостность липидов мембран эритроцитов в норме и при острых коронарных синдромах.

3.1.1. Обычная ЭПР-спектроскопия.

В данном разделе приведены результаты сравнительного исследования жидкостности мембран эритроцитов в норме (лица без признаков ИБС), при стабильной стенокардии и нестабильной, стенокардии. Проведена сравнительная оценка ряда других факторов, которые характерны при ИБС и могли бы' повлиять на физико-химические свойства мембран эритроцитов. На рис.1 показан зарегистрированный при 37°С спектр ЭПР эритроцитов человека в норме, меченых 5-доксилстеаратом.

Рис.1. Спектр ЭПР эритроцитов человека в норме, меченых 5-док-силстеаратом (37°С).

Как видим из рисунка, форма спектра ЭПР 5-доксилстеарата является типичной для данного зонда и свидетельствует о быстром анизотропном вращении парамагнитного фрагмента зонда вокруг молекулярной оси; перпендикулярной к поверхности липидного бислоя. Результаты измерения спектрального параметра 2А|) приведены в таблице 1.

Таблица 1. Параметры спектров ЭПР и ЭПР-ПН, характеризующие вращательное движение 5-доксилстеарата в мембранах эритроцитов.

группа 2А||- С'/С т||

обследованных (Гс) (10-® с)

контрольная 54,46 1,15 -1,21 51'

группа ±0,15 ±0,08 ±0,05 ±2

группа 55,59 1,41 -0,81 205

с нестабильной ±0,20 ±0,11 ±0,04 ±14

стенокардией

группа 54,57 1,21 -1,12 68

со стабильной ±0,11 ±0,09 ±0,08 ±5

стенокардией

Как видим из табл. 1, значения спектрального параметра 2Хц спин-меченых эритроцитов у этих трех групп лиц между собой отличаются. При этом жидкостность липидов мембран эритроцитов в группе с нестабильной стенокардией было достоверно (р<0.05) меньше, чем в группе со стабильной стенокардией и группе без признаков ИБС. И то же время значения параметра двух последних групп достоверно не отличались. Исследования, проведённые с использованием 16-доксилстеарата, покзали, что

времена корреляции вращательной диффузии т для этого зонда у лиц трех групп между собой достоверно не отличались. Форма спектра соответствует почти изотропному вращению с т я 10~9 с. Таким образом,

2Л|| (НС) > 2л!|| (СС) 2Дц(норма). Мы также оценивали концентрацию общего ХС плазмы крови (см. таблицу 2) с которым могли быть связаны вышеуказанные изменения жидкостности мембран эритроцитов, и индекс атерогенности

ХС^-аХС аХС

с которым связан риск развития инфаркта миокарда. Таблица 2. Липидный состав плазмы крови.

группа ХС аХС ТГ ХСавщ - аХС аХС

обследованных (мг)% (мг%) (мг%)

контрольная 165,7 46,1 89,4 2,6

группа ±2,6 ±0,6 +2,6 ±0,1

группа 211,7 36,1 141,6 4,9

с нестабильной ±15,1 ±2,4 ±9,7 ±0,6

стенокардией

группа 200,7 34,5 134,2 4,8

со стабильной ±11,6 ±1,7 ±13,5 ±0,5

стенокардией

Как видим из табл. 2, концентрация общего холестерина в группе с нестабильной и стабильной стенокардией достоверно (р<0.05) выше, чем в норме. В то же время содержание холестерина

больных с нестабильной стенакардией достоверно не отличается в плазме крови от содержания холестерина в плазме крови больных со стабильной стенокардией. Аналогичная ситуация наблюдается для индекса атерогенности.

Было также проведено апобелковый анализ плазмы крови. Рассчёты показали, что индекс атерогенности, оцененный как отношение апоВ к апоА1, в группе с нестабильной стенокардией оказалось выше, чем в норме и при стабильной стенокардии. В случае больных со стабильной стенокардией индекс атерогенности больше, чем в норме. Однако, в наших опытах достоверность этих различий между больными стабильной стенокардией и нестабильной стенокардией оказалась недостаточной.

Из анализа представленных выше данных можно сделать вывод, что жидкостность мембран эритроцитов при нестабильной стенокардии меньше, т.е. липиды в них более плотно упакованы, чем при стабильной стенокардии и в норме. При этом параметр 2Л1ц у больных со стабильной стенокардией практически не отличается от нормы, хотя концентрация общего холестерина в плазме крови у больных этой группы остается такой же высокой, как и в случае нестабильной стенокардии. Учитывая способность холестерина изменять вязкость биологических мембран, можно полагать, что при нестабильной стенокардии соотношение ХС/ФЛ для мембран эритроцитов больше, чем при стабильной стенокардии и в норме. Здесь отметим, что изменяться может либо ХС, либо ФЛ, либо и то и другое. Учитывая, что содержание общего холестерина в плазме крови при нестабильной стенокардии и стабильной стенокардии практически одинаково, можем полагать, что при стабильной стенокардии либо меняются условия переноса холестерина от липопротеидов в мембраны эритроцитов, либо в них увеличивается

количество фосфолипидов. Это возможно путем "активации" рецепторов или других факторов, что приводит к увеличению концентрации фосфолипидов в мембране.

Другое возможное объяснение полученных результатов может состоять в следующем. Известно, что при атеросклерозе наблюдается увеличение холестерина в клетках крови: лимфоцитах, тромбоцитах и эритроцитах. Одной из основных причин, вызывающих эти процессы, считается изменение характера взаимодействия липо-протеидов (модификация их физико-химических характеристик) с клеточными мембранами. Эта модификация проявляется, в частности, в изменении поверхностного потенциала и в нарушении белок-липидных взаимодействий, что приводит к изменению как конформации аполипопротеидов, так и молекулярной упаковки в поверхностном монослое липопротеидов. Для ЛПНП эти изменения таковы, что приводят к увеличению неспецифического захвата ЛПНП клеткой, т.е. к увеличению перехода холестерина из липопротеидов в клеточную мембрану. Для ЛПВП - наоборот.

Одной из возможных причин, вызывающих указанные нарушения в структуре липопротеидов, может являться перекисное окисление липидов, интенсивность которого увеличивается при атеросклерозе. Одновременно снижается активность анти-оксидантной защитной системы крови. Перекисное окисление липидов приводит к снижению микровязкости и обнажению липидных участков на поверхности липопротеида, что, по-видимому, облегчает высвобождение молекул холестерина. Эритроциты, как известно, имеет эффективную антиоксидантную защитную систему. По-видимому, липопротеды окисляются в разной степени и модифицируются по разному при нестабильной стенокардии и стабильной стенокардии, а также в норме. Это может

в первом случае привести к более интенсивному накоплению холестерина в мембранах эритроцитов, и, следовательно, к изменению жидкостности мембраны.

3.1.2. ЭПР - спектроскопия переноса насыщения.

Известно, что в биологических мембранах существуют участки (например, в непосредственной близости от мембранных белков), где вращательное движение липидных молекул более заторможено. Оценка времени корреляции вращательной диффузии МО-группы зонда по параметрам спектра ЭПР (например, по ДНтах (рис. 1)) дает, что даже при 37°С т я 10"? с. Таким образом, мы находимся у нижней границы чувствительности обычного метода ЭПР к конформационной динамике компонентов клеточных мембран, и возникает необходимость использовать другую экспериментальную методику, такую как ЭПР-спектроскопия переноса насыщения, которая чувствительна к медленным молекулярным движениям в биологических системах.

На рис. 2 показан зарегистрированный при 37°С спектр ЭПР-ПН 5-доксилотеарата, иммобилизованного в липидном бислое мембран эритроцитов человека. Этот спектр представляет собою вторую гармонику спектра поглощения, записанную при сдвиге фаз между сигналом и опорным напряжением на 90° в усовиях полного насыщения по СВЧ мощности.

Нахождение соотношений соответствующих спектральных параметров (С/С, Ь /Ь , Н /Н . см. рис.2, а также работы ГаЬег е! а1.. 1983, НогаиИ е1 а1., 1983, Коо1е е1 а1., 1985) позволяют определить времена корреляции вращательного движения т парамагнитной МО-группы вокруг главной молекулярной оси 5-доксилстеарата (т||) и вокруг осей, параллельных поверхности липидного бислоя (т±).

Рис.2. Спектр ЭПР-ПН 5-доксилстеарата, иммобилизованного в ли-пидном бислое мембран эритроцитов человека.

Соотношение С /С а основном определяется вращательным движением вокруг главной молекулярной оси этого нитроксильного радикала, а соотношения Ь"/Ь и Н"/Н - движением вокруг осей, расположенных в перпендикулярной плоскости. По параметрам представленного на рис.2 спектра, используя приведенные в работах Непптигща ег а!., 1984, 1989 калибровочные кривые, получим, что при нормальной физиологической температуре (37"С) вращательная диффузия 5-доксилостеарата вокруг указанных молекулярных осей характеризуется временами корреляции 2*10'? и 8*10~5С. Из табл.1 видим, что нестабильная стенокардия характеризуется большим временем врашательной корреляции т||, чем в норме и при стабильной стенокардии, а у последних времена корреляции между собой практически не отличаются. Таким образом, т||(НС) > т||(СС) =» т||(норма). Это свидетельствует (как и в разделе 3.1.1) о более плотной упаковки липидов мембран эритроцитов при нестабильной

стенокардии. Из табл. 1 видим, что при исследовании мембран эритроцитов человека ЭПР-спектроскопия переноса насыщения характеризуется большей чувствительностью, нежели метод обычной спектроскопии ЭПР. Интересно отметить (см. работы Неттиц>а е1 а1., 1984, 1985), что близкие к указанным значениям времена корреляции могут быть получены также по соотношениям параметров второй производной спектра ЭПР - второй гармонике спектра поглощения, записанной при сдвиге фаз 0° между сигналом и опорным напряжением.

Необходимо отметить, что приведенные выше для 5-доксил-стеарата значения времен корреляции вращательной диффузии являются усредненными, поскольку молекулы этого зонда не распределяются в мембранах эритроцитов однородно. Показанный на рис.2 спектр ЭПР-ПН представляет собой наложение нескольких спектров, обусловленных спиновыми зондами, локализованными в липидных областях с разной микровязкостью (НогоЦЬ е1 а1., 1983, \yilkerson е1 а1., 1978). Полученные данные свидетельствуют о преимуществах метода ЭПР-ПН по сравнению с обычной ("линейной") ЭПР-спектроскопией, так как по форме приведенного на рис.1 обычного спектра ЭПР практически невозможно придти к выводу о гетерогенности молекулярной упаковки липидов в разных частях мембран эритроцитов.

3.2. Термоицдуцированные изменения жидкостности липидов мембран эритроцитов.

Несмотря на то обстоятельство, что эритроциты, как и другие клетки, функционируют в организме при постоянной температуре, эксперименты с варьированием температуры могут дать

существенную информацию о молекулярной организации их плазматических мембран и возможной связи между структурой и функцией клетки. Нами проведено сравнительное исследование термоиндуцированных структурных изменений в липидных областях мембран эритроцитов в динамике течения болезни, т.е. при обострении болезни и при клинической стабилизации состояния больного, а также в норме. Исследовались больные с нестабильной и стабильной стенокардией в момент обострения приступов стенокардии и после клинической стабилизации или улучшения их состояния (в нашем случае это составляло в среднем три недели). На рис. 3 и 4 приведены кривые температурной зависимости константы СТС 2Ац (определяемого по обычному спектру ЭПР) и соотношения параметров С'/С спектра ЭПР-ПН. Из указанных рисунков видно, что во всем физиологически значимом интервале температур при нестабильной стенокардии жидкостность мембран эритроцитов остается меньшей, чем в норме. После курса лечения наблюдается увеличение жидкостности мембран эритроцитов и значения и С /С приближаются к норме. В этом плане каких-то ощутимых изменений ж.идкостности мембран эритроцитов при стабильной стенокардии не наблюдалось.

Проведенный нами детальный анализ показал, что после использованного в клинике медикаментозного лечения не происходит существенных изменений липидного и апобелкового состава плазмы крови. Анализируя эти данные, можно сделать вывод, что курс лечения приводит лишь к нормализации структуры липопротеидов, по-видимому, модифицированной в результате усиления процесса перекисного окисления при острых приступах стенокардии. Это, в свою очередь, приводит к нормализации обмена холестерина между мембранами эритроцитов и липопротеидами.

10ОО/Т, 1/К

температура, град С

Зависимость параметра 2Х|| спектра ЭПР 5-доксилстеарата (рис. 3) и зависимость соотношения параметров С'/С спектра ЭПР-ПН (рис. 4) от температуры. А - нестабильная стенокардия во время обострения болезни, Б - нестабильная стенокардия после медикаментозного лечения, В - норма, Г - ошибка эксперимента.

3.3. Влияние иммуномодуляторов на жвдкостносгь лнпидов мембран эритроцитов.

При лечении и профилактике сердечно-сосудистых заболеваний возникает необходимоть введения в организм лекарственных препаратов. Введенное в кровоток лекарство (химическое вещество) неизбежно взаимодействует с клетками крови - в частности, с эритроцитами. Это взаимодействие может изменять физико-химические свойства клеточных мембран, вызывать агрегацию эритроцитов и, тем самым, оказывать влияние на реологию крови. В этом плане представлял интерес изучение влияния некоторых препаратов нового типа - так называемых синтетических иммуномодуляторов - на жидкостность липидов мембран эритроцитов. В настоящей части диссертации изложены результаты изучения влияния синтетических иммуномодуляторов, созданных на основе декстрана - эпоксихлоргидронивдекстрана и додециддекстрана* - на жидкостность мембран эритроцитов. Структурные формулы указанных соединений представлены ниже.

Л =

-о

сн,он I

сн—о

он

Н/о-

н он (декстран)

Мж= 57200

1. Эпоксихлоргидрониндекстран:

Я — СН _— СН — СН -

Мп= 38700

п

2. Додецилдекстран:

к-сн2-(сн2)10-сн3 ч-^-'

гидрофобный радикал

* - данные соединения синтезированы в лаборатории искусственных антигенов и вакцин (рук. проф. М.И.Мустафаев) Бакинского государственного университета им. М.Э.Расулзаде.

Нами исследованы зависимости параметра 2Ац 5-доксил-стеарата и времени корреляции вращательной подвижности г 16-доксилстеарата, иммобизизованных в мембранах эритроцитов, от концентрации иммуномодуляторов. Клетки инкубировались с декстраном, додецилдекстраном и эпоксихлоргидрониндекстраном. Максимальный эффект наблюдался при концентрациях указанных соединений 0.5-5 мг/мл.

Нами проведено также сравнительное исследование термоиндуцированных изменений подвижности липидов мембран эритроцитов, инкубированных с иммуномодуляторами и без инкубации. В этих опытах использовали зонд 16-доксилстеарат. Конечная концентрация иммуномодуляторов в суспензии эритроцитов составляла 1 мг/мл. Получено, что при инкубации эритроцитов с декстраном время вращательной корреляции увеличивается по мере уменьшения температуры. и максимальный эффект наблюдается при 21°С . В случае инкубации эритроцитов с додецилдекстраном при 21°С наблюдается максимальное (однако, небольшое) уменьшение времени корреляции. При инкубации эритроцитов с эпоксихлоргидрогащдекстраном при низких температурах (I < 23°С) т(0) и т(+1) увеличиваются, а при высоких температурах т(0) уменьшается.

Данные иммуномодулятора являются полиэлектролитами. Они могут взаимодействовать с полярными головками фосфолипидов липидного матрикса и тем самым повлиять на их подвижность, вызвать фазовый переход, а также взаимодействовать с белками, встроенными в липидный матрикс. Последнее важно для активации иммунокомпетентных клеток. В данной работе синтетичекая полиэлектролитная несущая структура (декстран) содержит гидрофобный радикал в случае додецилдекстрана и эпоксигруппу в случае эпоксихлоргидрониндекстрана. Полимерная молекула способна к многоточечному кооперативному взаимодействию с клеточными мембранами. Гидрофобный радикал способен встраиваться в мембрану, и, тем самым, усиливать способность звеньев полиэлектролита сорбироваться на поверхности клетки. Наверное, присутствием гидрофобного радикала объясняется полученный нами результат, что додецилгекстран увеличивает жидкостность в глубине мембраны, тогда близкий к поверхности участок мембраны становится более жестким благодаря электростатистическому взаимодействию полиэлектролита с полярными головками фосфолипидов. Эпоксигруппа способна при комнатной температуре образовать ковалентную связь с белками (N¡-¡2 группами). Возможно, этим объясняется тот факт, что т(0) при низких температурах увеличивается, а при высоких температурах уменьшается. Таким образом, мы видим, что данные пммуномодуляторы могут повлиять на реологию крови, изменяя физико-химические свойства мембран клеток крови. Поэтому целесообразно было бы учитывать эти факторы при подходе к лечению различных болезней, в частности ИБС, при которой важную роль играет реология крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Диссертационная работа посвящена одной из наиболее актуальных проблем медицинской биофизики - выяснению физико-химических основ патологии сердечно-сосудистой системы. Целью работы было сравнительное исследование физико-химических свойств мембран эритроцитов больных с острыми коронарными синдромами и липидно-белкового состава их плазмы. В ней детально изучена динамика изменений структурных параметров липидных областей мембран эритроцитов и характеристик липид-транспортной системы у пациентов с нестабильной стенокардией при дальнейшем течении атеросклеротического процесса и при клинической стабилизации их состояния, проведено, сравнение с пациентами со стабильной стенокардией и контрольной группой лиц без признаков ИБС и отклонений от нормального спектра липопротеидов. Показано, что термоиндуцированные изменения параметров вращательной диффузии спиновых зондов, связанные со структурными перестройками липидных областей мембран эритроцитов происходит по разному для лиц контрольной группы, больньЬс с нестабильной стенокардией и больных со стабильной стенокардией. При этом эритроциты пациентов с нестабильной стенокардией характеризовались во всем физиологически значимом интервале температур меньшей жидкостностью плазматических мембран, чем эритроциты, выделенные из крови лиц контрольной группы, а также больных со стабильной стенокардией. После прохождения курса лечения и клинической стабилизации состояния больного с нестабильной стенокардией физическое состояние мембран их эритроцитов изменилось - по параметрам молекулярной

упаковки липидов они стали ближе к эритроцитам лиц контрольной группы без признаков ИБС.

Патогенез нестабильной стенокардии обусловлен взаимодействием целого ряда факторов, определенная часть которых связана с состоянием форменных элементов крови - в первую очередь, эритроцитов. Нам удалось показать существование взаимосвязи между функциональным состоянием эритроцитов и физико - химическими характеристиками их мембран. В модельных опытах было показано, что на молекулярную подвижность липидов в мембранах эритроцитов оказывает также влияние введенные в среду инкубации мембранные модификаторы - иммуномодуляторы. Полученные экспериментальные данные позволили предположить, что нарушения микроциркуляции крови в сердечной мышце вследствие потери эластичности эритроцтов и соответствующего изменил реологических параметров связаны с воздействием других компонентов крови на липидные области мембран эритроцитов.

ВЫВОДЫ

1. С помощью ЭПР-спектроскопии спиновых зондов и спектроскопии переноса насыщения выявлены различия в микровязкости ("жидкостности") мембран эритроцитов человека в норме и в условиях проявления острых коронарных синдромов.

2. Плотность молекулярной упаковки липидов в плазматических мембранах эритроцитов человека неоднородна во всем физиологически значимом интервале температур.

3. Жидкостность мембран эритроцитов больных с нестабильной стенокардией во время обострения болезни меньше, чем

жидкостность мембран эритроцитов лиц конрольной группы без признаков ИБС и больных со стабильной стенокардией.

4. Клиническая стабилизация состояния больных с нестабильной стенокардией, достигнутая в результате медикаментозной терапии, сопровождается увеличением жидкостности плазматических мембран эритроцитов.

5. При стабильной стенокардии жидкостность мембран эритроцитов не претерпевает статистически достоверных изменений в процессе клинической стабилизации состояния больного в результате медикаментозной терапии.

6. Медикаментозная терапия больных с острыми коронарными синдромами и последующая клиническая стабилизация их состояния не приводят к статистически достоверным изменениям липидного и апобелкового состава плазмы крови.

7. При взаимодействии эритроцитов человека с созданными на основе декстрана иммуномодуляторами происходит изменение жидкостности их плазматических мембран.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Ruuge, Е.К., Noeva, Е.А., Sharifov, T.Sh., Gorshkova, I.N., Perova, N.V., Ruda, M.Ya. Effect of unstable angina on the fluidity of lipids in red blood cell membranes (17th Congress of the European Society of Cardiology). // European Heart Journal, 1995, v. 16 (suppl.), p. 473.

2. Шарифов Т. Ш., Ноева Е. А., Рууге Э. К. Исследование методом ЭПР-спектроскопии переноса насыщения физического состояния

липидов мембран эритроцитов человека. // Препринт физического факультета МГУ, 1995 г.

3. Шарифов Т. Ш., Ноева Е. А., Рууге Э. К. Физико-химические характеристики мембран эритроцитов человека: исследование методом ЭПР-спектроскопии переноса насыщения. // Биофизика, в печати.

Типографии ордена " ¡гик Почета" тлательетиа МГУ 119Я99, Москгм Ленинские горы