Генотип-зависимые механизмы свободно-радикальных процессов при радиационном и химическом воздействии

Саенко, Юрий Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генотип-зависимые механизмы свободно-радикальных процессов при радиационном и химическом воздействии
ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Генотип-зависимые механизмы свободно-радикальных процессов при радиационном и химическом воздействии"

На правах рукописи

Саенко Юрий Владимирович

^^Генотип-зависимые механизмы

свободно-радикальных процессов при радиационном и химическом

воздействии

03.01.01— радиобиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 8 НОЯ 2013

Москва - 2013

005540516

Работа выполнена на кафедре физиология и патофизиологии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет»

Научный консультант:

Генинг Татьяна Петровна, доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой физиологии и патофизиологии ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет».

Официальные оппоненты:

Журавлев Александр Иванович, доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры радиобиологии и биофизики ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им.К.И. Скрябина» г. Москва;

Осипов Авдреян Николаевич, доктор биологических наук, зав. лабораторией радиационной биофизики ФГБУ ГНЦРФ «Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна» г. Москва;

Гусарова Марина Леонидовна, доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой безопасности жизнедеятельности и радиобиологии ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» г. Нижний Новгород.

Ведущая организация: ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» г. Казань

Защита состоится 25 декабря 2013 года в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д220.042.04 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им.КЛ. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им.К.И. Скрябина».

Автореферат разослан « ¿г&^т//^ 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук ¿¿-¿¿'О В.Д. Фомина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Актуальность проблемы

Свободно-радикальные процессы (СРП), выполняющие ряд важных функций в клетках, играют одну из ведущих ролей в патогенезе многих заболеваний [Roberts et al., 2009] . Под свободно-радикальными процессами понимаются все биохимические реакции, протекающие с участием свободно-радикальных молекул. Источниками свободно-радикальных молекул в живых организмах могут быть как внешние воздействия, так и внутренние биохимические процессы [Jones, 2008, Wardman, 2009]. Радиационное облучение , и редокс-циклические химические соединения служат основными индукторами свободно-радикальных процессов в живых организмах. К внутренним источникам свободно-радикальных молекул на клеточном уровне относится мито-хондриальная дыхательная цепь и ряд биохимических процессов, связанных с окислением субстратов [Addabbo et ai; 2009, Moldovan et al., 2006]. Повышение интенсивности СРП относительно физиологического порога приводит к инициации клеточной гибели. На клеточном уровне существует ряд механизмов, задачей которых служит коррекция внутриклеточной концентрации свободно-радикальных молекул. В случае невозможности поддерживать уровень СРП в нужных рамках включаются другие механизмы, целью которых служит запуск программы апоптоза [Wang & Dean, 2007]. СРП могут достичь такой высокой интенсивности, что и запуск программы апоптоза становится невозможным и происходит разрушение клетки по некротическому сценарию. Некроз является нежелательным событием для многоклеточного организма, так как в этом случае возникает воспалительный ответ [Kung et al., 2011]. Но ещё более опасным является промежуточное состояние, когда запуск апоптоза по каким-то причинам невозможен, а интенсивность свободно-радикальных процессов недостаточна для некротического разрушения клетки. В этом случае СРП вызывают повреждение ядерной и митохондриальной ДНК и могут стать причиной возникновения мутаций [Ferguson, 2010]. Повреждение ДНК может быть вызвано непосредственно активными свободными радикалами, возникающими в непосредственной близости от нуклеотидов, что происходит при радиационном облучении, либо при взаимодействии с некоторыми производными свободно-радикальных молекул, среди которых наиболее важной является пероксинит-рит. Ведущая роль в генерации пероксинитрита принадлежит митохондриям, которые являются основным источником супероксиданион радикала и оксида азота - предшественников пероксинитрита [Maynard et al., 2009].

клетках, так как это может вызвать появление радио- и химиорезистент-ных раковых опухолей, обладающих высокой способность к метастазирова-нию [Halazonetis et al, 2008]. Среди наиболее распространённых мутаций генов в раковых клетках, блокирующих запуск программы апоптоза, является сверхэкспрессия гена С-Мус и подавление экспрессии гена ТР53. Каждая из этих мутаций найдена более чем в 50 % злокачественных опухолей [Muller et al, 2011, Lin et al, 2009]. Мутации онкогенов и генов супрессоров опухолей не только затрагивают процессы реализации апоптоза, но также оказывают влияние на процессы репарации ДНК и пролиферации [Jalal et al, 2011]. Свободно радикальные процессы связаны с физико-химическими законами и протекают одинаково во всех клетках независимо от их статуса. Но клеточный ответ на активацию свободно-радикальных процессов полностью зависит от особенностей фенотипа и генотипа [Jones, 2008, Finkel, 2011]. Большинство современных методов терапии раковых заболеваний основаны на инициации повреждения ДНК непосредственно либо путем активации свободно-радикальных процессов в раковых клетках. К ним, в частности, относятся все виды радиотерапии и химиотерапии антрациклиновыми антибиотиками [Wells et al, 2009]. Считается, что раковые клетки более чувствительны к подобного рода воздействиям, чем нормальные соматические клетки, поскольку обладают высокими темпами пролиферации и, вследствии этой особенности, меньшей способностью к репарации повреждений [Javle & Curtin, 2011]. Практическое применение методов лечения, основанных на активации свободно-радикальных процессов, демонстрирует неоднозначные результаты [Prosina, 2009]. Ряд неопластических образований хорошо поддаются лечению, тогда.как другие типы раковых опухолей отвечают на подобное лечение увеличением агрессивности и мета-стазированием нормальных тканей. Причины такого ответа раковых опухолей на одно и то же воздействия до сих пор остаются до конца не выясненными [Loeb et al, 2008, Вес, 2005].

Таким образом, радиационно- и химически индуцированные СРП в раковых клетках могут привести к различным исходам, как благоприятным связанным, с инициацией апоптоза, так и негативным, выражающимся в дальнейшем прогрессировании злокачественных новообразований. В то же время данные, отражающие влияния радиационно- и химически индуцированных СРП в раковых клетках на процессы мутагенеза и клеточной смерти с учетом типа' мутаций, отсутствуют. Исследование общих закономерностей в механизмах клеточной смерти и мутагенеза раковых клеток, индуцированных свободно-радикальными процессами, следует рассматривать как важный и необходимый этап в решении важной биологической и медицинской проблемы механизмов канцерогенеза и мутагенеза.

Цель исследования

Целью настоящего исследования является изучение свободно-радикальных процессов в раковых клетках нормальных и дефектных по гену ТР53 и С-Мус при радиационном и химическом воздействии.

Задачи исследования

1. Исследовать динамику и источники активных форм кислорода и азота после радиационного облучения культуры раковых клеток, дефектных по гену ТР53 и С-Мус.

2. Изучить механизмы клеточной гибели в результате радиационного и соче-танного радиационного и химического воздействия на культуру раковых клеток, дефектных по гену ТР53 и С-Мус.

3. Изучить радиационно-индуцированную динамику повреждения ДНК в раковых клетках, дефектных по гену ТР53 и С-Мус,

4. Исследовать влияние свободно-радикальных процессов на клеточный цикл.

5. Исследовать особенности процессов репарации ДНК после радиационного воздействия в раковых клетках, дефектных по гену ТР53 и С-Мус.

6. Изучить динамику и источники радиационо-индуцированных свободно-радикальных процессов, механизмы клеточной смерти при ингибировании процессов репарации ДНК и блокировании митохондриальных пор переменной проницаемости.

7. Оценить особенности функционирования митоген-активируемых сигнальных механизмов в условиях активации свободно-радикальных процессов в раковых клетках дефектных, по гену ТР53 и С-Мус.

8. Оценить профили экспрессии генов в зависимости от динамики развития радиационно-индуцированных свободно-радикальных процессов.

Научная новизна исследования

второго максимума интенсивности свобордно-радикальных процессов, через 1248 часов после радиационного воздействия, являются митохондрии. Причиной увеличения генерации митохондриями дополнительных количеств АФК в клетках с мутантным геном ТР53 является рост совокупной клеточной митохон-дриальной массы.

Мутации гена ТР53 препятствуют запуску апоптоза после радиационного воздействия, что связано со сверх-экспрессией антиапоптотических белков семейства Вс1-2. Гибель клеток с не активным белком р53 происходит по каспаз-независимому некротическому механизму. Сочетанное радиационное и химическое воздействие неспособно изменить типы клеточной гибели изученных клеточных линий. Сверхэкспрессия гена С-Мус препятствует индукции апоптоза.

В клетках, мутантных по гену ТР53, репарация радиационно-индуцированных повреждений ДНК происходит не полностью, что является причиной возникновения аномалий ядра и развития генетической нестабильности данных клеток. Репарация повреждений ДНК в клетках с нормальной экспрессией онкогена С-Мус и ТР53 происходит эффективно, что препятствует возникновению генетической нестабильности в этих клетках. Ингибирование процессов репарации ДНК приводит к росту внутриклеточной концентрации АФК. Показано, что блокировка клеточного цикла снимается быстрее в клетках мутантных по гену ТР53. Во время блокировки клеточного цикла во всех изученных клеточных линиях зафиксирован рост внутриклеточной концентрации глутатиона.

Показано, что блокирование митохондриальных пор переменной проницаемости приводит в значительному росту радиационно-индуцированной гибели ТР53 мутантных клеток без увеличения признаков нестабильности генома.

Анализ профиля экспрессии генов продемонстрировал, что экспрессия гена РОБ повторяет динамику изменения внутриклеточной концентрации АФК в облученных раковых клетках. В ТР53 мутантных с концентрацией АФК связана экспрессия гена ОБР15,который является репрессором гена РОБ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Механизмы радиационно и химически индуцированной клеточной гибели зависят от,особенностей генотипа клетки.

2. Митохондриально-зависимые свободно-радикальные процессы являются причиной повреждения ДНК в ТР53 мутантных клетках после радиационного воздействия.

3. Мутация гена ТР53 подавляет запуск радиационно-индуцированной программируемой клеточной смерти через каспазный механизм и препятствует нормальному процессу репарации поврежденной ДНК.

4- Экспрессия онкогена С-Мус препятствует запуску программы апоптоза, но не влияет на процессы репарации ДНК.

5. Степень радиационно-индуцированного повреждения ДНК зависит от динамики свободно-радикальных процессов и оказывает влияние на их интенсивность.

Научно-практическая ценность работы

Результаты исследования роли св.ободно-радикальных процессов в механизмах клеточной смерти и генетической стабильности являются актуальными и важными не только для фундаментальной медицины и физиологии, но и для прикладной медицины, позволяя существенно продвинуться не только в понимании роли свободно-радикальных процессов в развитии ряда патологий, но и повысить эффективность коррекции раковых заболеваний методами радиационной и химиотерапии. Полученные данные о важной роли гена ТР53 в процессах клеточной гибели и репарации ДНК позволяют дать рекомендацию не использовать химиотерапию, стимулирующую повреждение ДНК, совместно с радиотерапией ТР53-дефицитных раковых опухолей.Выявление отсроченной активации свободно-радикальных процессов после радиационного воздействия дает возможность применения в этот момент времени дополнительных фармакологических препаратов, усугубляющих оксидативный стресс, в случае если опухоль не является мутантной по гену ТР53. Понимание механизмов гибели раковых клеток в зависимости от особенностей функционирования внутриклеточных сигнальных путей позволяет более целенаправленно осуществлять лечение раковых опухолей в клинической практике. Полученные результаты позволяют дать рекомендацию по использованию антиоксидантов и радиопротекторов не только в первые часы после облучения, но и в более поздние периоды для снижения последствий выявленной нами отсроченной митохондриально-зависимой активации свободно-радикальных процессов. Результаты исследования показали, что ингибиторы митохондриальных пор переменной проницаемости могут быть эффективны в борьбе с ТР53 мутантными раковыми опухолями.

Личное участие автора

Экспериментальные исследования выполнялись автором лично либо при его непосредственном участии в коллективных работах.Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в формулировании проблемы, постановке целей и задач, планировании и проведении экспериментов, в обобщении и интерпретации полученных результатов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Часть работ выполнялась в Онкологическом центре им. М. Складовской-Кюри (г. Гли-вице, Польша) с участием А. С^еаЬг-РоЬиёа и Л. 112е8го\Узка-\<Уо1пу.

Апробация работы

Материалы, представленные в работе, докладывались на межкафедральных заседаниях сотрудников кафедр теоретического и терапевтического профиля медицинского факультета "Ульяновского государственного университета, на ежегодных научно-практических межрегиональных конференциях врачей Ульяновской области (Ульяновск, 1999, 2000, 2004-2010), Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2005), Международной конференции «Gliwice Scientific meeting» (2009, 2010), Международной конференции по онкологии «Anticancer Agents Research Congress»(Осло,2010), 22-м конгрессе Европейской ассоциации по исследованию рака (Барселона,2012), 38-м конгрессе Федерации Европейских биохимических обществ (Санкт-Петербург, 2013).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 26 статей в том числе 17 работ в журналах из списка ВАК и 1 монография.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературных источников. Работа изложена на 334 страницах машинописного текста, включает 16 таблиц, 83 рисунка, 457 источников литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Клеточные линии. В экспериментах использовали клеточные линии: 1)хронической миелоидной лейкемии человека К562; 2) промиелоцитарного лейкоза человека HL-60; 3) линия лимфобластоидных клеток человека Raji; 4) рака прямой кишки человека НСТ-116(с нормальным и мутантным геном ТР53).Эксперименты проводили с культурами в логарифмической фазе роста.Клетки облучали рентгеновским излучением, генерируемым терапевтическим акселератором Clinac 600, при комнатной температуре в дозах 4 и 12 Гр одноразово. Мощность дозы составляла 0,03 Гр в секунду при фокусном расстоянии 104 см, поле облучения - 30 см. Высота водяного столба над клетками составляла 1 см. Клетки облучались в 24 луночных планшетах (объём лунки -2,5 мл.). Параметры анализировались через 15, 30 минут, 1,4,8,12,24,48 часов.

Штаммы Sachoromyces cerevisiae. В исследовании использовался штамм Sacharomyces cerevisiae YPH499 (МАТ ura3-52, lys2-801, ade2-101, trpl- 63, his3-

200, leu2- 1) трансфицированный плазмидами pZZ2 (YCp, URA3, RNR3-LacZ), содержащая промотор гена RNR3, кодирующий большую субъединицу рибону-клеотидредуктазы, сцепленный с геном галактозидазы [Elledge & Davis, 1990], и плазмидой pCLZ-314 (TRP1, YRE-LacZ) содержащая Yapl-респонсивный элемент (YRE) гена НАДФН-тиоредоксин редуктазы (КФ 1.8.1.9.) сцепленный с геном галактозидазы [Моуе-Rowley, 2003]. Инкубацию клеток с различными концентрациями доксорубицина, менадиона и Ь-бутионин-R, S-сульфоксимин проводили в течении 24 часов при температуре 25°С в минимальной синтетической среде без урацила.

Цитохимические методы исследования. Для исследования роли митохондрий в процессах генерации АФК использовали ротенон, который является ингибитором комплекса I дыхательной цепи [Kuznetsov et al, 2008]. Ротенон добавляли в среду за 20 минут до начала определения АФК в конечной концентрации 50 наноМ.Совокупный клеточный митохондриальный потенциал определяли с использованием флуоресцентного красителя этилового эфира тетрародоминперхлората [Gan et al., 2011].Совокупную митохондриаль-ную массу в клетках определяли с использованием флуоресцентного красителя 10-нонил акридинового оранжевого (NAO) [Cossarizza et al, 1994]. Внутриклеточную концентрацию активных форм кислорода определяли с использованием 2,7-дихлородигидрофлуоресцеин диацетата (DCFH-DA)[Oyama et al., 1994]. Концентрацию оксида азота внутри клеток определяли с использованием флуоресцентного красителя 4-амино-5-метиламино-2,7-дифлуоресцеин диацетата (DAP-FM) [Sheng et al., 2005]. Оценку распределения клеток линий К562, HL-60, Raji по фазам клеточного цикла проводили с использованием флуоресцентного краситиля пропидиум ftoflHfla[Rousselle et al., 1998].Количество клеток с признаками апоптоза и некроза мы оценивали с использованием проточной цитометрии и набора реагентов для определения апоптоза V-FITC Apoptosis Kit (Invitrogen)[van Engeland et al, n.d.].Оценка процессов автофагии проводилась по исследованию лизосомальной массы с использованием флуоресцентного красителя - акридинового оранжевого [Clerc & Barenholz, 1998]. Интенсивность флуоресценции во всех вышеперечисленных методах измеряли с использованием проточного цитометра Becton Dickinson FACS Canto.

Внутриклеточную концентрацию восстановленного глутатиона in vivo изучали с использованием флуоресцентного красителя монохлоробимана [Nair et al, 1991]. Величину флуоресценции оценивали с использованием флуоресцентного микроскопа при Аех 390 нм и Ает 480нм и программы ImageJ 1.45.

Повреждение ДНК изучалось с использованием метода электрофореза одиночных клеток в агарозном геле после щелочного лизиса. Длинна шлейфа ДНК (тайл-момент, который свидетельствовал о степени повреждения ДНК) была

рассчитана не менее чем для 100 ядер в каждом слайде. При расчете тайл-момента использовали программное обеспечение (Comet Score)[Tice et al, 2000].

Морфологические методы исседования. Фазы клеточного цикла S.cerevisiae оценивали с использованием светового микроскопа. К Gl-фазе относили одиночные клетки, к S-фазе относили клетки в фазе почкования, в случае если объём дочерней клети был не более 50 % от объёма материнской клетки, к фазе G2/M0 - относились клетки, у которых объём дочерней клетки составлял более 50 % объёма материнской клетки [Alic et al, 2001].

Иммуногистохимические методы исследования. Твёрдофазный иммуно-ферментный анализ выполняли по стандартной методике. Белки разделяли ПААГ-ДСН электрофорезом по Лаемли [Laemmli, 1970]. При проведении твердофазного иммуноферментного анализа использовались следующие первичные антитела, полученные от компании SantaCruse (США): 1) aHTH-JNKl/2(F3) SC-1648; 2) p-ERKl/2 (Е-4) SC-7383; 3)p-JNK (D-2) SC-7345; 4) ERK-1 (k-23) SC-94; 5)рАКТ 1/2/3/ (Ser473)-R, SC7985-R; 60АКТ 1/2/3/ (Н-136), SC-8312. Вторичные антитела 1) мышиные антикроличьи IgG-HRP sc-2357; 2) кроличьи анти-мышинные IgG-HRP sc-358917.

Определение активности ПАРП-1 и ПАР проводили с использованием кроличьих поликлональных антител LP96-10-04 (Alexis Biochemicals Corporation). Клетки визуализировались красителем Alexa Fluor 488, коньюгированным с козьими антителами анти-IgG кролика (Invitrogen). Ядра клеток окрашивали с использованием 1% р-ра DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindoleoHCl, Sigma). В каждой экспериментальной точке (5, 15, 30 мин, 1,4,8,12,24,48ч) измеряли интенсивность флуоресценции около 100 клеток с помощью программного обеспечения BiFIS. Средние значения интенсивности выражались в процентах по отношению к контролю [Ryabokon et al., 2008].

Биохимические методы исследования. Активность каспазы 1, 3, 8, 9 определяли в клеточном лизате при помощи набора для колорометрического определения активности каспаз 1, 3, 8, 9 (Biomol 1пс.)в соответствии с инструкцией производителя [Tatsuta et ai, 2000].

Концентрацию глутатиона восстановленного (GSH) определяли в депроте-инизированной ' фракции клеток в реакции с 5,5'-дитио-бис-нитробензойной кислотой (ДНТБ). Окисленный глутатион (GSSG) вначале восстанавливали глутатионредуктазой до GSH, а затем определяли в реакции с ДНТБ. [Baker et al., 1990], Оптическую плотность измеряли спектрофотометри-чески. Определение активности /3-галактозидазы проводилось с использованием о-нитрофенилгалактопиранозида (ONPG) в качестве субстрата [Elledge & Davis, 1990].

Методы транскриптомики. Профили экспрессии генов в клетках К562 и HCT-11G, облученных в дозе 4 Гр изучали с использованием методов и микроматрицы серии HGU133A (Human Genome U133A) фирмы Affymetrix (Санта-Клара, Калифорния, США) через 1,12 и 24 часа. РНК выделяли из 3x10s клеток с использованием набора для выделения РНК (RNeasy Mini, Qiagen, США) в соответствии с инструкцией производителя. Целостность выделенной РНК проверяли с использованием биоанализатора Agilent 2100 по целостности 18S и 28S рибосомальной РНК с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Библиотеку клонированных ДНК готовили с использованием набора GeneChip Expression З'-Amplification One-Cycle cDNA Synthesis Kit (Affymetrix). Мечение биотйном антисмысловых библиотек клонированных РНК и очистка были проведены с использованием набора GeneChip Expression З'-Amplification Reagents for I VT Labeling (Affymetrix). Все работы проводились в соответствии с инструкцией производителя. Матрицу окрашивали стрептовидин-фикоэритрином и сканировали на сканере Gene Array G2500A (Agilent,Santa Clara, CA, USA) [Coller et al., 2000].

Статистическая обработка. Для оценки нескольких гибридизационных сигналов полученных от одного и того же гена, использовали тест Диксона [Irizarry et ai, 2003].

Результаты экспериментов обработаны статистически с использованием критерия t Стьюдента для парных переменных. Показатели представлены как M±SD. Различия между группами считали достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Динамика развития радиационно и химически-индуцированных свободно-радикальных процессов

В наших экспериментах мы сравнивали кинетику накопления внутриклеточных активных форм кислорода в клетках К562, HL-G0 и Raji через 30, 1, 4, 8, 12, 24, 48 часов после облучения. После облучения в дозах 4 и 12 Гр в клетках К562 АФК генерируются циклически с двумя максимумами через 30 минут и 24 часа после облучения (рис. 1А). В первый час после радиационного воздействия в клетках HL-60 нами зафиксировано увеличение концентрации АФК в среднем на 20-60%. К 4 часу после облучения концентрация АФК нормализуется (рис. 1А). Далее происходит постепенный рост внутриклеточной концентрации АФК, который достигает максимума к 24 часам после облучения. Через 48 часов после облучения концентрация АФК немного снижается, подобно снижению АФК в экспериментах с клетками К562.Кинетика изменения внутриклеточной концентрации АФК в клетках Raji была похожа на таковую в клетках К562 и HL-60 за исключением того, что первый максимум концентрации АФК через

Рас. 1. Динамика изменения активных форм кислорода после облучения клеток линии К562(А) и HL-60(B) рентгеновским.излучением в дозе 4 и 12 Грэй. Примечание. Данные представлены как отношение величины внутриклеточной флуоресценции дихлорофлуоресцеина опытных групп к контрольной группе (* - р < 0,05 в сравнении с контрольной группой)

30 минут после облучения нами не был обнаружен. Таким образом, динамика накопления активных форм кислорода после радиационного воздействия характеризуется цикличностью с двумя максимумами: через 30 минут и 24-48 часов после облучения.

На рис. 2 представлена динамика изменения внутриклеточной концентрации оксида азота (N0) после облучения клеток К562 (А) и HL-60 (Б) в дозах 4 и 12 Гр. Радиационное облучение приводило к росту внутриклеточной концентрации оксида азота в клетках обеих линий. Увеличение концентрации N0 происходило не сразу после облучения, а через 4-8 часов, что свидетельствует в пользу предположения о митохондриальном происхождении N0. Оксид азота в настоящее время признан важным регулятором апоптоза [Carreras & Poderoso, 2007]. Проапоптотическая активность N0 была продемонстрирована в различных клетках и тканях (Choi et al., 2002]. NO может напрямую инициировать высвобождение цитохрома с через снижение митохондриального мембранного потенциала или путем нитрования остатков тирозина цитохрома с. N0- доноры или эндогенный N0, вызывают апоптоз клеток через активацию JNK/SAPK и р38 МАПК -киназ и каспазы 3 или инактивации фактора NF-кВ. Исследования профиля экспрессии генов с использованием микроматрицы серии HGU133A показало, что радиационное облучение стимулирует рост количества мРНК тран-скриптов NOS2 в клетках лини К562.В среднем количество мРНК транскрип-тов по сравнению с контролем увеличивалось на 20-30 %.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов нами было установлено, что рентгеновское излучение вызывает рост внутриклеточной концентрации азота в клетках К562 и HL-60. В клетках К562 увеличение

30 мин 4 ч 8ч 12ч 24ч 4Вч

Время прошедшее после облучения

1ч 4ч 8ч 12ч 24ч 48ч

Время прошедшее после облучения

Рис. 2. Влияние рентгеновского облучения в дозах 4 и 12 Гр на внутриклеточную концентрацию оксида азота в клеточных культурах К562(А) и НХ-60(Б)(* - р < 0,05 в сравнении с контрольной группой; # - р < 0,05 в сравнении с группой К562 4 Гр).

концентрации оксида азота происходит позднее, чем в клетках линии НЬ-60.

Для оценки вклада митохондрий в генерацию АФК после облучения мы использовали ротенон, который является ингибитором комплекса I дыхательной цепи. На рис. 3 представлены данные демонстрирующие влияние ротенона на концентрацию АФК в клетках К562 и НЬ-60 при облучении рентгеновским излучением в дозе 12 Гр. Добавление ротенона к клеткам К562 вызывало снижение внутриклеточной концентрации АФК только во время второго максимума, т.е. 24-48 часов, тогда как добавление ротенона сразу после облучения не влияло на концентрацию АФК. На основании этого эксперимента мы сделали заключение, что сразу после облучения ведущая роль в генерации АФК не связана с митохондриями, тогда как позднее, начиная с 12 часа после облучения, главный вклад в развитие оксидативного стресса к клетках линии К562 начинают вносить митохондрии (рис. За) . В клетках линии НЬ-60 ротенон вызывал рост концентрации АФК во всех случаях, что свидетельствует в пользу предположения о не митохондриальных источниках АФК (рис. 36).

Анализ профилей экспрессии генов в клетках К562 пЬказал отсутствие изменения в уровне транскриптов генов: 1) МАОВ- моноамин оксидазы; 2) РОЯ - р450 цитохром оксидоредуктазы; 3)АЬОХ5, АЮХ12 - арахидонат липооксигеназы 5 и 12.

Ь-бутионин-В,,8-сулъфоксимин (ВБО) является ингибитором ключевого фермента синтеза глутатиона - гамма-глутамилцистеин синтетазы. ВБО вызывает снижение внутриклеточной концентрации глутатиона и тем самым ограничивает способность клетки к обезвреживанию АФК.Ь-бутионин-11,8-сульфоксимин в наших экспериментах увеличивал внутриклеточную

Время прошедшее после облучен™ Вреия „рдшедшев шспе облучения

Рис. 3. Влияние ротенона на концентрацию АФК в клетках К562(А) и HL-60(B) облученных в дозе 12 Гр. Примечание. Данные представлены как отношение величины флуоресценции DCFH-DA в клетках, подвергшихся рентгеновскому облучению к контрольной группе в присутствии ротенона и без него. (* - р < 0,05 в сравнении с контрольной группой; # - р < 0,05 в сравнении с группой 12Гр)

концентрацию АФК в клетка К562 и Raji, облученных в дозе 4 Гр, и не изменял динамику накопления АФК в клетках К562 облученных в дозе 12 Гр.Добавление доксорубицина увеличивало внутриклеточную концентрацию активных форм кислорода в клетках К562 и Raji на поздних этапах после облучения.

Добавление в ростовую среду ингибитора полимеразы 1 поли(АДФ-рибозы)8-гидрокси-2-метилкуназолин-4-[ЗН]он (NU1Ü25) за 30 мин до облучения вызывает увеличение продукции АФК в период времени 12-48 часов после облучения, но не влияет на продукцию АФК в период времени 30 мин - 8 часов после радиационного воздействия. На рис. 4 отражены результаты экспериментов по изучения влияния ингибитора полимеразы 1 поли(АДФ- рибозы) на концентрацию АФК в клетках линии К562 после облучения в дозе 4 и 12 Гр. Ингибирование активности полимеразы 1 поли(АДФ- рибозы)(ПАРП) вызывает ухудшение репарационных процессов связанных с механизмами эксци-зионной репарации удалением поврежденных оснований (ВER) и эксцизионной репарация нуклеотидов (NER). Как видно из графиков ингибирование активности ПАРП приводило в увеличению внутриклеточной концентрации АФК, по сравнению с группой 4 Гр, только по прошествии 12-48 часов после облучения. Эксперименты с добавлением ротенона к культуре облученных клеток линии K5G2, в условиях присутствия NU1Ü25, продемонстрировало, что источником дополнительных количеств АФК являются митохондрии. Таким образом, нарушение процесса репарации радиационно-индуцированных повреждений ДНК в клетках линии К562 ингибитором полимеразы 1 поли(АДФ- рибозы)вызывает

§-2,2-i X

HS- Контроль

А |

s 3,6-,

Контроль

Б,

0,8-

-1-■-1-.-1---1---1-■-г- х °'6

30 мин 4 ч 8 ч 12 ч 24 ч 48 4g Время прошедшее после облучения

ь О

30 мин 4 ч 8 ч 12 ч 24 ч 4В ч Время прошедшее после облучения

'б

Рис. 4. Влияние ингибитора полимеразы 1 поли(АДФ-рибозы) на концентрацию АФК в клетках К562 облученных в дозе 4 Гр(А) и 12 Гр (В).Примечание. Данные представлены как отношение величины флуоресценции DCFH-DA в клетках, подвергшихся рентгеновскому облучению к контрольной группе в присутствии NU1025 и без него. (* - р < 0,05 в сравнении с контрольной группой; # - р < 0,05 в сравнении с группой 12Гр)

рост внутриклеточной концентрации активных форм кислорода через 24-48 часов после облучения.

Внутриклеточная концентрация восстановленного глутатиона (GSH) служит одной из характеристик тяжести внутриклеточного оксидативного стресса. Считается, что при снижении концентрации GSH развивается оксидативный стресс [Schafer & Buettner, 2001]. В наших экспериментах концентрация GSH в облученных клетках линии К562 была выше практически на всём протяжении эксперимента с максимумом концентрации через 12 часов после воздействия (рис.5). Увеличение концентрации GSH в период времени до 12 часов после облучения, вероятно, связано с радиационно-индуцированной задержкой клеточного цикла G2/M фазе, поскольку именно в этой фазе наблюдается наиболее высокая концентрация GSH [Schafer к Buettner, 2001]. Для проверки нашего предположения о взаимосвязи задержки клеточного цикла с ростом концентрации GSH мы выполнили ряд экспериментов по изучению влияния задержки клеточного цикла на концентрацию GSH. С этой целью мы использовали клетки S. cerevisiae, которые инкубировали вместе с доксорубицином и менадионом. Доксорубицин препятствует нормальному течению клеточного цикла и вызывает его задержку [Ehrhardt et al., 2011], тогда как менадион не блокирует клеточный цикл, но вызывает развитие внутриклеточного оксидативного стресса. На рисунке 5Б представлены данные о влиянии доксорубицина и менадиона на внутриклеточные концентрации GSH и GSSG в клетках S. cerevisiae. Как видно из графика, доксорубицин вызывал увеличение внутриклеточного содержания GSH и GSSG, тогда как менадион приводил к снижению концентрации GSH и увеличению внутриклеточного количества GSSG.

1—□— Контроль

2—О—4 Гр

3 - —А— 12 Гр_

ш 25-

о; 20-

=г

1 15-

а>

а.

о 10-

>■

с;

о 0,25 -

>0,20-

= 0,10-

§■0,05

о 0,00

ГШ ввн

Контроль 10 мкМ 20 мкМ 30 мхМ 40 мкМ 50 мкМ

Концентрация доксорубицина

1ч

Время прошедшее после облучения

Рис. 5. Изменение внутриклеточной концентрации восстановленного глутатиона после облучения клеток линии К562 рентгеновским излучением в дозе 4 и 12 Гр-эй.(А).Содержание СЭН и СввС в клетках в.сегеюгзгае инкубированных в среде с разной концентрацией доксорубицина (Б).(* - р < 0,05 в сравнении с контрольной группой).

В результате анализа профиля экспрессии генов с использованием матрицы серии ГЮШЗЗА установлено, что после облучения в клетках линии К562 увеличивается экспрессия генов биосинтеза глутатиона: - глутатион-цистеин лигазы {вСЬС) и глутатион синтетазы (С55). Радиационное воздействие стимулирует использование глутатиона тиоредоксиновой системой для поддержания тиол-дисульфидного баланса в белках, а также использование глутатиона для детоксикации, что проявляется через увеличение уровней мРНК генов митохондриального тиоредоксина {ТХЫ2), глутаредоксина {ТХЫЯ.ВЗ) и изо-форм А1 и Т1 глутатион-Б-трансферазы. Вероятно, основным компонентом АФК после радиационного воздействия является супероксиданион радикал, что подтверждается отсутствием реакции на радиационное воздействие со стороны генов глутатион пероксидаз (ОРХ1,СРХ4)и гена митохондриальной супероксид дисмутазы - БОБЗ .

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что динамика накопления активных форм кислорода после радиационного воздействия на раковые клетки линий К562, НЬ-60 и И,а.ц характеризуется двумя максимумами через 30 минут и 28-48 часов после облучения. Источниками активных форм кислорода в культуре раковых клеток линии К562 через 24-48 часов являются митохондрии, тогда как в клетках линий НЬ-60 и Блр рост концентрации АФК в период времени 24-48 часов не связан с их митохондриальной продукцией. Радиационное излучение вызывает монотонный рост внутриклеточной концентрации оксида азота в клетках линий К562, НЬ-60 и Ка,ц источником которого являются увеличение активности синтетазы оксида азота 2.

На основании вышеизложенного можно сделать вывод, что радиационное облучение вызывает возникновение отсроченного оксидативного стресса, источником которого в TP5S мутантных клетках являются митохондрии.

Влияние радиационно- и химически-индуцированных свободно-радикальных процессов на механизмы клеточной смерти

Радиационное облучение клеток линий К562 в дозе 4 и 12 Гр вызывало зависимую от дозы смерть клеток линии К562 путем апоптоза и некроза (рис.бА).Через 48 часов количество клеток находящихся на терминальной стадии апоптоза, в группах 4 и 12 Гр практически не отличалось между собой, но почти в 3 раза превосходило аналогичный показатель в контрольной группе. Количество некротических клеток в группе клеток подвергавшихся облучению через 24 и 48 часов было достоверно выше аналогичного показателя контрольной группы и зависело от дозы облучения. В группе облученных дозой в 12 Гр количество некротических клеток было самым высоким. Данная серия экспериментов позволила нам сделать вывод, что терминальные стадии апоптоза, сопровождающиеся фрагментацией ДНК, наблюдаются через 48 часов после начала эксперимента.Для изучения механизмов реализации апоптоза мы предприняли попытку оценки активности каспаз. На рис. 6Б представлены результаты определения активности каспаз через 48 часов после облучения клеток линии К562 в дозах 4 и 12 Гр. Как видно из графика, нами не обнаружено преобладающей активности какой-либо из каспаз. Кроме этого, нами не выявлено достоверных отличий между группами по активности каспазы 3. Это может свидетельствовать в пользу предположения, что в нашем случае мы имеем дело с каспаз-независимым механизмом реализации апоптоза. Можно предположить, что это связано с отсутствием активности белка р53 в клетках линии К562.

На рис. 7А представлены данные экспериментов в которых определялось количество клеток с признаками апоптоза и некроза через 48 часов после облучения линии Raji в дозе 4 и 12 Гр. Как видно из рисунка, преобладающим механизмом смерти после радиационного воздействия является апоптоз. Увеличение дозы облучения вызывало зависимое от дозы рост количества, клеток с признаками апоптоза. На рис. 7Б представлены данные экспериментов по определению активности каспаз в клетках линии Raji через 48 часов после рентгеновского облучения в дозе 4 и 12 Гр. Как видно из графика, рентгеновское облучение в дозе 4 Гр вызывало увеличение активности каспазы 3 и каспазы 9. Активность каспаз 1 и 8 не изменялась после радиационного воздействия. При облучении клеток линии Raji в дозе 12 Гр активность каспаз снижалась, что, по нашему мнению, связано с большим количеством погибших клеток. Высокая активность каспазы 9 свидетельствует о том, что в клетках Raji после радиационного воздействия апоптоз реализуется по митохондриальному пути.

В наших экспериментах для определения апоптоза и некроза и использовался метод двухцветного окрашивания клеток аннексином-V-FITC (annexinV,

Рис. б. Количество клеток линии К562 с признаками апоптоза и некроза через 24 и 48 часов после облучения в дозе 4 и 12 Гр.(А).Активность каспаз 3,8 и 9 в клетках линии К562 через 48 часов после облучения в дозах 4 и 12 Гр (Б). (* - р < 0,05 в сравнении с контрольной группой;)

Рис. 7. Количество клеток линии Г1а,р с признаками апоптоза и некроза через 48 часов после облучения в дозе 4 и 12 Гр (А) .Активность каспаз 1, 3, 8 и 9 в клетках линии Ка,)1 через 48 часов после облучения в дозах 4 и 12 Гр (Б). (* - р < 0,05 в сравнении с контрольной группой;)

зелёная флуоресценция) и пропидиум йодидом (Р1, красная флуоресценция). Поэтому фактически число мёртвых клеток - это сумма клеток с признаками апоптоза (аппехшУ+Р1-) и клеток с признаками как апоптоза так и некроза (аппехтУ+Р1+). На рис. 8 представлено распределение клеток Па.^ и К562 по цветовым каналам цитофлуориметра и видны отличия между двумя клеточными линиями. Клетки И,а]1 вначале оказываются в области только зелёной флуоресценции (аппехш У+ Р1-), а затем попадают в область с красной флуоресценцией (аппехт Р1+). Или другими словами, клетки На.р с красной флуоресценцией имеют высокую зеленую флуоресценцию (рис. 8, Шф 4 Гр).Это означает, что, прежде чем перейти в стадию некроза они обязательно проходят

К562 контроль К562 4 Гр Raji контроль Raji 4Гр

Рис. 8. Тпичное распределение клеток Raji и К562 в норме и после облучения в дозе 4 Гр по интенсивности флуоресценции в зелёном и красном спектре после инкубации с аннексином-V-FITC и пропидиум йодидом. Примечание. Аннексии-V-FITC дает флуоресценцию в зеленом спектре (участок 3), пропидиум иодид - к красном спектре (участок 1). Смешанная флуоресценция - участок 2

стадию апоптоза. Иная картина наблюдается в случае клеток К562. В их популяции большое количество клеток с высокой красной флуоресценцией (которая свидетельствует о нарушении проницаемости цитоплазматической мембраны и проникновении внутрь клетки PI) и низкой или отсутствующей зелёной флуоресценцией (которая свидетельствует о связывании меченного FITC аннексина-V с фосфотидилсерином на внешней поверхности цитоплазматической мембраны). Аннексии-V-FITC также может связываться и с фосфотидилсерином на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны с случае нарушения ее целостности. Поэтому все клетки с кроеной флуоресценцией, т.е. связавшие пропидиум йодид, также обладают и зелёной флуоресценцией, т.е. связывают аннексии-V-FITC, но на внутренней стороне цитоплазматической мембраны. Это хорошо видно на рис. 8: практически линейная зависимость между количеством связавшегося с клетками аннексина-V-FITC и связавшегося с ДНК PI. Мы сделали вывод, что клетки К562 после радиационного воздействия начинают гибнуть, минуя стадию апоптоза, тогда как в клетках линии Raji вначале

запускается эта стадия.

Сравнительный анализ радиационно-индуцированное изменение экспрессии генов в клетках линий К562 и НСТ-116 р53-/- (с накаутированным геном ТР53) и НСТ-116 р53+/+ (с диким геном ТР53) продукты которых участвуют в процессе регуляции программируемой клеточной смерти продемонстрировал ряд существенных различии. В клетках линии НСТ-116 р53+/+ радиация стимулировала увеличение экспрессии генов TRADD и TRAF1, продукты которых белки - протеин ассоциированный с рецептором фактора некроза опухолей (ФНО) и фактор ассоциированный с рецептором ФНО участвуют в активации каспазы 8, тогда как в клетках линии НСТ-116 р53-/- такой активации не наблюдалось. Радиационно-индуцированные свободно-радикальные

Рис. 9. Количество клеток линии К562(А) и В.а.р(Б) с признаками апоптоза и некроза через 48 часов после облучения в дозе 4 Гр в присутствии ВВО. (* - р < 0,05 в сравнении с контрольной группой; # - р < 0,05 в сравнении с группой 4Гр)

процессы, которые развиваются через 24 часа в TP 53 мутантных клетках (К562 и НСТ-116 р53-/-) являются более сильными индукторами экспрессии антиапоптотических генов, чем в клетках содержащих нормальный ген ТР53, что проявляется в более высоком уровне мРНК генов BCL-2, BCL-XL, MCL1 и XIAP в клетках линий К562 и НСТ-116 р53-/-.

На рис. 9А представлены результаты экспериментов с добавлением BSO в конечной концентрации 0,5 мМ к клеткам линии К562. Как видно из графика, BSO не влиял на количество апоптозных клеток в облучённой популяции, но значительно увеличивал (более чем в 2 раза) число клеток со следами некроза. На рис. 9Б представлены данные экспериментов с добавлением BSO в конечной концентрации 0,5 мМ к клеткам линии Raji, которые обладают нормально функционирующим белком р53. Как видно из графика, BSO увеличивал количеств клеток в популяции со следами апоптоза и некроза, но не так значительно, как в случае увеличения некротических клеток в популяции К562. По нашему мнению, это связано с тем, что BSO в клетках Raji стимулирует уже запущенный механизм клеточной смерти и поэтому не может вызвать значительного увеличения клеточной смерти.

Мы также выполнили определение активности каспаз 1, 3, 8, 9 в клетках линии К562 и Raji после облучения дозе 4 Гр с добавлением BSO и без него. BSO не влиял на активность каспаз в данных культурах клеток.

Ингибитор полимеразы 1 поли(АДФ- рибозы)8-гидрокси-2-метилкуназолин-4-[ЗН]он (NU1025) вызывает увеличение продукции АФК на поздних этапах после облучения (рис.4. Кроме этого NU1025 увеличивает количество одно цепочечных разрывов ДНК. После облучения клеток линии К562 в дозе 4 Гр

присутствие NU1025 в ростовой среде не приводило к увеличению количества клеток с признаками необратимой деградации в сравнении с клетками, облучавшимися только в дозе 4 Гр.

Поскольку в предыдущей главе мы сделали заключение, что источником свободно-радикальных процессов через 24-48 часов после облучения являются митохондрии мы использовали 4,4'-Диизотиоциано-2,2'-стильбендисульфоновую кислоту(DIDS), которая является блокатором мито-хондриальных пор переменной проницаемости. Добавление DIDS в конечной концентрации 100 мкМ перед облучением приводило к увеличению количества клеток с признаками деградации в среднем на 30-40 % для линии К562, и 50-60 % для линии Raji. Добавление DIDS не приводило к изменению механизмов клеточной смерти.

В результате проведенных экспериментов мы смогли сделать заключение, что рентгеновское излучение вызывает гибель клеток лейкемии линии К562 в результате каспаз-независимого некроза, а клеток линии Raji - с запуском каспаз-зависимого апоптоза. Мутация гена ТР53 подавляет запуск радиационно-индуцированной программируемой клеточной смерти через кас-пазный механизм. Ь-бутионин^,8-сульфоксимин в дозе 500 мкМ стимулировал увеличение клеток с признаками некроза в культуре клеток К562 и с признаками апоптоза и некроза в культуре клеток Raji,а также не вызывал изменений в активности каспаз при его добавлении за 12 часов до облучения к клеточным линия К562 и Raji. Применение ингибитора ПАРП-1 NU1025 совместно с рентгеновским облучением в дозе 4 Гр клеток линии К562 не приводит к увеличению количества клеток с признаками некроза и апоптоза. использование DIDS с последующем облучением вызывало рост количества клеток линий К562 и Raji с признаками деградации без изменения механизма клеточной смерти.

На основании вышеизложенного нами было сделано заключение, что реализация сценария клеточной гибели в результате оксидативного стресса зависит от особенностей функционирования внутриклеточных сигнальных механизмов и не зависит от индуктора оксидативного стресса, а также что мутация гена ТР53 подавляет запуск программируемой клеточной смерти через каслазный механизм.

Влияние свободно-радикальных процессов на повреждение ДНК в

раковых клетках

На рис. 10 представлен график, отражающий кинетику изменения повреждений ДНК после рентгеновского облучения клеток линии К562 (рис.ЮА)и HL-60 (рис.МБ)в дозах 4 и 12 Гр. После рентгеновского облучения в клетках линий К562 и HL-G0 наблюдается сложная динамика изменения количества разрывов

Время прошедшее после облучения Время прошедшее после облучения

Рис. 10. Кинетика изменения тайл-момента ДНК после рентгеновского облучения клеток линии К562 (А) и НЬ-60(Б) в дозах 4 и 12 Гр.(* - р < 0,05 в сравнении с контрольной группой; # - р < 0,05 в сравнении с группой 4Гр)

ДНК, которую можно разделить на 3 этапа: 1 этап заключается в росте повреждения ДНК в первый час после облучения; 2 этап характеризуется снижением тайл-момента до значений характерных, для контрольной группы; и 3 этап характеризуется повышением тайл-момента облученных клеток; 2) Наибольшая активность репарационных процессов после повреждения ДНК рентгеновским излучением наблюдается в период времени 30 мин-1час после воздействия; динамика изменения тайл-момента клеток линии НЬ-60 идентична наблюдаемой в экспериментах с клеточной линией К562, тогда как репарационные процессы в клетках линии НЬ-60 запускаются раньше. Бели сравнить динамику изменения количества разрывов цепей ДНК с динамикой изменения внутриклеточной концентрации АФК 1, то можно увидеть, что они похожи.

Ведущую роль в устранении неправильных воссоединений концов ДНК играет хроматин и модификации гистонов, главной из которых является фосфо-рилирование С-концевых радикалов серина в гистоне 7 - Н2АХ.В настоящей работе мы оценивали интенсивность фосфорилирования гистона 7 - Н2АХ после радиационного облучения через 1, 3,6 и 9 часов после момента облучения. На рис 11 представлен график, отражающий результаты определения количества мест связывания антител с гистоном 7 - Н2АХ в клетках линии К562(А) и НЬ-60(Б). После облучения клеток К562 в дозе 4 Гр мы видим незначительное снижение количества разрывов цепей ДНК, а при дозе 12 Гр в клетках линии К562 не происходит репарации двухцепочечных разрывов цепей ДНК. В клетках линии НЬ-60, наоборот наблюдаются очень интенсивные репарационные процессы. При дозе облучения 4 Гр через 3 часа количество мест фосфорилирования гистона 7 - Н2АХ не отличается от контроля, в дальнейшем происходит небольшое их увеличение, что связано с увеличением концентрации АФК (рис. 1). Таким образом, можно сделать заключение, что клетки линии К562 не спо-

Время прошедшее после облучения Время прошедшее после облучения

Рис. 11. Динамика изменения количества клеток содержавших 10 и более мест связывания антител к гистону 7 - Н2АХ в ядре клеток линии К562(А) и HL-60(B) после облучения в дозе 4 и 12 Гр. (* - р < 0,05 в сравнении с контрольной группой; # - р < 0,05 в сравнении с группой 4Гр)

собны к активной репарации разрывов цепей ДНК, тогда как клетки линии HL-6Ü могут восстанавливать разрывы цепей ДНК.

На рис. 12 представлены данные экспериментов по определению количества ядерных аномалий клеток линии К562 после рентгеновского облучения в дозах 4 и 12 Гр. К ядерным аномалиям относятся микроядра, двух ядерные и многоядерные клетки. Как видно из графика, рентгеновское излучение стимулировало в клетках линии К562 образование всех видов аномалий ядра клеток. Такое большое увеличение количества ядерных аномалий мы связываем с неспособностью линии К562, содержащей мутированный ген ТР53, к репа,-рации повреждений на ранних этапах. Это было нами продемонстрировано в экспериментах по определению степени фосфорилирования гистона 7-Н2АХ в клетках этой линии (рис. 11 А).Проведённые эксперименты по определения аномалий клеточного ядра в клетках линии К562 позволили сделать вывод, что рентгеновское излучение индуцирует появление ядерных аномалий в клетках линии К562 в связи с низкой активностью репарационных процессов.

Исследование экспрессии генов в клетках линии К562 продукты которых участвуют в различных механизмах репарации ДНК выявило возможные причины высокой нестабильности генома клеток К562. В клетках линии К562 после радиационного воздействия не обнаружено индукции генов системы эксцизионной репараций удалением поврежденных оснований (BER) и постре-пликационной репарация ошибочно спаренных нуклеотидов (MMR).

Кинетику репарации повреждения ДНК после облучения клеток, различных по статусу белка р53, мы исследовали оценивая распределение клеток по величине шлейфа деградированной ДНК (tail length) полученного с помощью мето-

Рис. 12. Количество ядерных аномалий клеток линии К562 после рентгеновского облучения в дозах 4 и 12 Гр.(* - р < 0,05 в сравнении с контрольной группой; # - р < 0,05 в сравнении с группой 4Гр)

да электрофореза одиночных клеток в агарозном геле после щелочного лизиса (Commet assay). В отличие от графиков (рис. IDA и Б), отражающих средние значения тайл-момента в условных единицах, на графиках пердставленных на рисунке 13 видна эффективность репарационных процессов, а также количество клеток с необратимыми процессами деградации (некроз, апоптоз). На рис. 13А кривая, отражающая распределение клеток по длине шлейфа деградировавшей ДНК после облучения в дозе 4 Гр через 24 часа, представлена 1 пиком без значительного хвоста. Это свидетельствует в пользу того, что рост ТМ, зафиксированный нами через 24-48 часов после облучения, не связан с процессами апоптоза и некроза, а отражает нестабильность генома клеток К562 после облучения. Способность к репарации одноцепочечных разрывов ДНК значительно выше у клеток линии HL-60. Через 5 минут после воздействия радиации этот параметр для клеток линии HL-G0 составил 5-40 усл.ед., что соответствует аналогичному показателю для клеток линии К562. Через 24 часа этот параметр у клеток линии HL-60 почти полностью возвращается в норму. Таким образом, исследование распределения клеток в зависимости от длины шлейфа деградировавшей ДНК после облучения в дозе 4 и 12 Гр продемонстрировало способность клеток линии HL-60 к репарации одноцепочечных разрывов ДНК.

Рис. 13. Распределение клеток линии К562(А) и НЬ-60(В) в зависимости от длины шлейфа повреждённой ДНК после облучения в дозе 4 Гр через 5 минут и 24 часа.

Клетки линии НЬ-60 могут более эффективно поддерживать стабильность генома, что следует из их способности к репарации одноцепочечных разрывов ДНК и способности в большей степени подвергаться апоптозу/некрозу, если такая репарация невозможна.

Использование ингибитора ПАРП-1 совместно с рентгеновским облучением клеток линии К562 в дозе 4 Гр приводило к ухудшению процессов репарации ДНК, как в первые моменты после облучения, так и на поздних этапах. Использование ингибитора ПАРП-1 N111025 вызывает снижение эффективности репарационных процессов и увеличивает количество одноцепочечных разрывов ДНК в период до 4 часов и 12-48 часов после облучения в дозе 4 Гр в клетках линии К562.

Выполненные эксперименты продемонстрировали, что после рентгеновского облучения в ТР53 дефицитных клетках линий К562 и НЬ60 наблюдается сложная динамика изменения количества разрывов ДНК, повторяющая динамику изменения внутриклеточной концентрации активных форм кислорода. Её также можно разделить на 3 этапа: 1 этап заключается в росте повреждения ДНК в первый час после облучения; 2 этап характеризуется снижением тайл-момента до значений, характерных для контрольной группы; и 3 этап характеризуется повышением тайл-момента облученных клеток. Наибольшая активность репарационных процессов после повреждения ДНК рентгеновским излучением и последующим оксидативным стрессом наблюдается в период времени 30 мин-1час после воздействия. Клетки линии К562, мутантные по гену ТР53, не способны к полной репарации радиационно-индуцированных двухцепочечных разрывов ДНК, тогда как клетки линии НЬ-60 способны к репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Рентгеновское излучение индуцирует появление ядерных аномалий в клетках линии К562 в связи с низкой активность репарационных про-

цессов. Использование ингибитора ПАРП-1 NU1025 вызывает снижение эффективности репарационных процессов и увеличивает количество одноцепочечных разрывов ДНК в период до 4 часов и 12-48 часов после облучения в дозе 4 Гр в клетках линии К562.

На основании вышеизложенного мы сделали вывод, что степень повреждения ДНК зависит от динамики свободно-радикальных процессов и, в свою очередь, индукция повреждения ДНК может стимулировать увеличения внутриклеточной концентрации АФК.

Влияние свободно-радикальных процессов на динамику клеточного

цикла

В настоящее время установлено, что существует взаимосвязь между нормальной репликацией ДНК и клеточным ответом на повреждение ДНК. Повреждение ДНК, индуцированное оксидативным стрессом, вызывает арест клеточного цикла в поздней S-фазе и ранней С2/М-фазе [Lieber, 2008]. В таких случаях репарация радиационно-индуцированных повреждений ДНК необходима для продолжения и завершения репликации ДНК.

На рис. 14 представлен график, отражающий отношение клеток в G2 фазе к клеткам, находящимся в фазе Gl после облучения клеток линии К562 и HL-60 в дозе 4 и 12 Гр. Максимальные значения этого параметра в случае облучения клеток К562 дозой 4Гр приходятся на 12 часов, при дозе 12 Гр - на 24 часа после облучения (рис.14А). В последующем отношение G2/G1 снижается, а для клеток, облучавшихся дозой 4 Гр, в момент времени - 48 часов - практически сравним с контрольными значениями. Для клеток, подвергшихся облучению в дозе 12 Гр, отношение G2/G1, хотя и равняется 2,91, но, по сравнению с аналогичным показателем в 24 часа, равным 9,3, существенно ниже.В отличие от клеток линии К562, задержка клеточного цикла клеток линии HL-60 не зависит от силы радиационного воздействия). На рис. 14Б приведен график, отражающий динамику изменения отношения'количества клеток в G2 фазе, к клеткам, находящимся в фазе Gl. Максимальных показателей отношение G2/G1 в данном случае достигает к 24 часам и равно 9,23 и 7,11 в случае облучения клеток в дозах 4 и 12 Гр соответственно. Через 48 часов после облучения отношение G2/G1 ниже, чем в предыдущий момент времени, а для группы 4Гр отношение G2/G1 практически приближается к значениям, характерным для контрольной группы.

На рис. 15 представлен график, отражающий динамику изменения отношения количества клеток линии Raji в G2 фазе к клеткам, находящимся в фазе Gl после облучения в дозе 4 Гр. Как видно из рисунка, динамика изменения отношения G2/G1 для клеток Raji отличается от таковой для клеток линия К562 и HL-60. Самое большое отличие, по нашему мнению заключается в значительно более низком значении отношения G2/G1. Так, если максимальное

Рис. 14. Динамика изменения отношения количества клеток линии К562(А) и НЬ-вО(В) в фазе С2 к количеству клеток в фазе С1 после рентгеновского облучения в дозах 4 и 12 Гр.(* - р < 0,05 в сравнении с контрольной группой; # - р < 0,05 в сравнении с группой 4Гр)

значения для клеток линий К562 и НЬ-60 при дозе облучения 4 Гр было равно 5,5 и 9,2 соответственно, то для клеток линии 11а,)1 оно равнялось значению 2,27. Мы не смогли достоверно оценить динамику изменения отношения клеток линии Г1а,р 02/01 после облучения в дозе 12 Гр из-за большого количества клеток, находящихся в различных стадиях деградации. Это связано с тем, что клетки линии 11а,р обладают меньшей радиорезистентностью в сравнении с клетками линий К562 и НЬ-60.

Таким образом, в заключение данного раздела можно сделать следующие выводы: 1) задержка клеточного цикла в клетках линии НЬ-60 при облучении рентгеновским излучением в дозах 4 и 12 Гр происходит синхронно, тогда как в клетках линии К562 пики отношений 02/01 разнесены во времени; 2) радиационно-индуцированная задержка цикла деления клеток линии Ла^ характеризуется более низким значением отношения количества клеток в фазе 02 к количеству клеток в фазе 01, чем аналогичный показатель для клеток линии К562 и НЬ-60.

Изучение роли митохондрий в механизмах индукции свободно-радикальных процессов

Митохоидриальный мембранный потенциал является важным показателем метаболической активности клеток, кроме этого он отражает способность митохондрий генерировать АФК. На рис. 16 представлены данные, отражающие изменение митохондриального мембранного потенциала после облучения клеток К562(1А) и НЬ-60(1Б) в дозах 4 и 12 Грэй. Как видно из графика,

Рис. 15. Динамика изменения отношения количества клеток линии На.]! в фазе С2 к

количеству клеток в фазе С1 после рентгеновского облучения в дозах 4 и 12 Гр.(* -

р < 0,05 в сравнении с контрольной группой; # - р < 0,05 в сравнении с группой 4Гр)

радиационное облучение стимулировало рост митохондриального потенциала в обеих клеточных линиях.Наиболее существенное увеличение митохондриаль- I ного потенциала мы наблюдали через 24-48 часов после облучения. Сопоставив эти данные с данными полученными в ходе исследования динамики накоп- 1 ления АФК (рис. 1), а также данными опытов с использованием ингибитора окислительного фосфорилирования - ротенона (рис.3), мы смогли сделать заключение, что источником активных форм кислорода после радиационного воздействия через 4-48 часов в клетках линии К562 однозначно являются митохондрии, тогда как клетках линий НЬ60 рост концентрации АФК в период времени 4-48 часов неоднозначно связан с их митохондриальной продукцией. Добавление БШЭ перед облучением вызывало снижение совокупного клеточного митохондриального потенциала в среднем на 20-30% по сравнению с контрольной группой и 30-60% по сравнению с облученными клетками.

Мембранный митохондриальный потенциал может возрастать из-за разных причин, но наиболее важными из них являются нарушение процессов окислительного фосфорилирования и увеличение митохондриальной массы. Митохон-

Рис. 16. Динамика изменения митохондриального потенциала(Х) и митохондриальной массы (2) после облучения клеток линии К562(А) и HL-60)(B) рентгеновским излучением в дозе 4 и 12 Грэй. Яршиепание.Данные представлены как отношение величины флуоресценции TMRE и NAO в клетках подвергшихся рентгеновскому облучению к аналогичному показателю клеток контрольной группы. (* - р < 0,05 в сравнении с контрольной группой; # - р < 0,05 в сравнении с группой 4Гр).

дриальную массу мы определяли с использованием флуоресцентного красителя нонил-акридинового оранжевого. Этот потенциал-независимый флуоресцентный краситель связывается со специфическими липидами митохондриальных мембран и позволяет оценить митохондриальную массу независимо от величины митохондриального мембранного потенциала. На рис. 16 показаны данные экспериментов по изучению влияния радиационного облучения в дозе 4 и 12 Гр на изменение митохондриальной массы в клетках линий К562(2А) и HL-60(2B). Митохондриальная масса в клетках К562 начала возрастать практически сразу после облучения и достигала максимального значений к концу мониторинга. В клетках линии HL-6Ü рост митохондриальной массы нами был зафиксирован только в последней контрольной точке через 48 часов после облучения.

Вклетках линии К562 радиационное воздействие вызывает увеличение экспрессии генов митохондриальной глицерол-3-фосфатдегидрогеназы, пиру-

ватдегидрогеназы, а-кетоглутарат дегидрогеназы и изоцитрат дегидрогеназы параллельно с ростом совокупного клеточного митохондриального потенциала и митохондриальной массы. Изучение влияния радиации на экспрессию генов, продукты которых участвуют в регуляции митохондриального биогенеза показало, что радиационное воздействие в дозе 4 Гр вызывает репрессию генов NRF1, TFAM. PPRC1, ESRRA, POLRMT, TFB2M и не влияет на экспрессию генов PPARA и TFB1M. Это позволяет сделать вывод о том, что в клетках линии К562 под действием радиации происходит репрессия генов кодирующих белки участвующих в митохондриальном биогенезе.

Таким образом, нами было сделано заключение, что радиационное облучение клеток К562 и HL-60 в дозах 4 и 12 Гр вызывает зависимый от дозы рост совокупного клеточного митохондриального мембранного потенциала. Рост митохондриального потенциала в клетках К562 связан с увеличением митохондриальной массы, Причиной второго максимума радиационно-индуцированной концентрации АФК и второго максимума повреждения ДНК в клетках К562 можно назвать рост митохондриального потенциала, вызванный увеличением клеточной митохондриальной массы не связанной с задержкой клеточного цикла.

На основании вышеизложенного мы сделали заключение, что митохондриально-индуцируемый оксидативный стресс является причиной повреждения ДНК и возникновения аномалий ядра в клетках мутантных по гену ТР53.

Исследование активности внутриклеточных сигнальных механизмов в условиях активации радиационно-индуцированных свободно-радикальных процессов

Протеинкиназы, активируемые митогенами (МАПК), играют важную роль в регуляции экспрессии генов при всех проявлениях жизнедеятельности клеток. МАПК-каскады реакций фосфорилирования протеинкиназ и других регулятор-ных белков обеспечивают декодирование первичных эффекторных сигналов путем их передачи от поверхности клеток к ядру или другим внутриклеточным компонентам, завершающееся кооперативными ответами клеток организма.

Мы провели оценку содержания фосфорилированной и дефосфорилирован-ных форм АКТ 1/2-киназ, JNK 1/2-киназ, ERK 1/2-киназ в клетках К562 и Raji через 1,12,24,4-8 часов после облучения в дозе 4 Гр. В результате экспериментов установлено, что рентгеновское облучение вызывает снижение фосфорилированной формы АКТ 1/2/3 киназ. JNK 1/2 киназы непосредственно связываются со специфическими белковыми доменами c-Jun и ATF2 , которые образуют один из димерных факторов транскрипции семейства API. В результате c-Jun

и ATF2 фосфорилируются по N- концевым доменам. Эти домены являются активаторными, и их фосфорилирование приводит к увеличению транскрипционной активности их димера API. Кроме Мс1т2-зависимой деградации р53 в клетках, в нормальных условиях, функционирует альтернативная система, которая использует не активированную JNK. JNK связывается с р53 в районе аминокислотных остатков 97-117 и способствует убиквитинилированию и дестабилизации рБЗ.Как следует из полученных нами данных, радиация не вызывает значимого изменения количества киназ JNK 1/2 в клетках К562, но увеличивает количество фосфорилированной формы JNK 1/2 кииазы. Вероятно, такое увеличение связано с отсутствием белка р53. Радиационное воздействие снижает внутриклеточное количество ERK1/2 киназ в клетках линии К562.

Радиационное излучение в дозе 4 и 12 Гр индуцировало накопление АКТ1/2 киназы в клетках Raji. Наиболее сильная индукция наблюдалась в случае АКТ2. Внутриклеточная концентрация АКТ2 киназы зависела от дозы облучения и при увеличении дозы происходило ее большее накопление в цитоплазме. Рост внутриклеточной концентрации АКТ1/2 киназ достигал максимума уже через 1 час после облучения и сохранялся вплоть до окончания мониторинга.Радиационное облучение стимулировало стабилизацию фосфорилированной формы ERK-киназы в клетках линии Raji. Накопление фосфорилированной формы ERK 1 /2-киназы увеличивалось с ростом дозы облучения.

Таким образом, радиационно-индуцированный оксидативный стресс в клетках линии К562, мутантных по гену ТР53, вызывает снижение фосфорилированной формы АКТ 1/2/3 и ERK1/2 киназ и увеличивает количество фосфорилированной формы JNK 1/2 киназы, тогда как в клетках Raji, которые содержат нормальный белок р53, происходит накопление АКТ 1/2 киназ и стабилизацию фосфорилированной формы ERK 1/2-киназы.

Идентификация генов, экспрессия которых зависит от динамики

развития радиационно-индуцированных свободно-радикальных

процессов

Анализ профиля экспрессии генов в клетках К562, НСТ116 р53-/- и НСТ116 р53+/+ продемонстрировал наличие генов, экспрессия которых, соответствовала изменениям внутриклеточной концентрации АФК после радиационного облучения. В случае линии К562 изменение экспрессия 156 генов соответствовало изменению концентрации АФК, в случае линии НСТ116 р53-/- выявлено 66 генов, и экспрессия 92 генов соответствовала динамики изменения АФК в клетках линии НСТ116 р53+/+. При помощи программы STRING 9.0 (доступна по адресу: - http://string-db.org) был проведен сравнительный анализ существующих взаимодействий среди белков, экспрессия генов которых повторяет динамику изменения АФК после радиационного облучения в клетках мутантных и

Рис. 17. Схема, отражающая взаимосвязь белковых продуктов генов, экспрессия которых повторяет динамику изменения АФК после радиационного облучения в клетках мутантных и нормальных по гену ТР53. Примечание. Сигнальные механизмы, которые дополнительно появляются в TP5S мутантных клеточных линиях, выделены серым цветом.

нормальных по гену ТР53. На рисунке 17 представлена схема взаимодействий сигнальных белковых молекул в нормальных и мутантных по гену ТР53 (выделено серым цветом) клетках. Как видно из рисунка, белки, кодируемые генами, экспрессия которых зависит от уровня АФК, после радиационного облучения, могут формировать несколько связанных между сигнальных каскадов, наиболее важным из которых является сигнальный каскад с белком FOS. Этот белок является ключевым в ряде функция связанных с пролиферацией, апоптозом, а также участвует в регуляции клеточного метаболизма на различных уровнях [Jimeno et al, 2006]. В ТР53 мутантных клетках экспрессия гена c-FOS подавляется в результате активации сигнального каскада GDF15 (ростовой фактор дифференциации 15) - KDM5B (лизин(К) специфическая деметилаза), которые оказывает ингибирующее действие на белок FOS.

Таким образом, экспрессия гена FOS зависит от внутриклеточной концентрации АФК в облученных клетках. В ТР53 мутантных клетках происходит увеличение экспресиии гена FOS сопровождается увеличением экспрессии гена GDF15, продукт которого, белок GDF15 является репрессором белка FOS.

Заключение

Радиационно-индуцированные свободно-радикальные процессы в раковых клет-

ках обладают сложной динамикой и зависят от особенностей их генотипа. Общей чертой динамики развития радиационно-индуцированных СРП является наличие двух максимумов внутриклеточной концентрации АФК. Причиной второго максимума концентрации АФК в ГРЯ^-мутантных клетках является увеличение совокупного клеточного митохондриального потенциала связанного с ростом митохондриальной массы. Генотип злокачественного образования влияет на процессы репарации повреждений ДНК и механизмы клеточной гибели. В ТР53 мутантных опухолях процессы репарации протекают менее активно, что приводит к появлению признаков генетической нестабильности, которые сопровождаются блокированием апоптоза и преобладанием некротического сценария гибели. Ингибирование процесса репарации ДНК может приводить к усилению митохондриально-зависимых свободно-радикальных процессов в раковых клетках. Динамика повреждения ДНК в изученных линиях раковых клеток совпадает с динамикой изменения внутриклеточной концентрации АФК. Изменение экспрессии ряда генов, также может быть связано с изменением концентрации АФК и зависеть от генотипа раковых клеток. Таким образом, радиационно и химически-индуцированные свободно-радикальные процессы могут вызывать как гибель клетки, так и дальнейший мутагенез, что зависит от генотипа раковых клеток и это необходимо учитывать при разработке перспективных противоопухолевых лекарственных средств и протоколов радио- и химиотерапии онкологических заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Динамика накопления активных форм кислорода после радиационного воздействия на раковые клетки линий К562, НЬ-60 и характеризуется двумя максимумами: через 30 минут и 28-48 часов после облучения.' Источниками активных форм кислорода в культуре раковых клеток линии К562 через 24-48 часов являются митохондрии, тогда как в клетках линий НЬ-60 и рост концентрации АФК в период времени 24-48 часов не связан с их митохондриальной продукцией.

2. Радиационное излучение вызывает монотонный рост внутриклеточной концентрации оксида азота в клетках линий К562, НЬ-60 и Ил^, источником которого является увеличение активности синтетазы оксида азота 2.

3. Радиационное излучение вызывает гибель клеток линии К562 в результате автофагии и каспаз-независимого некроза, а клеток линии НЬ-60 и 11а,р

в результате каспаз-зависимого апоптоза.

4. Сочетанное радиационное и химическое воздействие не изменяет механизма гибели клеток линий К562, НЬ-60 и 11а.р в сравнении с радиационным воздействием.

5. Динамика образования радиационно-индуцированных одноцепочечных разрывов ДНК в клетках линий К562, НЬ60 и Raji повторяет динамику изменения внутриклеточной концентрации активных форм кислорода при этом типе воздействия и характеризуется на первом этапе - ростом повреждений ДНК, на втором этапе - снижением тайл-момента до значений, характерных для контрольной группы, и на третьем этапе повышением тайл-момента по сравнению с контролем.

6. Для всех изученных клеточных линий период с максимальной задержкой клеточного цикла в фазе вг/М соответствовал максимальным значениям концентрации АФК и повышенным уровням внутриклеточной концентрации восстановленного глутатиона.

7. Наибольшая активность репарационных процессов после радиационно-индуцированного повреждения ДНК во всех исследованных клеточных линиях зафиксирована в период времени 30 мин-1час после воздействия. При этом клетки линии К562 не способны к полной репарации, а клетки линии НЬ-60 и Иа]! способны к репарации радиационно-индуцированных одно и двух-цепочечных разрывов ДНК. В клетках линии К562 частота появления ядерных аномалий после радиационного воздействия выше, чем в клетках лини НЬ-60 и Иа,]!.

8. Нарушение процесса репарации радиационно-индуцированных повреждений ДНК в клетках линии К562 ингибитором полимеразы 1 поли(АДФ- ри-бозы)вызывает рост внутриклеточной концентрации активных форм кислорода через 24-48 часов и не влияет на механизмы клеточной гибели в сравнении с облученными клетками, в которых процессы репарации ДНК не ингибировались.

9. Блокирование митохондриальных пор переменной проницаемости вызывало снижение радиационно-индуцированой внутриклеточной концентрации активных форм кислорода в клетках линий К562 и Еа.р с одновременным снижением совокупного клеточного митохондриального потенциала, приводило к уменьшению повреждения ДНК и вызывало рост клеточной гибели без изменения её механизмов в сравнении с клетками, которые подвергались только радиационному облучению.

10. Радиационно-индуцированные свободно-радикальные процессы в клетках линии К562 вызывают снижение фосфорилированной формы АКТ 1/2/3 и ЕИК1/2 киназ и увеличивают количество фосфорилированной формы ,1МК 1/2 киназы, тогда как в клетках линии Иа^ инициируют накопление АКТ 1/2 киназ и стабилизируют фосфорилированную форму ЕЙК 1/2-киназы.

11. Во всех изученных клеточных линиях экспрессия гена ^05 зависит от динамики внутриклеточной концентрации АФК . В ТР53 мутантных клетках от динамики внутриклеточной концентрации АФК зависит экспрессия гена продукт которого, белок СБПб является репрессором белка РОБ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Публикации в журналах из перечня ВАК.

1. Анализ динамики транскриптома в процессе развития радиационно-индуцированного оксидативного стресса в раковых клетках с нормальным и мутантным геном ТР53/Ю.В. Саенко, М.А. Семенова, Д.А. Викторов, A.B. Мастиленко, В.А. Остаточни-ков, Е.С. Глущенко, A.B. Антонова, И.В. Живодерников, В.П. Свеколкин, П.В. Бе-логу бов//Изцестия Самарского научного центра Российской академии наук,- 2013— Т15,№4(3)-С.755-760

2. Изучение сочетанного действия доксорубицина и дегидроэпиандростерона на пролиферацию и оксидативный стресс в клетках Saccharomyces cerevisiae. /Ю.В. Саенко, С.М. Напалкова, Э.Ш. Бникеев, Е.В. Расторгуева // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010. - Т73, №4. - С. 31-34.

3. Изучение особенностей экспрессии генов ДНК-репарирующих механизмов в раковых клетках с нормальным и мутантным геном ТР53/Глущенко Е.С., Белогубов П.В., Антонова A.B., Семенова М.А., Живодерников И.В., Свеколкин В.П., Викторов Д.А., Мастиленко A.B., Иванская H.H., Столбовская О.В., Шутов A.M., Макеева Е.Р., Остаточ-ников В.А., Напалкова С.М., Саенко Ю.В. // Фундаментальные исследования.-2013-№8(4)-С.867-871

4. Нарушение митохондриального биогенеза является причиной развития радиационно-ипдуцированного оксидативного стресса в клетках линии К562/Ю.В. Саепко, О.В. Столбовская, М.А. Семенова, Д.А. Викторов, A.B. Мастиленко, В.А. Остаточников, Е.С. Глущенко, A.B. Антонова, И.В. Живодерников, В.П. Свеколкин, П.В. Белогубов// Известия Самарского научного центра Российской академии наук,- 2013-Т15,№4(3)-С.761-768

5. Особенности развития радиационно-индуцированного оксидативного стресса в раковых клетках мутантных по гену ТР53/Ю.В. Саенко, A.M. Шутов, С.М. Напалкова, М.А. Семенова, H.A. Цыганова, Т.И. Кузнецова, Е.С. Глущенко, Е.А. Крючков, Д.А. Белозе-ров, Н.С. Манышкина// Известия Самарского научного центра Российской академии наук- 2012-Т4,№4(4)-С. 1162-1170

6. Радиационное излучение индуцирует отсроченный, митохондриально-зависимый оксидативный стресс в клетках лейкемии К562./Ю.В. Саенко, A.M. Шутов, С.М. Напалкова, Е.В. Расторгуева, А.Г. Маслакова, Д.В-.Серова//Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2012. - № 2. - С. 11-18

7. Саенко, Ю.В. Изучение генотоксических свойств доксорубицина с использованием клеточной модели Saccharomyces cerevisiae. / Ю.В. Саенко, A.M. Шутов // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2007. - Т70, №3. - С. 29-32.

8. Саенко, Ю.В. Доксорубицин и менадион вызывают задержку клеточной пролиферации Saccharomyces cerevisiae с помощью различных механизмов./ Ю.В. Саенко, A.M. Шутов, Е.В. Расторгуева // Цитология. - 2010. - №5. - С. 407-411.

9. Саенко, Ю.В. Исследование динамики развития радиационно-индуцированного оксидативного стресса в клетках лейкемии./ Ю.В.Саенко, A.M. Шутов// Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2011. - № 3. - С. 30-42.

10. Саенко, Ю.В. Рентгеновское излучение стимулирует генерацию активных форм кислорода и азота митохондриями клеток лейкоза К562/ Ю.В. Саенко, A.M. Шутов, С.М. Напалкова// Радиационная биология. Радиоэкология. - 2011. - Т51,№6. - С.677-684

111. Саенко, Ю.В. Рентгеновское излучение индуцирует митохондриально-зависимый окси-дативный стресс в клетках лейкимии К562/ Ю.В. Саенко, A.M. Шутов, Т.В. Абакумова, Д.Р. Долгова, О,С. Воронова, М.А. Благовская// Фундаментальные исследования.

- 2012. - №9(2). - С.60-64

12. Саенко Ю.В. Изучение роли митохондрий в процессах развития радиационно-индуцированного оксидативного стресса в клетках лейкемии К562/ Ю.В. Саенко, A.M. Шутов, Б.В.Расторгуева,А.Г. Маслакова //Бюллетень экспериментальной биологии'и медицины. -2012,- Т154,№11.-0.586-590

13. Сравнительное исследование радиационно-индуцированной динамики транскриптома раковых клеток с нормальным и дефектным геном ТР53 /Ю.В. Саенко, В.В. Учай-кин, Р.Т. Сибатов, В.В. Саенко, В.А. Остаточников, Е.В. Кожемякина, О.В. Ляпейко-ва, О.С. Воронова, Д.А. Евсеев, Н.В. Белозеров, С.А. Васильев, О.С. Глущенко, И.В. Живодерников//Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2012-Т4,№4(4)-С. 1107-1013

14. Трасикриптомный анализ дифференциально-экспрессирующихся генов в раковых клетках с мутантным и нормальным геном ТР53 после радиационного воздействия/Б.С. Глущенко, П.В. Белогубов, А.В. Антонова , М.А. Семенова, И.В. Живодерников, В.П. Свеколкин, Д.А. Викторов, А.В. Мастиленко, О.В. Столбовская, Ю.В Саенко// Фундаментальные исследования -2013-№10(2)-С.339-343

15. Bystander normal human fibroblasts reduce damage response in radiation targeted cancer cells through intercellular ROS level modulation./M. Widel, W.M. Przybyszewski, A. Cieslar-Pobuda, Y. V. Saenko, J. Rzeszowska-Wolny // Mutation Research. - 2012. - V731, №1-2.

- P.117-124.

16. Cieslar-Pobuda, A. PARP-1 inhibition induces a late increase in the level of reactive oxygen species in cells after ionizing radiation./А. Cieslar-Pobuda, Y.V. Saenko, J. Rzeszowska-Wolny //Mutation Research. -2012. V732, №3-4.- P.9-15

17. Saenko, К Changes of reactive oxygen and nitrogen species and mitochondrial functioning in human K562 and HL60 cells exposed to ionizing radiation/Y. Saenko, A. Cieslar-Pobuda, M. Skonieczna, J. Rzeszowska-Wolny//Radiation Research.-2013-V180-doi:10.1667/RR3247.1

Коллективная монография.

18. Система перекисное окисление липидов-антиоксиданты в норме и патологии./Под ред. д.б.н., проф. Т.П.Генинг. - Ульяновск: Изд-во "Вектор-С- 2008. - 236 с.

Статьи, изданные в других журналах, сборниках трудов конференций, симпозиумов и конгрессов.

19. Increased levels of reactive oxygen and nitrogen species in cells exposed to ionizing radiation./ A. Cieslar-Poduba, Y. Saenko, M. Skoneczna, J. Rzeszowska-Wolny// European Journal of Cancer. Supplements. - 2012. - V48,№5.-P. S271.

20. Induction of reactive oxygen and nitrogen species at different stages of the cell cycle and after exposure of human K562 and HL60 cells to ionizing radiation. Gajda, M. Skonieczna, A. Cieslar-Pobuda, Y. Saenko, J. Rzeszowska-Wolny

FEBS Journal - 2013,- V280,sl - P - SW03.S13-111

21. PARP-1 dependent DNA damage rapair and formation of reactive oxygen species in response to ionizing radiation./ A.Cieslar-Poduba, Y. Saenko, A. Byczek, J. Rzeszowska-Wolny// European Journal of Cancer. Supplements. - 2010. - V8, №5.-P. S242.

22. Saenko, Yu.V. Protective effect of erythropoethin against doxorubicin induced acute nephrotoxocoty. /Yu.V. Saenko , N.Y. Marder, G.T. Brynskih //Proc. Annual Meeting of International Society of Nephrology «Forefront of nephrology» - Drezden (Germany), 2004-P. 67-68.

23. Saenko, Yu. KRole of DNA-repair pathway in doxorubicine-induced damege /Y.V. Saenko , A.M.Shutov, B.V.Rastorgueva, A.G.Maslakova //13th Gliwice Scientific Mitings - Gliwice (Poland), 2009.- P. 85.

24. Saenko, Yu. V.Oxidative stress induced by ionizing radiation in K562 cells results from mitochondrial dysfunction./Y.V. Saenko , A.Cieslar-Pobuda, W.Przybyszewski, J.Rzeszowska-Wolny //14th Gliwice Scientific Mitings - Gliwice (Poland), 2010.- P. 84.

Подписано в печать 12.11.2013. Формат 60 х 84/16. Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 120 экз. Заказ № 143 /2zS

Отпечатано с оригинал-макета в Издательском центре Ульяновского государственного университета 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Саенко, Юрий Владимирович, Москва

УЛЬЯНОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

05201450114 На правах рукописи

Саенко Юрий Владимирович

Генотип-зависимые механизмы

свободно-радикальных процессов при радиационном и химическом

воздействии.

Специальность 03.01.01- радиобиология

диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук

Научный консультант: д.б.н.. профессор Генинг Т. П.

Москва- 2013

Оглавление

Условные обозначения 6

Введение 9

Глава 1. Обзор литературы 18

1.1 Патофизиология свободно-радикальных процессов..... 18

1.1.1 Характеристика свободных радикалов и процессов свободно-радикального окисления при радиационном и химическом воздействии............. 19

1.1.2 Физиологические источники свободно радикальных молекул.......................... 28

1.1.3 Влияние свободно-радикальных процессов на клеточный метаболизм................... 33

1.2 Роль свободно-радикальных процессов в механизмах клеточной смерти.......................... 37

1.2.1 Роль свободно-радикальных процессов в программируемой клеточной смерти.............. 37

1.2.2 Роль свободно-радикальных процессов в возникновении некроза...................... 45

1.3 Радикально-индуцированные механизмы клеточной смерти в раковых клетках...................... 48

1.3.1 Роль онкогенов и генов супрессоров опухолей в механизмах клеточной смерти неоплазмы........ 51

1.3.2 Радикально-индуцированное повреждение ДНК и

его связь с механизмами клеточной смерти...... 59

Глава 2. Материалы и методы 71

2.1 Объекты исследования..........................................71

2.1.1 Клеточные линии........................................71

2.1.2 Штаммы БаскоготусеБ сегеу1з1ае........................73

2.2 Методы исследования............................................74

2.2.1 Цитохимические методы исследования................74

2.2.2 Морфологические методы исседования................78

2.2.3 Иммуногистохимические методы исследования. ... 78

2.2.4 Биохимические методы исследования..................80

2.2.5 Методы транскрилтомики..............................82

2.2.0 Статистическая обработка..............................83

Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 85

3.1 Динамика развития радиационно и химически-------- индуцированных свободно-радикальных процессов..........85

3.1.1 Динамика накопления активных форм кислорода после радиационного воздействия ....................85

3.1.2 Динамика накопления активных форм азота после радиационного воздействия............................90

3.1.3 Исследование источников активных форм кислорода после радиационного и химического воздействия 96

3.1.4 Влияние индукторов оксидативного стресса на динамику образования активных форм кислорода после радиационного воздействия............102

3.1.5 Влияние ингибиторов полимеразы 1 поли(АДФ- ри-бозы) на радиационно-индуцированную динамику изменения концентрации АФК............113

3.1.6 Влияние оксидативного стресса на внутриклеточную концентрацию глутатиона ............ 116

3.2 Механизмы клеточной смерти под действием радиационно

и химически-индуцированного оксидативного стресса . . . 127

3.2.1 Оценка величины некроза, апоптоза и автофа-гии в зависимости от интенсивности радиационно-индуцированных свободно-радикальных процессов . 127

3.2.2 Исследование механизмов радиационно-индуцированной гибели клеток неоплазмы с

мутированным и нормальным геном ТР53 .....143

3.2.3 Влияние индукторов оксидативного стресса на механизмы радиационно-индуцируемой клеточной

смерти..........................160

3.3 Механизмы повреждения ДНК в условиях оксидативного

стресса различного генеза...................178

3.3.1 Исследование динамики радиационно-индуцированного повреждения ДНК во взаимосвязи с кинетикой развития оксидативного стресса..........................178

3.3.2 Исследование кинетики репарации повреждений ДНК в условиях развития радиационно-индуцированного оксидативного стресса.......197

3.3.3 Сравнительный анализ механизмов репарации ДНК в клетках с нормальным и мутантным геном ТР53 после радиационного воздействия.......205

3.3.4 Влияние ингибиторов полимеразы 1 поли(АДФ-рибозы) на механизмы репарации ДНК в условиях радиационно-индуцированного оксидативного стресса..........................211

3.4 Влияние радиационно- и химически-индуцированных свободно-радикальных процессов на клеточный цикл . . . 220 3.4.1 Изучение связи динамики развития радиационно-

индуцированного оксидативного стресса с распределением клеток по фазам клеточного цикла .... 220

3.5 Изучение роли митохондрий в механизмах развития оксидативного стресса........................231

3.5.1 Влияние радиационно-индуцированного оксидативного стресса на изменение митохондриалы-юго потенциала .........................231

3.5.2 Влияние радиационно-индуцированного оксидативного стресса на изменение митохондриальной массы 238

З.б Исследование влияния свободно-радикальных процессов на профили экспрессии генов и активность внутриклеточных сигнальных механизмов .................247

3.6.1 Исследование активности митоген-активируемых внутриклеточных сигнальных путей АКТ1/2, ЛЫК.

_ ЕГ1К в раковых клетках в условиях оксидативного ■

стресса..........................248

3.6.2 Исследование активности редоксчувствительных сигнальных путей в условиях оксидативного стресса в клетках 51. сегеугвгае................254

3.6.3 Поиск и идентификация генов экспрессия которых зависит от динамики свободно-радикальных процессов ..........................259

Заключение 276

Выводы 287

Литература 290

Условные обозначения

Arro-AI - аполипопротеин Al;

АТФ - аденозинтрифосфат;

АФК - активные формы кислорода;

АФА - активные формы азота;

ГР - глутатион редуктаза

ДОК - доксорубицина гидрохлорид;

ДГЭА - дегидроэпиандостерон;

ДР - двунитевой разрыв цепей ДНК;

МДА -малоновый диальдегид;

НАДН2 - никотинамидадениндинуклеотид восстановлен-

ный;

НАД+ - никотинамидадениндинуклеотид окисленный;

НАДФН2 - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный;

НАДФ+ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат окис-

ленный;

IiXOl - НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктаза1

ПАР - поли(АДФ-рибоз^;

ПАРП-1 - полимераза 1 поли(АДФ- рибозы);

СРО - свободно-радикальное окисление;

СРП - свободно-радикальные процессы;

ТМ - тайл-момент, маркер повреждения ДНК;

AnV - аннексии-V-FITC

Вах - проапоптотический белок семейства Bel;

BER - система эксцизионной репараций ДНК удалени-

ем поврежденных оснований; Bel - семейство белков, участвующих в запуске про-

граммы апоптоза; Вс1-2 - антиапоптотический белок семейства Bel;

Bcl-X^, - антиапоптотический белок семейства Bel;

Cu/Zn-СОД - медь/цинк - содержащая супероксиддисмутаза; С-Мус - прото-онкоген С-Мус;

DCFH-DA - 2,7-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат; DAF-FM - 4-Амино-5-метиламино-2,7-дифлуоресцеин ди-

ацетат;

DIDS - 4,4'-Диизотиоциано-2,2'-

стильбендисульфоновую кислота; ERK1/2 - кииаза регулируемая внеклеточными сигнала-

ми (Extracellular signal-regulated kinase); FOS - протоонкоген FOS;

GDF15 - ростовой фактор дифференциации 15;

GSH - восстановленный глутатион;

GSSG - окисленный глутатион;

GST - глутатион-Б-трансфераза;

JAK - киназа Януса/ (Janus kinase/);

МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа;

MMR - система пострепликационной репарация оши-

бочно спаренных нуклеотидов; NAO - нонил акридиновый оранжевый;

NF-«;B - ядерный фактор транскрипции «:В;

N0 - оксид азота (II);

NU1025 - 8-гидрокси-2-метилкуназолин-4-[ЗН]он (ингиби-

тор ПАРП-1); О2 ~ супероксид-анион радикал;

ОН* - гидроксильный радикал;

PI - пропидиум йодид

р53 - белковый фактор транскрипции р53 (protein 53);

R—00* - пероксильный радикал;

TMRE - STi'moBsq эфир тетрародоминперхлората;

ТР53 - ген супрессора опухолей белка р53;

Тгх^Б) - тиоредоксин окисленный;

Тгх(ЗН2 - тиоредоксин восстановленный;

Введение

Актуальность проблемы

Свободно-радикальные процессы (СРП), выполняющие ряд важных функций в клетках, играют одну из ведущих ролей в патогенезе многих заболеваний [295] . Под свободно-радикальными процессами понимаются все биохимические реакции, протекающие с участием свободно-радикальных молекул. Источниками свободно-радикальных молекул в живых организмах могут быть как внешние воздействия, так и внутренние биохимические процессы [225. 438]. Радиационное облучение и редокс-циклические химические соединения служат основными индукторами свободно-радикальных процессов в живых организмах. К внутренним источникам свободно-радикальных молекул на клеточном уровне относится митохондриальная дыхательная цепь и ряд биохимических процессов, связанных с окислением субстратов [10, 353]. Повышение интенсивности СРП относительно физиологического порога приводит к инициации клеточной гибели. На клеточном уровне существует ряд механизмов, задачей которых служит коррекция внутриклеточной концентрации свободно-радикальных молекул. В случае невозможности поддерживать уровень СРП в нужных рамках включаются другие механизмы, целью которых служит запуск программы апоптоза [430]. СРП могут достичь такой высокой интенсивности, что и запуск программы апоптоза становится невозможным и происходит разрушение клетки по некротическому сценарию. Некроз является нежелательным событием для многоклеточного организма, так как в этом случае возникает воспалительный ответ [242]. Но ещё более опасным является промежуточное состояние, когда запуск апоптоза по каким-то причинам невозможен, а интенсивность

свободно-радикальных процессов недостаточна для некротического разрушения клетки. В этом случае СРП вызывают повреждение ядерной и митохондриальной ДНК и могут стать причиной возникновения мутаций [150]. Повреждение ДНК может быть вызвано непосредственно активными свободными радикалами, возникающими в непосредственной близости от нуклеотидов, что происходит при радиационном облучении, либо при взаимодействии с некоторыми производными свободно-радикальных молекул, среди которых наиболее важной является пероксинитрит. Ведущая роль в генерации пероксинитрита принадлежит митохондриям, которые являются основным источником супероксиданион радикала и оксида азота - предшественников пероксинитрита [50].

Повреждение ДНК может привести к сверхэкспрессии онкогенов или подавлению экспрессии генов супрессоров опухолей, что может являться причиной неспособности клетки запустить программу апоптоза и служить источником канцерогенеза. Особенно нежелательны эти процессы в раковых клетках, так как это может вызвать появление радио- и хи-миорезистентных раковых опухолей, обладающих высокой способность к метастазированию [185]. Среди наиболее распространённых мутаций генов в раковых клетках, блокирующих запуск программы апоптоза, является сверхэкспрессия гена С-Мус и подавление экспрессии гена ТР53. Каждая из этих мутаций найдена более чем в 50 % злокачественных опухолей [286, 250]. Мутации онкогенов и генов супрессоров опухолей не только затрагивают процессы реализации апоптоза, но также оказывают влияние на процессы репарации ДНК и пролиферации [221]. Свободно радикальные процессы связаны с физико-химическими законами и протекают одинаково во всех клетках независимо от их статуса. Но клеточный ответ на активацию свободно-радикальных процессов полностью зависит от особенностей фенотипа и генотипа [225, 151]. Большинство современных методов терапии раковых заболеваний основаны на инициации повреждения ДНК непосредственно либо путем активации

свободно-радикальных процессов в раковых клетках. К ним, в частности, относятся все виды радиотерапии и химиотерапии антрациклино-выми антибиотиками [313]. Считается, что раковые клетки более чувствительны к подобного рода воздействиям, чем нормальные соматические клетки, поскольку обладают высокими темпами пролиферации и, вследствии этой особенности, меньшей способностью к репарации повреждений [222]. Практическое применение методов лечения, основанных на активации свободно-радикальных процессов, демонстрирует неоднозначные результаты [167]. Ряд неопластических образований хорошо поддаются лечению, тогда как другие типы раковых опухолей отвечают на подобное лечение увеличением агрессивности и метастазированием нормальных тканей. Причины такого ответа раковых опухолей на одно и то же воздействия до сих пор остаются до конца не выясненными [253, 57].

Таким образом, радиационно- и химически индуцированные СРП в раковых клетках могут привести к различным исходам, как благоприятным связанным, с инициацией апоптоза, так и негативным, выражающимся в дальнейшем прогрессировании злокачественных новообразований. В то же время данные, отражающие влияния радиационно-и химически индуцированных СРП в раковых клетках на процессы мутагенеза и клеточной смерти с учетом типа мутаций, отсутствуют. Исследование общих закономерностей в механизмах клеточной смерти и мутагенеза раковых клеток, индуцированных свободно-радикальными процессами, следует рассматривать как важный и необходимый этап в решении важной биологической и медицинской проблемы механизмов канцерогенеза и мутагенеза.

Цель исследования

Целью настоящего исследования является изучение свободно-радикальных процессов в раковых клетках нормальных и дефектных

по гену ТР53 и С-Мус при радиационном и химическом воздействии.

Задачи исследования

2. Изучить механизмы клеточной гибели в результате радиационного и сочетанного радиационного и химического воздействия на культуру раковых клеток, дефектных по гену ТР53 и С-Мус.

3. Изучить радиационно-индуцированную динамику повреждения ДНК в раковых клетках, дефектных по гену ТР53 и С-Мус.

4. Исследовать влияние свободно-радикальных процессов на клеточный цикл.

6. Изучить динамику и источники радиационо-индуцированных свободно-радикальных процессов, механизмы клеточной смерти при ингибировании процессов репарации ДНК и блокировании митохон-дриальных пор переменной проницаемости.

Научная новизна исследования

Проведенное исследование позволило выявить влияние генотипа раковых клеток на специфику свободно-радикальных процессов и их роль в механизмах повреждения ДНК и гибели клеток после радиационного воздействия. В рамках данного исследования впервые описана динамика накопления активных форм кислорода и азота в раковых клетках различных по статусу генов ТР53 после однократного радиационного облучения. Установлено, что источниками АФК на разных этапах развития радиационно-индуцированных свободно-радикальных процессов являются различные механизмы. Выявлено, что в клетках с мутантным геном ТР53 источником активных форм кислорода во время второго максимума интенсивности свобордно-радикальных процессов, через 1248 часов после радиационного воздействия, являются митохондрии. Причиной увеличения генерации митохондриями дополнительных количеств АФК в клетках с мутантным геном ТР53 является рост совокупной клеточной митохондриальной массы.

сту внутриклеточной концентрации АФК. Показано, что блокировка клеточного цикла снимается быстрее в клетках мутантных по гену ТР53. Во время блокировки клеточного цикла во всех изученных клеточных линиях зафиксирован рост внутриклеточной концентрации глутатиона.

Анализ профиля экспрессии генов продемонстрировал, что экспрессия гена РОБ повторяет динамику изменения внутриклеточной концентрации АФК в облученных раковых клетках. В ТР53 мутантных с концентрацией АФК связана экспрессия гена 5,который является репрес-сором гена

Основные положения, выносимые на защиту

1. Механизмы

Информация о работе

Саенко, Юрий Владимирович
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.01

Диссертация

Генотип-зависимые механизмы свободно-радикальных процессов при радиационном и химическом воздействии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы