Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Радиозащитные свойства ряда пуриновых соединений

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Радиозащитные свойства ряда пуриновых соединений"

005010893

АСАДУЛЛИНА Нелли Рустамовна

РАДИОЗАЩИТНЫЕ СВОЙСТВА РЯДА ПУРИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ

03.01.01 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степеии кандидата биологических наук

- 1 мь?20'2

Москва 2012

005010893

Работа выполнена в лаборатории изотопных исследований Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Брусков Вадим Иванович

кандидат биологических наук Гудков Сергей Владимирович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Засухина Галина Дмитриевна

доктор биологических наук, профессор Сынзыныс Борис Иванович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биофизики клетки РАН

Защита диссертации состоится 15 марта 2012 года в_часов на заседании

диссертационного совета Д.501.001.65. в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г.Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, ауд._.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Отзывы просим присылать по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологических факультет, Веселовой Т.В. Факс: (495) 939-11-15.

Автореферат диссертации разослан «_» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Т.В. Веселова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поиск и изучение новых природных радиозащитных соединений, способных модифицировать повреждающие эффекты ионизирующего излучения, обусловленные повреждением биологических макромолекул - ДНК, белков, липидов, которые приводят к патологическим последствиям, являются актуальной проблемой. Известно, что повреждения молекул ДНК являются одной из основных причин пострадиационной гибели животных (Ярмоненко, Вайнсон, 2004).

Воздействие ионизирующего излучения на живые организмы может происходить как за счет непосредственного возбуждения и ионизации макромолекул (прямое действие), так и за счет высокореакционных свободных радикалов, которые образуются в результате радиолиза воды - косвенное действие радиации (Кудряшов, 2004). Около 80% радиациошю-индуцированных повреждений в клетке являются результатом косвенного действия радиации (Газиев, 1999). Индуцированные радиацией повреждения ДНК приводят к генетически запрограммированному сигнально-регуляторному запуску сложной системы реакций ответа клетки на повреждения. Она сопряжена с изменением экспрессии многих генов: активацией систем антиоксидантной защиты клетки, систем контроля клеточного цикла пролиферации, репарации ДНК, инициации апоптоза и других процессов (Газиев, 2011). Так как свободные радикалы, образующиеся в результате радиолиза воды и других молекул, из-за их высокой реакционной способности являются короткоживущими продуктами, основное направление в области радиационной защиты было связано с поиском и использованием радиопротекторов - веществ, которые нейтрализуют свободные радикалы при введении их в организм непосредственно перед облучением.

В настоящее время известен и хорошо изучен ряд эффективных радиопротекторов, которые проявляют защитные свойства при введении их незадолго до воздействия радиации. Это существенно ограничивает возможности их практического использования и создаёт необходимость

разработки радиозащитных средств, защищающих организм от повреждающего воздействия ионизирующей радиации при введении их в организм после облучения.

В середине прошлого столетия было обнаружено, что препараты РНК (Detre, Finch, 1958; Лучник, 1958) защищали растения и животных от радиационно-индуцированных повреждений и увеличивали выживаемость облученных животных при введении их как до, так и после облучения. Гидролизаты РНК до уровня мононуклеотидов проявляли аналогичные защитные свойства (Maisin et al., 1959). Позднее было показано, что из всех основных природных рибонуклеозидов, входящих в состав РНК, только инозин и гуанозин обладают ярко выраженными антиоксидантными и радиозащитными свойствами. Причем наиболее эффективные радиозащитные свойства они проявляли при введении их в организм вскоре после облучения (Gudkov et al., 2006; Gudkov et al., 2009). В связи с этим изучение радиозащитных свойств ряда природных пуриновых соединений, а также механизмов их действия, представленные в данной работе, актуально и связано с потенциальной возможностью использования полученных результатов в практических медицинских целях.

Цель исследования: изучить антиоксидантные и радиозащитные свойства природных пуриновых соединений: ксантозина (Хао), кофеина (1,3,7-триметилксантин, Caf), инозин-5'-монофосфата (IMP) и гуанозин-5'-монофосфата (GMP).

Задачи исследования:

1. Исследовать антиоксидантные свойства данных пуриновых соединений.

2. Изучить их влияние на радиационно-индуцированное образование повреждений ДНК in vitro и in vivo.

3. Определить радиозащитные свойства этих пуриновых соединений и исследовать возможные механизмы их защитного действия.

Научная новизна исследования: Впервые установлено, что пуриновые соединения: Хао, Caf, IMP и GMP проявляют существенные антиоксидантные

2

свойства, значительно уменьшая радиационно-индуцированный выход перекиси водорода и гидроксильных радикалов в водных растворах и образование 8-оксогуапина (7,8-дигидро-8-оксо1уанина, 8-ОГ) в ДНК иод действием рентгеновского излучения in vitro. В работе впервые показано, что исследуемые пуриновые соединения проявляют выраженные радиозащитные свойства, увеличивая выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении их после радиационного воздействия в летальной дозе 7 Гр. Показано, что фактор изменения дозы (ФИД) для этих пуриновых соединений равен примерно 1,2. В работе установлено, что введение этих пуриновых соединений стимулирует процессы кроветворения, увеличивая количество лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови облученных животных и нормализуя гемопоэз в пострадиационный период. Установлено, что исследуемые соединения стимулируют ускоренное пострадиационное восстановление повреждений ДНК при введении их как до, так и в существенно большей степени после облучения мышей. Они уменьшают процентное содержание полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ), содержащих микроядра (МЯ), в костном мозге животных и уровень деградации ДНК в клетках тимуса мышей, подвергнутых воздействию рентгеновского излучения. Впервые установлено, что данные пуриновые соединения в системе in vitro нейтрализуют долгоживущие активные формы бычьего сывороточного альбумина.

Научио-практнчсская ценность работы: Впервые установлено, что исследуемые пуриновые соединения проявляют антиоксидантные свойства in vitro и in vivo и могут быть использованы как биологически активные добавки, препятствующие патологическим последствиям окислительного стресса. Впервые показано, что исследуемые пуриновые соединения проявляют радиозащитные свойства при введении их животным вскоре после воздействия рентгеновского излучения. Таким образом, данные пуриновые соединения могут рассматриваться как потенциально перспективные профилактические и терапевтические средства для уменьшения патологических эффектов, индуцированных воздействием ионизирующего излучения на организм млекопитающих и человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Пуриновые соединения: Хао, Caf, IMP и GMP в системе in vitro проявляют антиоксидантные свойства.

2. Данные пуриновые соединения проявляют радиозащитные свойства in vivo: увеличивают выживаемость облученных животных, стимулируют кроветворение у облученных мышей в пострадиационный период и пострадиационное восстановление повреждений ДНК при введении пуриновых соединений мышам как до, так и после облучения.

3. Обоснование возможных механизмов действия исследованных пуриновых соединений и применения их как потенциально перспективных профилактических и терапевтических радиозащитных средств.

Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на 10 международных и 9 российских конференциях: XI и XII Межд. научно-практическая конференция «Человек и космос» (Днепропетровск 2009, 2010), 14 и 15-я Межд. школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино 2010, 2011), IX Межд. симпозиум «Биологические механизмы старения» (Харьков 2010), VIII Межд. конференция «Биоантиоксидант» (Москва 2010), 38th Annual Meeting of the European Research Society (Stockholm 2010), III Всероссийской конгресс с межд. участием «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород 2010), XVIII Межд.научная конференция «Ломоносов-2011» (Москва 2011), конференция с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург 2011), 38-я научной конференция студентов (Самара 2007), 34 Самарская областная студенческая научная конференция (Самара 2008), конференция «90-летие создания Института биофизики в России (Пущино 2009), конференция «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Москва 2009), «VIII и IX Конференция молодых ученых, специалистов и студентов» посвященная Дню космонавтики (Москва 2009, 2010), конференция «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино 2010), III Евразийский конгресс по

медицинской физике «Медицинская физика 2010» (Москва 2010), VI Съезд по радиационным исследованиям (Москва 2010).

Публикации: По теме диссертации опубликовало 25 печатных работ, в том числе 5 статей в рецензируемых журналах, из которых 4 статьи в изданиях рекомендованных ВАК, и 20 статей в сборниках и в тезисах научных конференций.

Структура и объем диссертации: диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, заключения, экспериментального исследования (материалов и методов исследования), результатов исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов, списка используемых сокращений и обозначений, списка цитируемой литературы (316 источников). Работа иллюстрирована 16 рисунками и содержит 10 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Экспериментальные исследования выполнены на 6-ти недельных самцах белых мышей аутбредной линий SHK массой 18-22 г. Животных содержали в стандартных услониях вивария ИТЭБ РАН не более чем по 10 мышей в клетке. Работа с животными проводилась согласно рекомендациям Комиссии по биоэтике ИТЭБ РАН.

Пуриновые соединения. В работе использовали Хао, Caf, IMP и GMP (Sigma, США) в концентрациях 0,02, 0,05, 0,1, 1 мМ в 1 мМ фосфатном буфере рН=7,4 для экспсриментоз in vitro и в концентрации 5 мМ в 0,14 М растворе NaCl для экспериментов in vivo. Мышам пуриновые соединения вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 45 мг/кг.

Воздействие ионизирующего излучения. Облучение проводили на рентгеновской терапевтической установке РУТ-15 (Мосрентген, Россия). Животных и водные растворы облучали при мощности 1 Гр/мин (фокусное расстояние 37,5 см, ток 20 мА, напряжением 200 кВ), раствор ДНК при мощности 4,5 Гр/мин (фокусное расстояние 19,5 см, ток 20 мА, напряжение 200 кВ).

Определение концентрации перекиси водорода в водных растворах..

Использовали высокочувствительный метод усиленной хемилюмииесценции в системе люминол-4-йодофенол-пероксидаза хрена (Брусков и др., 2001). Пуриновые соединения (0,02-1мМ) добавляли в раствор непосредственно перед облучением. Регистрацию величины хемилюмииесценции осуществляли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика "Бета-Г' (СССР), работающего в режиме счета одиночных фотонов.

Определение продукции гидроксильных радикалов. Определение концентрации гидроксильных радикалов осуществляли с помощью их реакции с кумарин-3-карбоновой кислотой (ККК), продукт гидроксилирования которой - 7-ОН-ККК - является удобным флуоресцентным зондом для определения образования этих радикалов (Черников, Брусков, 2002). Пуриновые соединения (0,02-1мМ) добавляли в раствор ККК непосредственно перед облучением. Интенсивность флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре SFM 25А ("Kontron Instruments", Италия) при = 400 нм, Хеш = 450 им в зеркальной кварцевой кювете при комнатной температуре (Gudkov et al., 2009).

Иммуноферментный аналш по определению содержания 8-оксогуанина в ДИК. Для количественного определения 8-оксогуанина в ДНК использовали иммуноферментный анализ с применением моноклональных антител, специфичных к 8-ОГ. Экспериментальные процедуры подробно описаны ранее (Брусков и др., 1999, Bruskov et al., 2002).

Микроядерный тест. Величину цитогенетических повреждений в клетках костного мозга мышей определяли по появлению ПХЭ, содержащих МЯ. Мышей умерщвляли методом цервикалыюй дислокации через 28 ч после облучения. Гистологические препараты готовили и окрашивали по стандартной методике с модификациями, связанными с растворением клеточного материала. Подсчет ПХЭ, содержащих МЯ, осуществляли с помощью светового микроскопа с иммерсионным объективом при увеличении хЮОО (Карп и др., 2010).

Тест на выживаемость. Выживаемость мышей после воздействия рентгеновского излучения определяли ежедневно в течение 30 сут. Пуриновые

6

соединения (5 мМ) вводили внутрибрюшинно мышам по 0,5 мл за 15 мин до облучения или через 15 мин, 3, 5 или 8 ч после облучения. Контролем служили две группы мышей, инъецированные изотоническим раствором NaCI и облученные в той же дозе или не подвергавшиеся облучению.

Подсчет форменных элементов крови. В группе из 10 животных у пяти, отобранных случайным образом, было подсчитано количество форменных элементов периферической крови, а затем эти результаты были усреднены. В конце эксперимента, если число выживших мышей в группе было меньше пяти, кровь для подсчета забиралась у всех оставшихся животных. Образцы периферической крови брались из хвостовой вены. Все экспериментальные процедуры подробно описаны ранее (Gudkov et al., 2009).

Проточная цитофлуориметрия. Мышей умерщвляли методом цервикачьной дислокации через 22 ч после облучения. Клетки тимуса выделяли, охлаждая их на льду, и помещали в раствор для выделения. Далее все процедуры осуществляли в соответствии с протоколом Ormerod (2000). Измерение проводили на цитофлуориметре Partee PAS III (Германия).

Измерение индуцированной рентгеновским излучением хемилюминесценцин белковых растворов. Данный метод позволяет определить количество образующийся в растворе долгоживущих активных форм белка. Измерение индуцированной хемилюминесценцин раствора БСА проводили с помощью хемилюминометра Биотоке 7А-М (Россия). БСА (0,1%) растворяли в 20 мМ Трис-HCl буфере, рН 8,0. Пуриновые соединения добавляли к раствору белка через 1 ч после облучения в конечной концентрации ОД мМ.

Статистический анализ. Средние значение и величина стандартной ошибки были рассчитаны для большинства результатов. Средние значения в экспериментальных группах сравнивали с контрольной группой, используя «U» критерий теста Маниа-Уитни или непарный /-критерий Стыодента. В экспериментах на выживание различия между группами сравнивались по точному критерию Фишера. При р < 0,05 разница считалась статистически значимой.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние пуриновых соединений на радиационно-химический выход АФК в водных растворах и образование 8-оксогуанина в ДНК, индуцированные рентгеновским излучением in vitro.

Влияние Хао, Caf, IMP и GMP (0,02-1 мМ) на радиационно-химический выход перекиси водорода при воздействии рентгеновского излучения в дозе 7 Гр представлено на рис. 1. Все исследуемые пуриновые соединения уменьшали выход перекиси водорода, в концентрации соединений 1 мМ на 50-75% относительно контроля. Антиоксидантные свойства исследуемых соединений в концентрации 1 мМ уменьшаются в ряду: Хао > GMP > IMP > Caf.

z

Рис. 1. Влияние Хао, Caf,

вша контроль 7 Гр IMP и GMP (0.02-1 м\1) на

генерацию перекиси

водорода в водном растворе

при

действии

рентгеновского излучения (7 Гр) (М ± ш, п=3, *- р < 0,05). Значения концентраций

представлены

в

? 0.1 о

логарифмическом масштабе.

0,02 0,05 0,1

Концентрация соединений, мМ

У

Рис. 2. Влияние Хао, Caf, IMP и GMP (0,02-1мМ) на генерацию гидроксильных радикалов в фосфатном буфере (20 мМ, рН=6,8) при действии рентгеновского излучения (7 Гр) (М ± ш, n=3, *- р < 0,05). Значения концентраций представлены в логарифмическом

х

—т— IMP -a- Caf

0,02 0,05 0,1

Концентрация соединений, мМ

масштабе.

Исследовано влияние пуриновых соединений (0.02-1 мМ) на радиационно-индуцироваиный (7 Гр) выход гидроксильных радикалов (рис. 2). Все исследуемые пуриновые соединения уменьшают образование гидроксильных радикалов на 55-80% относительно контроля, причем защитные свойства уменьшаются в ряду (в концентрации 1 мМ): Caf > IMP = GMP > Хао.

Рис. 3. Влияние Хао, Caf, IMP и GMP (0,02-1мМ) на образование 8-оксогуанина в ДНК in vitro при действии рентгеновского излучения (7 Гр) (М ± m, n=6, *- р < 0,05). Значения концентраций представлены в

логарифмическом масштабе.

Методом неконкурентного иммуноферментного анализа исследовано влияние Хао, Caf, IMP и GMP в диапазоне концентраций 0,02-1 мМ на образование 8-оксогуанина в ДНК спермы лосося, индуцированное воздействием рентгеновского излучения в дозе 7 Гр, in vitro. Полученные данные представлены на рис. 3. Количество 8-оксогуанина, образовавшегося в ДНК под воздействием рентгеновского облучения, линейно зависит от дозы. Все исследуемые соединения существенно уменьшают образование 8-оксогуанина в ДНК в концентрации 1 мМ на 50-85%, защитные свойства снижаются в ряду: Caf > IMP > Хао > GMP.

Таким образом, показано, что ксантозин, кофеин, IMP и GMP проявляют существенные антиоксидантные свойства, уменьшая радиационно-индуцированный выход таких АФК, как перекиси водорода и гидроксильных радикалов в водных растворах, а также образование 8-оксогуанина в ДНК in vitro. Антиоксидантные свойства исследуемых пуриновых соединений могут проявляться за счет их низкого окислительно-восстановительного потенциала

0,02 0,05 0,1

Концентрация соединений, мМ

(Faraggi et al., 1996; Pan et al., 2001; Kim ct al., 2000), благодаря чему они могут легко окисляться в присутствии свободных радикалов, образуемых в процессе радиолиза воды.

2. Влияние ксантозина, кофеина, IMP и GMP при введении до воздействия облучения на образование повреждений ДНК in vivo.

Поскольку Хао, Caf, IMP и GMP проявляют антиоксидантные свойства in vitro (рис. 1, 2, 3), можно предположить, что исследуемые пуриновые соединения способны проявлять антиоксидантные свойства in vivo. Для проверки данного предположения с помощью микроядерного теста исследовано влияние Хао, Caf, IMP и GMP на процентное содержание ПХЭ с МЯ в красном костном мозге мышей при их внутрибрюшинном введении за 15 мин до облучения в дозе 1,5 Гр. Полученные результаты представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Влияние пуриновых соединений при внутрибрюшинном введении (~ 45 мг/кг) за 15 мин до воздействия рентгеновского облучения в дозе 1,5 Гр ка процентное содержание ПХЭ с МЯ в костного мозга мышей. (М ± m, *- р < 0,05).

Воздействие Количество животных Количество ПХЭ Количество ПХЭ сМЯ ПХЭ с МЯ, %

Контроль 0 Гр 5 10188 54 0,53 ± 0,06*

Контроль 1,5 Гр 5 10532 513 4,88 ± 0,41

Хао + 1,5 Гр 5 10312 372 3,61 ±0,31*

Caf + 1,5 Гр 5 10398 372 3,58 ± 0,12*

IMP +1,5 Гр 5 10055 171 1,71 ±0,09*

GMP + 1,5 Гр 5 10306 358 3,48 ± 0,25*

После облучения животных процент ПХЭ с МЯ увеличился в ~ 9 раз от 0,53%, при отсутствии воздействия до 4,88% при 1,5 Гр. При введении пуриновых соединений интактным животным не наблюдалось достоверного изменения процента ПХЭ с МЯ. При введении пуриновых соединений животным до облучения процент ПХЭ, содержащих МЯ, уменьшается на

10

30-60% по сравнению с облученным контролем. Защитные свойства пуриновых соединений уменьшаются к ряду IMP > GMP > Caf > Хао. Появление таких радиационно-индуцировашшх повреждений, как МЯ, отражает образование разрывов ДНК активными формами кислорода и дефектов их репарации (Ярмоненко, Вайнсон, 2004). Вероятно, что исследуемые пуриновыс соединения уменьшают образование повреждений ДНК при введении их до облучения за счет своих антиоксидантных свойств.

3. Влияние пуриновых соединений на выживаемость облученных животных.

7Гр

Хао + 7 Гр 7 Гр + Хао

Время после облучения, сут

А

5 10 1 5 20 25

Время после облучения, сут

100

£

80

S

Б

о 60

I

V

га

в 40

X

к

CQ 20

0

• -- 7Гр - о- Caf + 7 Гр Т" 7Tp + Caf

р<о. Ml тттт*тт»»тттттттт

о S

0

8 40 £

1

3 20 m

Время после облучения, сут

Б

7Гр

GMP + 7 Гр 7 Гр + GMP

Р < О, 001

тттттттттттттттттттт

'-ООО

5 10 15 20 25

Время после облучения, сут

в Г

Рис. 4. Влияние Хао (A), Caf (Б), IMP (В) и GMP (Г) (-45 мг/кг) на выживаемость мышей при внутрибрюшшшом введении до или после воздействия рентгеновского излучения в дозе 7 Гр. Каждая экспериментальная группа состояла из 30-90 мышей.

Исследовано влияние Хао, Caf, IMP и GMP на выживаемость мышей при внутрибрюшинном однократном введении их за 15 мин до или после воздействия рентгеновского излучения в летальной дозе 7 Гр (рис. 4). В группе контрольных облученных мышей, которым вводили изотонический раствор, средняя продолжительность жизни составила 6 сут, а максимальное время дожития 13 сут. Введение пуриновых соединений до воздействия облучения в летальной дозе не оказало существенного защитного эффекта. Так средняя продолжительность жизни мышей составила 10 сут, а максимальное время дожития в среднем составило 15 сут. Существенный радиозащитный эффект наблюдается при введении пуриновых соединений после облучения. В этом случае при введении Хао (A), Caf (Б), GMP (В) и IMP (Г) приблизительно 30%, 45%, 50% и 35% животных оставались живыми в течение 30 сут после облучения, соответственно, при 100% гибели в контрольной группе облученных животных. Выживаемость животных уменьшается при введении пуриновых соединений в ряду: IMP > Caf > GMP > Хао.

100

„ 80 Л

Б

% 60

V га ей

S 40 *

3

Сй 20

: Ы

I Ччз

La 1-! ! -г

- • - 7 Гр

—о..... 7 Гр + IMP через 15 мин

7 Гр + IMP через 3 ч -д- 7 Гр + IMP через 5 ч -а— 7 Гр + IMP через 8 ч

То

-»-•■♦оооооооооо-оосю '■»т

^ '-т

•-А

5 10 15 20 25 Время после облучения, сут

Рис. 5. Влияние IMP (~ 45 мг/кг) на выживаемость мышей при

внутрибрюшинном введении через 15 мин, 3, 5 или 8 ч после воздействия рентгеновского излучения в дозе 7 Гр. Каждая экспериментальная группа состояла из 20-90 мышей.

Исследована зависимость защитного эффекта от времени введения пуриновых соединений мышам (через 15 мин, 3, 5 или 8 ч). Показано, что наибольший радиозащитный эффект наблюдается при введении IMP через 15 мин после облучения (рис. 5). Данные представлены только для IMP, поскольку для этого соединения наблюдалась максимальная выживаемость

облученных животных и для Хао, Caí, GMP наблюдалась сходная зависимость защитного эффекта от времени введения пуриновых соединений животным.

Исследована зависимость защитного эффекта от вводимой концентрации соединений (15, 45, 90 мг/кг). В дополнительных экспериментах было показано, что при увеличении концентрации пуриновых соединений от 15 до 45 мг/кг защитный эффект увеличивается, при увеличении концентрации до 90 мг/кг не наблюдалось дальнейшего достоверного увеличения радиозащитного эффекта.

901 8070, 605040 30" , 20

105 -

• Контроль О Хао

6 6.5 7 Доза, Гр

10

6 6.S 7 Доза, Гр

90

80 70 ■ 60 50 40 30

о

X

£ и

5

10

• Контроль О IMP

5 6 6.5 7 8

Доза, Гр

В г

Рис. 6. Влияние Хао (A), Caf (Б), IMP (В) и GMP (Г) (~ 45 мг/кг) на выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении через 15 мин после облучения. График представлен в координатах доза - смертность пробит. На каждую точку на графике приходилось не менее 20 мышей.

Кроме того, концентрация пуриновых соединений 45 мг/кг, применяемая в работе, превышает внутриклеточную и сывороточную концентрации в ~ 20 раз и не является токсичной для мышей (Traut, 1994; Lecka et al., 2010; Sigma

Aldrich MSDS, 2011; Lewis, 1989). В связи с этим в данной работе использовалась концентрация исследуемых соединений 45 мг/кг.

Для определения фактора изменения дозы, исследована зависимость защитного эффекта пуриновых соединений от дозы излучения в диапазоне доз 5-8 Гр для 30-тидневного теста на выживаемость мышей (рис. 6). Для мышей, которым вводили изотонический раствор через 15 мин после облучения, ЛДзо/зо (ЛД5о/зо - Дозы вызывающие 50% смертность в течение 30 сут) составила 5,8 Гр. После введения Хао (A), Caf (Б), IMP (В) и GMP (Г) ИД5о/зо увеличился до 6,7, 6,9, 7,1 и 6,8 Гр, соответственно. Фактор изменения дозы, который рассчитывается как отношение ЛД50/30 доз в присутствии и в отсутствие радиозащитного соединения - составляет для исследуемых пуриновых соединений 1,22-IMP, 1,20-Caf, 1,17-GMP, 1,16-Хао.

4. Возможные механизмы радиозащитного действия пуриновых соединений при введении их после воздействия рентгеновского излучения.

Радиозащитный эффект пуриновых соединений может быть связан с возможностью влияния на процессы пострадиационного восстановления критических (наиболее радиочувствительных) органов и тканей, репарацию лучевых повреждений, а также на нейтрализацию долгоживущих активных форм белка, которые способны генерировать вторичные АФК в течение длительного времени после облучения in vivo.

с

Рис. 7. Влияние Хао, Caf, IMP и GMP при

внутрибрюшинном

введении (~ 45 мг/кг) через 15 мин после воздействия рентгеновского облучения в дозе 7 Гр на количество

лейкоцитов

в

о

5 10 15 20 25 30

Время после облучения, сут

периферической крови мышей. Каждая точка состояла из 2-10 животных (М ± ш, *- р < 0,05). Ось ординат представлена в логарифмическом масштабе.

Известно, что в диапазоне доз от 3-4 до 10 Гр критическими системами, нарушение которых определяет летальный исход мышей, при действии радиации - являются системы кроветворения и пищеварения. Поскольку в течение экспериментов на выживаемость у подавляющего большинства животных отсутствовали признаки диареи, то было предположено, что смерть мышей наступает в результате костномозгового синдрома. Результаты, полученные при проведении некропсии, подтвердили данное предположение.

Исследовано влияние Хао, Caf, IMP и GMP на количество лейкоцитов в периферической крови мышей, при введении после воздействия рентгеновского излучения (рис. 7). Количество лейкоцитов в группе необлученных животных практически не изменялось на всем протяжении эксперимента. Во всех группах облученных животных регистрировалось уменьшение количества лейкоцитов вплоть до 8 сут. В контрольной группе животных количество лейкоцитов уменьшалось более чем на -90%, относительно интактных мышей, и существенно не увеличилось вплоть до смерти. В группах с введением пуриновых соединений количество лейкоцитов, начиная с 11 сут эксперимента начало увеличиваться и к 30-м сут эксперимента составило 65-80% по отношению к необлученному контролю.

с

Рис. 8. Влияние Хао, Caf, IMP и GMP при внутрибрюшинном введении (~ 45 мг/кг) через 15 мин

после

воздействия

рентгеновского облучения в дозе 7 Гр на количество

гранулоцитов периферической мышей. Каждая

в

крови точка

о

5 10 1S 20 25 30

Время после облучения, сут

состояла из 2-10 животных (М ± m, *- р < 0,05).

Исследовано влияние пуриновых соединений при внутрибрюшинном введении на количество гранулоцитов в периферической крови облученных мышей (рис. 8). Количество гранулоцитов в группе неполученных животных практически не изменялось на всем протяжении эксперимента. Изменение количества гранулоцитов в группах облученных животных схоже с изменением количества лейкоцитов. В группе облученного контроля количество гранулоцитов уменьшилось на ~ 95% относительно необлученного контроля и не изменилось вплоть до смерти мышей. В группе животных, которым вводились Хао, Caf, IMP и GMP количество гранулоцитов с 11 сут начало постепенно увеличиваться и составило к 30-м сут 70-90% по отношению к необлученному контролю.

Тромбопения, индуцированная радиацией, играет значительную роль в нарушении прочности капилляров и возникновении кровотечений, что способствует проникновению бактерий в кровь и развитию инфекции (Кудряшов, 2004). Влияние пуриновых соединений при внутрибрюшинном введении после воздействия рентгеновского излучения на количество тромбоцитов в периферической крови мышей представлено на рис. 9.

Рис. 9. Влияние Хао; Caf, IMP и GMP при внутрибрюшинном введении (~ 45 мг/кг) через 15 мин после воздействия

рентгеновского облучения в дозе 7 Гр на количество тромбоцитов в

периферической крови

мышей. Каждая точка состояла из 2-10 животных

О 5 10 15 20 25 30 (М ± Ш, *-р < 0,05).

Время после облучения, сут

В группе необлучснных животных количество тромбоцитов практически не

изменялось на всем протяжении эксперимента. В группе облученных

16

контрольных животных количество тромбоцитов к 8-м сут снизилось на ~ 80% относительно количества тромбоцитов в периферической крови шггактных мышей и не увеличилось до смерти животных. В группе животных, получивших Хао, Caf, IMP и GMP после облучения, количество тромбоцитов к 30-м сут составляло 70-85% по сравнению с необлученным контролем.

Период наибольшей лейкопении и тромбоцитопении у контрольных облученных мышей приходится на 8-13 сут, что коррелирует с максимумом летальности животных в этот период.

Известно, что основными причинами гибели клеток при воздействии ионизирующего излучения являются необратимые повреждения молекулы ДНК. Так образование МЯ является основным биомаркером двунитевых разрывов цепи ДНК (Газиев, 1999). В связи с этим с помощью микроядерного теста исследовано влияние ксантозина, кофеина, IMP и GMP на процентное содержание ПХЭ с МЯ в красном костном мозге мышей при их внутрибрюшинном введении через 15 мин после облучения (1,5 Гр).

Таблица 2. Влияние Хао, Caf, IMP и GMP при внутрибрюшинном введения (-45 мг/кг) через 15 мин после воздействия рентгеновского облучения в дозе 1,5 Гр на процентное содержание ПХЭ с МЯ в костного мозга мышей. (М ± т, *- р < 0,05).

Воздействие Количество животных Количество ПХЭ Количество ПХЭ с МЯ ПХЭ с МЯ, %

Контроль 0 Гр 5 10188 54 0,53 ± 0,06*

Контроль 1,5 Гр 5 10532 513 4,88 ±0,41

1,5 Гр + Хао 5 10312 319 3,10 ±0,30*

l,5Tp + Caf 5 j 10398 252 2,43 ±0,12*

1,5 Гр + IMP 5 10055 149 1,48 ±0,09*

1,5 Гр + GMP 5 10306 263 2,56 ± 0,25*

Полученные результаты представлены в Таблице 2. Показано, что после облучения животных в дозе 1,5 Гр процент ПХЭ с МЯ увеличился в ~ 9 раз после воздействия рентгеновского излучения. При введении исследуемых

соединений необлученным животным не наблюдается достоверного изменения процента ПХЭ с МЯ. При введении Хао, Caf, IMP и GMP животным после воздействия ионизирующего излучения процентное содержание ПХЭ с МЯ уменьшилось на -40-70% относительно облученного контроля. Радиозащитные свойства пуриновых соединений уменьшаются в ряду: IMP > Caf > GMP > Хао.

Известно, что в результате действия облучения, помимо образования хромосомных аберраций и микроядер, происходит деградация ДНК (Umansky S. et al., 1982). С помощью метода проточной цитофлуориметрии (Ormerod, 2000) исследовало влияние пуриновых соединений при внутрибрюшинном введении после облучения на степень деградации ДНК в клетках тимуса мышей (рис. 10).

Рис. 10. Влияние Хао, Caf, IMP и GMP при внутрибрюшинном введении (~ 45 мг/кг) через 15 мин после воздействия

рентгеновского облучения в дозе 7 Гр на степень деградации ДНК в клетках тимуса мышей. Каждая группа состояла из 4-7 животных (М ± m, n=3, *- р <0,05).

Внутрибрюшинное введение исследуемых соединений необлученным животным не оказало существенного эффекта на уровень поврежденное™ ДНК в клетках тимуса. В контрольной группе облученных животных процент деградированной ДНК в клетках увеличился более чем в 6 раз. При введении пуриновых соединений процент деградации ДНК уменьшается на 20-35% относительно группы облученных контрольных животных. В результате эффект пуриновых соединений уменьшается в ряду Хао > IMP > GMP > Caf.

Помимо короткоживущих АФК, индуцируемых ионизирующим

излучением, в клетках и в растворах различных белков образуются

18

долгоживущие активные формы белков (ДАФБ) (главным образом в виде нероксильиых радикалов и гидропероксидов) (Kumagai, 2003; Гудков и др., 2007).

Рис. 11. Влияние ксантозина, кофеина, IMP и GMP в концентрации 0,1 мМ на нейтрализацию

долгоживущих активных форм бычьего сывоточного альбумина в течение 3,5 ч после облучения в дозе 7 Гр. Фоновые значения

хемилюминесценции вычтены из полученных 0,0 0,5 1,5 2,5 3,5 результатов (М ± ш, п=4, *-

Время после облучения,ч Р < 0,05).

Эти активные формы белков, как было показано недавно, способны продлять окислительный стресс в организме млекопитающих путем генерации активных форм кислорода АФК ('02, Н02", Н202 и ОН") в течение длительного (до ~ 5 ч) времени (Гудков и др., 2010). Исследовано влияние Хао, Caf, IMP и GMP (0,1 мМ) на нейтрализацию долгоживущих активных форм белков, индуцированных воздействием рентгеновского излучения. Полученные данные представлены на рис. 11. Показано, что уже через 30 мин после добавления пуриновых соединений наблюдается снижение уровня долгоживущих активных белковых форм. Так через 3,5 ч инкубации пуриновые соединения уменьшали количество долгоживущих активных форм БСА на 30-75% относительно контроля. Таким образом, антиоксидантные свойства уменьшаются к ряду Хао > Caf > GMP > IMP.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из механизмов радиозащитного действия исследованных пуриновых соединений при введении их в организм млекопитающих вскоре после воздействия рентгеновского облучения может быть нейтрализация

долгоживущих активных форм белков, индуцируемых ионизирующим излучением. Эти активные формы белков, как было показано недавно (Гудков и др., 2010), способны продлять окислительный стресс в организме млекопитающих путем генерации активных форм кислорода в течение длительного времени. Нейтрализация этого процесса за счет антиоксидантных свойств данных пуриновых соединений может быть эффективным способом противодействия развитию окислительного стресса. При этом не исключаются и другие возможные механизмы: комплексное системное воздействие этих соединений на процессы, связанные с сигнально-регуляторной ролью АФК в клетках, воздействие пуриновых соединений на некоторые пуриновые рецепторы, включение клеточных механизмов антиоксидантной защиты и репарационных процессов.

Важно подчеркнуть, что радиозащитный эффект достигается даже при однократном введении этих соединений. Не исключено, что еще более выраженные радиозащитные свойства могут быть достигнуты путем неоднократного дополнительного введения этих соединений в организм после воздействия облучения. Таким образом, данные пуриновые соединения могут рассматриваться как потенциально перспективные профилактические и терапевтические средства для устранения рисков патологического воздействия ионизирующего излучения на организм млекопитающих и человека. В настоящее время разработка и использование таких средств весьма актуальны в связи с необходимостью защиты населения в случае угрозы осуществления радиационного терроризма и возникновения радиационных аварий.

ВЫВОДЫ

1. Пуриновые соединения: ксантозин, кофеин, IMP и GMP в диапазоне концентраций 0,02-1 мМ проявляют антиоксидантные свойства in vitro. Они существенно уменьшают образование перекиси водорода и гидроксильных радикалов, индуцированное рентгеновским излучением в водных растворах, и предотвращают образование 8-оксогуанина -основного биомаркера окислительных повреждений в ДНК. Ксантозин,

кофеин, IMP я GMP в системе in vitro нейтрализуют долгоживущие активные формы бычьего сывороточного альбумина.

2. Исследуемые пуриновые соединения проявляют выраженные радиозащитные свойства, увеличивая выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении после радиационного воздействия в летальной дозе 7 Гр. Фактор изменения дозы при таком введении составляет величину 1,2. Введение этих пуриновых соединений стимулирует процессы кроветворения, увеличивая количество лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови облученных животных в пострадиационный период.

3. Исследуемые соединения стимулируют пострадиационное восстановление повреждений ДНК при введении их как до, так и, что более существенно, после облучения, уменьшая процентное содержание ПХЭ с МЯ в костном мозге и деградацию ДНК в клетках тимуса мышей, подвергнутых радиационному воздействию.

4. Данные пуриновые соединения можно рассматривать как потенциально перспективные профилактические и терапевтические средства для уменьшения рисков патологического воздействия ионизирующего излучения на организм млекопитающих и человека.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Gudkov S., Karp О., Shtarkman I., Asadullina N., Garmash S., Andrievsky G., Nedzvetsky V., Tykhomyrov A. DNA-protective and radioprotective effects of hydrated C^ fùilerene // Physics of the Alive. 2009. Vol. 17, p.82-88.

2. Asadullina N.R., Usacheva A.M., Smirnova V.S., Gudkov S.V. Antioxidative and radiation modulating properties of guanosine 5'-monophosphate // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2010. Vol. 29(10), p. 786-799.

3. Асадуллина H.P., Гудков C.B., Брусков В.И. Антиоксидантные свойства ксантозина при воздействии рентгеновского излучения // Фундаментальные исследования. 2011. №10 (1), с. 22-25.

4. Асадуллина Н.Р., Гудков C.B., Брусков В.И. Кофеин модифицирует эффекты рентгеновского излучения при воздействии на мышей после облучения, прояатяя радиозащитные свойства // Доклады РАН. 2012. Т. 442, №3, с. 405-408.

5. Гудков C.B., Штаркман И.Н., Карп О.Э., Ассадулина Н.Р., Гармані С.А., Черников A.B., Брусков В.И. Использование рибоксина (инозина) после рентгеновского облучения для защиты клеток крови мышей // Нижегородский медицинский журнал. 2008. №4, с. 18-24.

6. Гудков C.B., Асадуллина Н.Р., Карп О.Э., Гармаш С.А., Штаркман И.Н., Брусков В.И. Антиоксидантные и радиозащитные свойства некоторых пуриновых соединений // Вестник Российской военно-медицинской академии (приложение 1). 2008. № 3, с. 211.

7. Асадуллина Н.Р. Антиоксидантные свойства гуанозина, инозина, ксантозина и гуанозинмонофосфата // Тезисы тридцать восьмой научной конференции студентов, Самара, 2007, с. 67.

8. Асадуллина Н.Р. Гуанозин, инозин, ксантозин и гуанозинмонофосфат как природные антиоксиданты и радиопротекторы // Тезисы докладов XXXIV Самарской областной студенческой научной конференции. 4.1, Самара, 2008, с. 151.

9. Асадуллина Н.Р. Антиоксидантные и радиозащитные свойства гуанозин-5'-монофосфата // Тезисы конференции «90-летие создания Института биофизики в России». Пущино, 2009, с. 13.

Ю.Асадуллина Н.Р. Антирадикальные и радиозащитные свойства гуанозин-5'-монофосфата // Тезисы конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина», Москва, 2009, с. 24.

11.Асадуллина Н.Р., Гудков C.B., Брусков В.И.. Гуанозин-5'-монофосфат уменьшает тяжесть радиационной лейко- и тромбопении и увеличивает выживаемость мышей подвергнутых воздействию рентгеновского излучения // XI Міжнародна науко-практична конференция «Людина I Космос», Днепропетровск, Украина, 2009, с. 218.

12.Асадуллнна Н.Р., Гудков C.B., Брусков В.И. Гуанозин- 5'-монофосфат проявляет антирадикальные и радиозащитные свойства // Тезисы VIII «Конференции молодых ученых, специалистов и студентов» посвященная Дню космонавтики, Москва, 2009, с. 5.

13.Асадуллина Н.Р., Гудков C.B., Брусков В.И. Инозин- 5'-монофосфат как антиоксидант и радиопротектор // Тезисы 14-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века». Пущипо, 2010, с. 103.

14.Асадуллнна Н.Р. Ксантозин проявляет антиоксидантные и радиопротекторные свойства. Труды конференции Экспериментальная и теоретическая биофизика '10, Пущино, 2010, с. 12.

15.Гудков C.B., Асадуллина Н.Р., Брусков В.И. Возможность использования ряда пуриновых соединений в качестве геропротскторов // Тезисы IX Международного симпозиума «Биологические механизмы старения», Харьков, Украина, 2010, с. 69.

16.Асадуллина Н.Р. Пуриновое производное проявляет радиозащитные свойства. // XII М1жиародна науко-практична конференция «Людина I Космос», Днепропетровск, Украина, 2010, с. 241.

17.Асадуллина Н.Р., Гудков C.B., Брусков В.И. Инозин- 5'-монофосфат проявляет радиозащитные свойства. Сборник тезисов III Евразийского конгресса по медицинской физике «Медицинская физика 2010», Москва, 2010, с. 428-430.

18.Асадуллина Н.Р., Гудков C.B., Брусков В.И. Антиоксидантные свойства некоторых пуриновых соединений // Тезисы докладов VIII Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 2010, с.28.

19.Asadullina NR. Inosine-5'-monophosphate as a radioprotective agent // 38th Annual Meeting of the European Research Society. Stockholm, Sweden, 2010, p. 206.

20.Асадуллина H.P., Гудков C.B., Брусков В.И. Антиоксидантные и радиопротекторные свойства инозин-5-монофосфата // Сборник тезисов

Ill Всероссийский с международным участием конгресс студентов и аспирантов «Симбиоз-Россия 2010», Нижний Новгород, 2010, с. 160.

21.Асадуллина Н.Р., Гудков C.B. Гено- и гемопротекторные свойства инозин- 5'-монофосфата // Тезисы IX «Конференции молодых ученых, специалистов и студентов» посвященная Дню космонавтики, Москва, 2010, с. 17.

22.Асадуллина Н.Р., Усачева A.M., Гудков C.B., Брусков В.И. Радиозащитные свойства инозин- 5'-монофосфата // Тезисы докладов VI Съезда по радиационным исследованиям, Москва, 2010, с. 176.

23.Асадуллина Н.Р., Гудков C.B., Брусков В.И. Ксантозин проявляет радиозащитные свойства при введении его мышам после воздействия рентгеновского излучения // Тезисы 15-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология- наука XXI века». Пущино, 2011, с. 124.

24.Асадуллина Н.Р., Гудков C.B., Антиоксидантный эффект ксантозина in vitro и in vivo // Материалы XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «JIOMOHOCOB-2011», Москва, 2011, с. 33.

25.Асадуллина Н.Р., Гудков C.B., Брусков В.И. Модулирующий эффект кофеина при введении его мышам после воздействия рентгеновского излучения // Тезисы докладов российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии», Санкт-Петербург, 2011, с. 217.

Подписано в печать:

03.02.2012

Заказ № 6608 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Асадуллина, Нелли Рустамовна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

61 12-3/551

На правах рукописи

Асадуллина Нелли Рустамовна РАДИОЗАЩИТНЫЕ СВОЙСТВА РЯДА ПУРИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ

03.01.01 - Радиобиология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Брусков В. И. кандидат биологических наук Гудков C.B.

Москва 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

Глава 1. Характеристика основных видов активных форм кислорода (АФК) 9

1.1. Супероксид - анион радикал (Ог*") 9

1.2. Перекись водорода (Н2О2) 9

1.3. Гидроксильный радикал (ОН*) 11

1.4. Синглетный кислород ('Ог) 12 Глава 2. Повреждающая роль активных форм кислорода 12

2.1. Окислительное повреждение ДНК и нуклеотидов 13

2.2. Окислительное повреждение белков 15

2.3. Окислительное повреждение липидов 16 Глава 3. Характеристика основных радиозащитных средств 17

3.1. Серосодержащие противолучевые препараты 17

3.2. Ферментные антиоксиданты и миметики 20

3.3. Витамины 21

3.4. Селен 24

3.5. Металлосодержащие соединения, металлотеонин 25

3.6. Соединения растительного происхождения 27

3.7. Индолилалкинамины 31

3.8. Эйкозаноиды 32

3.9. Иммуномодуляторы и цитокины 33

3.10. Гормоны 37

3.11. Кислоты и их производные 3 8

3.12. ДНК, связывающие агенты 40

3.13. Нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты 41 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 44 ЧАСТЬ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ 45 Глава 4. Материалы и методы исследования 45

4.1. Материалы 45

4.2. Воздействие ионизирующего излучения и объекты исследования 45 4.3 .Методы 46

4.3.1. Определение радиационно-химического выхода перекиси

водорода 46

4.3.2. Определение радиационно-химического выхода ОН - радикалов 46

4.3.3. Определение концентрации ДНК 46

4.3.4. Иммуноферментный анализ по определению 8-оксогуанина в ДНК 46

4.3.5. Измерение индуцированной облучением хемилюминесценции белковых растворов 47

4.3.6. Микроядерный тест 47

4.3.7. Тест на выживаемость мышей 49

4.3.8. Подсчет форменных элементов крови 49

4.3.9. Определение степени окислительной модификации белков сыворотки крови 49

4.3.10. Проточная цитофлуорометрии 49

4.3.11. Культивирование клеток карциномы гортани человека 50

4.3.12. Оценка выживаемости клеточной культуры 51

4.3.13. Статистический анализ 51 ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 52 Глава 5. Влияние ксантозина, кофеина, IMP и GMP на образование АФК в водных растворах in vitro и повреждений ДНК in vitro и in vivo при воздействии рентгеновского излучения 52

5.1. Влияние ксантозина, кофеина, IMP и GMP на образование АФК в водных растворах и 8-оксогуанина в ДНК при воздействии рентгеновского излучения

in vitro 52

5.2. Влияние ксантозина, кофеина, IMP и GMP на образование повреждений ДНК in vivo при введении их до воздействия рентгеновского излучения 57

Глава 6. Влияние ксантозина, кофеина, IMP и GMP на выживаемость животных, подверженных воздействию рентгеновского излучения 59

Глава 7. Возможные механизмы радиозащитного действия ксантозина, кофеина, IMP и GMP при введении их после воздействия рентгеновского излучения 65

7.1. Влияние ксантозина, кофеина, IMP и GMP на количество форменных элементов периферической крови облученных животных 65

7.2. Влияние ксантозина, кофеина, IMP и GMP на образование повреждений ДНК индуцированных рентгеновским излучением in vivo 70

7.3. Влияние ксантозина, кофеина, IMP и GMP на образование долгоживущих радикалов белка, индуцированное рентгеновским излучением in vitro 75

7.4. Влияние ксантозина, кофеина, IMP и GMP на степень радиационно-индуцированной окислительной модификации белка in vivo 78

Глава 8. Влияние пуриновых соединений на выживаемость клеток карциномы

гортани человека подверженных воздействию рентгеновского излучения in vitro 79

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ 82

ВЫВОДЫ 84

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ 85

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 86

ВВЕДЕНИЕ

Поиск и изучение новых природных радиозащитных соединений, способных модифицировать повреждающие эффекты ионизирующего излучения, обусловленные повреждением биологических макромолекул - ДНК, белков, липидов, которые приводят к патологическим последствиям, являются актуальной проблемой. Известно, что повреждения молекул ДНК являются одной из основных причин пострадиационной гибели животных (Ярмоненко, Вайнсон, 2004).

Воздействие ионизирующего излучения на живые организмы может происходить как за счет непосредственного возбуждения и ионизации макромолекул (прямое действие), так и за счет высокореакционных свободных радикалов, которые образуются в результате радиолиза воды - косвенное действие радиации (Кудряшов, 2004). Около 80% радиационно-индуцированных повреждений в клетке являются результатом косвенного действия радиации (Газиев, 1999). Индуцированные радиацией повреждения ДНК приводят к генетически запрограммированному сигнально-регуляторному запуску сложной системы реакций ответа клетки на повреждения. Она сопряжена с изменением экспрессии многих генов: активацией систем антиоксидантной защиты клетки, систем контроля клеточного цикла пролиферации, репарации ДНК, инициации апоптоза и других процессов (Газиев, 2011). Так как свободные радикалы, образующиеся в результате радиолиза воды и других молекул?из-за их высокой реакционной способности, являются коротко живущими продуктами основное направление в области радиационной защиты, было связано с поиском и использованием радиопротекторов - веществ, которые нейтрализуют свободные радикалы при введении их в организм непосредственно перед облучением. В настоящее время известен и хорошо изучен ряд эффективных радиопротекторов, которые проявляют защитные свойства при введении их незадолго до воздействия радиации. Это существенно ограничивает возможности их практического использования и создаёт необходимость разработки радиозащитных средств, защищающих организм от повреждающего воздействия ионизирующей радиации при введении их в организм после облучения.

В середине прошлого столетия было обнаружено, что препараты РНК (Detre, Finch, 1958; Лучник, 1958) защищали растения и животных от радиационно-индуцированных повреждений и увеличивали выживаемость облученных животных при введении их как до, так и после облучения. Гидролизаты РНК до уровня мононуклеотидов проявляли аналогичные защитные свойства (Maisin et al., 1959). Позднее было показано, что из всех основных природных рибонуклеозидов, входящих в состав РНК, только инозин и

гуанозин обладают ярко выраженными антиоксидантными и радиозащитными свойствами. Причем наиболее эффективные радиозащитные свойства они проявляли при введении их в организм вскоре после облучения (Gudkov et al., 2006; Gudkov et al., 2009). В связи с этим изучение радиозащитных свойств ряда природных пуриновых соединений, а также механизмов их действия, представленные в данной работе, актуально и связано с потенциальной возможностью использования полученных результатов в практических медицинских целях.

Цель диссертационной работы заключалась в изучении антиоксидантых и радиозащитных свойств природных пуриновых соединений: ксантозина, кофеина, инозин-5'-монофосфата и гуанозин-5'-монофосфата. В соответствии с целью были поставлены основные задачи:

1. Исследовать антиоксидантные свойства данных пуриновых соединений.

2. Изучить их влияние на радиационно-индуцированное образование повреждений ДНК in vitro и in vivo.

3. Определить радиозащитные свойства этих пуриновых соединений и исследовать возможные механизмы их защитного действия.

Научная новизна исследования

Впервые установлено, что пуриновые соединения: ксантозин (Хао), кофеин (1,3,7-триметилксантин, Caí), инозин-5'-монофосфат (IMP) и гуанозин-5'-монофосфат (GMP) проявляют существенные антиоксидантные свойства, значительно уменьшая радиационно-индуцированный выход перекиси водорода и гидроксильных радикалов в водных растворах и образование 8-оксогуанина (7,8-дигидро-8-оксогуанина, 8-ОГ) в ДНК при воздействии рентгеновского излучения in vitro. В работе впервые показано, что исследуемые пуриновые соединения проявляют выраженные радиозащитные свойства, увеличивая выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении их после радиационного воздействия в летальной дозе 7 Гр. Показано, что фактор изменения дозы (ФИД) для этих пуриновых соединений равен примерно 1,2. В работе установлено, что введение этих пуриновых соединений стимулирует процессы кроветворения, увеличивая количество лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови облученных животных и нормализуя гемопоэз в пострадиационный период. Впервые показано, что исследуемые соединения стимулируют ускоренное пострадиационное восстановление повреждений ДНК при введении их как до, так и в существенно большей степени после облучения, уменьшая процентное содержание полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ), содержащих микроядра (МЯ) в костном мозге, и уровень деградации ДНК в клетках тимуса мышей

подвергнутых воздействию рентгеновского излучения. Впервые установлено, что данные пуриновые соединения в системе in vitro нейтрализуют долгоживущие активные формы бычьего сывороточного альбумина и яичного альбумина, a in vivo уменьшают степень окислительной модификации белков сыворотки крови.

Научно-практическая ценность работы

Впервые установлено, что исследуемые пуриновые соединения проявляют антиоксидантные свойства in vitro и in vivo и могут быть использованы как биологически активные добавки, препятствующие патологическим последствиям окислительного стресса. Впервые показано, что исследуемые пуриновые соединения проявляют радиозащитные свойства при введении их животным вскоре после воздействия рентгеновского излучения. Таким образом, данные пуриновые соединения могут рассматриваться как потенциально перспективные профилактические и терапевтические средства для уменьшения патологических последствий индуцированных воздействием ионизирующего излучения на организм млекопитающих и человека.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на 10 международных и 9 российских конференциях: XI и XII Международные научно-практические конференции «Человек и космос» (Днепропетровск 2009, 2010), 14 и 15-я Международные школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино 2010, 2011), IX Международный симпозиум «Биологические механизмы старения» (Харьков 2010), VIII Международная конференция «Биоантиоксидант» (Москва 2010), 38th Annual Meeting of the European Research Society (Stockholm 2010), III Всероссийский с международным участием конгресс «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород 2010), XVIII Международная научная конференция «Ломоносов-2011» (Москва 2011), конференция с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург 2011), 38-я научной конференция студентов (Самара 2007), 34 Самарская областная студенческая научная конференция (Самара 2008), конференция «90-летие создания Института биофизики в России (Пущино 2009), конференция «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Москва 2009), «VIII и IX Конференция молодых ученых, специалистов и студентов» посвященная Дню космонавтики (Москва 2009, 2010), конференция «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино 2010), III Евразийский конгресс по медицинской физике «Медицинская физика 2010» (Москва 2010), VI Съезд по радиационным исследованиям (Москва 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, в том числе 5 статей в рецензируемых журналах, из которых 4 в изданиях рекомендованных ВАК, и 20 статей в сборниках научных конференций и в тезисах докладов научных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, заключения, экспериментального исследования (материалы и методы исследования), результатов исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов, списка используемых сокращений и обозначений, списка цитируемой литературы {316 источников). Работа иллюстрирована 16 рисунками и содержит 10 таблиц.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Характеристика основных видов активных форм кислорода

Как отмечено во введении основная часть радиационно-индуцированных повреждений в клетке образуется под воздействием активных форм кислорода (АФК). АФК - это высокореакционные, преимущественно радикальные, кислородные соединения, образующиеся в живых организмах в результате неполного восстановления молекулярного кислорода или изменения спина одного из его электронов, находящихся на внешних орбиталях (Зенков и др., 2001). Это делает радикалы химически высоко реакционноспособными, за очень короткий период они либо рекомбинируют друг с другом, либо реагируют с другими молекулами с образованием радикальных продуктов. Образование АФК происходит постоянно и в процессе нормальной жизнедеятельности всех аэробных организмов. АФК частично поступают в организм с кислородом воздуха и потребляемыми жидкостями, а также образуются в функциональных системах клеток в процессах синтеза простангландинов, в результате респираторного взрыва фагоцитирующих клеток, при восстановлении кислорода в дыхательной цепи транспорта электронов митохондрии , а также при окислении ксенобиотиков и эндогенных субстратов (Меныцикова и др., 2002). Установлено, что 2-5 % от вдыхаемого человеком кислорода переходит в АФК (Владимиров и др., 1991. Кроме эндогенных источников образования АФК, существуют и различные экзогенные источники, самым известным из которых является ионизирующая радиация.

Различные источники АФК можно разделить на две большие группы (Ргепке1, 1992):

Эндогенные источники: Экзогенные источники:

1. Стимуляция фагоцитирующих клеток. 1. Ионизирующее излучение.

2. Нефагоцитирующие клетки. 2. УФ - излучение.

3. Редокс-цикл" хинон-семихинон". 3. Воздействие ксенобиотиков.

4. Индукция синтеза прооксидантных 4. Озон.

ферментов.

5. Ингибирование антиоксидантных

ферментов.

6. Индукция синтеза Со А - оксидаз

жирных кислот.

7. Ишемия и реперфузия.

Активными формами непосредственно кислорода являются гидроксильный радикал, перекись водорода, супероксид-анион радикал, синглетный кислород и гидроперекисный радикал.

1.1. Супероксид анион-радикал (Ог* )

Супероксид анион-радикал образуется при присоединении одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии. В водной среде Ог* может спонтанно дисмутировать и сам по себе обладает малой реакционной способностью. Время его жизни в биологических субстратах составляет около 10"6 с.

Супероксид анион-радикал способен повреждать белки, содержащие железо -серные кластеры, такие как сукцинатдегидрогеназа, аконитаза и НАДН-убихинон оксидоредуктаза, приводить к различным окислительным повреждениям: перекисному окислению ненасыщенных жирных кислот, окислению БН-групп белков, повреждению ДНК и др. В живых организмах существует специализированный фермент, отвечающий за снижения уровня супероксид анион-радикала - супероксиддисмутаза. При нормальном протекании метаболизма супероксид анион-радикал в клетках не накапливается (Болдырев, 1998).

При кислых значениях рН супероксид анион-радикал может протонироваться с образованием более реакционноспособного пероксильного радикала (НО*г). При физиологическом рН = 7,4, как показывают расчеты (Владимиров, 1991) на одну молекулу О2*" приходится образование около 400 молекул гидроперекисных радикалов. Наибольшей способностью продуцировать Ог*" в животных организмах обладают фагоцитирующие клетки и фибробласты человека (МиггеП е1 а1., 1990). Помимо этого, супероксид-анинон радикал является продуктом промежуточных биохимических реакций, таких как окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, а также метаболизма ксенобиотиков (Зенков и др., 2001). Согласно расчетным оценкам (НаШ\уе11, 1982) в организме человека за счет перехода на молекулярный кислород электронов с митохондриальной и микросомальной электрон-транспортных цепей за год образуется около 2 кг супероксид анион-радикала.

1.2. Перекись водорода (Н2О2)

Присоединение двух электронов к молекуле кислорода или одного электрона к супероксид анион-радикалу приводит к образованию перекиси водорода, которая является окислителем средней силы. Н2О2 не являясь радикалом, взаимодействует с веществами как радикальным, так и нерадикальным путем (Зенков и др., 2001). В водных растворах при отсутствии каталазы, пероксидаз и ионов металлов переменной валентности Н2О2 относительно стабильна и, будучи электростатически нейтральной молекулой, легко проникает сквозь гидрофобные мембраны и может мигрировать в клетки и ткани (Маянский и др., 1989; 8шк1яу1з1:, 1991). Радиационно-химический выход (в) Н2О2 в

процессе радиолиза воды (рН от 3 до 10) имеет значение 0,75 молекул/ 100 эВ (Кудряшов 2004).

В живых организмах источниками Н2О2 являются ферментативные реакции с оксидазами, переносящими д