Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЧВЕННЫЕ АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ РОДА CLOSTRIDIUM - И ИХ РОЛЬ В ТРАНСФОРМАЦИИ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХ СОЕДИНЕНИИ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ПОЧВЕННЫЕ АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ РОДА CLOSTRIDIUM - И ИХ РОЛЬ В ТРАНСФОРМАЦИИ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХ СОЕДИНЕНИИ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

улг--,л '£) &£)-<£} На правах рукописи

БАБАЙЦЕВА Валентина Антоновна

УДК 831.461(47+57]

ПОЧВЕННЫЕ АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ РОДА

CLOSTRIDIUM - И ИХ РОЛЬ В ТРАНСФОРМАЦИИ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХ СОЕДИНЕНИИ

Специальность 03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1978

іииБІс/рСЮґпС&ґ-иГриБСгґ

л€>лёл7.

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии им/К. А. Тимирязева.

Научный руководитель — доктор биологических наук профессор В. Т. Емцев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук профессор Д. Г. Звягинцев, кандидат биологических наук А. Ф. Перцовская.

Ведущее учреждение — Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, Ленин-град—г. Пушкин.

чЗащита состоится «\. ..-..»;• . ..-, . . • • 1978 г. в « . .'. » часов «а заседании Специализированного совета К-120.36.06 в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева. Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 47. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « . . . ».......1978 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доцент

В. Г. Марьей

Актуальностьчпроблемы. В процессе разложения сложных органических веществ, нуклеиновых кислот и др., поступаю-, щих в почву вместе с. растительными > остатками, происходит высвобождение пуриновых и . пиримидиновых соединений н дальнейшее их превращение. .Эти соединения могут служить в почве для микроорганизмов источником ростовых веществ (Stolp, I955), а их минерализация приводит к пополнению почвы азотом,-.углеродом,фосфором. ; ,,» .'....

♦ Пуриновые if пирнмидиновые соединения активно метабо-лизируются микроорганизмами и поэтому не накапливаются в почве в значительяыхколичествах. В то же время они играют важную роль каю субстраты энергетического и конструктивного обмена для-многих гетеротрофных организмов, а для некоторых представителей рода Clostridium являются единственным источником литания. Указанные соединения при' влекают к себе внимание исследователей не только в связи с проблемой минерализации-органических соединений в почве. Среди аналогов пурина"и пиримидина имеется-большое число инсектицидов, гербицидов, химиотерапевтических'средств.Несмотря на то, что рядом авторов-отмечена важнаяроль анаэробов рода Clostridium В'разложении гетероциклических соединений (Barker, 1961; Vogels, 1976), -работ, посвященных трансформации аналогов пурина и пиримидина почвенными анаэробами, крайне мало, а имеющиеся касаются в основном изучения возможности указанных соединений обеспечивать рост анаэробов'(Дунцис, 1971; Durand, 1966). В связи с этим проблема микробиологического превращения гетероциклических пестицидов — производных пиримидина — приобретает большую актуальность и представляет не только теоретический, но и практический интерес, а'поиски новых — наиболее эффективных штаммов микроорганизмов позволят расширить рамки применения микробов как реатентов для обезвреживания остатков пестицидов в биосфере.

Цель и задачи исследования. Целью исследования было изучение анаэробных .микроорганизмов, трансформирующих пуриновые и пирнмидиновые соединения, для выяснения их роли в процессах разложения в почве производных .«пурина и пиримидина. •

Для выполнения работы были поставлены-следующие задачи.

1. Изучить распространение анаэробов, использующих пу-риновые и пиримидиновые соединения в основных типах почв СССР.

2. Охарактеризовать морфологические, культуральные, физиологические и биохимические особенности анаэробов рода Clostridium, разлагающих пурины и пиримидины.

3. Выяснить пути катаболизма производных пурина и пиримидина выделенными культурами бактерий -рода .Clostridium. '

• '4. Исследовать возможность использования и трансформа' ции некоторых пестицидов'— производных пиримидина выделенными культурами анаэробов.

5. Определить влияние пестицидов на биологическую активность дерново-подзолистой-почвы. ',, ,

Научная новизна. В работе впервые получены количественные данные о наличии в почве анаэробов рода -Clostridium, использующих пуриновые и пиримидиновые соединения, установлены закономерности распространения этих анаэробов в почвах СССР. Изучена способность почвенных анаэробов рода Clostridium использовать производные пурина и пиримидина в качестве основных элементов питания. Изучены, основные пути катаболизма пуриновых и пиримидиновых соединений маслянокислыми и ацетонобутиловыми анаэробами, показана возможная трансформация мочевой кислоты и ксантина по восстановительному пути. Количественно оценено влияние пуриновых и пиримидиновых соединений на фиксацию азота анаэробами рода Clostridium. Установлена способность некоторых штаммов маслянокислых -и ацетонобутнловых анаэробов использовать и трансформировать гетероциклические пестициды — производные пиримидина. .

Практическая ценность. Результаты исследований могут быть использованы для разработки'практических- • рекоменда'' ций.по ускорению микробиологической детоксикации пестици-' дов в почве. Итоги работы .по превращению пуриновых и пи-римидиновых соединений анаэробами различных почв могут быть применены для оценки биологической активности и в целях биодиагностики почв.

Апробация работы. Основные положения диссертации до-ложены.на конференциях молодых ученых ЛГУ им. П.Стуч-ки (секция биологических наук, Рига, 1976) и ТСХА (секция почвоведения, г. Москва, 1977), на Всесоюзной конференции «Микробиологические процессы 'в почвах и урожайность сельскохозяйственных .культур», (Каунас, 1978).

.Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей. ....

- Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав, выводов, содержит 107 страниц печатноЛ го текста, 47 таблиц, 23 рисунка и список литературы из' 245 наименований (из них 116 — зарубежные). . -

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность доктору биол. наук. проф. X. А. Мауринел! канд. биол. наук доц. М. Я. Витолу за помощь в работе и ценные консультации, а также доктору биол. наук проф. Е. Л. Рубан, кандл биол. наук А. Я. Лишмане, ст. науч. сотр. И. Мужниеку —за консультации при выполнении отдельных разделов диссертации,

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Распространение анаэробных бактерий рода Clostridium изучали в различных почвах СССР —в дерново-подзолистых почвах таежнолесной зоны, в черноземах степной и лесостел-ной зоны, в каштановых почвах сухих степей, в сероземе пустынной зоны; а также в интразональных,почвах: в торфянике маломощном ожелезненном, в пойменной дерново-луговой почве, в солонце черноземовидном луговом.

. Для количественного учета анаэробов, использующих-пул рнновые и пиримидиновые соединения, было испытано 10 питательных сред/Наилучшей оказалась среда следующего состава (в ,%): NazHPO* —0,1; КН2Р04 —0,05; MgSOv—0,05; FeSCu — следы; смесь микроэлементов по Федорову (1959) 1 мл; СаСОз — 0,5 тиогликолат натрия иди тиоглнколиевая кислота — 0,05; нейтральрот — 0,004; глюкоза—0,5; дрожжевой автолизат — 0,02; агар-агар — 0,075; пуриновый или пириг-мидиновый компонент.

В качестве пуринового компонента в среды добавляли: аденозин — 5 — монофосфат —'0,2%,. ксантин, • ксантозин, гуано-зин, мочевую кислоту —0,15%, гипоксантин, аденин, инозин, аденозин — 0,1%; пиримидинового— урацил, цитознн, дигид-ротимин, тимин—,0,1%, уридин — 5—«мояофосфат — 0,2%. В опыты были включены аналоги пиримидина — инсектициды*: диазинон—13 мг/100 мл среды (Швейцария), дурс-бан —15 мг/100 мл (США), пиримнфос-метил — 20 мг/100 мл (Англия), хостатион'—150 мг/100 мл (ФРГ), и гербицнд-лена-цил — 80 мг/100 >мл (ГДР). В модельном опыте по изучению 'трансформации пестицидов бактериями в дерново-яодзолнЛ стой почве дозы внесения рассчитывали исходя из пятикратно увеличенной полевой дозы '(диазинона— 200 кг/га, дурс-бана — 25 кг/га, ленацила — 20 кг/га).

* Инсектициды были любезно предоставлены из лаб. инсектоакарицидов, ВНИИ защиты растений (г. Ленинград)' канд.. биолог. нау.:с Сухоручен-ко Г. И., за что автор выражает искреннюю благодарность.

*

Количественный учет анйэробов проводили 'Методом предельных разведений с предварительной обработкой почвы по Д: Г. Звягинцеву (1963). Разведения почвы вносили по 1 мл в пробирку с соответствующей средой (размер пробирок 1X Х25 см). Повторность опыта — 3-кратмая. Наблюдения проводили каждые сутки в течение 7—10 дней, при этом определяли: а) наличие газообразования (учитываемые виды Clo-stridium образуют в процессе использования пуриновых соединений С02, Нг, NH3); б) восстановление нейтральрота (флюоресценция среды; в) наличие клостридиальных клеток; г) трансформацию внесенных пуриновых и пиримидиновых компонентов, о которой судили по . изменению химической структуры внесенных соединений при хроматографическом и сиектрофотометрическом анализе (методика указана ниже).

.... Для выделения Clostridium в чистую культуру испытывали

6 сред, наилучшей оказалась картофельно-морковная среда с урацилом. Накопительные культуры-получали двумя способами: 1) без пастеризации с 4-кратным пересевом по методу И. С. Скалона (I960); 2) с пастеризацией при 80° в течение 15.минут (4-разовый пересев). Выделение чистых культур анаэробов проводили в трубках Вейона (Бычковская, 1966) и на чашках.Петри в микроанаэростатах с использованием щелочного раствора пирогаллола. Температура инкубации посевов 30 и 37°.

Чистота выделенных культур Clostridium проверялась на следующих средах: мясопептонном бульоне с 2%-ным агаром (МПА) косячком и в чашках Петри в аэробных -и анаэробных условиях; мясопептонном бульоне высоким и низким столбиком в пробирках, среде Китт-Тароцци (в пробирках).

Идентификацию выделенных чистых .культур проводили по определителю Берге (Bergey, 1974).

Морфологические особенности выделенных штаммов изучали на жидкой картофельно-морковной среде с урацилом.

О .культуральных свойствах судили по разжижению желатины, росту в лакмусовом молоке, отношению к различным источникам углерода.

Для выявления способности выделенных культур Clostridium, а также коллекционных штаммов маслянокислых анаэробов расщеплять пуриновые и пиримидиновые соединения и их аналоги, последние добавляли к среде в качестве основных источников питания: углерода, азота и фосфора. За основную среду была принята указанная выше среда с глюкозой без агара. Минеральным источником азота в контроле служила соль NH4H2P04 — 0,3%.

О способности анаэробов использовать пуриновые и пири-мидиновые соединения и их аналоги в качестве источников питания судили на основании таких критериев: а) по росту

культур, который определяли на фотоколориметре —нефелометре ФЭК—56 с зеленым светофильтром (Я=540 нм),в кюветах 3060; б) изменению рН среды, измеренной на потенциометре ЛПУ-01; в) трансформации внесенных пурнновых и,пи-римиднновых соединений. Для исследования химических превращений внесенных пуриновых и пиримиднновых соединений использовали культуральную жидкость (инкубат) после отцен-трифугирования бактериальных клеток. Изменение, химической структуры этих соединений определяли с помощью хроматографии, электрофореза и УФ-спектрофотометрии.

Хроматопрафический анализ заключался в разделении продуктов трансформащии внесенных в среды пуриновых и пири-миднновых соединений методом восходящей хроматографии на бумаге (Хайс, Мацек, 1962) в следующих системах растворителей: 1) этилацетат: СН3СООН : НгО = 3 : 1 : 1; 2) изопро-панол: 25% NH4OH : Н20= 14 : 5 : 1; 3). Н-бутанол: ледяная уксусная кислота: ''НгО=2 :1 : 1; 4) Н-бутанол: ацетон: CHjCOOH: 5% NH4OH : Н<Э = 7 : 5 : 3 ; 3 : 2; 5) изомасляная кислота: Н 0:№14ОН 25% =33 : 66 : 1,5; ,6) изопропанол : Н20 = 7:3; 7) этиловый спирт : Н2О = 80 : 2. Продолжительность хроматографического разделения (от 24 до 48 час) зависела от использованной системы.

Электрофоретическую подвижность (ЗП) определяли в буферных растворах 30% уксусной кислоты, (рН 1,4) и 0,05 М боратного буфера (р№ 9,2). ' ......., " '

Напряжение при выходе из выпрямителя 300 в при силе тока 2,5 Л. Градиент потенциала на бумаге 10.в/см.

Пуриновые и лиримндиновые соединения обнаруживали по поглощению ультрафиолетовых лучей с помощью ультрахе-мископа (Блумберг, 1960), дигидросоединения после обработ-. ки 0,5 н NaOH, аобразовавшиеся уреидосоединения проявляли n-диметиламинбензальдегидом (Fink et al, 1954).

Количественное определение проводилось на спектрофотометре Сф-16 при длине волны в ближайшей УФ области, соответствующей максимуму поглощения данного'соединения (при рН 1). Количество вещества (в мкг/мл) определялось при помощи стандартных кривых. • '

Идентификацию выделенных и очищенных соединений проводили путем сравнения Rf соединений в различных системах с Rf образцов заведомо известных структур и снятием спектров: Уф-поглощения соединений при рН Г-и рН II наспектро-' фотометре Specord UV-VIS. (Иена,'ГДР).'Все опыты по коли-' чественному и качественному определению пуриновых и пири-миднновых соединений проведены в 3-кратной • повторности.' Для идентификации аминокислот применяли реагент нингнд-рина (Пасхина, 1964).

.Изучение:продуктов Деградации ксантина, мочевой кислб-ти, дурсбана и диазинона проводили методом адсорбционной хроматографии на Uvicord II 8300 LKB Broma с ислользова-ннем в качестве наполнителя в колонках сефадекса G-10. Фракции УФ-поглощающих веществ собирали на коллекторе Ultrarack и подвергали хроматографнческому и спектрофото-метрическому анализу с целью их идентификации- (Sweetman, Nyham, 1968).

Способность анаэробов фиксировать азот в присутствии пуриновых и пиримидиновых соединений определяли ацетиленовым методом на газовом.хроматографе «ХРОМ-4» (ЧССР) (Hardy et'al, 1973). .

РАСПРОСТРАНЕНИЕ CLOSTRIDIUM, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ ПУРИНОВЫЕ И ПИРИМИДИНОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, '

В ПОЧВАХ ШИРОТНЫХ ПОЧВЕННЫХ ЗОН СССР

Распространение пуринолнтнческих анаэробов. Изучение динамики развития анаэробных бактерий, использующих пури-новыеЧюединения,' в различных типах почв широтных почвенных зон Советского Союза показало (рис. I), что эти организмы обнаруживаются во всех изученных почвах, однако наибольшее количество выявлено в каштановой почве; меньшее количество обнаруживается в сероземе и очень мало в черноземе и дерново-подзолистой почве. Количество клеток анаэробов, использующих аденин н гипсоксантин, в дерново-подзолистой почве было значительно меньше (в 10 и более раз), чем количество клеток микроорганизмов, использующих аденознн. Большая доступность нуклеозидов для бактерий, по-видимому, объясняется содержащимися, в них углеводами. Численность анаэробов,.использующих мочевую кислоту, достаточно высокая во всех почвах и сравнима с численностью микроорганизмов, использующих нуклеознды. .

Доминирование анаэробов, использующих пуриновые вещества, в' каштановой почве, в меньшей степени, в сероземе, по-видимому, можно объяснить тем, что в них происходит интенсивная минерализация органического вещества и обогащение последних белком, нуклеиновыми кислотами, аминокислотами и. другими соединениями лмикробного происхождения. Согласно исследованиям ряда авторов (Anderson, 1961; Панни-ков и др., .1975), пуриновые и пиримидиновые соединения как компоненты нуклеиновых кислот, .содержащихся в почве. имеют преимущественно 'микробный источник поступления. С этой точки зрения, видимо, можно объяснить наблюдаемую нами тенденцию к увеличению численности изучаемых анаэробов с севера на юг.

Распространение анаэробов, использующих пиримидине-вые соединения. Во всех исследованных почвах обнаруживают-' ся анаэробные бактерии, использующие пиримидиновые "сое-" динения (рис. 2)'. При этом в каштановой почве их численность также наибольшая, меньшее количество этих организмов выявляется . в дерново-подзолистой почве и' черноземе:' Интересно подчеркнуть, что количество "анаэробов," выявленных на средах с пнрнмидиновыми основаниями, несколько выше такового на средах "с пуриновымн основаниями, что;:види-' мо,: можно объяснить лучшей доступностью пиримидинов для анаэробных бактерий."' •;••" _ : . . ' " - 'V; • • ;•/

Окультуривание почв в ряде случаев способствует увели-" чению количества айаэробных бактерий,'использующих- nypiV новые и пиримидиновые соединения. ' • ,♦ -у."'- : . .; :

Снижение численности анаэробов, использующих пурино-вые и пиримидиновые соединения, с глубиной; по-видимому, связано с уменьшением содержания органического вещества по профилю почвы. , •

Что касается изменения численности анаэробов,'использующих производные пурина и пиримидина, втеченне вегетаци-' онного периода,-то можно отметить, что наибольшее число этих микроорганизмов обнаружено в" весенне-осенннй период,' что, возможно, связано с поступлением в.почву в;этО'время-

свежего органического вещества. ' ; ,.....

Таким образом, проведенные исследования'позволяют еде-' лать вывод о том," что анаэробы, использующие гетероцикличе- ; ские соединения пуринового и пиримидшювого'ряда в различных почвах, распространены достаточно широко. Наибольшая'' их численность выявлена в каштановой почве."-Это, видимо,"-связано с увеличением в этой почве количества органического -вещества микробного" происхождения. "'г "•;• -.: • • ": • • , • : . Отмечено определенное преобладание в' почвах анаэробов,' использующих пиримидиновые соединения, над анаэробами," использующими пуриновые основания." • ' * " " '

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ, КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АНАЭРОБНЫХ

БАКТЕРИИ РОДА CLOSTRIDIUM, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ ПУРИНОВЫЕ И: ПИРИМИДИНОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ1

• Выделение чистых культур Clotsridium: В наших исследованиях для получения чистых культур использовали "пуриновые" соединения —аллантонн " и аденин, пирнмидиновое —урацил. Выделить" анаэробные бактерии рода Clostridium, которые бы-использовали пуриновые соединения в качестве источников углерода или азота,, не удалось. Однако* было выделено

9 штаммов облигатных анаэробов на среде с урацилом в качестве источника углерода и азота и 45 штаммов анаэробов на среде сурацилом в качестве источника азота. Для дальней-, ших исследований было отобрано М наиболее активных штаммов анаэробов. За основной критерий активности была принята способность бактериальной культуры наиболее полно пре- • вращать урацил в дигидроурацил.

Изучение некоторых морфологических и физиологических особенностей выделенных чистых культур Clostridium дало возможность отнести, согласно определителю Берге (Bergey, 1974), 2 штамма к виду CI. pasteurianum, 6 штаммов к виду CI. butyricum, 2 штамма к виду CI. acetobutylicum; один штамм, обладающий сильновыраженными протеолитическими свойст-. вами, остался неидентифишированмым.

Отношение чистых культур к различным источникам углерода

Сравнительное исследование потребления углеродсодер-жащих соединений показало, что CI. pasteurianum не сбраживает крахмал, a CI. butyricum — глицерин; оба вида не используют пуриновые и пиримидиновые соединения в качестве источника углерода. .

Культуры CI. acetobutylicum и Closridium sp., выделенные из светло-каштановой почвы и светлого серозема, не различались существенно по использованию глюкозы, галактозы, лактозы, мальтозы, крахмала, однако по отношению к пуринам и пиримндннам штаммы CI. acetobutylicum оказались более активны: они использовали, хотя и слабо, оротовую кислоту, .мочевую кислоту и урацил как источники углерода и азота.

Использование пуриновых и пиримидиновых соединений Clostridium в качестве источника азота в,среде. Исследование показало, что пиримидиновые основания (тимин, урацил), а также дигидросоединения и, в некоторых случаях, оротовая кислота могут утилизироваться анаэробами. При этом происходит накопление биомассы бактерий, в 2—3 раза превышающее рост в контроле. Рост культур на средах с нуклеозлдами происходит лучше, чем в' средах с основаниями, что, по-видимому, можно объяснить высвобождением рибозидных остатков, которые могут служить дополнительным источником питания.

Отмечено депрессирующее действие цитозина и цитидина на выделенные анаэробы.

Следует отметить слабое использование в качестве источников азота нуклеотидов по сравнению с нуклеозидами и основаниями. ,|

Хороший рост всех культур Clostridium обеспечивают еле--

дующие пуриновые нуклеозиды: ксантозин, аденозин, меньше гуанозин и инозин. Пуриновые основания г-аденин, гипок'сан-тин, а также аденозин-5-монофосфат—не используются изучае-. мыми культурами, а аденнн даже подавляет рост маслянокис: лых и ацетонобутиловых бактерий. Следует отметить существенный рост анаэробов на среде с ксантином.

Характерно, чтоша среде с янтарной кислотой и.глицери-ном нуклеотиды как источники фосфора и азота могу.т.'обес-печивать рост культур, хотя и незначительный; без ну'клеоти-дов на этой среде накопление биомассы полностью отсутствует. , " . Следует подчеркнуть, что способность коллекционных штаммов маслянокислых анаэробов к использованию пурино-вых и пиримидиновых соединений увеличивается в среде с дополнительным источником азота.

Отношение Clostridium к витаминам. Отношение изучаемых видов анаэробных бактерий к различным витаминам изучалось на среде с глюкозой, куда были добавлены все витамины (Одинцова, 1959), из которой исключался тот или другой витамин.. Было установлено, что выделенные на.урациле масля-нокислые и ацетонобутиловые бактерии весыма требовательны к биотину, а маслянокислые анаэробы, кроме того, к никотиновой кислоте. Такие желанные были получены ранее рядом. авторов (Stolp, 1955; Гудков, 1965).

Влияние пуриновых соединений на фазы развития CI. buty-ricum и CI. acetobutylicum изучали на основной среде,с мочевой кислотой и ксантином как источниками азота, а также на среде с дополнительным источником азота. Контролем явля-' лась среда без пуринов. . -

Было установлено, что мочевая кислота и ксантин способствовали более интенсивному развитию клостридий. Ацетоно-бутиловые и маслянокислые анаэробы быстро росли и накапливали значительную'биомассу на средах с. пуринами, при этом они имели более, короткие фазы развития и заканчивали' свой рост значительно, раньше, чем на среде без пуринов.

4 Влияние пуриновых и пиримидиновых соединений на азот-фиксирующую активность. В литературе отсутствуют данные об усвоении молекулярного азота Clostridium при росте на пу-риновых и пиримидиновых веществах.

Нами были проведены исследования по изучению влияния. указанных соединений на величину фиксации азота.

Установлено, что гуанин, мочевая кислота и оротовая кислота, внесенные в количестве 0,05—0,5%, стимулировали азотфиксацию всех изучаемых культур. '. • •_.

Исследование влияния различных концентраций пурино-.-вых соединений на фиксацию азота атмосферы Clostridium выявило, что лучшей концентрацией гуанина и мочевой кисло--

ты, обеспечивающих оптимальный уровень фиксации азота у большинства анаэробов, была концентрация 0,5% (CI. pasteu-rianum — 0,1%). Наблюдалась корреляция между уровнем азотфиксацин и ростом культур. Пуриновые соединения, внесенные в количестве 1,0%, резко сокращали уровень азотфик--сирующей способности у исследуемых культур. Урацнли ди-гидротимин увеличивали накопление биомассы, однако не способствовали процессу фиксации азота (рис. 3).

Известно, что некоторые виды анаэробов могут использовать экзоциклические группы пуриновых соединений, не раз-. рывая цикла, однако урацил и тимин расщепляются с разрывом пирнмидинового кольца (Дунцис, 1972; Vogels, 1976). Возможно, что малые дозы азота, выделяющиеся в первом случае, усиливают фиксацию азота, являясь «стартовыми», а избыточный азот во втором случае подавляет ее.

Таким образом, показано, что пуриновые соединения оказывают существенный ростовой эффект на Clostridium, стиму-лируя'процесс связывания молекулярного азота атмосферы.. Степень стимулирующего воздействия указанных веществ на фиксацию азота анаэробами зависит не только от характера соединения, но и от вида микроорганизма.

ТРАНСФОРМАЦИЯ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ АНАЭРОБНЫМИ БАКТЕРИЯМИ

Разложение производных пурина и пиримидина накопительными культурами. Анаэробные бактерии, используя гетероциклические соединения, выделяют продукты их,превра-щения в среду. Идентификация этих продуктов дает возможность изучить химические пути превращения гетероциклических соединений. Выделенные из различных почв анаэробы1 осуществляли трансформацию аденина в гипоксантин. Одна-1 ко бактерии из каштановой почвы весь исходный аденин превращали в гипоксантин, в то время как анаэробы из подзолистой почвы, чернозема, серозема осуществляли частичное его превращение. ' ... .,•.-•

" При анализе среды с гипоксантином нам удалось установить его микробиологическую трансформацию при посевах из каштановой почвы. Обнаруженное новое соединение идентифицировано как ксантин.

'На средах с'аденозином микроорганизмы из всех типов почв растут хорошо. Нами установлено, что наиболее частым продуктом трансформации аденозина является инозин. Как единственный продукт он встречается при трансформации аденозина анаэробами дерново-подзолистой, "серой лесной почв, а.также чернозема и торфяника. Инозин и гипоксантин образуются при развитии Clostridium из серозема и каштано-;

Ю

g I

«3

«3»

.4

V.

Ч л

У

ЧУ

i-1 i Ц-1 i i

V V// KB К V И/ 1 IX V W/ ГШ /X У УД УИЯ V W/ Ш «г

1еГ Джтт численности меток жаробо6,ит№3№иш пурино&ыв соединения & целинных почЗихразных типок

1-ЙЙЙЙИЛ?-подзолистая почйа а- айтт г-аденож

£-чернозем мощный б- гипокоаитин

$*арозем сбгтяый ' б- мочгЗая кислота

А -йшо-коштанобая почба д- абенож-5-монофосфо.т

/

4

/

1- 1.

4

I I I •

v vii via ix у w/ VIII ix v vit via ix v vii viii ix v VII vurix-

месяцы ,

Puo.2 Линамика тленности клеток анаэробобиспользующих'.';.,• лиримидино8ые соединения в целинных. почтахразличных moS

а - урацил . 1 -дерно&нюдзшистая почба

б - оротобая кисло/па 2-чернозем мощный

S - уридин 3 - серозем сЗетлый •;>.;.

г, уридин - 5 - монофосфат 4 - светло - тштаноШя.

д\- цитозии

0,05

too

0,10'-:-,-. я о.ю , , } .-; Лозы соединении, % Рис.3 Влияние.различных\ 0озпуринодшхипири-

мидинобь/х соединении на рост и величину фиксации азота Сб. асеШиЩюит

Азопириксация„ „ Рост культур

,..... ..... ОРотоВая кислота

д —

: А-

О-

-.д'.

-і. .А'

-О

Оигидротимин урацил : •: гуанин

мочевая кислота контроль- *

: л---\-\ZA '

диазиион

1

51

дурсбан

т—:——!—-Г

Часы 24 7г то

РасЛ Вшяиив диазинона. дурсбана и лвнашша

На РОЩ С1.асе1аВи1уИеит .

-пестицид как источник углерода и азота

' -контроль

-пестицид Внесен с глюкозой

__о_ — контроль (среда с глюкозой)

-: — пестицид Знесен с глюкозой и ЩНрО§

-о-контроль с глюкозой + !Шл11гР04

вой почвы. Инозин, гипоксантин и аденин обнаруживаются при использовании аденозина анаэробами солончаков и пойменной почвы. Такое соотношение продуктов деградации аде-нозина позволяет сделать вывод о том, что анаэробы, имею-!щие дезамнназы, более широко распространены во всех почвах. Они осуществляют основной путь трансформации адено-зина в инозин; несколько меньше анаэробов, осуществляющих 'разрыв N-глюкозндной связи, когда инозин превращается в 'гипоксантин, а аденозин — в аденин и, видимо, еще меньше анаэробов, превращающих аденин в гипоксантин. Таким q6pa-|зом, для аденозина можно предположить два параллельных пути трансформации развивающимися в почве анаэробами.

>—Инозин,.

АденозинЛ Л-«-Гипоксантин

л-'Аденин '

Аналогичные данные были получены при изучении трансформации аденозина некоторыми штаммами почвенных акти-номицетов (Вольский, 1974).

. При инкубации накопительных культур на средах с мочевой кислотой обнаружены следующие продукты микробиологической трансформации: аллантонн в небольших количествах и вещество с Rf ксантина, которое, из-за исключительно малых количеств, идентифицировать не удалось. ,

Пиримиднновые основания трансформировались анаэробами по • восстановительному пути через дигндросоединення и уреидокислоты.

Пуриновые и пиримиднновые нуклеотиды трансформирова- . лись накопительными культурами анаэробов, по пути дефосфо-рилирования с образованием соответствующих нуклеозидов.

Катаболизм пуриновых и пирнмидиновых соединений мас-лянокислыми и ацетонобутиловыми анаэробами. Изучение физико-химических свойств промежуточных продуктов показало, что в основном катаболизм экзогенных производных пурина и лиримидина осуществляется одинаково у всех изученных анаэробов согласно схеме-1.

♦ .,'..., Схема 1

Пути расщепления производных пурина анаэробами рода

Clostridium

Ладенин л

АТф ГТЛАДфГТ :£ АМф аденозин гипоксантин

ЧэинозинА

п

ИМФ

И-

Ксантозин

ii

Ксантин- ♦ ♦'♦...........>♦ глицин

f >

" Мочевая кислота ' :

' - Пути расщепления производных пиримидина-УМФ_ Л Ztуридин_1лурацил_ _ I* дигидроурапил

. . . . . ' И ;

-• цитиднн-*цитозин . р-уреидопропионовая кислота, .

и . •: р-аланин .

i

Тимидин тг:Тимин -гз дигидротнмин =Лх р-уреидоизомасляная

кислота

— — —реакция установлена на ацетонобутиловых анаэробах

--• — реакция установлена на.маслянокислых анаэробах' ' )

Следует, однако, отметить неодинаковое использование аде-, нина и его производных., Аденин не использовался ни одним* штаммом маслянокислых бактерий. Внесение дополнительного} минерального источника азота .также не стимулировало,его' использование' коллекционными; штаммами 'маслянокислых'-

♦ бактерий. Видимо, указанные анаэробы не имеют аденинами-1'

, ногидролазы, которая осуществляет .превращение аденина в*-.гнпокеантнн; однако такое .превращение осуществляют С1. асе-tobutylicum и.Clostridium sp.

♦ Изучение превращения мочевой кислоты и ксантнна. ПутьЛ катаболизма мочевой кислоты и ксантина, установленный у, большинства видов микроорганизмов, существенно отличается от данных, полученных рядом исследователей,для некоторых анаэробов'рода Clostridium. Известно, что; "культуры CI. aci-diuriei и CI. sticWandii восстанавливают мочевую кислоту в

♦ ксантин,-с которого затем начинается разрыв пуринового кольца (Rabinowitz, Pricer, 1956/ Schafer,' Schwartz, 1976).

• Представлялось интересным исследовать пути деградации указанных:соединений маслянокнслыми и ацетонобутиловыми анаэробами. При исследовании,культуральной жидкости после 72-часовой инкубации Clostridium были обнаружены два новыхЛвещества, пики-которых, появлялись в 8,0 мл и 21,0 мл элюанта. По'хроматогр-афическим испектрофотометрическим. характеристикам ни одно изнихне соответствовало мочевой кислоте,аллантоину или' мочевине,- однако появление двухно-вых''вёществ указывает на'Ляв/ную трансформацию ксантина. Хотянам не удалось идентифицировать продукты деградации

ксантинагмы все же можем -предположить, что его разложе-. ние происходит, причем появляется глицин, который был нами обнаружен реакцией снингидрином. . ,

i • Анализ.продуктов трансформации мочевой кислоты позволил установить восстановительный путь ее превращения в ксантин. Обнаруженное новое вещество, пик которого соответствует 30,3 мл элюанта, идентифицировано нами как ксантин.

Лллантоин, аллантоиновая кислота — обычные продукты метаболизма мочевой кислоты у аэробных бактерий, нами не были выявлены у Clostridium. ,

РАЗЛОЖЕНИЕ ПЕСТИЦИДОВ -ПРОИЗВОДНЫХ ПИРИМИДИНА -АНАЭРОБАМИ РОДА CLOSTRIDIUM

Результаты лабораторных исследований. Трансформацию микроорганизмами пестицидов начали изучать сравнительно недавно. В основном исследования касались выявления ингн-бирующего" или стимулирующего действия пестицидов на,раз-личные микроорганизмы, гораздо меньше работ посвящено поискам культур, способных использовать тот или иной пестицид как.единственный источник углерода или азота (Скрябин, Головлева, 1975).

Целью проведенных нами исследований было выяснение степени и характера влияния некоторых гетероциклических пестицидов на чистые культуры маслянокислых и ацетонобу-тиловых анаэробов, а также выявление возможной трансформации исследуемых пестицидов анаэробами. Последнее особенно важно, так как деятельность 'микроорганизмов — один из факторов, влияющих на дальнейшую судьбу препарата в биоценозе. !

При изучении способности активных штаммов Clostridium, выделенных на урациле, использовать некоторые пестициды, аналоги .пиримидина, было обнаружено,, что 9 штаммов анаэробов могут.использовать инсектициды —диазинон и дурс-бан в_ качестве единственных источников азота и углерода в среде, а гербицид ленацил в качестве источника ;азота. Однако инсектициды хостатион н пнримифосмегил оказались токсичными для всех исследуемых культур как в дозе 20 мг и 150 мг на 100 мл среды соответственно, так и вдвое меньшей дозе. - * '.:_..,.

Нами изучалась также динамика роста 9'штаммов анаэробов на средах с диазиноном", дурсбаном и ленацилом в условиях кометаболизма; в качестве дополнительного источника углерода вносилась глюкоза (0,5%), дополнительным источ-ником.азота служила соль NH4H2P04 (0,1%). Было выявлено значительное увеличение биомассы,анаэробов при использовании диазинона и дурсбана в соокиелнтельных условиях (бо-

лее чем в 3 раза превышающее контрольный уровень), однако ; ленацил оказался менее доступен для анаэробов рода Clostri- ' dium (рис. 4). , •_ , |

*' ' 'При изучении продуктов биодеградации исследуемых пе- • стицидов мы, применяли, описанную выше .методику -разделе:, i ния на сефадёксеО-Ю с последующим хроматографированнем .' и спектрофотомётрированием.'* Исследования .проведены на • 5-е сутки инкубации. Культуры Clostridium, выращенные на ' средах'"с диазиноном.'накапливали'три новых метаболита. При { использовании маслянокислыми анаэробами другого ннсекти- i цида — дурсбана —в среде появилось два новых соединения (табл.1). Г'?л;иЬ"-:1;лГ/;-т;;,Лл ,;П1.;,:- - • ., • ;

' .'Обнаруженные «новые .'соединения, не лидентифицированы, ' однако некоторые физико-химические характеристики опрёде-". лены.' J • и,.-<-"--\л:р:у r'y'\--jr:.\r'-:!:- •. - - - "\

........ • «Viv" •-*•—V- •"*-,."7 *">'.; ;'-"-VТаблица 1.,

Метаболиты, обнаруженные в средах с инсектицидами г , '' -при развитии культур Clostridium* * '" ~*\

*

Среды сдиазино-:\ ном • как; источ- - * никомЧ ' '•' \УЛ'*.';Г*/Среды с дурсбаном -\*C:D", : как источником " ;:'

-Вид , бактерии Ж' угле-. - дополни-»-тельным -,"." углерода • дополнительным -

;..... : 3 ' рода и азота углерода углерода и азота и азота углерода углерода •и азота

100 Kia KsB К, KsB ИС,Х исх нс, ЙС,Х

Cl.'butyricum 1546 К, а Ki К. а К! " Kia Ka ИС,Х ис, Исходное соединение

1446 К, а Kj Kia." К," K,a ИС,х . нс, ис„ нс, Использовано ПОЛНО- ' стью .

CI. acetobuty-• licum 4115 2100 к.: К,» KiB Ki Kic K,a ис„ НСу ИС,х нс , . . НС,х • ИС,у ис1х . ис»х. Использовано полно-, ## стью > » -

Контроль (без культуры) , Кг Ki' ;;КЛ; ;v.Kii. :,ис,;Л 'ИС, ' ис, ИС,- "' ,

ИС|, ИС,, Кь К, —исходные соединения в среде.-'" - ' а, в, с, х, у,—4 обнаруженные метаболиты.-. •• •'{ *

Культуры Clostridium, выращенные на среДё, гДе Дурсбан вносился с дополнительным источником азота и углерода, весь исходный инсектицид использовали полностью, что было выявлено хроматографически (не обнаружены вещества, адсорбирующие УФ-лучн, а реакция с нингидрином была отрицательной, в контроле— положительной).

Результаты модельного опыта. Для изучения влияния органического вещества на использование и трансформацию пестицидов бактериями рода Clostridium был поставлен модельный опыт с дерново-подзолистой почвой~(табл. 2). В каждой серии опыта определяли численность анаэробов, использующих тот или иной пестицид, а также продукты возможной трансформации внесенного пестицида.

Следует отметить, что через 20 дней компостирования следов присутствия диаоинона и дурсбана в нестерильной почве обнаружено не было, однако в варианте I со «стерильной» почвой было отмечено наличие одного метаболита дурсбана. По характеру Rf в системах он очень сходен с соединением х, обнаруженным при деградации дурсбана чистыми культурами.

Установлено, что в дерново-подзолистой почве имеется значительное количество «собственно» почвенной анаэробной микрофлоры, способной использовать ленацил, несколько меньше анаэробов, использующих диазннон, и совсем мало микроорганизмов, утилизирующих дурсбан.-Инокуляция почвы ацетонобутнловыми бактериями значительно увеличивала

Таблица 2

Влияние органического вещества на развитие Clostridium, использующих пестициды в дерново-подзолистой почве

Серии опытов

I II III

пп. Варианты -диазннон дурсбан ленадил

колчество клеток анаэробов

в тыс/г абсолютно сухой почвы

1 0,52 0,24 0,13

С «Стерильная» почва+Clostridium 24 10

0 62 10 еоо

4 Нестерильная почва+Clostridium 440 .100 240

б «Стерильная» почва+клевер . . . 0,88 1 2

6 Нестерильная ' почва+клевер+С1о-

2800 1000 4400

7 Нестернльная почва+клевер . . 80 53 2800

* Количество клеток анаэробов, обнаруживаемых в «стерильной» почве, принималось за контроль. По-видимому, 3-кратное автоклавированне при 1 атм в течение 3-х дней по 20 мин не обеспечило полной стерильности' почвы. Такая мягкая стерилизация применялась во избежание возникновения токсичности почвы. . . . . . . . .

Ш

численность- анаэробов,Л1спользу'.ющнх;диазинон к дурсбан, и почти не влияла наиспользование. ленацйла.. Однако внесение органического .вещества..сутественно? повысило численность как почвенной анаэробной лмикрофлоры, :'(для. ленацила'в 10 раз.дурсбана ~--"5:раз), таки внесеннойЛиспытуемой культуры (более чем:в 20 раз.в.-вариантегх';Инсёктицидами), что' указывает на' значительные,преимущества"условий ком'етабо-лизма при использовании (пестицидов микроорганизмами.' -. ♦ ..Таким образом, установлено, что, пестициды, производные гетероциклических соединений,,: могут. утилизироваться масля -}юкислыми и ацетонобутиловыми анаэробами.' Внесение дополнительного органического, вещества /существенно активизн-" рует деятельность анаэробной.микрофлоры,что указывает на значительные : преимущества4' условий у ко метаболизма при использовании пестицидов бактериями. .Все это обусловливает возможность ускорения детоксикации пестицидов в почве. . ' "

'- ' • . ",.ч-Выводы;'."',Л-.'. . "'.

1< Изучено, распространение:анаэробов;,11Спользующих"ну-риновые и пиримидиновые соед] 1НёнЦя*в'почвах основных почвенных jicnoB СССР» Выявлено ;^TOi зоной,оптимального роста таких анаэробов являются южные;, (каштановые) почвы. Сопоставление численности анаэробов рода Clostridium по'сезо-, нам года показывает, что наибольшее их количество обнару-' живается в весенне-осенний период. .Отмечено, что во'всех' исследуемых .почвах численность анаэробов, использующих пи-римидиновые основания, значительноi больше,,чем численность

анаэробов, использующих'пуринЬвыё'основания. - ......

. J2J ИЗ различных почв,выделены анаэробные бактерии,'способные использовать экзогенные производные пурина и пиримидина в качестве источника азотного питания. Полученные культуры ;были идентифицированы какСК pasteurianum. C1. butyricum, CI. acetobbtylicum, Clostridium sp. ;,

.. ЗЛ-Изучены морфологические н.'физиологические свойства. выделенных штаммов анаэробов и установлена способность Clostridium использовать экзогенные производные пурина и пиримидина. Характер утилизации пуриновых.и пиримидино-вых соединений определяется особенностями ферментативных систем анаэробов и составом среды выращивания. В качестве источника азота;В среде активно потребляются нуклеозиды, пнримидиновьГе основания, .'менее'-активно'.'используются пури-новые.основания и нуклеотиды/ Отмечена слабая доступность-' нуклеотидов в каче'стве'источника фосфора для-анаэробов. Экзогенные; пиримидиновые соединения (нуклеозиды,1 основа-"; ння); используются. Clostridium лучше,-чем:. соответствующие; пуриновые соединения.'* ч С .V.......',„...:..:; ...„.:...

4. Установлены основные пути катаболизма пуриновых н шгримидиновых соединений (нуклеотидов, нуклеозпдов и оснований) накопительными и чистыми культурами маслянокис-лых и ацетонобутиловых анаэробов. Так, трансформация нуклеотидов идет то пути дефосфорилирования. При использовании нуклеозпдов ацетопобутнловые бактерии осуществляют как разрыв N-глюкозидной связи, так и дезаминирование. Маслянокислые анаэробы трансформируют нуклеозиды без предварительного отщепления рибозы. Пиримиднновые основания трансформируются по восстановительному пути через дигидросоединення с последующим расщеплением пнримиди-нового кольца и образованием р-уреидокислот.

5. Выявлено, что пуриновые соединения оказывают определенный ростовой эффект на Clostridium, стимулируя процесс связывания молекулярного азота атмосферы.

6. Исследована способность 9 штаммов масляиокислых и ацетонобутиловых бактерий использовать пестициды как единственные источники углеродного и азотного питания. Такие пестициды, как дурсбан, диазинон и ленацил наиболее интенсивно утилизируются анаэробами в соокислительных условиях.

7. Изучена трансформация инсектицидов, аналогов пиримидина, ацетонобутиловыми бактериями и определены некоторые физико-химические характеристики обнаруженных метаболитов.

8. Внесение в почву повышенных доз пестицидов вместе с органическим веществом активизирует размножение Clostri-dium и существенно ускоряет разложение этих соединений, что подтверждает важную роль кометаболизма в трансформации веществ в почвенных условиях.

Материалы диссертации опубликованы в работах

1. Трансформация пуриновых и шгримидиновых соединений почвенными анаэробами рода Clostridium (в соавторстве). Известия ТСХЛ, вып. 2, '1977, 107—112.

2. Распространение анаэробных бактерий рода Clostridium, трансформирующих пуриновые и пиримиднновые соединения в.почвах Советского Союза (в соавторстве). Известия ТСХЛ, вып.'2, 1978, 124—133.

3. К методике количественного учета анаэробных бактерий рода Clostridium, использующих пуриновые и пиримиднновые соединения (в соавторстве). Известия ТСХЛ, вып. 3, 1978.

4. Влияние гербицидов на биологические свойства торфяно-болотной почвы низинного типа, (в соавторстве). Научн. труды торфоболотной опытной станции, выл. 3, 1977, 122—129.

i. 5 . Фиксация атмосферного азота'бактериями рода Clostridium, использующими пуриновые и пиримидиновые соединения (в соавторстве). В сб. «Микробиологические процессы'в почвах и урожайность сельскохозяйственных, культур», 1978, Вильнюс, 29—30.

, .6. Трансформация пурнновых и пирнмидиновых соединений накопительными, культурами . анаэробов рода Clostridium! Докл. ТСХА, в. '238. 68—74. ,'.'"'

Л 100905 21/Х1—78 г. Объем 1'Д п. л. Заказ 1840. Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44