Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансформация природных веществ и ксенобиотиков (пестицилов) почвенными анаэробными бактериями

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дзысюк, Сергей Анатольевич, Москва



Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева

На правах рукописи

ДЗЫСЮК Сергей Анатольевич

ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРИРОДНЫХ ВЕЩЕСТВ И КСЕНОБИОТИКОВ (ПЕСТИЦИДОВ) ПОЧВЕННЫМИ АНАЭРОБНЫМИ БАКТЕРИЯМИ

Специальность 03.00.07 микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель - лауреат Государственной премии СССР, Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор В.Т. Емцев

Москва,!998 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................10

1.1. Природные вещества почвы и их состав..................................10

1.1.1. Гумус и его состав..................................................................10

1.1.2. Трансформация гумуса почвы микроорганизмами...............19

1.2. Лигнин и его состав...................................................................32

1.2.1. Трансформация лигнина почвенными микроорганизмами..34

1.3. Ксенобиотики (пестициды) и их влияние на почвенные микроор ганизмы. ........................................................................................... 36

1.3.1. Краткая характеристика производных симметричных триази-нов, применяемых в сельском хозяйстве....................................................36

1.3.2. Влияние симазина и атразина на различные физиологические группы микрооорагнизмов в почве..............................................................42

1.3.3. Трансформация ксенобиотиков (пестицидов) почвенными микроорганизмами.............................................................................................48

1.3.4. Интенсификация микробиологических процессов с целью ускорения трансформации пестицидов в почве.............................................54

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..............................62

2.1 .Объекты исследований..............................................................62

2.2. Методика получения препаратов гумусовых веществ.............63

2.3. Методы определения элементного и функционального состава гумусовых веществ..................................................................................65

2.4. Методика изучения трансформации лигнина анаэробными бактериями..............................................................................................................69

2.5. Методика определения редукции нитратов и нитритов у бактерий ряда Clostridium...........................................................................................70

2.6. Методика изучения фракционирования изотопов углерода саха-ролитическими анаэробными бактериями...................................................71

2.7. Методы изучения участия анаэробных бактерий в трансформации ксенобиотиков (пестицидов)......................................................................73

2.7.1. Методы изучения влияния гербицидов на аэробную и анаэробную микрофлору почвы..............................................................................73

2.7.2. Методы определения трансформации гербицидов анаэробными бактериями................................................................................................. 75

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...............................................76

3.1. Некоторые физиолого-биохимические характеристики анаэробных бактерий рода Clostridium......................................................................76

3.1.1. Редукция нитратов и нитритов сахаролитическими анаэробами рода Clostridium.............................................................................................76

3.1.2. Фракционирование изотопов углерода сахаролитическими анаэробами..........................................................................................................82

3.2. Трансформация гумусовых веществ почвенными анаэробными пуринолитическими и протеолитическими бактериями рода Clostridium..86

3.2.1. Характеристика элементного и функционального состава фракций гумусовых веществ............................................................................... 86

3.2.2. Исследование воздействия пуринолитических и протеолитиче-ских анаэробов на элементный состав фракций гумусовых соединений.. 93

3.2.3. Исследование воздействия пуринолитических и протеолитиче-ских анаэробов на функциональный состав фракций гумусовых соединений...................................................................................................................107

3.3. Трансформация лигнина сахаролитическими анаэробными бактериями рода Clostridium...................................................................................122

3.4. Участие почвенных анаэробных бактерий рода Clostridium в трансформации ксенобиотиков (пестицидов)...............................................128

3.4.1. Влияние гербицидов на аэробную микрофлору почвы..........129

3.4.2. Влияние гербицидов на анаэробную микрофлору почвы......132

3.4.3. Влияние возрастающих доз гербицидов и их смесей на анаэробные микроорганизмы рода Clostridium..................................................132

3.4.3.1. Влияние возрастающих доз гербицидов и их смесей на Clostridium pasteurianum штамм 7..................................................................135

3.4.3.2. Влияние возрастающих доз гербицидов и их смесей на Clostridium butyricum штамм 15.....................................................................137

3.4.3.3. Влияние возрастающих доз гербицидов и их смесей на Clostridium acetobutylicum штамм 29.............................................................139

3.4.3.4. Влияние возрастающих доз гербицидов и их смесей на проте-олитические анаэробы..................................................................................141

3.4.4. Определение оптимальных условий, обеспечивающих высокую эффективность процессов трансформации пестицидов почвенными аэробными и анаэробными микроорганизмами....................................................143

3.4.4.1. Трансформация гербицидов в почве...................................143

3.4.4.2. Трансформация гербицидов анаэробными бактериями.... 146

ВЫВОДЫ............................................................................................148

ЛИТЕРАТУРА....................................................................................151

ПРИЛОЖЕНИЯ..................................................................................190

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что зеленые растения на протяжении многих сотен миллионов лет синтезируют из двуокиси углерода органические соединения, однако сколько-нибудь заметного накопления органических веществ за это время не произошло. Только небольшая их часть в условиях без доступа воздуха сохранилась в форме сильно восстановленных соединений углерода - это нефть, природный газ и каменный уголь. Каким бы сложным ни было то или иное вещество, в природе всегда найдется микроорганизм, способный полностью или частично его трансформировать, а продукты этой трансформации будут использованы другими микроорганизмами.

Трансформация органических остатков (растительного, животного и микробного происхождения) представляет собой важнейший процесс, определяющий существование биологического круговорота элементов в природе. Основную массу органических веществ, подвергающихся трансформации в почве, составляют полимерные соединения целлюлоза, пектины, хитин, лигнин, гумус и др.). Причем, если легко разлагающиеся материалы подвергаются быстрому и достаточно полному окислению, то полимерные соединения с трудом расщепляются микроорганизмами и поэтому длительное время остаются в почве как ее органические компоненты. Следовательно, органическое вещество почвы частично состоит из не вполне распавшихся остатков растений и частично из гумуса. Последний представляет собой аморфный, обычно темноокрашенный материал биологического, главным образом микробного происхождения. В состав гумуса входят соединения, с трудом разлагающиеся микроорганизмами, - прежде всего это лигнин, а также жиры, воски, углеводы и белковые компоненты. Они превращаются в полимерные соединения, не поддающиеся точной химической характеристике. Полимерные соединения подвергаются микробным превращениям, в которых участвует разнообразные группы сапротрофных организмов, включающие пред-

ставителей хемоорганогетеротрофных бактерий. Скорость трансформации полимерных органических веществ в почве, природа микроорганизмов, осуществляющих ее, оказывает большое влияние на процессы формирования почвы, создание ее структуры и уровень плодородия (распределение гумуса по профилю почвы и др.). В связи с интенсификацией сельскохозяйственного производства (широкое применение минеральных удобрений, интенсивных систем обработки почв, мелиорации и узкоспециализированных севооборотов) процессы микробного разложения органического вещества почвы существенно ускоряются. Это приводит к деградации гумуса, сопровождающейся обесструктуриванием, снижением емкости поглощения, бу-ферности, водоудерживающей способности и другими негативными процессами, что обусловливает, в конечном итоге, падение плодородия почвы. Отсюда возникает необходимость замедления процесса трансформации органического вещества в почве. Однако для решения данной проблемы необходимо знать некоторые основные принципы микробной трансформации органических веществ в почве (гумуса, лигнина и других полимерных веществ).

В устойчивости к трансформации большое значение имеет, во-первых, химическое строение органического вещества, во-вторых, характер микробного ценоза почвы и условия его функционирования. Однако в настоящее время остается еще недостаточно изученными не только состав многих полимерных соединений, входящих в органическое вещество почвы, но и специфика его трансформации микробным ценозом и его отдельными представителями. Кроме того известно, что современный уровень антропогенного воздействия на почву сопровождается значительным изменением ее экологии. Это приводит к нарушению естественного равновесия в микробном ценозе почвы, перестройке в их функциональной и таксономической структуре. При этом существенно изменяется интенсивность и направленность процессов трансформации органических веществ в почве. Поэтому для

разработки надежных методов регулирования скорости трансформации органических веществ в почве следует подробно изучить как кинетику ее разложения в различных условиях, так и микроорганизмы, которые доминируют в процессах деструкции того или иного органического вещества.

В настоящее время показано, что трансформация органических веществ в почве осуществляется как аэробными, так и анаэробными микроорганизмами. Среди анаэробных бактерий особо выделяется группировка микроорганизмов, относимая к роду Clostridium. Это одна из наиболее широко распространенных во всех (или почти во всех) почвах, принимающая участие во многих почвенных процессах, связанных с трансформацией простых и сложных органических соединений (углеводов, полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, липидов, гумусовых веществ, нефти и др. веществ (Мишустин, Емцев, 1974; Емцев, 1982, 1985, 1986; Емцев, Бабайцева, Витол, 1977; Ручко, Туев, 1984, Емцев, 1987). Известно также участие Clostridium в трансформации ксенобиотиков инсектицидов и гербицидов) в почве (Емцев, 1982). А так как род Clostridium включает целый ряд физиологических подгрупп организмов, обладающих различными ферментными системами, возникает необходимость изучения участия каждой такой группировки анаэробных бактерий в деструкции различных органических веществ, а также исследования условий протекания этих процессов. Хотя некоторые физиологические подгруппы рода Clostridium были изучены (Мишустин, Емцев, 1974; Емцев, 1982), однако многие вопросы участия анаэробных бактерий в деструкции природных и неприродных веществ, остаются недостаточно изученными. В связи с указанным, целью данной работы было изучение роли пуринолитических, про-теолитических и сахаролитических анаэробов рода Clostridium в трансформации ряда природных веществ (гумуса, лигнина), а также ксенобиотиков (гербицидов).

Для решения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Характеризовать некоторые физиолого-биохимические характеристики почвенных сахаролитических анаэробных бактерий рода Clostridium;

2. Изучить характер трансформации гумуса в зависимости от его фракционного состава, определив при этом воздействие пуринолитических и протеолитических анаэробов на элементный и функциональный состав гумусовых соединений;

3. Изучить трансформацию лигнина сахаролитическими анаэробами рода Clostridium;

4. Исследовать возможность использования и трансформации пестицидов (гербицидов) сахаролитическими анаэробами.

Научная новизна. Установлена трансформация различных фракций фульво- и гуминовых кислот пуринолитическими и протеолитическими анаэробами рода Clostridium. Более лабильные фульвокислотные фракции гумуса трансформируются интенсивнее и легче, чем фракции гуминовых кислот. Изменения гумусовых соединений в результате их трансформации анаэробными бактериями происходят по окислительно-гидролитическому пути, в результате чего в макромолекулах гумуса снижается доля периферической части, повышается ее обуглероженность, окисленность и ароматичность. При трансформации фракций гумуса пуринолитическими бактериями происходит деструкция не только алифатической, но и ядерной части молекул, в то время как протеолитические анаэробы использовали только периферическую часть гумусовых молекул без нарушения их ароматического ядра.

Впервые установлено, что сахаролитические анаэробы рода Clostridium обладают способностью к трансформации лигнина, которая сопровождается карбоксилированием и гидроксилированием молекул этого вещества, увеличением содержания в составе лигнина карбонильных групп и

снижением метоксилов. Микробная трансформация лигнина в первую очередь затрагивает алифатическую часть его молекул и незначительно сказывается на ароматических фрагментах. Выявлена способность к трансформации ксенобиотиков (гербицидов) у сахаролитических и протеолитических анаэробов.

Практическая значимость. Полученные в работе данные могут быть использованы при разработке практических приемов регулирования микробиологической трансформации гумуса и лигнина, а также для разработки научно-обоснованных мероприятий по направленному регулированию процесса разложения и детоксикации ксенобиотиков (гербицидов) в почве.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Природные вещества почвы и их состав

1.1.1. Гумус и его состав

Гумус составляет основу органического вещества почвы, и его содержание колеблется в пределах от 40 в южных сероземах до 300 т/га в тучных черноземах (Ковда, 1973).

Образовавшийся в результате сложных биохимических и чисто химических процессов гумус сравнительно устойчив к трансформации микроорганизмами. Методом меченых атомов установлено, что отдельные его фракции имеют возраст от 25 до 35 тысяч лет (Герасимов, 1970; Герасимов, Чичагова, 1971; Martin, Haider, 1971, Lada, 1976, Paul, 1984). В почве количество гумуса остается сравнительно постоянным, что свидетельствует о динамическом равновесии процессов его синтеза и распада. Если же накопление отстает от распада, то содержание гумуса в почве медленно падает.

Ежегодно трансформируется сравнительно небольшая часть почвенного гумуса. Так, в большинстве почв в среднем разлагается и обновляется от 2 до 4 т/га гумуса. В зональном аспекте эти показатели могут достигать более значительных величин: от 1% или менее в почве холодного климата до 25% - в тропических почвах. В регионах с умеренным климатом годовой обмен почвенного гумуса составляет в среднем 3% (Кононова, 1976; Александрова, 1980). Скорость разложения его биологическими и химическими агентами контролируется, главным образом, уровнем влажности, аэрации, температуры, значением pH, природой органического материала, минералогическим составом почв и др.

Современные представления о почвенном гумусе формировались в течение длительного времени. Уже в работах классиков естествознания XIX века К.Шпренгеля, Я.Берцелиуса и Г.Мульдера было установлено, что гумус почвы является природным образованием и главнейшие составные час-

ти его представлены сложными органическими соединениями специфической природы. Особо пристальное внимание к гумусу привлекло учение В.В. Докучаева о почве. Большое значение имели исследования П.А. Кос-тычева, установившего большую роль микроорганизмов в синтезе гумусовых веществ. Изучением химической природы гумуса занимались В.Р. Вильяме, С. Оден, A.A. Шмук, О.Шрайнер, Е.Шорн. Оригинальную концепцию о природе гумуса создал С.Ваксман, считавший, что главная масса гумуса представлена лигно-протеиновым комлексом.

На основании исследований природы и свойств гумусовых соединений они подразделяются на две основные группы: гуминовые и фульвокис-лоты. Гуминовые кислоты характеризуются слабой растворимостью в воде и обладают способностью накапливаться на месте своего образования. Фульвокислоты составляют группу воднорастворимых гумусовых соединений и относительно легко мигрируют по почвенному слою.

Рядом исследователей в составе гумусовых веществ в особую группу выделяют т.н. гумины, представляющие комплекс гуминовых кислот и фульвокислот, прочно связанный с минеральной частью почвы и не извлекающийся из нее при обычных способах экстрагирования (Орлов, 1974; Кауричев, 1982; Орчегова, 1992).

Деление это достаточно хорошо обосновано комплексом данных по их основным параметрам (разной растворимостью и осаждаемостью, различием в элементном составе, в деталях строения молекулы), а главное - в существенных различиях их роли в почвообразовании вследствие неодинаковой растворимости как самих кислот, так и их органо-минеральных производных.

Гуминовые кис