Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие азобензола и микрофлоры почвы

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие азобензола и микрофлоры почвы"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ РАСХН

На правах рукописи

РРБ ОД

* ДсК

КОНЕВА Наталия Данииловна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АЗОБЕНЗОЛА И МИКРОФЛОРЫ ПОЧВЫ

специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологи: РАСХН

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Ю.В.Круглов Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.И.Сухаревич кандидат биологических наук Ж.П.Попова

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный университет

Защита состоится «26» декабря 2000 года в 1030 часов на зе седании Диссертационного совета (К 020.26.01) по присуждению уче ной степени кандидата наук во Всероссийском научно исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологи (19 6608, Санкт-Петербург, Пушкин 8, шоссе Подбельского, д.З).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всерос сийского научно-исследовательского института сельскохозяйствен ной микробиологии.

Автореферат разослан_2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, канд. биол. наук

П06Ь сг/<ъ

А.Н.Зарецказ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Увеличение масштабов сельскохозяйственного и промышленного производства во всем мире отрицательно сказывается на состоянии биосферы. При этом если в развитых странах проблема загрязнения, в первую очередь, связана с гло-эальным ростом производства, то в развивающихся странах также важным моментом является отсутствие современных технологий переработки и недостаточность финансирования экологических программ.

Попадая в окружающую среду, ксенобиотики способны вызывать нарушения нормальных циклов биологического круговорота веществ, включаться в цепи питания и, вследствие этого, аккумулироваться живыми организмами. Риск аккумуляции живыми системами особенно велик для гидрофобных соединений, которые чаще всего устойчивы к деградации и сохраняются длительный период в окружающей среде. Среди таких веществ эдно из ведущих мест занимают азосоединения, включающие эбширную группу азокрасителей для текстильной, пищевой, фармацевтической, косметической и лакокрасочной промышленности, а также пестициды и продукты трансформации ряда гербицидов производных ароматических аминов. Некоторые из них обладают канцерогенными свойствами и представляют определенную опасность для экосистемы и здоровья человека.

Вместе с тем, до настоящего времени исследования ззаимодействия азосоединений и микрофлоры почвы не троводились, и в литературе данные о влиянии азобензолов на структуру микробного комплекса почвы и роли микроорганизмов в IX детоксикации практически отсутствуют.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы — -гаучить влияния азобензола на динамику развития и структуру Зактериального комплекса почвы, выяснить характер ззаимодействия почвенных микроорганизмов и гидрофобных зеществ и оценить возможность микробной деградации азобензола.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

• изучить влияние азобензола на комплекс аэробных гетеротрофных бактерий почвы;

■ выделить и идентифицировать обнаруженные виды бактерий; оценить их устойчивость к азобензолу в чистой культуре;

■ исследовать влияние азобензола на топографию распределения микроорганизмов в почве;

• оценить способность выделенных из почвы бактерий к трансформации азобензола.

Научная новизна исследования. На примере азобензола исследовано воздействие гидрофобных субстратов на формирование микробного комплекса почвы, его сукцессию и топографию распределения микроорганизмов. Отмечено несущественное влияние соединения на численность и видовое разнообразие комплекса гетеротрофных почвенных бактерий. В то же время, внесение ксенобиотика оказывает значительный эффект на пространственное распределение микроорганизмов в почве. Таким образом, проведенные исследования показали, что воздействие гидрофобных соединений на микрофлору почвы имеет микрозональный характер.

Дана оценка воздействия азобензола на рост микроорганизмов в чистой культуре, выделены устойчивые и чувствительные к нему формы.

Впервые выявлена способность азобензола, перемещаясь в геле и воздушном пространстве, аккумулироваться в колониях отдельных видов микроорганизмов, что связано с метастабиль-ностью соединения.

Из почвы и с поверхности частиц азобензола выделены бактерии, способные к колонизации и последующей дезинтеграции этого субстрата в почве. Показана трансформация азобензола выделенными штаммами гетеротрофных бактерий.

Практическая значимость. Произведена оценка воздействия азобензола на микрофлору почвы.

В ходе исследования из почвы выделены штаммы гетеротрофных бактерий и показана их способность к деградации азобензола. Выделенные штаммы могут быть использованы для исследования процессов трансформации азосоединений и разработки методов очистки природных источников.

Апробация работы. Результаты работы доложены на 3-м Международном симпозиуме по микробиологии пестицидов (Монхейм, Германия, 2000), на ежегодной рабочей сессии Учебно-научного центра «Экологический мониторинг природной среды» (Санкт-Петербург, 1999), а также Всероссийской конференции "Микробиология почв и земледелие" (Санкт-Петербург, 1998). По теме диссертации опубликованы 3 статьи.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из вне дения, обзора литературы, 4 глав экспериментальной части, заклю чения, выводов, списка литературы и 2 приложений. Работа изложе на на 133 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы, 1 рисунков. Библиография включает 130 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние азобензола на структуру комплекса гетеротрофных бактерий почвы изучали в модельных опытах. Использовали дерново-подзолистую легкосуглинистую хорошо окультуренную почву Ленинградской области (гумус 2.1%, рН солевой вытяжки 6.3). Для модельных опытов почву отбирали из пахотного слоя и просеивали ее через сито с отверстиями 3 мм в диаметре. В сосуды емкостью 500 мл вносили по 400 г почвы. Азобензол добавляли в почву в концентрации 50 мг/кг. Почвенные образцы инкубировали при постоянной температуре (+26°С) и влажности (50% от полной влагоемкости) в течение 4-х месяцев. Микробиологические анализы проводили в динамике на 1, 7, 30, 60 и 120 сутки инкубации почвенных образцов. Использовали стандартный метод посева почвенной суспензии на агаризованную глюкозопептонную среду с дрожжевым экстрактом. Влияние азобензола на видовое разнообразие бактерий почвы оценивали по изменению индекса видового богатства и индекса Шеннона (Одум, 1986).

Поскольку азобензол нерастворим в воде, и распределение его в почве носит дискретный характер, было изучено влияние азобензола на топографию распределения микроорганизмов в почве. Пространственное распределение микроорганизмов изучали методом стекол обрастания Н.Г.Холодного в модификации А.В.Рыбалкиной и Е.В.Кононенко (1953). С этой целью стерильные предметные стекла 2x5 см покрывались тонкой пленкой агаризованной среды, на поверхность которой наносились частицы азобензола, после чего стекла подсушивались в термостате при температуре +40°С, погружались в почву и инкубировались в течение трех месяцев. Использовали два варианта почвенных образцов: 1) почва преинкубировалась без азобензола; 2) почва предварительно инкубировалась с азобензолом (50 мг/кг). Микроскопический анализ препаратов проводили в динамике, наблюдения документировали микрофотографированием.

Выделение и дальнейшее культивирование почвенных микроорганизмов проводили на глюкозопептонной среде с дрожжевым экстрактом и крахмало-аммиачном агаре. В некоторых случаях использовали другие питательные среды, состав которых описан в соответствующих разделах диссертации. Выделенные штаммы бактерий хранили на агаризованной питательной среде под вазелиновым маслом.

Микроорганизмы со стекол обрастания выделяли методом

отпечатков на "голодном" и крахмало-эммиачном агаре, а также путем переноса отдельных кристаллов азобензола из почвы на поверхность агаризованной среды.

Выделенные из почвы штаммы бактерий и грибов были идентифицированы. Для их идентификации использовали морфолого-культуральные и физиолого-биохимические признаки (Литвинов, 1967; Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 19841989; Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991; Практикум по микробиологии, 1993; Определитель бактерий Берджи, 1997).

Оценка воздействия азобензола на выделенные штаммы микроорганизмов была произведена методом репликаций для бактерий и методом гигантских колоний для грибов.

Разложение азобензола изучали в жидкой культуре бактерий на минеральной среде Александера для бацилл и Эшби для азотфиксируюгцих бактерий, в которые вносили 1% спиртовой раствор азобензола из расчета 200 мг/л среды. Культивировали в стеклянных колбах емкостью 250 мл на качалках при 100 об/мин и температуре +28°С. Периодически из культуральной жидкости отбирали пробы для анализа.

Азобензол экстрагировали из культуральной жидкости двойным объемом бензола (Филов, 1964). Определение азобензола и возможных продуктов его трансформации - анилина, фенола, гидрохинона, хингидрона, р-оксибензойной кислоты и резорцина в пробе проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем Silufol (Чехословакия). Концентрацию азобензола определяли путем прямой колориметрии бензольного экстракта на фотоэлектроколориметре при 440 нм.

Математическую обработку результатов исследований проводили по Б.А.Доспехову (1985). Для оценки воздействия азобензола на бактериальный комплекс почвы использовали программу статистической обработки данных однофакторного эксперимента "Diana3", версия 1.02 на ПЭВМ (Воробьев Н.И.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние азобензола па комплекс гетеротрофньпс бактерий дерново-подзолистой почвы В модельных опытах было установлено, что азобензол не оказывал существенного влияния на динамику численности и качественный состав гетеротрофных бактерий в почве. В процессе работы было выделено 25 штаммов, которые на основании морфологических и физиолого-биохимических тестов были отнесены к 11 видам: Arthrobacter globiformis, Arthrobacter uratoxydans, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus polymyxa, Bacillus licheniformis, Curtobacterium sp., Micrococcus varians, Pseudomonas facilis, Pseudomonas stutzeri и Xanthomonas campestris (табл. 1).

Таблица 1. Структура бактериального комплекса почвы в ходе сукцессии (% от общей численности)

Сутки

1 7 30 60 120

Arthrobacter globiformis 26 20 15 15 12*

26 24 17 12 4

Arthrobacter uratoxydans 5 8 5 6 6

5 6 • 7 10 8

Bacillus cereus 6 6 8 11 14

6 4 10 11 10

Bacillus licheniformis 0 1 1 4 5

0 <1 1 3 4

Bacillus megaterium 9 8 15 17 15

9 11 11 19 21

Bacillus polymyxa <1 1 1 2 1

<1 <1 1 1 2

Curtobacterium sp. 33 35 40 11 23

33 36 34 16 24

Micrococcus varians 13 14* 5 17 7

13 ' 9 11 18 11

Pseudomonas facilis 5 4 6 11 12

5 4 5 6 13

Pseudomonas stutzeri <1 2 3 2 2

<1 1 1 2 1

Xanthomonas campestris 2 1 2 4 3

2 ■ 4 3 3 2

Примечание. Числитель — контроль, знаменатель — азобензол. *При Р>0.95 разница между вариантами существенна.

Показано, что на начальных этапах сукцессии в контрольном варианте доминировали СитЬоЪасЬеггит эр., АгИ1.д1оЫ/огт{з, Mic.varia.ns и Bac.megateriv.Tn. В ходе сукцессии наблюдались изменения в распределении видов в сообществе. Так, спустя месяц наблюдалось падение численности Мгс.уаггапз, а лидирующее положение занимали СигЬоЪасЬеНит ер., Arth.gloЪiformis и Вас.теда1ег1ит. Через два месяца численность этого вида снова возрастала и превышала численность СиНоЪа^еНит эр. и Arth.gloЪгformis (табл. 1).

После инкубации почвенных образцов в течение 120 суток ведущее положение в биоценозе занимали СигЬоЪасЬеНит эр., Вас.тедаЬетит, Вас.сегеиз, Рз./асШв и Arth.gloЫformis.

Ход сукцессии бактериального комплекса существенно не изменялся в присутствии азобензола. На 7-е сутки в варианте с азобензолом снижалась численность Мжлапапв по сравнению с контролем, коэффициент доли влияния фактора составил 0.76. Спустя 12С суток из группы доминирующих видов выпадал Arth.gloЫformis (коэффициент доли влияния фактора 0.98), а ведущее положение в бактериальном комплексе занимали два вида - СиНоЪаМепит зр. у Вас.тедаЬеНит (рис.1).

Виды

□ контроль В азобензол

Рис. 1. Влияние азобензола на сукцессию бактериального комплекса почвы. Виды бактерий: 1 — Си-НоЪасЬепит Бр., 2 — Arth.gloЪiformis, 3 — Мк^апапэ, 4 — Вас.теда1еггит, 5 - Вас.сегеиз, 6 -Рв./асгЪ^, 7 — АгЫг.игаЬохув.апз, 8 - Х.сатрезШБ, 9 -Рв^Шгеп, 10 — Вас.тро1утпуха, 11 — Bac.licheniformis

На протяжении двух месяцев разнообразие бактериального комплекса почвы, которое оценивали по изменению индекса видового богатства и индекса Шеннона, увеличивалось (рис.2). Однако спустя 4 месяца инкубации в варианте с азобензолом индекс Шеннона был ниже, чем в контроле, что говорит об изменении в структуре бактериального комплекса и снижении его разнообразия.

Индекс видового богатств Индекс Шеннона

Время, недель ВремЯ) неДели

В - контроль, □ - азобензол

Рис. 2. Изменение индексов, характеризующих экологическое состояние микробоценоза, в присутствии азобензола

Оценка токсического эффекта азобензола на рост бактерий, выделенных в ходе изучения сукцессии бактериального комплекса почвы

Нами была исследована реакция отдельных штаммов гетеротрофных бактерий в ответ на внесение в питательную среду азобензола в дозе 3.5, 10 и 15 мг на чашку Петри (15 мл). Отмечено, что на питательной среде, содержащей азобензол, происходило подавление роста Arth.globiformis уже при низкой дозе соединения. При концентрации 10 мг также ингибировались Mic.varians, X.campestris и Arth.uratoxydans. Рост Bac.polymyxa, напротив, усиливался в присутствии азобензола.

При высокой концентрации азобензола (15 мг) на чашках Петри наблюдали рост 11 из 25 штаммов, относящихся, главным образом, к роду Bacillus.

Было обнаружено, что различные штаммы бактерий одного и того же вида, не всегда проявляли сходную реакцию на внесение

азобензола. Так, два штамма, отнесенные к Вас-сегеия, подавлялись при внесении 10 мг соединения, тогда как один из выделенных штаммов этого вида активно развивался даже при высокой его дозе. Аналогичным образом проявлялось действие соединения на различные штаммы Вас.тедаЬеНитп. Азобензол в дозе 10 мг не оказывал влияния на рост трех штаммов вида, рост других четырех штаммов подавлялся. Одновременно с этим в присутствии азобензола наблюдалось активное развитие одного из штаммов. Различные штаммы, отнесенные к СигЪоЬа^еггит ер., проявляли сходную реакцию на внесение азобензола в питательную среду: их рост подавлялся в присутствии соединения.

При росте на среде с азобензолом наблюдалось окрашивание колоний большинства видов бактерий, выделенных из почвы, в ярко-оранжевый цвет, в ряде случаев усиливалось выделение слизи. Этот эффект сильнее проявлялся на среде Александера и менее на глюкозопептонной среде с дрожжевым экстрактом. Окрашивание наблюдалось при расположении бумажного фильтра с азобензолом как на поверхности агаризованной среды, так и на дне чашки - под слоем агара. С помощью качественной реакции с хлоридом олова (Губен-Вейль, 1963) было показано наличие азобензола в колониях бактерий. Последнее показывает, что азобензол способен диффундировать через гель и аккумулироваться в культуре микроорганизмов.

Далее была проверена способность бактерий к поглощению азобензола из газообразной фазы. С этой целью после посева бактериальных культур методом репликаций 100 мг порошка азобензола насыпали на дно крышки чашки Петри, после чего чашки инкубировали в перевернутом виде. Показано, что азобензол, как фумигант, может передвигаться в воздушной среде, выпадать в виде кристаллов на стенках чашки Петри и адсорбироваться бактериальными колониями, что имеет существенное значение при анализе транслокации азобензола в такой гетерогенной среде как почва и роли микроорганизмов в этом процессе.

Топография распределения микроорганизмов в почве под влиянием азобензола На стеклах обрастания азобензол обнаруживался в виде мелких частиц неправильной формы и кристаллов желто-оранжевого размером от 5 до 14 мкм. В процессе инкубации их в почве вокруг кристаллов и на их поверхности формировалась микрофлора, интенсивность и характер развития которой зависели от времени инкубации стекол в почве и состава среды, нанесенной на стекла (табл. 2).

В первый месяц инкубации на стеклах с голодным агаром, в тсутствии дополнительного энергетического материала, микробный юмплекс был представлен мелкими бактериальными клетками, :оторые располагались вокруг частиц азобензола, в некоторых лучаях на крупных частицах соединения присутствовали тдельные слизистые скопления бактериальных ¡слеток [икроколонии. Через 3 месяца появлялись мицелиальные формы [икроорганизмов. Происходила деструкция крупных и исчезновение [елких частиц азобензола в местах скопления бактериальных леток.

Таблица 2. Характер обрастания стекол в присутствии азобензола

(3 месяца)

Преинкубация почвы Преинкубация почвы без азобензола с азобензолом

X 1111Е>1 микроорганизмов Голодный агар Крахмал о-аммиачный агар Голодный агар Крахмало-аммиачный агар

Грибы + + + +

Актиномицеты + + + +

Споровые бак- ++ +++ +++ +++

терии

Мелкие палочки +++ ++ +++ ++

Кокки + +++ ++ +++

Крупные эллип- + +++ +++ +++

совидные бактерии

Примечание. Вокруг кристаллов азобензола — 1) рост микроорганизмов не наблюдается "-"; 2) встречаются отдельные клетки и редко группы "+"; 3) группы микроорганизмов вблизи и на поверхности частиц "++"; 4) колонии вблизи и на поверхности частиц повсеместно, наблюдается деструкция последних "+++".

В варианте опыта, где почва предварительно инкубировалась с зобензолом, обрастание кристаллов азобензола шло более [нтенсивно. Через месяц инкубации на поверхности частиц зобензола наблюдалось скопление мелких бактериальных клеток. 1ерез 2 месяца на стеклах обрастания присутствовали мелкие :оккобациллы и крупные эндоспорообразующие палочки, а также хицелий грибов. Происходило массовое обрастание частиц вещества 1актериями, при этом, вокруг одной частицы развивалась [реимущественно какая-то определенная монокультура бактерий. 1ерез 3 месяца инкубации в зоне расположения частиц развивались ■акже крупные эллипсовидные клетки. Наблюдалась деструкция [астиц азобензола.

На стеклах с крахмало-аммиачной средой обрастание части! азобензола микроорганизмами было более интенсивным х наблюдалось уже на 9 сутки в обоих вариантах опыта. Вокру) кристаллов азобензола и на их поверхности развивались различные формы бактерий (кокки, мелкие и крупные" "палочки эндоспорообразующие бактерии), гифы грибов и актиномицетов Спустя 3 месяца появлялись крупные овальные и эллипсовидные клетки бактерий. Наблюдалась деструкция кристаллов превращение их в аморфную массу.

Анализируя топографию распределения микроорганизмов i почве под воздействием азобензола, можно заключить, чте азобензол оказывает существенное влияние на пространственное перераспределение микроорганизмов, которое проявляется i концентрации вокруг частиц азобензола специфической микрофлоры, устойчивой к этому соединению. При этоь преимущественно развитие получают различные бактериальные формы микроорганизмов. Постепенно происходит массовое обрастание частиц азобензола бактериальными клетками v деструкция последних.

В ходе эксперимента со стекол обрастания были выделень бактерии родов Beijerinckia, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus Flavobaterium и Arthrobacter. При наличии энергетическогс материала все они хорошо росли на питательных средах включающих 0.1% азобензола, что говорит об их высокой устойчивости к этому соединению.

При культивировании различных штаммов Azotobacter Arthrobacter и Bacillus на агаризованных средах с добавленного азобензола наблюдалось окрашивание колоний бактерий в ярко-желтый цвет. Качественная реакция с хлоридом олова (Губен-Вейль, 1963) показала, что эта окраска обусловлена высокой концентрацией азобензола в них.

На крахмало-аммиачной среде в присутствии азобензола был* выделены три штамма грибов, идентифицированные Kai Trichoderma lignorum, Mucor sp., Pénicillium sp.

Методом гигантских колоний было показано, что a306eH30j оказывает на микроскопические почвенные грибы ингибирующи? эффект, который заключался в уменьшении радиальной скорости роста колоний и задержке спороношения. Токсичность азобензолг для микромицетов возрастала по мере увеличения его концентрации в среде.

Трансформация азобепзола выделенными из почвы бактериальными культурами В связи с полученными результатами встает вопрос относительно способности микроорганизмов к трансформации азобензола. Для исследования было отобрано 2 штамма споровых □актерий Вас.сегеиз и Вас.ро1утуха, выделенные при изучении сукцессии, и выделенные со стекол обрастания Аго1оЪас1ег эр. и Вецеггпскга ер. Было показано, что в присутствии азобензола в качестве единственного источника углерода рост их на минеральной среде отсутствовал. Последнее говорит о том, что азобензол не использовался бактериями в качестве источника энергетического материала. Как отмечалось выше, при росте на среде с глюкозой штамм Вас.сегеиз активно аккумулировал азобензол. Аналогично была обнаружена аккумуляция азобензола АгоЬоЪасЬег ер., что можно было наблюдать на начальном этапе инкубации чашек, поскольку со временем колонии приобретали черно-коричневую окраску вследствие накопления меланина. Колонии Вас.роХутуха и ВецеппсЫа ер. не накапливали азобензол, хотя активно развивались в его присутствии.

В жидкой культуре на полноценной среде с глюкозой с добавлением азобензола наблюдался интенсивный рост спорообразующих бактерий, который не отличался от контрольного варианта опыта. Последнее также доказывает, что азобензол не токсичен для этих микроорганизмов. Результаты анализа азобензола в культуральной жидкости представлены на рис. 3, из которого видно, что в процессе роста бактерий происходит интенсивное разложение азобензола. Содержание его в культурах Вас.сегеиз и Вас.ро1утуха на 14 сутки снижается на 47% и 33% (рис. 3).

Веуеппскт ер АгоЬоЪаЛет ер. Вас.ро1утуха

Вас.сегеиз Время, сутст

Рис. 3. Разложение азобензола в культуре бактерий 1 — ВецеггпсЫа зр., 2 — АгоЬоЪасЬег эр., 3 - Вас.сегеиз, 4 — Вас.ро1утуха

О 7 14 21

При выращивании АгоЬоЪа^ет эр. и Вецег1псМа эр. в жидкой культуре на среде с маннитом в присутствии азобензола значительного влияния на рост бактерий отмечено также не было. Происходило снижение концентрации азобензола на соответственно 30% и 25% (рис. 3).

По имеющимся источникам можно представить, что ключевым моментом деградации азобензола является разрыв двойной связи между двумя атомами азота в молекуле с образованием моноароматических производных, что было показано в целой серии работ, посвященных анаэробной деградации (цит. по РаБЙ-ОпяБЫ е! а1, 1992).

Нами были проанализированы экстракты бактериальных культур при деколоризации азобензола на наличие анилина, фенола, хингидрона, резорцина, р-оксибензойной кислоты и гидрохинона. На хроматограммах в экстрактах АгоЬоЪасЬег эр. и Вас.ро1утуха после инкубации культур в течение недели было обнаружено пятно по и окраске наиболее близкое к свидетелю-гидрохинону. Других возможных продуктов разложения азобензола не наблюдали ни в одном из экстрактов.

Из проведенного исследования можно сделать вывод, что почвенные бактерии способны к деградации азобензола. При этом важно подчеркнуть участие в этом процессе азотфиксирующих микроорганизмов. Возможно, в этом процессе принимает участие нитрогеназный комплекс, под действием которого происходит разрыв двойной связи между атомами азота в молекуле азобензола.

ВЫВОДЫ

1. Изучено влияние азобензола на сукцессию комплекса гетеротрофных аэробных бактерий дерново-подзолистой почвы. По результатам микробиологического анализа выделено 25 штаммов, которые на основании морфолого-культуральных и физиолого-биохимических признаков отнесены к 11 видам бактерий.

2. Установлено, что азобензол в концентрации до 50 мг/кг не оказывает влияние на динамику численности и видовой состав микрофлоры. На протяжении 4-х месяцев эти показатели были одинаковы с контрольным вариантом опыта.

3. Показано, что в ходе сукцессии происходит перестройка микробного комплекса за счет изменения относительного содержания в нем различных видов бактерий. Спустя 60 дней и до конца опыта в почве, содержащей азобензол, снижается видовое разнообразие, наблюдается более высокий индекс доминирования. Из состава доминирующих видов выпадает

АНк.д1оЫ/огтг8, что свидетельствует о кумулятивном эффекте этого соединения.

4. Используя методику стекол обрастания, показали, что действие азобензола на почвенную микрофлору имеет микрозональный характер. Это выражается в пространственном перераспределении микроорганизмов. Вокруг нерастворимых в воде частиц азобензола формируется специфическая микрофлора, включающая, главным образом, различные морфологические формы бактерий, которые со временем колонизируют поверхность этих частиц и разрушают их.

5. Обнаружено, что выделенные в ходе изучения сукцессии бактерии имеют различную чувствительность к азобензолу, что зависит как от вида, так и от штамма бактерий. Наиболее устойчивые из них способны адсорбировать и аккумулировать это соединение.

6. Установлено, что выделенные из почвы и со стекол обрастания бактерии Васхетеив, Вас.ро1утуха, АгоЬоЪасЫг эр. и ВщеппсЫа эр. способны к деградации азобензола. При этом разрушается хромофорная группа этого соединения. Среди продуктов трансформации обнаружен гидрохинон, что говорит о разрыве двойной связи между атомами азота в молекуле.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Конева Н.Д. Влияние азобензола на структуру бактериального комплекса дерново-подзолистой почвы // «Микробиология почв и земледелие» Тез. докл. Всероссийской конференции, Санкт-Петербург, 13-17 апреля 1998 г. - Санкт-Петербург, 1998. - С. 89.

2. Конева Н.Д. Взаимодействие азобензола и микрофлоры почвы // Материалы ежегодной рабочей сессии Учебно-научного центра "Экологический мониторинг природной среды". - Санкт-Петербург, 1999. - С.34-35.

3. Koneva N., Kruglov Yu. Azobenzene and Soil Microflora Interaction // The 3rd International Symposium on Environmental Aspects of Pesticide Microbiology: Monheim, 22-27 July 2000. - Monheim, 2000. - P.28.

Научное издание Отпечатано на дубликаторах ООО "ИННОВАЦИОННЫЙ ЦЕНТР ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ" ВИЗР Лицензия ПЛД № 69-253

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Конева, Наталия Данииловна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Взаимодействие микроорганизмов и гидрофобных ксенобиотиков.

1.1.1. Микробиологическая трансформация ксенобиотиков.

1.1.2. Механизм взаимодействия микроорганизмов и гидрофобных соединений.

1.2. Азобензол - нерастворимое синтетическое органическое соединение.

1.2.1. Свойства и применение азобензолов.

1.2.2. Токсичность азобензолов и продуктов их трансформации.

1.3. Разложение азобензолов в окружающей среде.

1.3.1. Общие вопросы очистки окружающей среды от химического загрязнения.

1.3.2. Физико-химические методы деструкции азосоединений.

1.3.3. Биотрансформация азобензолов.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследования.42.

2.2. Исследование влияния азобензола на структуру микробного комплекса почвы.

2.3. Методы идентификации выделенных культур микроорганизмов.

2.4. Изучение взаимодействия азобензола и почвенных микроорганизмов.

2.4.1. Оценка токсического эффекта азобензола на выделенные штаммы микроорганизмов.

2.4.2. Анализ способности выделенных штаммов почвенных бактерий к трансформации азобензола.

Глава 3. ВЛИЯНИЕ АЗОБЕНЗОЛА НА КОМПЛЕКС ГЕТЕРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЫ.

3.1. Структура комплекса гетеротрофных бактерий почвы при внесении азобензола.

3.2. Оценка токсического эффекта азобензола на рост бактерий, выделенных в ходе изучения сукцессии.

Глава 4. ПРОСТРАНСТВЕННОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРООРГА

НИЗМОВ В ПОЧВЕ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ АЗОБЕНЗОЛА.

4.1. Топография распределения почвенных микроорганизмов под влиянием азобензола.

4.2. Выделение микроорганизмов, колонизирующих субстрат.

Глава 5. ТРАНСФОРМАЦИЯ АЗОБЕНЗОЛА ВЫДЕЛЕННЫМИ ИЗ

ПОЧВЫ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КУЛЬТУРАМИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие азобензола и микрофлоры почвы"

Каждый год в биосферу поступает более 1000 новых соединений. По данным на 1988 год валовое ежегодное мировое производство синтетических органических соединений составляет свыше 300 миллионов тонн. Отмечено, что в развитых странах поступление в окружающую среду опасных отходов варьирует от 12 до 600 кг на человека каждый год (Решэоп, 1988).

К основным химическим загрязнителям относятся: пестициды, галогенсодержащие алифатические углеводороды, ароматические соединения, нитро - и хлорароматические углеводороды, полихлорированные бифенилы, фталатные эфиры, полициклические ароматические углеводороды и нитрозамины. Серьезную опасность для экологических систем представляют гидрофобные ксенобиотики, которые, как правило, наиболее устойчивы к микробной деградации. В ряде исследований отмечена способность к накоплению в тканях растений и животных таких труднорастворимых соединений как симтриазиновые гербициды (симазин, атразин), производные мочевины (диурон, монурон) и ДДТ (Бурый и др., 1975; Тинсли, 1982).

В условиях наземной среды химические соединения в конечном итоге оказываются в почве. Химическое загрязнение приводит к изменению таксономической структуры и ухудшению качества почвенного покрова.

Разрушение и превращение поступающих в почву веществ происходит, главным образом, под воздействием микроорганизмов. Отмечено, что в разложении пестицидов наиболее активны представители родов Alcaligenes, Flavobacterium, Pseudomonas и Rhodococcus (Aislabie, Lloydjones, 1995). В процессах биотрансформации могут также принимать участие представители животного и растительного мира, но они способны усваивать только те химические соединения, которые относятся к нормальным метаболитам живой клетки. Микроорганизмы используют соединения как природного, так и синтетического происхождения.

Процессы микробной трансформации ксенобиотиков лежат в основе процессов детоксикации, деконтаминации и биоремидиации почвы. Но биотрансформация ксенобиотиков в почве может приводить как к положительным, так и к отрицательным, с точки зрения человека, эффектам. С последней проблемой сталкивается сельское хозяйство в тех случаях, когда трансформация используемых пестицидов идет ускоренными темпами. Иногда в процессе биотрансформации образуются более токсичные соединения, чем исходное вещество. Изучение взаимодействия ксенобиотиков и почвенной микрофлоры имеет ряд важных прикладных аспектов: во-первых, это - экотоксикологическая оценка влияния синтетических соединений в почве, во-вторых, очистка окружающей среды от химического загрязнения. Особый интерес в этом плане представляют гидрофобные ксенобиотики, к которым относится большинство используемых в сельском хозяйстве пестицидов, а также полихлорароматические и азосоединения.

Химическая природа пестицидов весьма разнообразна - они относятся более чем к 20 различным группам соединений (Мельников, 1985). Наиболее широко используют феноксипроизводные, производные карбаминовой и тиокарбаминовой кислот, триазина, мочевины, урацила и аминов. В качестве инсектицидов в больших количествах применяют фосфорорганические и хлорорганические соединения, а также производные карбаминовой кислоты. Находят применение также различные вещества, содержащие мышьяк и растительные яды. В качестве фунгицидов используют соединения меди, ртути и т.д.

Актуальность темы. Увеличение масштабов сельскохозяйственного и промышленного производства во всем мире отрицательно сказывается на состоянии биосферы. При этом если в развитых странах проблема загрязнения, в первую очередь, связана с глобальным ростом производства, то в развивающихся странах также важным моментом является отсутствие современных технологий переработки и недостаточность финансирования экологических программ.

Попадая в окружающую среду, ксенобиотики способны вызывать нарушения нормальных циклов биологического круговорота веществ, включаться в цепи питания и, вследствие этого, аккумулироваться живыми организмами. Риск аккумуляции живыми системами особенно велик для гидрофобных соединений, которые чаще всего устойчивы к деградации и сохраняются длительный период в окружающей среде. Среди таких веществ одно из ведущих мест занимают азосоединения, включающие обширную группу азокрасителей для текстильной, пищевой, фармацевтической, косметической и лакокрасочной промышленности, а также пестициды и продукты трансформации ряда гербицидов производных ароматических .аминов. Некоторые из них обладают канцерогенными свойствами и представляют определенную опасность для экосистемы и здоровья человека.

Вместе с тем, до настоящего времени исследования взаимодействия азосоединений и микрофлоры почвы не проводились, и в литературе данные о влиянии азобензолов на структуру микробного комплекса почвы и роли микроорганизмов в их детоксикации практически отсутствуют.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучить влияния азобензола на динамику развития и структуру бактериального комплекса почвы, выяснить характер взаимодействия почвенных микроорганизмов и гидрофобных веществ и оценить возможность микробной деградации азобензола.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

Изучить влияние азобензола на комплекс аэробных гетеротрофных бактерий почвы.

Выделить и идентифицировать обнаруженные виды бактерий. Оценить их устойчивость к азобензолу в чистой культуре.

Исследовать влияние азобензола на топографию распределения микроорганизмов в почве.

Оценить способность выделенных из почвы бактерий к трансформации азобензола.

Научная новизна исследования. На примере азобензола исследовано воздействие гидрофобных субстратов на формирование микробного комплекса почвы, его сукцессию и топографию распределения микроорганизмов. Отмечено несущественное влияние соединения на численность и видовое разнообразие комплекса гетеротрофных почвенных бактерий. В то же время, внесение ксенобиотика оказывает значительный эффект на пространственное распределение микроорганизмов в почве. Таким образом, проведенные исследования показали, что воздействие гидрофобных соединений на микрофлору почвы имеет микрозональный характер.

Дана оценка воздействия азобензола на рост микроорганизмов в чистой культуре, выделены устойчивые и чувствительные к нему формы.

Впервые выявлена способность азобензола, перемещаясь в геле и воздушном пространстве, аккумулироваться в колониях отдельных видов микроорганизмов, что связано с метастабильностью соединения.

Из почвы и с поверхности частиц азобензола выделены бактерии, способные к колонизации и последующей дезинтеграции этого субстрата в почве. Показана трансформация азобензола выделенными штаммами гетеротрофных бактерий.

Практическая значимость. Произведена оценка воздействия азобензола на микрофлору почвы.

В ходе исследования из почвы выделены штаммы гетеротрофных бактерий и показана их способность к деградации азобензола. Выделенные штаммы могут быть использованы для исследования процессов трансформации азосоединений и разработки методов очистки природных источников.

Апробация работы. Результаты работы доложены на 3-м Международном симпозиуме по микробиологии пестицидов (Монхейм,

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Конева, Наталия Данииловна

выводы

1. Изучено влияние азобензола на сукцессию комплекса гетеротрофных аэробных бактерий дерново-подзолистой почвы. По результатам микробиологического анализа выделено 25 штаммов, которые на основании морфолого-культуральных и физиолого-биохимических признаков отнесены к 11 видам бактерий.

2. Установлено, что азобензол в концентрации до 50 мг/кг не оказывает влияние на динамику численности и видовой состав микрофлоры. На протяжении 4-х месяцев эти показатели были одинаковы с контрольным вариантом опыта.

3. Показано, что в ходе сукцессии происходит перестройка микробного комплекса за счет изменения относительного содержания в нем различных видов бактерий. Спустя 60 дней и до конца опыта в почве, содержащей азобензол, снижается видовое разнообразие, наблюдается более высокий индекс доминирования. Из состава доминирующих видов выпадает. АлЪ^оЫГопшз, что свидетельствует о кумулятивном эффекте этого соединения.

4. Используя методику стекол обрастания, показали, что действие азобензола на почвенную микрофлору имеет микрозональный характер. Это выражается в пространственном перераспределении

102 микроорганизмов. Вокруг нерастворимых в воде частиц азобензола формируется специфическая микрофлора, включающая, главным образом, различные морфологические формы бактерий, которые со временем колонизируют поверхность этих частиц и разрушают их.

5. Обнаружено, что выделенные в ходе изучения сукцессии бактерии имеют различную чувствительность к азобензолу, что зависит как от вида, так и от штамма бактерий. Наиболее устойчивые из них способны адсорбировать и аккумулировать это соединение.

6. Установлено, что выделенные из почвы и со стекол обрастания бактерии Вас.сегеиБ, Вас. ро1утуха, АгоШЬайег эр. и Вецегтскга Бр. способны к деградации азобензола. При этом разрушается хромофорная группа этого соединения. Среди продуктов трансформации обнаружен гидрохинон, что говорит о разрыве двойной связи между атомами азота в молекуле.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе мы рассмотрели взаимодействие гидрофобного ксенобиотика азобензола и микрофлоры почвы. Как отмечалось, азосоединения широко присутствуют в объектах окружающей среды, поскольку используются как в сельском хозяйстве, так и в промышленности.

В природе гетеротрофный процесс разложения (катаболизма) химических соединений осуществляется, в первую очередь, под воздействием микроорганизмов - грибов, актиномицетов и бактерий. Гетеротрофные бактерии способны к разложению широкого круга химических соединений. Очевидно, что изучение воздействия ксенобиотиков на структурное разнообразие гетеротрофных микроорганизмов почвы, куда попадает основная масса химических загрязнителей, представляет теоретический и практический интерес.

Проведенные нами исследования показали, что азобензол не оказывает существенного влияния на качественный состав и динамику общей численности гетеротрофных бактерий почвы. Ход сукцессии бактериального комплекса также существенно не изменялся под влиянием азобензола, незначительные изменения наблюдались только после длительной инкубации и были связаны с реакцией отдельных видов бактерий. Анализ интегральных показателей видового разнообразия подтвердил полученные данные. Видовое богатство и выравненность сообщества в ходе сукцессии постепенно увеличивались, при этом, введение в почву азобензола существенно не изменяло направленности процесса.

Известно, что в почве гидрофобные ксенобиотики распределяются неравномерно - в виде отдельных частиц и микрокапель, поэтому их воздействие на микрофлору часто носит микрозональный характер (Круглов, 1991). В связи с этим, нами было изучено влияние соединения на топографию распределения микроорганизмов в почве.

Было показано, что гидрофобные свойства соединения в значительной степени определяют характер его взаимодействия с почвенными микроорганизмами. Установлено, что действие азобензола на почвенную микрофлору имеет пространственный характер и проявляется в перегруппировке микроорганизмов вблизи поверхности частиц. Вокруг частиц и на их поверхности формируется устойчивая микрофлора, при этом, как правило, у поверхности частиц развивается какая-либо одна культура микроорганизмов, преимущественно вытесняя другие. Степень и характер обрастания частиц зависят от времени инкубации и состава питательной среды, нанесенной на стекла. Наблюдали обрастание частиц азобензола различными формами бактерий - эллипсовидными клетками, мелкими и крупными палочками, эндоспорообразующими бактериями; мицелиальные формы вокруг частиц развивались реже и были, в основном представлены актиномицетами. Со стекол обрастания были выделены некоторые штаммы почвенных микроорганизмов и изучена их способность к трансформации соединения.

Была произведена оценка роста на агаризованной среде в присутствии азобензола почвенных бактерий, выделенных в ходе изучения сукцессии. Обнаружен токсический эффект азобензола на отдельных представителей почвенной микрофлоры при их непосредственном выращивании на питательных средах с добавлением вещества. Такие бактерии могут быть потенциальными индикаторами присутствия азобензола в окружающей среде. Был также отмечен ингибирующий эффект азобензола на микромицеты, выделенные из почвы. Последний заключался в уменьшении радиальной скорости роста и задержке спороношения. Это подтверждает описанную ранее картину на стеклах обрастания. Токсичность азобензола для микроорганизмов возрастала по мере увеличения его концентрации в среде.

Соответственно литературным данным, которые обсуждались выше, было отмечено токсическое действие азосоединений на Salmonella typhimurium (Mori et al, 1986; Graver et al, 1996) и нитрифицирующих бактерий (He, Bishop, 1994) при росте на питательных средах в их присутствии. По-видимому, в питательной среде азобензол представлен в более доступной для микроорганизмов форме, нежели в почве, где может происходить его сорбция почвенными частицами, а также рассеивание в газообразном виде в открытом пространстве.

Вместе с тем, было обнаружено, что часть микроорганизмов способна активно взаимодействовать с азобензолом, аккумулировать и трансформировать его.

Важным фактом является наличие у азобензола, кроме гидрофобности, метастабильных свойств. В частности, именно с метастабильностью, в первую очередь, мы связываем способность соединения к аккумуляции в живой природе. Ранее отмечалась способность азосоединений к аккумуляции в тканях животных (Allinson, Morita, 1995), это свойство также называют биоконцентрацией. Нами была показана способность азобензола аккумулироваться отдельными почвенными микроорганизмами. При этом, бактерии, которые накапливали азобензол, как правило, активно росли в его присутствии и обнаруживали, вместе с тем, накопление слизи. Особенно активно этот процесс происходил у представителей рода Bacillus, которые также отличались высокой толерантностью к соединению и росли на питательных средах при его значительном содержании. Происходит ли поступление в клетку аккумулированного азобензола, или он находиться непосредственно в колониальной массе, предстоит выяснить. Нам представляется наиболее вероятным, что азобензол в виде кристаллов содержится в слизи на поверхности клеток и, одновременно, может поступать внутрь клетки в газообразной форме. Это предположение было отчасти визуально подтверждено при микроскопировании колониальной слизи и обрывков грибного мицелия. При этом клетки имели различимое желтое окрашивание по сравнению с контролем, наблюдались и отдельные кристаллы соединения на поверхности микробных клеток и в слизи. Также при изучении под лупой отмечалось наличие более крупных кристаллов непосредственно на поверхности колоний. При этом азобензол обнаруживали не в виде аморфных частиц, которые наблюдаются при микроскопировании порошка соединения, а в виде кристаллов в форме звездочек. По-видимому, происходила миграция соединения через толщу к среды в газообразной форме и последующее осаждение вокруг центров кристаллизации. Была также показана способность азобензола к миграции через воздушное пространство с последующей биоконцентрацией почвенными микроорганизмами. Более детальный анализ описанного свойства биоконцентрации азобензола лежит за рамками данного исследования. Также мы не нашли ни одной работы посвященной взаимодействию метастабильных химических соединений и живой клетки.

Помимо прочего, нами был изучен другой аспект взаимодействия микроорганизмов с субстратом - биотрансформация соединения. Нами были использованы почвенные гетеротрофные бактерии, выделенные при изучении сукцессии, а также выделенные со стекол обрастания. В литературных источниках сообщается о деколоризации растворов азокрасителей в культурах Bacillus и некоторых кишечных бактерий, как отмечалось в литературном обзоре. Нами впервые показана возможность участия в этом процессе азотфиксирующих бактерий, обладающих способностью разрушать связи между атомами азота.

Микроорганизмы, обладая уникальными физиолого-биохимическими свойствами, способны к утилизации гораздо более широкого круга химических веществ, чем высшие организмы. Вопросы взаимовлияния различных химических соединений и микроорганизмов представляют, прежде всего, значительный практический интерес, причем особое значение имеет тщательное исследование взаимодействия микроорганизмов и гидрофобных соединений.

Знания в области взаимодействия нерастворимых в воде соединений и микроорганизмов, в первую очередь бактерий и микроскопических грибов, может быть использованы в различных отраслях человеческой деятельности

100

- фундаментальной науке, медицине, сельском хозяйстве и экологическом природопользовании.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Конева, Наталия Данииловна, Санкт-Петербург

1. Баркан Я.Г. Органическая химия. М.: Высшая школа, 1973. - 552 с.

2. Бызов Б.А. Гидролитики как функциональная группа микроорганизмов-деструкторов органических веществ в почве // Микробиологическая деструкция органических остатков в биогеоценозе. Тез. докл. Всесоюз. совещ. Москва. - 1987. - с. 19-21.

3. Головлева Л.А., Головлев Е.Л. Микробиологическая деградация пестицидов//Успехи микробиологии. 1980.-№ 15.-С.137-179.

4. Губен-Вейль. Методы органической химии. Методы анализа. М.: Изд-во Хим.лит-ры, 1963. - 1032 с.

5. Дажо Р. Основы экологии. М.: Прогресс, 1975. - 415с.

6. Динамика малых микробных экосистем и их звеньев / Под ред. Н.С. Печуркина. Новосибирск: Наука, 1981. - 249 с.

7. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М.: Колос, 1979. - 416с.

8. Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. -М.: МГУ, 1983.-307с.

9. Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. М.: МГУ, 1973. - 176с.

10. Илялетдинов А.Н., Алиева P.M. Микробиология и биотехнология очистки промышленных сточных вод. Алма-ата: Гылым, 1990. - 197 с.

11. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М.: Наука, 1982. - 144 с.

12. Кнунянц И.Л. Краткая химическая энциклопедия. М.: Совет.энцик-дия, 1964,- 1262 с.

13. Круглов Ю.В. Микробиологические аспекты применения гербицидов в сельском хозяйстве: Дис. д-ра биол. наук. Ленинград, 1984. - 419с.

14. Круглов Ю.В. Микрофлора почвы и пестициды. М.: Агропромиздат, 1991. - 128с.

15. Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов. Л.: Наука, 1967. - 304с.

16. Мельников H.H. Химия пестицидов. М.: Химия, 1968. - 496с.

17. Метелев В.В., Канаев А.И., Дзасохова Н.Г. Водная токсикология. М.: Колос, 1971. - 247с.

18. Методы почвенной микробиологии и биохимии /Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1991. - 304 с.

19. Мишустин E.H., Емцев В.Т. Микробиология. М.: Агропромиздат, 1987. -368с.

20. Одум Ю. Экология. М.: Мир, 1986, т.2. - 376с.

21. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, Дж.Стейнли, С.Уилльямса. М.: Мир, 1997. - т. 1,2.- 799 с.

22. Печуркин НС. Популяционная микробиология. Новосибирск: Наука, 1978.- 258с.

23. Печуркин Н.С., Брильков A.B., Марченкова Т.В. Популяционные аспекты биотехнологии. Новосибирск: Наука, 1990. - 172с.

24. Порай-Кошиц Б.А. Азокрасители. Л.: Химия, 1972. - 160с.

25. Практикум по микробиологии /Под ред. Е.З.Теппер, Е.К.Шильниковой, Г.И.Переверзевой.- 4-е изд. перераб. М.: Колос, 1993. - 175с.

26. Риклефс Р. Основы общей экологии. М.: Мир, 1979. - 424с.

27. Ротмистров М.Н., Гвоздяк П.И., Ставская С.С. Микробная деструкция синтетических органических соединений. Киев: Наук. Думка, 1975. - с.245.

28. Рыбалкина A.B., Кононенко Е.В. Непосредственное наблюдение микрофлоры в почве модифицированным методом Холодного // Микробиология. -1953. т. XXII, вып. 4. - 439-444с.

29. Синицин А.П., Райкина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: МГУ, 1994. - с.288.

30. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наукова думка, 1990. -с.264.

31. Смит Дж.М. Модели в экологии. М.: Мир, 1976. - 184с.

32. Справочная книга по ветеринарной токсикологии пестицидов. М.: Колос, 1976. -272с.

33. Справочник по пестицидам / Под ред. Мельникова H.H. М.: Химия, 1985.- 352с.

34. Ставская С.С., Удод В.М., Таранова A.A., Кривец И.А. Микробиологическая очистка воды от поверхностно-активных веществ. -Киев: Наукова думка, 1988. 234 с.

35. Сухопарова В.П., Соколов М.С. Сорбционно-десорбционное взаимодействие фенилмочевинных гербицидов с некоторыми типами почв // Механизм действия гербицидов и синтетических регуляторов роста растений. Междунар. симпозиум. Уфа, 1984. - 99-106с.

36. Сэги Й. Методы почвенной микробиологии. М.: Колос, 1983. - 296 с.

37. Тинсли И. Поведение химических загрязнителей в окружающей среде. -М.: Мир, 1982. -280с.

38. Уткин И.Б., Якимов М.М., Козляк Е.И. Деструкция токсичных органических соединений микроорганизмами // Биологическая химия. -Итоги науки и техники /ВИНИТИ/. М., 1991. - т.43. - С. 175.

39. Филов В.А. Определение ядохимикатов в биологических субстратов. -М.-Л.: Наука, 1964. 251с.

40. Холодный Н.Г. Методы непосредственного наблюдения почвенной микрофлоры. Микробиология. - 1935. - т.4, вып. 2. - 439-442с.

41. Шамшурин A.A., Кример М.З. Физико-химические свойства органических ядохимикатов и регуляторов роста. М.: Наука, 1966. - 172с.

42. Экологическая роль микробных метаболитов / Под ред. Д.Г.Звягинцева -М.: Изд-во МГУ, 1986. 237с.

43. Adams C.D., Fusco W., Kanzelmeyer Т. Ozone, hydrogen peroxide, ozone and UV ozone treatment of chromium- and copper-complex dyes decolorization and metal release // Ozone-Sci. and Engineering, 1995. - V.17. - № 2. - P. 149-162.

44. Adams R.L., Weber E.J., Baughman G.L. Photolysis of smoke dyes on soils // Environ.Toxicol. and Chem., 1994. V. 13. - № 6. - P.889-896.

45. Aislabie J., Lloydjones G. A review of bacterial degradation of pesticides // Australian J. Soil Research, 1995. V.33. - № 6. - P.925-942.

46. Ali T.A., Wainwright M. Effect of Phanerochaete chrysosporium on transformation of urea, sulphur-coated urea and peptone in soil // Bioresource TechnoL, 1995. V.53. - № 1. - P. 91-93.

47. Allinson G., Morita M. Bioaccumulation and toxic effect of elevated levels of 3,3',4,4'-tetrachloroazobenzene (33'44'-TCAB) towards aquatic organisms // Chemosphere, 1995. V. 30. - № 2. - P.215-242.

48. Asconcabrera M.A., Lebeault J.M. Cell hydrophobicity influencing the activity stability of xenobiotic-degrading microorganisms in a continuous biphasic aqueous-organic system // J. Fermentation and Bioengineering, 1995. V.80. - №3. - P.270-275.

49. Audus L. The Physiology and Biochemistry of Herbicides. Acad.Press., London-New York; 1964, p. 163-206.

50. Banat J.M., Nigam P., Singh D., Marchant R. Microbial decolorization of textile-dye-containing effluents // Bioresource Technol., 1996. V.58. - № 3. -P.217-227.

51. Barbone F., Detzell E., Austin H., Cole P. Exposure to epichlorohydrin and central nervous system neoplasm at a resin and dye manufacturing plant // Archives Environment. Health, 1994. V. 49. - № 5. - P. 355-358.

52. Bartha R. Microbial transformations and environmental fate of some phenylamide herbicides // Roczniki gleboznawcze, Warszawa, 1975. V. XXVI. -№2.-P. 17-24.

53. Bayman P., Ritchey S.D., Bennett J.W. Fungal interactions with the explosive RDX (hexahydro-l,3,5-trinitro-l,3,3-triazine)//J. Industrial Microbiology, 1995. -V. 15. № 5. - P.418-423.

54. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / J.G.Holt (ed) Baltimore: Williams and Wilkins Co., 1984-1989.

55. Bogan B.W., Lamar R.T. Polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading capabilities of Phanerochaete laevis HHB-1625 and its extracellular ligninolytic enzymes // Appl. and Environment. Microbiol., 1996. V.62. - N 5. - P. 1597-1603.

56. Bollag J.M., Shuttleworth K.L., Anderson D.H. Laccase-mediated detoxification of phenolic compounds // Appl. and Environment. Microbiol., 1988. -V. 54. -№ 12. -P.3086-3091.

57. Carliell C.M., Barclay S.J., Naidoo N., Buckley C.A., Mulholland D.A., Senior E. Microbial decolorisation of a reactive azo dye under anaerobic conditions // Water SA, 1995. V.21. - № 1. - P.61-69.

58. Chan W.F., Larson R.A. Formation of azobenzenes and azoxybenzenes from the aqueous reactions of anilines and ozone // Ozone-Sci and Engineering, 1995. -V. 17. № 6. - P.619-625.

59. Chao W.L., Lee S.L. Decoloriation of azo dyes by 3 white-rot fungi influence of carbon source // World J. Microbiol, and Biotechn., 1994. - V. 10. - № 5. -P.556-559.

60. Chivukula M., Renganatan V. Phenolic azo dye oxidation by laccase from Pyricularia oryzae // Appl. and Environment. Microbiol., 1995. V.61. - № 12. -P.4374-4377.

61. Cheung Y.L. Mutagenicity and CYP1A induction by azobenzenes correlates with their carcinogenecity// Carcinogenesis, 1994. V.15. - № 6. - P. 1257-1263.

62. Chung K.T., Chen S.C., Zhu Y.Y., Wong T.Y., Stevens S.E. Toxic effects of some benzamines on the growth of Azotobacter vinelandii and other bacteria // Environment.Toxicol. andChem., 1997.-V. 16.-№ 7. P. 1366-1369.

63. Dalton H., Stirling D.J. Co-metabolism // Phil.Trans.R.Soc.Lond., 1982.-B297-P.481-496.

64. Depaolis F., Kukkonen J. Binding of organic pollutants to humic and fulvic acids influence of pH and the structure of humic material // Chemosphere, 1997. -V.34. - № 8. - P.1693-1704.

65. Dieckman M.S., Gray K.A., Zepp R.G. The sensitized photocatalysis of azo dyes in a solid system a feasibility study // Chemosphere, 1994. - V.28. - № 5. -P.1021-1034.

66. Ensign J.C., Wolfe R.S. Nutritional control of morphogenesis in Arthrobacter crystallopoites // J. Bacterid., 1964. V.3. - № 5. - P.924-932.

67. Entry J.A., Donnelly P.K., Emmingham W.H. Mineralization of atrazine and 2,4-D in soils inoculated with Phanerochaete chrysosporium and Trappea darkeri // Appl. Soil Ecol., 1996. V.3. - № 1. - P.85-90.

68. Ewald G., Larsson P. Partioning of C-14-labelled 2,2',4,4'-tetrachlorobiphenyl between water and fish lipids//Environment. Toxicol, and Chem., 1994. V.13. -№10. - P.1577-1580.

69. Fewson C.A. Biodégradation of xenobiotic and other persistent compounds: the causes of recalcitrance // J. Trends. Biotechnol., 1988. V.6. - № 7. - P. 148153.

70. Fitzgerald S.W., Bishop P.L. Two stage anaerobic aerobic treatment of sulfonated azo dyes // J. Environment. Sci and Health, 1995. V.30. - № 6. -P.1251-1276.

71. Fu Y.C., Jiang H.S., Bishop P.L. An inhibition study of the effect of azo dyes on bioactivity of biofilms//Water Sci and Techn., 1994. V.29. - № 7. - P.365-372.

72. Fu Y.C., Bishop P.L. The evaluation of respiration rate in fixed-film system under various organic loading rates // Water Environment Research, 1995. V. 67. - № 7. - P.1036-1043.

73. Gahr A., Weil L., Neissner R. Polychromatic actinometry with filter solutions //Water Research, 1995. V. 29. - № 9. - P.2125-2137.

74. Ganesh R., Boardman G.D., Michelsen D. Fate of azo dyes in sludges // Water Research, 1994. V. 28. - № 6. - P. 1367-1376.

75. Gomes R-., Liteplo R.G., Meek M.E. Aniline evaluation of risks to health from environmental exposure in Canada // Environment. Carcinogenesis and Ecotoxicol. Rev.- Part C of J. Environment. Sci and Health, 1994. V.12. - № 2. - P.135-144.

76. Grover J.S., Kaur A., Mahajan R.K. Mutagenecity of some dye effluents // National Academy Sci Letters India, 1999. - V. 19. - № 7-8. - P.149-158.

77. Hamzah R.Y., Eltorkey N.M. Mutagenic activities of aromatic amines in

78. Salmonella typhimurium and its effect on rat drug metabolizing enzymes // Arab. Gulf J. Scientific Research, 1995.-V. 13. № 1. - P. 13-23.

79. Haring R.C. Azobenzene as an acaricide and insecticide // J. Economic Entomol., 1946. V.39. - № 1,- P. 78-81.

80. He Y.J., Bishop P.L. Effect of acide orange 7 on nitrification process // J. Environment. Engineering, 1994. V. 120. -№ 1. - P. 100-121.

81. Heinfling A., Bergbauer M., Szewzyk U. Biodégradation of azo and phthalayanine dyes by Trametes versicolor and Bjerkandera adusta // Appl. Micol. and Biotechn., 1997. V.48. - № 2. - P.261-266.

82. Hustert K., Moza P.N. Photocatalytic degradation of azo dyes by semiconducting iron compounds // Fresenius Environment. Bulletin, 1995. V. 13. -№ 1. - P. 13-23.

83. Karthikeyan S., Wolfaardt G.M., Kerber D.R., Caldwell D.E. Functional and structural responses of a degradative microbial community to substrates with varying degrees of complexity in chemical structure // Microbial Ecol., 1999. -V.38. № 2 - P.215-224.

84. Kaufmann D.D. Microbial metabolites of aniline-based herbicides // Roczniki gleboznwcze, Warszawa, 1975. V.XXVI. - № 2. - P.4-15.

85. Kim S.J., Ishikawa K., Hirai M., Shoda M. Characteristic of newly isolated fungus Geotrichum candidum Deel which decolorizes various dyes // J. Fermentation and Bioengineering, 1995. V. 79. - № 6. - P.601-607.

86. Kirby N., Memullan G., Marchant R. Decolorisation of an artificial textile effluent by Phanerochaete chrysosporium // J. Biotechnol., 1995. V.17. - № 7. -P.761-764.

87. Knackmuss H.J. Basic knowledge and perspectives of bioelimination of xenobiotic compounds // J. Biotechnology, 1996. V.51. - № 3. - P.287-295.

88. Knapp J.S., Newby P.S., Reece L.R. Decolorization of dyes by woot-rotting basidiomycete fungi // Enzyme and Microbial Technol., 1995. V. 17. - № 7. -P.664-668.

89. Kremer S., Sterner O. Metabolism of 3,4-dichloroaniline by the basidiomycete Tiloboletus species TA9054 // J. Agric. and FoodChem., 1996. V.44. - № 4. - P. 1155-1159.

90. Kulla H.G. Aerobic bacterial degradation of azo dyes // Microbial degradation of xenobiotics and recalcitrant compounds. Ed. by T. Leisinger. New York: Academic Press. 1981. - P.387-399.

91. Lee K.C., Rittmann B.E., Shi J.C., Mcavoy D. Advanced steady-state model for the fate of hydrophobic and volatile compounds in activated sludge // Water Environment. Research. V.70. - № 6. - P.l 118-1131.

92. Levanon D., Meisinger J.J., Coddling E.E., Starr J.L. Impact of tillage on microbial activity and fate of pesticides in the upper soil // Water, Air and Soil Pollution, 1994. V. 72. - № i-4. - P. 179-189.

93. Liakou S., Pavlou S., Lyberatos G. Ozonation of azo dyes // Water Sci and Techn., 1997. V.35. - № 4. - P.279-286.

94. Nakamura S.I., Oda Y., Shimada T., Oki I., Sugimoto K. SOS-inducing activity of chemical carcinogens and mutagens in Salmonella thyphimurium TA 1535 / pSK 1002 : examination with 151 chemicals // Mutag. Res., 1987 V.192 - № 4 - P.239-246.

95. Nigam P., Banat J.M., Singh D., Marchant R. Microbial process for the decolorization of the textile effluent containing azo, diazo and reactive dyes // Process Biochem., 1996. V. 31. - № 5. - P.435-442.

96. Ogutveren U.B., Koparal S. Colour removal from textile effluents by electrochemical destruction // J. Environment. Sci and Health, Part A: Environment. Sci and Engineering, 1994. V. 29 - № 1. - P. 1-16.

97. Pasti-Grigsby M.B., Burke N.S., Goszcsynski S., Grawford D.L. Transformation of azo dye isomers by Streptomyces chromofuscus All // Appl. and Environment. Microbiol., 1996. V.62. - № 5. - P. 1814-1817.

98. Paszczynski A., Grawford R.L. Potential for bioremediation of xenobiotic compounds by the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium // Biotechn. Process, 1995. V. 11. - № 4. - P.368-379.

99. Razoflores E., Luijten M., Donlon B.A., Lettinga G., Field J.A. Complete biodégradation of the azo dye azodisalicylate under anaerobic condition // Environment. Sci and Technol., 1997. V.31. - № 7. - P.2098-2103.

100. Reid J.D. Biodégradation of lignin // Canadia J. Botany, 1995. V.73. - № Suppl. 1 E-H. -P.1011-1018.

101. Sarnaik S., Kanekar P. Bioremediation of colour of methyl violet and phenol from a dye-industry waste effluent using Pseudomonas spp. isolated from factory soil //J. Appl.BacterioI., 1995. V.79. - № 4. - P.459-469.

102. Seiglemurandi F., Gruiraud P., Croize J., Falsen E., Eriksson K.E.L. Bacteria are omnipresent on Phanerochaete chrysosporium burdsall // Appl. and Environment. Microbiol., 1996. V.62. - № 7. - P.2477-2481.

103. Sharp S.S. Metastability and the efficiency of azobenzene as a fumigant //J. Economic Entomol., 1946. V.39. - № 5. - P.669-670.

104. Shu H.Y., Huang C.R., Chang M.C. Decolorization of mono-azo dyes in wastewater by advanced oxidation process a case study of acid-red-1 and acid-yellow-23 //Chemosphere, 1994. - V. 29. - № 12. - P.2597-2607.

105. Shu H.Y., Huang C.R. Degradation of commercial azo dyes in water using ozonation and UV-enhanced ozonation process // Chemosphere, 1995. -V. 31. № 8.-P. 3813-3825.

106. Simmons K.E., Minard R.D., Bollag J.-M. Oligomerisation of 4-chloroaniline by oxidoreductases // Environment. Sci and Techn., 1987. V.21. - P.999-1003.

107. Spadaro J.T., Isabelle L., Renganathan V. Hydroxyl radical mediated degradation of azo-dyes evidence for benzene generation // Environment. Sci and Techn., 1994. - V.28.-№7.-P. 1389-1393.

108. Stucki G., Alexander M. Role of dissolution rate and solubility in biodégradation of aromatic compounds // Appl. and Environment. Microbiol., 1987. V.53. - № 2. - P.292-297.

109. Sweeney E.A., Chipman J.K., Forsythe S.J. Evidence for direct acting oxidative genotoxicity by reduction products of azo dyes // Environment. Health Perspectives, 1994. - V. 102. - № 6. - P. 119-122.

110. Tang W.Z., Zhang Z., An H., Quitana M.O., Torres D.F. TiO / 2 UV photodegradation of azo dyes in aqueous solutions // Evironment. Techn., 1997. -V.18. № 1. -P.1-12.

111. Thomas J.M., Yordy J.R., Amador J.A., Alexander M. Rates of dissolution and biodégradation of water-insoluble organic compound // Appl. and Environment. Microbiol., 1986. V.52. - № 2. - P.290-296.

112. Urishigawa Y., Yonezawa Y. Chemico-biological interactions in biological purification system. Biodégradation of azocompounds by activated sludge // Bulletin of Environment. Contamination and Toxicol., 1977. V. 17. - № 2. -P.208-219.

113. Van Loosdrecht M.C.M., Lyklema J., Norde W., Zehnder A.J.B. Influence of interfaces on microbial activity // Microbial Reviews, 1990. V.54. - № 1. - P.75-87.

114. Wong P.K., Yuen P.Y. Decolorization and biodégradation of methyl red by Klebsiella pneumoniae RS-13 // Water Research, 1996. V. 30. - № 7. - P. 17361744.

115. Yateem A., Balba M.T., Al-Awadhi N., El-Nawawy A.S. White rot fungi and their role in remediating oil-contamination soil // Environment International, 1998.- V.24.-№ 1-2.-P.181-187.

116. Zissi U., Lyberatos G. Azo-dye biodégradation under anoxic conditions // Water Sci and Technol., 1996. V.34. - № 5-6. - P.495-500.

117. Zissi U., Lyberatos G., Pavlou S. Biodégradation of p-aminoazobenzene by Bacillus subtilis under aerobic conditions // J. Industrial Microbiol, and Biotechn., 1997. -V. 19. -№ 1. P.49-55.

118. Zhang W.X., Bouwer E.J., Ball W.P. Bioavailability of hydrophobic organic contaminants: effects and implications of sorption-related mass transfer on bioremediation // Ground Water Monitoring and Remediation, 1998. V. 18. - № 1.- P. 126-138.

119. Морфологические и физиолого-биохимические признаки бактерий выделенных при изучении