Экспериментальная оценка радиозащитной эффективности генистеина при остром облучении

Тарумов, Роман Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспериментальная оценка радиозащитной эффективности генистеина при остром облучении
ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальная оценка радиозащитной эффективности генистеина при остром облучении"

На правах рукописи

ТАРУМОВ Роман Алексеевич

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РАДИОЗАЩИТНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕНИСТЕИНА ПРИ ОСТРОМ ОБЛУЧЕНИИ

03.01.01 — радиобиология 14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 4 АПР 2014

Санкт-Петербург, 2014

005547527

Работа выполнена в ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени

С.М. Кирова» МО РФ

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Гребенюк Александр Николаевич доктор медицинских наук Башарин Вадим Александрович

Официальные оппоненты:

Долго-Сабуров Валерий Борисович, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУН «Институт токсикологии» Федерального медико-биологического агентства, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимической токсикологии и фармакологии

Турлаков Юрий Сергеевич, доктор медицинских наук, старший научный сотрудник, ФГУП «Научно-исследовательский институт промышленной и морской медицины» Федерального медико-биологического агентства, заместитель директора по научной работе

Ведущая организация:

ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова»

Защита диссертации состоится « 17» июня 2014 года в $. ^ на заседании диссертационного совета Д 215.002.11 при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева,

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова.

6).

доктор медицинских наук

Ученый секретарь диссертант

Автореферат разослан «_»

Язепок Аркадий Витальевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

A.К., 2008; Mornson W.H. et al., 2000]. По мнению ряда авторов [Ушаков И.Б. и др., 2013; Atwell W.A. et al., 2004], именно радиационный фактор может стать главным барьером на пути продвижения человека в космос. Все эти ситуации требуют дальнейшего совершенствования радиационной безопасности, важным элементом которой является использование фармакологических средств. Однако, разработанные к настоящему времени радиозащитные препараты далеки от совершенства, вследствие чего создание и испытание новых высокоэффективных медицинских средств противорадиационной защиты является одной из актуальных проблем современной радиобиологии, фармакологии и клинической фармакологии [Назаров В.Б. и др., 2008; Васин М.В., 2010; Seed Т.М., 2005; Xiao M. et al., 2009].

В настоящее время работы по поиску, разработке и созданию, экспериментальному (доклиническому) изучению безопасности, фармакодина-мики и механизмов действия новых противолучевых лекарственных средств на животных и в опытах in vitro активно продолжаются [Легеза

B.И. и др., 2008; Антушевич А.Е. и др., 2012; Gudkov A.V., Komarova Е.А., 2010; Koukourakis M.I., 2012; Wang X.Y. et al., 2013]. При этом большое внимание уделяется веществам природного происхождения и их синтетическим аналогам, которые могут быть эффективны как при профилактическом, так и лечебном их применении [Jagetia G.C., 2007; Weiss J.F., Landauer M.R., 2009]. Особое значение придается тому, чтобы впервые синтезированный фармакологический препарат был не только высокоэффективным, но и безопасным, удобным в применении и мог использоваться в обычной медицинской практике, т.е. имел бы двойное назначение.

Степень разработанности темы исследования

В настоящее время многочисленные отечественные и зарубежные исследователи показывают перспективность использования для профилактики и терапии радиационных поражений ингибиторов свободнорадикальных реакций, т.е. антиоксидантов, которые, являясь эффективными регуляторами окислительных процессов, проявляют радиозащитные свойства при остром облучении животных в сублетальных и минимально летальных дозах [Бурлакова Е.Б., 2007; Мороз Б.Б. и др., 2009; Шишкина Л.Н., 2013; Weiss J.F., Landauer M.R., 2000; Kumar K.S. et al., 2002]. Динамично развиваются исследования по оценке противолучевых свойств стимуляторов гемопоэза, в частности цитокинов и их индукторов [Смирнов H.A. и др., 2000; Легеза В.И. и др., 2008; Рождественский Л.М. и др., 2008; Grebenyuk А. et al., 2007]. Не прекращается поиск средств профилактики и раннего лечения лучевых поражений среди веществ стероидной структуры, в частности, эстрогенов и их природных аналогов - фитоэстрогенов [Гребенюк А.Н. и др., 2012; Whitnall М.Н. et al., 2002; Taghizadeh В. et al, 2013].

В настоящее время в качестве одного из наиболее перспективных радиозащитных средств рассматривается изофлавоноид сои - генистеин, полученный из природных источников растительного происхождения [Landauer M.R. et al, 2000, 2010]. Весьма интересным является тот факт, что для генистеина, по данным экспериментальных наблюдений, характерно наличие антиоксидантных свойств [Lengyel J. et al, 2013], стимулирующее влияние на продукцию цитокинов [Zhou Y, Mi М, 2005], а также умеренная эстрогенная активность [Zhu R. et al, 2012]. Кроме того, препарат обладает и другими биологическими эффектами: регулирует апоптоз, пролиферацию и дифференцировку клеток [Liu X. et al, 2013], повышает сопротивляемость организма при химиотерапии [Versantvoort С.Н.М. et al, 2007], индуцирует апоптоз опухолевых клеток [Polkowski К, 2000; Schultz D.R, Harrington W.J.Jr, 2003], подавляет ангиогенез новообразований [Zhou J.R. et al, 2000] и функции остеокластов [Bliar Н.С. et al, 1996], снижает активацию и пролиферацию лимфоцитов [Sakai Т, 2008], оказывает влияние на тучные клетки и проявляет умеренные противовоспалительные свойства [Verdrengh М. et al., 2003].

Кроме того, генистеин обнаруживает в эксперименте выраженную радиозащитную активность при хорошей переносимости [Landauer M.R. et al, 2003; Day R.M. et al, 2013; Ha C.T. et al, 2013]. Однако возможности практического применения этого препарата ограничиваются его весьма недешевым производством из растительного сырья, а также трудностями, связанными с получением стабильного, хорошо очищенного препарата. Химическая структура генистеина изучена в достаточной степени [Rozman K.K. et al, 2006] и российским ученым удалось синтетическим путем получить вещество, полностью соответствующее природному аналогу. Однако экспериментальное (доклиническое) изучение острой токсичности, во многом

определяющей безопасность применения препарата, исследование фарма-кодинамики и механизмов действия синтетического генистеина, а также оценка его радиозащитной эффективности в условиях острого облучения до настоящего времени не проводились, что послужило основанием для выполнения настоящей работы.

Цель исследования:

Экспериментально оценить острую токсичность и фармакологические свойства синтетического генистеина, а также его радиозащитную эффективность при остром воздействии рентгеновского излучения.

Задачи исследования:

1. В опытах на мелких лабораторных животных определить острую токсичность синтетического генистеина при различных способах его введения.

2. Изучить влияние синтетического генистеина на морфологический состав периферической крови, биохимические показатели углеводного, белкового и липидного обменов, содержание провоспалительных цитоки-нов и p-эстрадиола в сыворотке крови белых беспородных крыс.

3. Провести сравнительную оценку антиоксидантных свойств генистеина, кверцетина и аскорбиновой кислоты in vitro, а также изучить влияние препарата на систему глутатиона и перекисное окисление липидов в эритроцитах периферической крови интактных крыс.

4. Оценить радиозащитную эффективность синтетического генистеина по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни мышей, подвергнутых острому воздействию рентгеновского излучения, при различных схемах применения препарата.

5. Провести сравнительную оценку радиозащитной эффективности синтетического генистеина, антиоксидантов (мексидола, литана, цитохрома С), эстрогенов (p-эстрадиола) и серосодержащих радиопротекторов (циста-мина) по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных мышей.

6. Изучить механизмы радиозащитного действия синтетического генистеина в отношении костномозгового кроветворения и клеточного состава периферической крови облученных животных.

7. Исследовать влияние синтетического генистеина на постлучевые изменения показателей системы глутатиона и перекисного окисления липидов в эритроцитах периферической крови облученных крыс.

Научная новизна

Впервые проведена оценка острой токсичности, фармакологических свойств и радиозащитной эффективности отечественного синтетического генистеина.

Установлена плохая растворимость синтетического генистеина в воде, масле и ТВИНе-80. Показано, что генистеин хорошо растворяется в поли-этиленгликоле и диметилсульфоксиде, при этом, в отличие от полиэтиленг-ликоля, раствор препарата в диметилсульфоксиде в проведенных исследо-

ваниях не оказывал токсического влияния на организм мелких лабораторных животных. Определена численная характеристика токсичности препарата, растворенного в диметилсульфоксиде, на основании которой отечественный синтетический генистеин можно рассматривать как малотоксичное соединение.

Установлено, что однократное внутрибрюшинное введение синтетического генистеина не изменяет морфологического состава крови и не нарушает течения основных обменных процессов в организме животных. Выявлено, что на модели in vitro синтетический генистеин обладает антиокси-дантными свойствами, выраженность которых уступает кверцетину, но сопоставима с таковыми у аскорбиновой кислоты. Показано, что внутрибрюшинное введение генистеина крысам сопровождается увеличением концентрации восстановленного глутатиона и активацией сопряженных ферментов, а также способствует увеличению содержания провоспалительных ци-токинов в сыворотке крови крыс через 1 и 24 ч после введения препарата. Установлено стимулирующее влияние генистеина на синтез и продукцию Р-эстрадиола, содержание которого в сыворотке крови крыс по сравнению с контролем было более чем в 2 раза выше уже через 1 ч после введения препарата. Показано, что введение синтетического генистеина не сопровождается изменением эмоционального статуса и двигательной активности белых беспородных крыс.

Обнаружено, что синтетический генистеин обладает противолучевой эффективностью при остром внешнем радиационном воздействии. При этом выраженный защитный эффект наблюдался при внутрибрюшинном введении препарата за 1 ч до острого рентгеновского облучения в дозах СД50-90/30 Введение препарата мышам за 24 ч до или через 1 ч после облучения, а также курсом из 5 инъекций — один раз в день в течение 5 сут после радиационного воздействия, не оказывало существенного противолучевого эффекта.

Показано, что при профилактическом однократном применении за 1 ч до облучения синтетический генистеин более эффективно снижал летальность облученных в дозах СД50-90/З0 мышей, чем мексидол, цитохром С или литан, обладал сопоставимой с p-эстрадиолом радиозащитной эффективностью, но проявлял менее выраженные противолучевые свойства, чем цистамин.

Установлено, что профилактическое применение синтетического генистеина сопровождалось увеличением количества сохранивших жизнеспособность гемопоэтических клеток и снижением выраженности постлучевой гемодепрессии в отношении общего числа лейкоцитов и тромбоцитов, а также абсолютного количества нейтрофилов. Показано, что введение генистеина за 1 ч до острого лучевого воздействия снижало выраженность оксидантного стресса, оцененного по содержанию в эритроцитах периферической крови облученных крыс малонового диальдегида и восстановленного глутатиона.

Теоретическая и практическая значимость

В результате проведенного исследования научно обоснована возможность и целесообразность применения синтетического генистеина в качестве средства повышения радиорезистентности организма путем его влияния на антиоксидантную, кроветворную и иммунную системы организма. Опираясь на принципы доказательной медицины, показано, что применение синтетического генистеина в дозе 200 мг/кг за 1 ч до острого внешнего рентгеновского облучения способствует увеличению выживаемости и средней продолжительности жизни облученных животных, а также снижению выраженности постлучевых нарушений костномозгового кроветворения и морфологического состава периферической крови, изменений в системе глутатиона и перекисном окислении липидов в эритроцитах периферической крови облученных крыс. Сформулированы и научно обоснованы возможные механизмы радиопротекторного действия синтетического генистеина, связанные со способностью препарата предотвращать постлучевую депрессию кроветворения, уменьшать выраженность лейко- и тромбоцито-пении, а также стимулировать систему антиоксидантной защиты организма.

Практическая значимость заключается в экспериментальном обосновании возможности использования отечественного синтетического генистеина в медицинской практике, в том числе в качестве перспективного средства медицинской противорадиационной защиты. Выявленные у препарата гипохолестеринемические, антиоксидантные, эстрогенные свойства, а также стимулирующее влияние генистеина на продукцию цитокинов позволяют найти ему применение при фармакотерапии ряда заболеваний. Кроме того, проведена апробация различных схем применения синтетического генистеина для защиты организма от негативного воздействия острого облучения в поражающих дозах.

Полученные результаты о малой токсичности, фармакологических свойствах, радиозащитной эффективности и возможных механизмах реализации противолучевого эффекта синтетического генистеина позволяют рекомендовать дальнейшее экспериментальное изучение препарата при различных вариантах облучения.

Методология и методы исследований

На проведение экспериментального исследования получено разрешение локального независимого комитета по вопросам этики при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (протокол № 129 от 16.10.2012 г).

Исследование проводилось на базе кафедры военной токсикологии и медицинской защиты ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ. Работа была выполнена на 215 белых беспородных крысах (203 самцах и 12 самках) массой 180-220 г, 1118 самцах мышей первого поколения СВА х С57В1 (100 особей) и белых беспородных (1018 особей), 100 самках белых беспородных мышей массой 18-22 г разводки питомника лабораторных животных РАМН «Рапполово» (пос. Рапполово

Ленинградской обл.).

В работе использовали генистеин - препарат, синтезированный во ФГУП «Научно-производственный центр «Фармзащита» ФМБА России. Генистеин полностью соответствовал по структуре природному аналогу и представлял собой кристаллический порошок светло-желтого цвета. Оценку острой токсичности препарата проводили в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2011). Генистеин растворяли в воде, масле, ТВИНе-80, ПЭГ-400 и ДМСО, затем вводили белым беспородным мышам разного пола или мышам линии F,(CBAxC57Bl) в разных дозах различными способами однократно, но в ходе отдельного эксперимента было произведено повторное двукратное введение препарата. В течение двух недель фиксировали общее состояние животных, особенности их поведения, уровень двигательной активности, регистрировали сроки развития интоксикации и время наступления летального исхода. Морфологическое исследование тканей проводили с использованием стандартной методики приготовления гистологических препаратов [Меркулов Г.А., 1956].

Изучение фармакологических свойств препарата проводили после растворения генистеина в 60% ДМСО. При этом животным экспериментальных групп генистеин вводили внутрибрюшинно в дозе 200 мг/кг. В течение 30-ти суток после введения препарата регистрировали динамику содержания лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов в периферической крови у самцов и самок белых беспородных крыс. Через 1, 3, 24 и 72 ч после введения генистеина в сыворотке крови крыс-самцов определяли показатели углеводного, белкового и липидного обменов. В эти же сроки оценивали содержание в сыворотке крови крыс p-эстрадиола и цитокинов, а также динамику показателей системы глутатиона и перекисного окисления липидов в эритроцитах периферической крови животных. Кроме того, изучали влияние синтетического генистеина на двигательную активность и эмоциональный статус крыс в тесте «Открытое поле», а также проводили сравнительную оценку антиоксидантной активности отечественного генистеина с кверцетином (Sigma, США) и аскорбиновой кислотой (Sigma, США) в концентрациях от 0,78 до 100 мкг/мл на модели in vitro.

Для изучения противолучевых свойств синтетического генистеина препарат растворяли в 60% ДМСО и в дозе 200 мг/кг вводили животным за 1 сут, 1 ч до или через 1 ч после радиационного воздействия, а также курсом из 5 инъекций — один раз в день в течение 5 сут после воздействия радиации.

Моделирование общего однократного рентгеновского облучения животных осуществляли на рентгенотерапевтической установке РУМ-17 (Мосрентген, СССР) при напряжении 180 кВ, силе тока 14 мА, фильтре 0,5 мм Си + 1,0 мм А1, направлении облучения спина - грудь, кожно-фокусном расстоянии 50 см, мощности дозы 0,2 мА/кг (38,4 Р/мин). Дози-

метрический контроль проводили с помощью индивидуального дозиметра «ИД-11» с последующей оценкой показаний прибора на аппарате «ГО-32».

В качестве противолучевых средств сравнения использовали мекси-дол (Фармсофт, Россия), цитохром С (Самсон-Мед, Россия), литан (ВАМ, Россия), ß-эстрадиол (Sigma, США) и цистамин (ГНИИИ военной медицины, Россия). Мексидол в дозе 25 мг/кг, цитохром С в дозе 10 мг/кг и литан в дозе 30 мг/кг мышам вводили внутрибрюшинно однократно за 1 ч до или через 1 ч после облучения, а также курсом из 5 инъекций — один раз в день в течение 5 сут после радиационного воздействия. Субстанцию ß-эстрадиола в дозе 40 мг/кг вводили внутримышечно за 5 сут до радиационного воздействия. Цистамин в дозе 225 мг/кг вводили внутрибрюшинно за 20 мин. до облучения.

Оценку выживаемости и средней продолжительности жизни (СПЖ) погибших от облучения мышей проводили в течение 30 сут после радиационного воздействия. Радиозащитную эффективность соединений оценивали путем расчета фактора изменения дозы (ФИД).

Определение общего количества лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов в периферической крови лабораторных животных проводили пробирочным методом с последующим подсчетом клеток в камере Горяева. Для исследования лейкоцитарной формулы применяли способ быстрой окраски мазков крови краской Романовского по Н.Г. Алексееву (1956). Методики эн-до- и экзогенного колониеобразования выполняли по J.E. Till и Е.А. McCulloch (1961). Оценку концентрации общего белка, холестерина, глюкозы, мочевины, креатинина, активности аланинаминотрансферазы (AJIT) и аспартатаминотрансферазы (ACT) в сыворотке крови крыс проводили на биохимическом анализаторе «BS-120» (Mindray, Китай). Содержание в сыворотке ß-эстрадиола оценивали методом ферментативно-усиленной хеми-люминесценции на анализаторе «Immulite 2000» (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., США) при участии врача Е.Е. Ершова. Определение ИЛ-1, ИЛ-2 и ИЛ-6 в сыворотке крови крыс выполняли методом твердофазного иммуноферментного анализа с □ использованием наборов «Bender Medsystems» (Австрия) на анализаторе «EVOLIS Twin Plus» (BIO RAD, США) под руководством д.м.н. профессора B.JI. Пастушенкова. Концентрацию восстановленного глутатиона (ВГ) в гемолизатах эритроцитов определяли по методике G.L. Ellman (1959). Определение активности глутатион-редуктазы (ГР) проводили методом I. Carlberg и В. Mannervik (1959), активности глутатион-8-трансферазы (ГТ) - методом W.H. Habig и W.B. Jakoby (1981), активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6ФДГ) - методом А. Kornberg и соавт. (1955). Концентрацию малонового диальдегида (МДА) определяли по методу М. Uchiyama и М. Michara (1978). Оценку антиокси-дантной активности соединений проводили на модели in vitro с использованием хемилюминесцентной реакции рибофлавина в присутствии ионов двухвалентного железа и перекиси водорода под руководством д.м.н. В.М.

Прокопенко и д.м.н. профессора A.B. Арутюняна. Для оценки влияния синтетического генистеина на двигательную активность и эмоциональный статус животных использовали тест «Открытое поле» [Буреш Я. и др., 1991].

Полученные в ходе экспериментальных исследований данные были подвергнуты статистической обработке с расчетом среднего значения, ошибки средней и среднего квадратического отклонения. С целью выбора метода анализа взаимосвязи показателей (параметрические или непараметрические методы) исходные количественные характеристики были проверены на соответствие нормальному распределению с использованием тестов Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка и графических методов (гистограмм). Оценку различий средних значений данных при распределениях, близких к нормальным, проводили параметрическим методом с использованием t-критерия Стьюдента. Оценку различий данных, полученных при анализе выборок малого объема, проводили непараметрическим методом с использованием U-критерия Манна-Уитни. Вероятность р<0,05 и выше считали достаточной для вывода о статистической значимости различий полученных данных. Среднюю величину относительных показателей и ее ошибку определяли с помощью таблиц B.C. Генеса (1967). Достоверность различий средних значений показателей выживаемости погибших животных оценивали с использованием точного метода Фишера.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Отечественный синтетический генистеин является малотоксичным соединением, обладает антиоксидантными свойствами, стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов, повышает уровень ß-эстрадиола в периферической крови экспериментальных животных.

2. Профилактическое применение синтетического генистеина увеличивает выживаемость лабораторных животных, подвергнутых внешнему относительно равномерному облучению. Пути реализации радиозащитного эффекта препарата связаны с повышением радиорезистентности клеток стволового пула кроветворной системы и увеличением числа клеток, сохранивших жизнеспособность после облучения, в результате снижения глубины постлучевой лейко-, нейтро- и тромбоцитопении.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты получены на современном сертифицированном оборудовании: микроскоп «Микмед-6» (JIOMO, Россия), биохимический анализатор «BS-120» (Mindray, Германия), анализатор «Immulite 2000» (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., США), анализатор «EVOLIS Twin Plus» (BIO RAD, США).

Степень достоверности полученных результатов определяется достаточным количеством экспериментальных животных, использованных в исследовании, рандомизацией и формированием групп сравнения и контроля, адекватными токсикологическими, фармакологическими и радиобиологическими моделями и методами исследования, длительными сроками на-

блюдения и корректными методами статистической обработки.

Результаты исследования доложены и обсуждены на международной научной конференции «Охрана здоровья военнослужащих в региональных военных, климатических и эпидемиологических условиях» (Москва, 2012), научно-практической конференции «Актуальные вопросы радиационной медицины и промышленной токсикологии» (Красноярск, 2012), ХХХХУ научной конференции «Хлопинские чтения» (Санкт-Петербург, 2012), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы медико-санитарного обеспечения персонала объектов морской техники, работников предприятий с вредными и (или) опасными производственными факторами, а также населения территорий, обслуживаемых ФМБА России» (Санкт-Петербург, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012), Российской научной конференции «Острые проблемы разработки противолучевых средств: консерватизм или модернизация» (Москва, 2012), на заседании Санкт-Петербургского отделения Всероссийской общественной организации токсикологов (Санкт-Петербург, 2013), IV съезде токсикологов России с международным участием (Москва, 2013), международной научно-практической конференции по военной медицине (Санкт-Петербург, 2013).

Реализация результатов исследования

Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе на кафедре военной токсикологии и медицинской защиты ФГБВОУ «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ и научно-исследовательской работе ФГУП «Научно-производственный центр «Фарм-защита» ФМБА России.

В процессе выполнения работы оформлено и принято к использованию 3 рационализаторских предложения.

Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения

Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова: тема НИР № 211/5 шифр «Генистеин», тема НИР № 51/212/1 шифр «Изофлавоноид», тема НИР № 51/213/3 шифр «Комплексон-3», тема НИР № VMA.02.02.01.1315/0021 шифр «Гемопоэз-2».

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 19 научных работ, из них 8 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук.

Личный вклад автора

Автор принимал личное участие в планировании, организации и выполнении экспериментов по изучению острой токсичности, фармакодина-мики и радиозащитной активности синтетического генистеина. Автором лично осуществлялся учет и оценка полученных данных, статистическая обработка, обобщение и анализ полученных результатов.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации приведены 35 таблиц и 7 рисунков. Список литературы содержит 238 библиографических источников, из них 73 отечественных и 165 иностранных публикаций.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследования в экспериментах на белых беспородных мышах разного пола и мышах-самцах р1(СВАхС57В1) изучали токсичность синтетического генистеина. Генистеин перед введением растворяли в воде, масле, ТВИН-80, ПЭГ-400 и ДМСО. Препарат вводили внутрибрю-шинно, внутрижелудочно и подкожно однократно, а также повторно с интервалом в 3 ч.

Показано, что в воде, масле и ТВИН-80 генистеин не растворялся. Установлено, что ЬБзо для генистеина, растворенного в ПЭГ-400 при внутри-брюшинном пути введения составила 2267 мг/кг. Введение генистеина в растворе ПЭГ-400 животным обоего пола сопровождалось изменением их поведения, дозозависимой гибелью, а также морфологическими изменениями внутренних органов. Подобная же картина клинических и морфологических проявлений интоксикации была отмечена у мышей контрольной группы, получавших только растворитель ПЭГ-400. Результаты исследования токсичности синтетического генистеина, растворенного в ПЭГ-400, по всей вероятности, отражают токсичность растворителя, а не растворенного в нем препарата.

В то же время, внутрибрюшинное введение мышам синтетического генистеина, растворенного в ДМСО, в диапазоне доз от 2000 мг/кг до 6000 мг/кг не сопровождалось изменением массы тела и других физиологических показателей у экспериментальных животных. Кроме того, не было обнаружено и морфологических изменений внутренних органов у мышей после введения им растворенного в ДМСО синтетического генистеина в высоких дозах. Рассчитанное по показателям выживаемости значение ЬО50 соответствовало дозе генистеина 8292 мг/кг, что свидетельствовало о том, что изученный препарат можно отнести к классу малотоксичных веществ [Хабриев Р.У., 2011].

В ходе оценки фармакодинамики синтетического генистеина было изучено его влияние на гематологические, биохимические, биофизические и физиологические (поведенческие) показатели.

Установлено, что однократное внутрибрюшинное введение белым беспородным крысам синтетического генистеина в дозе 200 мг/кг не изменяет количества лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов в течение 30-ти суток наблюдения. Препарат также не вызывал изменений концентрации общего белка, глюкозы, мочевины, креатинина, активности ACT и AJTT в течение 72 ч после его введения. Однако, через 1 ч после введения генистеина в сыворотке крови крыс на 24% (р<0,05) по сравнению с контролем снижался уровень холестерина, что может свидетельствовать о проявлении генистеином гипохолестеринемических свойств. Подобные результаты были получены в работе J. Demonthy и соавт. (2003). Кроме того, введение синтетического генистеина не сопровождалось изменением показателей эмоционального статуса и двигательной активности белых беспородных крыс, оцененных в тесте «Открытое поле».

Выявлено, что синтетический генистеин на модели in vitro обладает антиоксидантными свойствами, которые выражены слабее, чем у кверцети-на, но сопоставимы с аналогичными показателями для аскорбиновой кислоты (рис. 1).

< О

0,78 1,56 3,12 6,25 12,5 25 50 100

Концентрация соедн нения, мкг/мл

Рисунок 1 - Зависимость антиоксидантной активности генистеина, кверце-тина и аскорбиновой кислоты от их концентраций

Считается, что чем ниже среднеэффективная доза соединения, тем его антиоксидантная активность по отношению к модельной системе будет выше [Бурлакова Е.Б. и др, 2010]. Как следует из данных, представленных на рисунке 1, среднеэффективная доза для кверцетина in vitro оказалась равной 3,9 мкг/мл, а для генистеина и аскорбиновой кислоты величина этого показателя составила 12,5 и 9,4 мкг/мл соответственно. Подобные данные, характеризующие антиоксидантную активность, были получены ранее для генистеина, выделенного из соевых культур [Макарова М.Н, 2006].

При изучении влияния синтетического генистеина на систему глутатио-на и перекисного окисления липидов in vivo было показано, что в эритроцитах периферической крови крыс через 4 ч после введения животным препарата концентрация ВГ повышалась на 73,8% (р<0,05), а спустя 1 сут значение этого показателя превосходило контрольные величины на 85% (р<0,05). Выявлено индуцирующее влияние генистеина на активность глутатион-редуктазы (ГР). Так, через 4 ч после введения генистеина отмечалась тенденция к увеличению активности ГР в 1,6 раза, а через 24 ч было зафиксировано двукратное ее увеличение по сравнению с контролем (р<0,05). В то же время препарат практически не оказывал влияния на активность ГТ, Г-6ФДГ и содержание МДА в эритроцитах периферической крови крыс.

Выявлено также, что через 1 ч после введения генистеина в дозе 200 мг/кг отмечалось статистически значимое (р<0,05) повышение содержания p-эстрадиола в сыворотке крови более чем в 2 раза по сравнению с контролем (табл. 1). По мнению Н.Р. Шепельской и М.Г. Проданчук (2010), L. Ye с соавт. (2009) наблюдаемый эффект может быть обусловлен влиянием препарата на увеличение активности ароматазы или снижение синтеза в печени глобулина, связывающего половые гормоны, что в свою очередь может приводить к изменениям в метаболизме эндогенного Р-эстрадиола.

Таблица 1 - Влияние генистеина на содержание р-эстрадиола, ИЛ-1, ИЛ-2 и ИЛ-6 в сыворотке крови белых беспородных крыс, пг/мл (Х±тх, п=б)_

Сроки исследования после введения препарата, ч Условия эксперимента Исследуемый показатель

Р-эстрадиол ИЛ-1 ИЛ-2 ИЛ-6

- интактные 26,1±2,7 105,3±4,8 131,8±5,24 18,4±1,5

1 контроль 24,1±1,9 107,1±13,5 124,4±8,5 22,2±2,1

генистеин 73,4±7,0* 144,0±3,6*# 132,5±5,7 25,4±1,8#

4 контроль 26,8±1,8 115,5±18,9 110,4±8,7 20,05±2,3

генистеин 31,0±3,5 151,1±10,7# 143±9,7* 26,6±2,0#

24 контроль 28,0±2,1 95,2±8,8 117,4± 15,0 17,7±1,5

генистеин 25,1±2,0 139,7±8,0*# 119,5±6,0 23,4±2,5*

72 контроль 27,1 ±3,3 105,5±10,1 121,7±3,9 20,7±1,1

генистеин 32,8±2,5 136,9±2,7*# 135,1±3,0* 21,0±1,9

Примечания: 1 — # - отличие (по ^критерию Стьюдента) от группы «интактные» достоверно, р<0,05; 2 —* - отличие (по (-критерию Стьюдента) от группы «контроль» достоверно, р<0,05.

Кроме того, уже через 1 ч после внутрибрюшинного введения генистеина в дозе 200 мг/кг в сыворотке крови крыс наблюдалось значимое увеличение содержания ИЛ-1 - основного стимулятора костномозгового кроветворения, на 26% по сравнению с контролем (р<0,05). Достоверное увеличение исследуемого показателя на 32% и 23% соответственно по сравнению с контролем (р<0,05) было выявлено и в более поздние сроки - через

24 и 72 ч после применения препарата. Кроме того, через 1 ч после внутри-брюшинного введения генистеина содержание ИЛ-6 в сыворотке крови крыс увеличивалось на 14% относительно показателей в группе контроля, а через 24 ч - на 30% (р<0,05). Стимуляция выработки клетками ИЛ-1 и ИЛ-6 может играть существенную роль в повышении радиорезистентности организма [Рождественский Л.М., 1997; Neta R., 1997].

На следующем этапе была проведена оценка радиозащитной эффективности генистеина по критериям выживаемости и СПЖ погибших мышей и выбор оптимальной схемы введения препарата облученным животным.

Установлено, что профилактическое введение генистеина за 1 ч до радиационного воздействия позволяло защитить часть мышей, подвергнутых действию рентгеновского излучения, от лучевой гибели (табл. 2). Так, при облучении в дозе 7 Гр выживаемость мышей, получивших генистеин, значимо увеличилась на 30% (р<0,05), в дозе 8 Гр - на 44% (р<0,05) и в дозе 9 Гр - на 37% (р<0,05). Расчетное значение ФИД для генистеина при введении за 1 ч до облучения составило 1,23±0,09. Кроме того, при облучении в дозе 8 Гр генистеин почти на 5 сут (р<0,05) увеличивал СПЖ погибших от облучения животных. Применение генистеина по альтернативным схемам применения препарата значимо не влияло на показатели выживаемости и СПЖ облученных животных.

Таблица 2 - Влияние генистеина на выживаемость и среднюю продолжительность жизни белых беспородных мышей-самцов, подвергнутых острому рентгеновскому облучению (Х±щх)_

Доза облучения, Гр Время введения генистеина относительно облучения Количество выживших животных / общее количество животных Выживаемость, % СПЖ, сут

7 контроль 10/20 50±12 12,7±1,4

за 24 ч 4/10 40±16 11,6±0,7

за 1 ч 16/20 80±9# 13,6±1,2

через 1 ч 8/20 40±11 9,5±0,8

в течение 5 сут 4/10 40±16 9,6±0,6

8 контроль 6/23 26±9 9,6±0,7

за 24 ч 3/12 25±13 10,1±0,9

за 1 ч 16/23 70±10# 14,6±0,7*

через 1 ч 8/23 35±10 10,1±0,7

в течение 5 сут 4/11 36±15 11,0±0,8

9 контроль 1/27 4±4 8,5±0,8

за 24 ч 2/15 13±9 8,3±0,5

за 1 ч 11/27 41±10# 10,4±1,1

через I ч 4/27 15±7 9,3±0,5

в течение 5 сут 0/12 0+8 8,0±0,7

Примечания: 1 - # - отличие (по точному критерию Фишера) от группы «контроль» достоверно, р<0,05; 2 - * - отличие (по (.-критерию Стьюдента) от группы «контроль» достоверно, р<0,05

Для сравнительной оценки радиозащитной эффективности синтетического генистеина были выбраны мексидол, литан и цитохром С, обладающие, по данным литературы [Зарубина И.В., Шабанов П.Д., 2004; Антуше-вич А.А. и др., 2011], антиоксидантными свойствами (табл. 3).

Как видно из данных, представленных в таблице 3, при профилактическом применении за 1 ч до облучения наиболее выраженным радиозащитным действием обладал генистеин. Его применение позволяло увеличить выживаемость облученных в дозе 7 Гр мышей на 40%, в дозе 8 Гр - на 46% (р<0,05), в дозе 9 Гр - на 58% (р<0,05). Значение ФИД для генистеина составило 1,28±0,09.

Применение мексидола, литана или цитохрома С за 1 ч до облучения способствовало незначительному повышению выживаемости мышей и не оказывало существенного влияния на СПЖ животных. При данной схеме введения изучаемых препаратов расчетное значение ФИД составило: для мексидола 1,17±0,13, для литана - 1,12±0,10, а для цитохрома С - 1,07±0,07. Таблица 3 - Влияние профилактического (за 1 ч до облучения) применения генистеина, мексидола, литана и цитохрома С на выживаемость и среднюю продолжительность жизни белых беспородных мышей-самцов, подвергну-

Условия эксперимента Доза облучения, Гр Количество выживших животных / общее количество животных Выживаемость, % СПЖ, сут

Облучение (контроль) 6,5 6/10 60±16 10,25±1,3

7 5/10 50±17 14,0±2,7

7,5 5/11 45±16 13,0±2,0

8 3/11 27±14 11,1±1,1

8,5 2/12 17±11 6,5±0,8

9 0/12 0+8 6,9±0,6

Генистеин + облучение 7 9/10 90±10 17,0

8 8/11 73±14* 14,0±3,0

9 7/12 58±15# 8,8±0,6*

Мексидол + облучение 7 6/10 60±16 12,5±0,6

8 4/11 36±15 11,4±1,0

9 1/12 8±8 8,6±0,7

Литан + облучение 7 5/10 50±17 9,0±1,1

8 3/11 27±14 10,0±0,6

9 0/12 0±8 8,5±0,7

Цитохром С + облучение 7 5/10 50±17 11,2±1,6

8 3/11 27±14 10,0±1,1

9 1/12 8±8 8,6±0,7

Примечания: 1 - # -отличие (по точному критерию Фишера) от группы «контроль» достоверно, р<0,05; 2 - * - отличие (по ^критерию Стьюдента) от группы «контроль» достоверно, р<0,05.

При однократном введении через 1 ч после облучения все изучаемые препараты способствовали повышению выживаемости облученных в дозах

СД50-90/30 животных в среднем на 15-25%, практически не оказывая влияния на СПЖ облученных мышей. Величина ФИД при однократном раннем терапевтическом использовании генистеина составила 1,17±0,12, мексидола-1,20±0,13, лигана —1,10±0,09, цитохрома С - 1,13±0,10.

В условиях курсового введения в течение 5 сут после острого облучения наиболее выраженная противолучевая активность была у мексидола. При этом, значение ФИД для мексидола составило 1,30±0,14, для генистеина- 1,08±0,07, для литана- 1,18±0,11, а для цитохрома С - 1,19±0,12.

При сравнительном изучении противолучевых свойств генистеина и р-эстрадиола было обнаружено, что при введении генистеина в дозе 200 мг/кг за 1 ч до облучения в дозе 7 Гр выживаемость мышей увеличилась на 40% (р<0,05), в дозе 8 Гр - на 32%, в дозе 9 Гр - на 20% по сравнению с контролем. Значение ФИД для генистеина составило 1,21±0,11. Применение р-эстрадиола в дозе 40 мг/кг за 5 сут до облучения способствовало значительному росту выживаемости защищенных мышей: на 39% при облучении в дозе 7 Гр (р<0,05), на 25% при облучении в дозе 8 Гр и на 34% при облучении в дозе 9 Гр (р<0,05). При этом расчетное значение ФИД для Р-эстрадиола составило 1,26±0,12.

На следующем этапе было проведено сравнение противолучевых свойств генистеина с радиопротектором цистамином. Установлено, что применение генистеина способствовало росту выживаемости защищенных мышей: на 30% при облучении в дозе 7 Гр, на 33% при облучении в дозе 8 Гр (р<0,05) и на 20% при облучении в дозе 9 Гр. Введение цистамина мышам увеличивало выживаемость животных при облучении в дозе 7 Гр на 40% (р < 0,05), в дозе 8 Гр - на 38% (р<0,05), а в дозе 9 Гр - на 53% (р < 0,05). ФИД для генистеина составил 1,20±0,09, а для цистамина -1,41 ±0,07.

Таким образом, генистеин при однократном применении за 1 ч до облучения более эффективно снижал летальность облученных в дозах СД50-90/30 мышей, чем мексидол, цитохром С или литан, обладал сопоставимой с р-эстрадиолом радиозащитной эффективностью, но проявлял менее выраженные противолучевые свойства, чем цистамин. При этом применение синтетического генистеина способствовало повышению выживаемости облученных в «костномозговом» диапазоне доз животных в течение 30-ти суток наблюдения, что может свидетельствовать о модификации гибели защищенных животных путем влияния препарата на кроветворную и иммунную системы. Для уточнения этого предположения было проведено изучение влияния генистеина на состояние гемопоэза облученных мышей с применением эндо- и экзоколониального тестов.

При изучении влияния генистеина на функцию эндогенного кроветворения у облученных белых беспородных мышей было установлено, что рост колониеобразующих единиц (КОЕ-С9) по сравнению с контролем наблюдался только в случае применения генистеина за 1 ч до облучения. Так,

число КОЕ-С9 значимо превышало аналогичные значения группы сравнения при облучении в дозе 7 Гр почти в 2 раза, при облучении в дозе 8 Гр - в 1,8 раза, при облучении в дозе 9 Гр - в 2,7 раза. Следовательно, профилактическое применение генистеина способствовало увеличению количества сохранивших жизнеспособность стволовых кроветворных клеток, а также увеличению их радиорезистентности. При использовании генистеина за 24 ч до или через 1 ч после радиационного воздействия препарат не оказывал существенного влияния на показатели функции эндогенного колониеобра-зования на селезенках облученных мышей.

Защитное действие генистеина на функцию кроветворения было выявлено и в экзоколониальном тесте. Как видно из данных, представленных в таблице 4, у мышей-доноров, которым за 1 ч до облучения в дозе 2 Гр вводили генистеин, число колоний было почти в 1,5 раза (р<0,05) больше, чем у животных контрольной группы (облучение). При облучении мышей в дозе 4 Гр число колоний возросло в 1,7 раза (р<0,05), а при облучении в дозе 6 Гр - в 2,7 раза (р<0,05).

Таблица 4 — Влияние генистеина на число миелокариоцитов и количество КОЕ-Сд на селезенках облученных мышей-самцов гибридов Е] (СВА х С57В1), выявленных в методике экзогенного колониеобразования

Доза облучения, Гр Условия эксперимента Количество мкц, х106/бедро Количество колоний (Х±тх) Количество КОЕ-С9

в 1 бедре (Х±тх) на 10б мкц (Х±тх)

0 контроль 16,50 8,5±0,91 1708±182 103,5±3,2

генистеин 14,25 7,4±1,65 1488±330 104,4±5,1

2 облучение 16,25 2,8±0,54 223±32,1 13,7±0,9

генистеин + облучение 16,75 4,2±0,45* 336±45,3* 20,0±1,1*

4 облучение 15,50 2,2±0,35 21,8±3,5 1,4±0,2

генистеин + облучение 15,75 3,7±0,51 37,0±5,1* 2,4±0,1*

6 облучение 16,0 1,0±0,36 2,0±0,7 0,1 ±0,02

генистеин + облучение 15,75 2,7±0,68* 5,4±1,4* 0,3±0,04*

Примечание - * — отличие (по t-критерию Стьюдента) от группы «облучение» достоверно, р<0,05.

Таким образом, применение синтетического генистеина за 1 ч до облучения способствует сохранению жизнеспособности значительного числа кроветворных клеток-предшественников гемопоэза, о чем свидетельствуют данные, полученные при исследовании противолучевой эффективности генистеина в методиках эндогенного и экзогенного колониеобразования. Механизм повышения радиорезистентности гемопоэтических клеток под влиянием генистеина может реализоваться путем торможения пролифера-тивной активности гемопоэтических клеток костного мозга, что позволяет снизить его поражение в момент облучения [Бутомо Н.В. и др., 2004; Davis

Т.А. е! а1., 2008]. Сохранение жизнеспособности и пролиферативной активности стволовых кроветворных клеток, в свою очередь, приводит к ускорению темпов восстановления нарушенного вследствие радиационного воздействия гемопоэза и, как итог увеличению числа зрелых клеток в периферической крови [Коноплянников А.Г., 1984].

Подтверждением возможности существования подобного механизма реализации противолучевых свойств генистеина являются данные, полученные при изучении показателей периферической крови облученных животных (рис. 2-3).

Как видно из рисунка 2, применение генистеина за 1 ч до облучения не допускало резкого постлучевого снижения количества лейкоцитов в ранние сроки после радиационного воздействия: на 1 сут после облучения у крыс, получавших генистеин, уровень лейкоцитов превышал показатели контрольной группы в 1,3 раза (р<0,05), а к 7 сут - более чем в 1,5 раза (р<0,05). Стоит отметить, что динамика содержания нейтрофилов в периферической крови облученных животных, получавших генистеин за 1 ч до радиационного воздействия, практически полностью повторяла те изменения, которые были зарегистрированы при изучении общего числа лейкоцитов.

- I л Облучение (контроль)__■ Генистеин {за 1 ч) + облучение

о 16 --

=1 ч

•А»

с: ф *

ДО 1 3 7 15 21 28

облучения

Сроки исследования после облучения, сут

Рисунок 2 - Влияние генистеина на общее количество лейкоцитов в периферической крови белых беспородных крыс-самцов, подвергнутых острому рентгеновскому облучению в дозе 6 Гр, х109/л (Х±тх, п=8) Примечание - * - отличие (по ^критерию Стьюдеета) от группы «облучение» достоверно, р<0,05.

Кроме того, введение генистеина за 1 ч до лучевой нагрузки способствовало уменьшению выраженности постлучевой тромбоцитопении в течение 7 сут наблюдения (рис. 3). При этом, на 3 и 7 сут исследования регистрировали значимое повышение величины этого показателя в 2,2 и 2,3 раза (р<0,05) соответственно по сравнению с контрольной группой.

'.Л

8 х ^

с: о

х-

до 1 з / .13 ¿о

облучения

Срони исследования после облучения, сут Рисунок 3 - Влияние генистеина на количество тромбоцитов в периферической крови белых беспородных крыс-самцов, подвергнутых острому рентгеновскому облучению в дозе 6 Гр, х109/л (Х±тх, п=8)

Примечание - * - отличие (по Исритерию Стьюдента) от группы «облучение» достоверно, р<0,05.

Вместе с тем, введение генистеина за 1 ч до облучения значимо не влияло на глубину постлучевого снижения абсолютного числа лимфоцитов и эритроцитов в периферической крови облученных крыс.

В ходе дальнейших исследований было также установлено, под влиянием генистеина происходит стимуляция системы глутатиона и ингибиро-вание процессов перекисного окисления липидов в эритроцитах периферической крови облученных крыс, что может рассматриваться как один из возможных путей реализации механизма радиозащитного действия генистеина.

Как видно из данных, представленных в таблице 5, у защищенных ге-нистеином облученных животных уже через 5 мин. после воздействия радиации отмечалось снижение уровня МДА на 25% (р<0,05) по сравнению с контролем (облучение). Через 24 ч после облучения было выявлено увеличение содержания ВГ на 26% (р<0,05) по сравнению с аналогичным показателем в группе контроля. В то же время, внутрибрюшинное введение генистеина не вызывало к статистически значимых изменений активности изученных ферментов системы глутатиона на протяжении всего срока наблюдения.

Таблица 5 - Влияние генистеина на состояние системы глутатиона и переписного окисления липидов в эритроцитах периферической крови белых беспородных крыс-самцов, подвергнутых острому рентгеновскому облуче-

Сроки исследования после облучении, сут Условия эксперимента Исследуемый показатель

вг, мкмоль/г НЬ ГР, ммоль/г НЬ-мин ГТ, ммоль/г НЬ-мин Г-6-ФДГ, ммоль/г НЬ-мин МДА, ммоль/г НЬ

- интактные 3,3±0,1 21,3±1,83 0,92±0,04 168,1 ±9,4 0,61 ±0,08

5 мин. облучение 3,7±0,2 24,6±3,4 0,9±0,02 194,6±7,9 1,2±0,1#

генистеин +облучение 3,5±0,2 28,1 ±0,9 0,9±0,02 188,5±13,0 0,9±0,04*#

3 облучение 2,8±0,4 22,2±3,2 0,7±0,08# 178,2±15,2 1,4±0,2#

генистеин +облучение 2,8±0,4 29,9±4,5 0,7±0,06# 189,4±12,1 1,2±0,06#

24 облучение 2,9±0,2 22,7±3,6 0,8±0,06 193,5±8,8 1,3±0,05#*

генистеин +облучение 3,6±0,2* 24,1±2,4 0,7±0,02# 199,5±5,4 1,3±0,05#

72 облучение 2,8±0,1# 15,8±1,1# 1,1±0,08 150,8±9,6 1,2±0,06#

генистеин +облучение 2,9±0,05 17,7±1,6 0,7±0,12*# 163,4±7,5 1,0±0,08#

Примечания: 1 - # - отличие (по t-критерию Стыодента) от группы «интактные» достоверно, р<0,05; 2 - * - отличие (по t-критерию Стыодента) от группы «облучение» достоверно, р<0,05.

Таким образом, результаты проведенных нами исследований свидетельствуют о том, что синтетический генистеин является малотоксичным соединением. Выявлено, что препарат влияет на индукцию провоспали-тельных цитокинов, которые как известно, формируют эндогенный фон радиорезистентности [Гончаренко Е.Н., Кудряшов Ю.Б., 1980; Maurya D.K. et al., 2006]. Кроме того, свойственная генистеину эстрогенная активность также имеет немаловажное значение в механизме реализации противолучевых свойств препарата, поскольку позволяет дать объяснение тому, каким образом генистеин может участвовать в процессе клеточной пролиферации, дифференцировке и апоптозе гемопоэтических клеток в условиях облучения [Banerjee S. et al., 2008]. В ходе проведенных нами исследований показано, что профилактическое применение препарата способствует уменьшению выраженности постлучевых нарушений костномозгового кроветворения, что в конечном счете отражается на повышении выживаемости облученных животных на фоне введения им генистеина. Наконец, установлено, что генистеин обладает антиоксидантной активностью, а препараты, обладающие антиоксидантной активностью, рассматриваются в качестве перспективных радиозащитных средств [Хавинсон В.Х. и др., 2003; Singh V.K. et al., 2013]. Защитный эффект этих препаратов в условиях лучевого воздействия связан, прежде всего, с их способностью подавлять процессы свобод-

но-радикального окисления и повышать активность антиоксидантных систем организма, снижать уровень перекисного окисления липидов и степень повреждения молекулы ДНК [Магира В.Ф., 2002; Шишкина Л.Н., 2013; Weiss J.F., Landauer M.R., 2000; Maurya D.K. et al., 2012].

Проведенные нами исследования свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения генистеина для разработки новых схем профилактики и ранней патогенетической терапии острой лучевой болезни и коррекции цитопенического синдрома радиационной природы. Кроме того, полученные нами данные о повышении выживаемости облученных животных при применении генистеина свидетельствуют о целесообразности продолжения изучения возможных механизмов радиозащитного действия этого препарата.

ВЫВОДЫ

1. Определены параметры острой токсичности синтетического генистеина. Внутрибрюшинное введение синтетического генистеина в диапазоне доз от 2000 мг/кг до 6000 мг/кг не сопровождалось изменением массы тела и не приводило к макроскопическим нарушениям морфологии внутренних органов у экспериментальных животных. Величина расчетной сред-несмертельной дозы LD50 для синтетического генистеина при внутрибрю-шинном введении составила 8292±1247 мг/кг, что позволяет отнести это соединение к малотоксичным веществам.

2. Однократное внутрибрюшинное введение генистеина в дозе 200 мг/кг не вызывало значимых изменений общего числа лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов в периферической крови, биохимических показателей углеводного, белкового и липидного обмена, а также эмоционального статуса и двигательной активности у белых беспородных крыс.

3. В хемилюминесцентной реакции in vitro с участием рибофлавина и перекиси водорода, синтетический генистеин обладал антиоксидантной активностью, сопоставимой с активностью аскорбиновой кислоты, но выраженной слабее, чем у кверцетина. В исследованиях in vivo выявлено, что в эритроцитах периферической крови крыс через 4 ч после введения животным генистеина концентрация восстановленного глутатиона повышалась на 73,8%, а спустя 1 сут значение этого показателя превосходило контрольные величины на 85%. В эти же сроки обнаружено увеличение активности глу-татион-редуктазы: в 1,6 раза через 4 ч после введения генистеина и в 2 раза - через 24 ч после введения препарата.

4. Внутрибрюшинное введение крысам генистеина в дозе 200 мг/кг сопровождается увеличением содержания ß-эстрадиола и провоспалитель-ных цитокинов в сыворотке крови животных. Через 1 ч после введения препарата содержание ß-эстрадиола повышалось более чем в 2 раза, ИЛ-1 - на 26%, ИЛ-6 - на 14%. Через 24 ч после введения генистеина содержание ИЛ-1 было на 32%, а ИЛ-6 - на 30% выше, чем в контроле.

5. Синтетический генистеин обладает радиозащитной активностью. Внутрибрюшинное введение препарата в дозе 200 мг/кг за 1 ч до острого воздействия рентгеновского излучения в дозах СД50.9о/зо приводило к увеличению выживаемости и средней продолжительности жизни облученных белых беспородных мышей. Значение ФИД для генистеина при данной схеме применения препарата составило 1,23. Однократное введение генистеина за 24 ч до или через 1 ч после радиационного воздействия, а также курсовое применение в течение 5 последующих суток после рентгеновского облучения не оказывало существенного влияния на показатели выживаемости и средней продолжительности жизни облученных животных.

6. При профилактическом однократном применении генистеин более эффективно снижал летальность облученных в дозах СД50.9„/30 мышей, чем мексидол, цитохром С или литан, обладал сопоставимой с Р-эстрадиолом радиозащитной эффективностью, но проявлял менее выраженные противолучевые свойства, чем цистамин. При профилактическом введении за 1 ч до облучения ФИД для генистеина составил 1,23, для мексидола - 1,17, для цитохрома С - 1,07, для литана - 1,12. Для Р-эстрадиола при однократном введении препарата за 5 сут до облучения расчетное значение ФИД равнялось 1,26, а для цистамина при введении за 20 мин. до радиационного воздействия — 1,41.

7. Синтетический генистеин обладает способностью уменьшать выраженность постлучевых нарушений костномозгового кроветворения. На фоне введения генистеина число колоний, выявленных в методике эндогенного колониеобразования на селезенках облученных в дозах 7-9 Гр мышей, было в 1,8-2,7 раза больше, чем в контроле. Профилактическое применение генистеина позволяло также в 1,5 раза увеличить число определенных в методике экзогенного колониеобразования КОЕ-С9 после облучения мышей в дозе 2 Гр, в 1,7 раза - после облучения в дозе 4 Гр, в 2,7 раза - после облучения в дозе 6 Гр.

8. Введение крысам генистеина в дозе 200 мг/кг за 1 ч до радиационного воздействия способствует снижению выраженности ранней постлучевой лейко-, нейтро- и тромбоцитопении. У облученных в дозе 6 Гр крыс, получивших препарат, на 1 сут после радиационного воздействия уровень лейкоцитов превышал показатели контрольной группы в 1,3 раза, а к 7 сут -в 1,5 раза. При этом на 3 и 7 сут исследования регистрировали значимое повышение количества тромбоцитов в 2,2 и 2,3 раза соответственно по сравнению с животными контрольной группы.

9. Применение генистеина для модификации биологических эффектов облучения в дозе 6 Гр позволяло уже через 5 мин. после радиационного воздействия на 25% по сравнению с контролем снизить уровень малонового диальдегида, а через 24 ч - на 26% увеличить содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах периферической крови облученных крыс.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выявленная в экспериментах на мелких лабораторных животных радиозащитная активность генистеина позволяет рекомендовать дальнейшее исследование этого препарата в качестве перспективного средства профилактики радиационных поражений.

2. Полученные результаты о повышении выживаемости облученных животных при профилактическом применении генистеина свидетельствуют о целесообразности изучения возможных механизмов радиозащитного действия этого препарата.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гребенюк, А.Н. Современные возможности профилактики и лечения поражений, вызванных применением ядерного оружия или радиационными авариями / А.Н. Гребенюк, В.П. Легеза, Д.Ю. Минаев, В.А. Мясников, В .Б. Назаров, В.В. Салухов, P.A. Тарумов, Т.В. Власенко, В.В. Зацепин // Охрана здоровья военнослужащих в региональных военных, климатических и эпидемиологических условиях: сб. науч. трудов междунар. конф. -СПб.: Человек и его здоровье, 2012. - С. 200-201.

2. Тарумов, P.A. Исследование токсичности изофлавоноида генистеина в экспериментах на мышах / P.A. Тарумов, В.А. Башарин, А.Н. Гребенюк, В.Б. Назаров, В.Ю. Ковтун, И.Е. Чикунов // Актуальные вопросы радиационной медицины и промышленной токсикологии: материалы науч,-практ. конф.- Красноярск, 2012. - С. 72-73.

3. Тарумов, P.A. Препараты эстрогенов как перспективные средства профилактики и лечения радиационных поражений у участников ликвидации последствий радиационных аварий / P.A. Тарумов, В.А. Мясников, В.А. Башарин, В.Н. Быков, А.Н. Гребенюк // Радиационная гигиена: итоги и перспективы: материалы XXXXV науч. конф. «Хлопинские чтения». - СПб.: СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2012. - С. 157-159.

4. Гребенюк, А.Н. Современные возможности медицинской защиты участников ликвидации последствий радиационных аварий / А.Н. Гребенюк, Д.Ю. Минаев, В.А. Мясников, В.Б. Назаров, P.A. Тарумов // Радиационная гигиена: итоги и перспективы: материалы XXXXV науч. конф. «Хлопинские чтения». - СПб.: СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2012. - С. 44-47.

5. Гребенюк, А.Н. Современные средства медицинской защиты от поражений факторами радиационной и химической природы и перспективные направления их совершенствования / А.Н. Гребенюк, В.А. Башарин, В.Н. Быков, В.В. Зацепин, Д.Ю. Минаев, В.А. Мясников, P.A. Тарумов, Ю.В. Шилов // Актуальные проблемы медико-санитарного обеспечения персонала объектов морской техники, работников предприятий с вредными и (или) опасными производственными факторами, а также населения территорий, обслуживаемых ФМБА России: материалы Всерос. науч.-практ. конф. - СПб., 2012. - С. 32-34.

6. Башарин, В.А. Острая токсичность отечественного синтетического генистеина / В.А. Башарин, А.Н. Гребенюк, P.A. Тарумов, В.Б. Назаров, В.Ю. Ковтун, И.Е. Чикунов // Инновации в современной фармакологии: материалы IV съезда фармакологов России. - Казань, 2012. - С. 19.

7. Тарумов, P.A. Влияние литиевой соли окисленного глутатиона на динамику гематологических показателей у облученных крыс / P.A. Тарумов, A.A. Антушевич // Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия: материалы II Всерос. науч. конф. молодых ученых. - СПб., 2012 - С 507-508.

8. Тарумов, P.A. Современные антиоксиданты как перспективные средства профилактики и лечения радиационных поражений / P.A. Тарумов, В.А. Башарин, A.A. Антушевич, В.Ю. Ковтун, А.Н. Гребенюк // Острые проблемы разработки противолучевых средств: консерватизм или модернизация: тез. докл. Рос. науч. конф. - М.: РУДН, 2012. - С. 20.

9. Тарумов, P.A. Предварительные результаты изучения радиозащитной эффективности синтетического генистеина / P.A. Тарумов // Острые проблемы разработки противолучевых средств: консерватизм или модернизация: тез. докл. Рос. науч. конф. - М.: РУДН, 2012. - С. 59.

10. Мясников, В.А. Изучение эффективности ß-эстрадиола, индоме-тафена и генистеина в качестве радиопротекторов при остром облучении / В.А. Мясников, P.A. Тарумов // Вестник новых медицинских технологий. -2012. - Т. 19, № 2. - С. 244-246.

11. Тарумов, P.A. Противолучевые свойства современных ангиокси-дантов / P.A. Тарумов, В.А. Башарин, А.Н. Гребенюк // Биомедицинский журнал medline.ru. - 2012. - Т. 13. - С. 682-700. - режим доступа: http//www.medline.ru, свободный.

12. Гребенюк, А.Н. Экспериментальное исследование острой токсичности генистеина в опытах на мелких лабораторных животных / А.Н. Гребенюк, В.А. Башарин, P.A. Тарумов, В.Б. Назаров, В.Ю. Ковтун, И.Е. Чикунов // Токсикологический вестник. - 2012. - № 6 (116). - С. 25-29.

13. Гребенюк, А.Н. Сравнительное изучение эффективности генистеина, мексидола, литана и цитохрома С как средств профилактики и ранней терапии радиационных поражений / А.Н. Гребенюк, В.А. Башарин, P.A. Тарумов, В.Ю. Ковтун, A.A. Антушевич // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2013. - № 1 (41). - С. 102-106.

14. Антушевич, A.A. Экспериментальное изучение лечебной эффективности литиевой соли дисульфида глутатиона в условиях острого внешнего у-облучения / A.A. Антушевич, А.Е. Антушевич, А.Н. Гребенюк, P.A. Тарумов, В.Г. Антонов // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2013 -Т.53, № 5. — С. 451-458.

15. Гребенюк, А.Н. Экспериментальная оценка радиозащитной эффективности генистеина по показателям выживаемости и костномозгового кроветворения мышей, подвергнутых рентгеновскому облучению / А.Н.

Гребенюк, В.А. Башарин, P.A. Тарумов, Н.В. Аксенова, В.Б. Назаров, В.Ю. Ковтун, И.Е. Чикунов // Радиационная биология. Радиоэкология. — 2013. — Т. 53, № 5. - С. 468-474.

16. Гребенюк, А.Н. Изучение антиоксидантных свойств отечественного синтетического генистеина на модели in vitro и in vivo / А.Н. Гребенюк, В.А. Башарин, P.A. Тарумов, В.Б. Назаров, В.Ю. Ковтун, A.B. Арутюнян, В.И. Прокопенко // Вестник Российской Военно-медицинской академии. -2013. - № 2 (42). - С. 83-87.

17. Тарумов, P.A. Влияние антиоксиданта литана на динамику гематологических показателей у облученных крыс / P.A. Тарумов, A.A. Антуше-вич // Вестник новых медицинских технологий. - 2013. - Т. 20, № 2. - С. 223-226.

18. Тарумов, P.A. Оценка острой токсичности отечественного синтетического генистеина и его влияния на гематологические, биохимические и физиологические показатели / P.A. Тарумов // IV Съезд токсикологов России с международным участием: сб. трудов. - М.: Capital Press, 2013. - С. 582-584.

19. Тарумов, P.A. Сравнительная оценка радиозащитной эффективности ß-эстрадиола и генистеина при остром облучении / P.A. Тарумов, В.А. Мясников // Международная научно-практическая конференция по военной медицине: материалы конф. - СПб., 2013. - С. 197-199.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

АЛТ АСТ

вг

Г-6ФДГ ГР

ДМСО

ил

КОЕ МДА Мкц ПОЛ

СД50 -90/30

СКК

СПЖ

ФИД

ЕБзо ЬДзо

- аланинаминотрансфераза

- аспартатаминотрансфераза

- восстановленный глутатион

- глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

- глутатион-редуктаза

- дметилсульфоксид

- интерлейкнн

- колониеобразующая единица

- малоновый диальдегид

- миелокариоцит

- перекисное окисление липидов

- доза облучения, вызывающая гибель 50-90% особей группы в течение 30 сут

- стволовая клетка крови

- средняя продолжительность жизни

- фактор изменения дозы

- среднеэффективная доза

- среднесмертельная доза

Подписано в печать 01.04.14. Формат 60x84/16. Объем 1,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ №238 Тип. ВМедА

194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Тарумов, Роман Алексеевич, Санкт-Петербург

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОЕННО-МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ С.М. КИРОВА» МИНИСТЕРСТВА ОБОРОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

рукописи

04201459315

ТАРУМОВ Роман Алексеевич

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА РАДИОЗАЩИТНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕНИСТЕИНА ПРИ ОСТРОМ ОБЛУЧЕНИИ

03.01.01- Радиобиология

14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители: доктор медицинских наук профессор А.Н. Гребенюк доктор медицинских наук В.А. Башарин

Санкт-Петербург 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................5

ГЛАВА 1 ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ГЕНИСТЕИНА КАК СРЕДСТВА ПРОФИЛАКТИКИ И ПАТОГЕНЕТИЧСКОЙ ТЕРАПИИ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ (обзор литературы)..............................................................................18

1.1 Современные подходы к фармакологической профилактике и терапии радиационных поражений.............................................................................................18

1.2 Фармакологические свойства изофлавоноида генистеина..................................24

1.3 Радиозащитная эффективность генистеина..........................................................39

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................46

2.1 Выбор и содержание лабораторных животных....................................................46

2.2 Характеристика используемых препаратов..........................................................47

2.3 Оценка острой токсичности синтетического генистеина....................................52

2.3.1 Изучение показателей выживаемости и клинической картины интоксикации животных при введении им синтетического генистеина в растворе полиэтиленгликоля.........................................................................................................52

2.3.2 Изучение показателей выживаемости и клинической картины интоксикации животных при введении им синтетического генистеина в растворе диметилсульфоксида.....................................................................................................53

2.3.3 Методика морфологических исследований.......................................................54

2.4 Радиобиологические методы..................................................................................55

2.4.1 Условия облучения................................................................................................55

2.4.2 Оценка выживаемости и средней продолжительности жизни облученных животных........................................................................................................................56

2.4.3 Определение фактора изменения дозы...............................................................56

2.5 Гематологические методы.................................... ...................................................57

2.5.1 Определение количества лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов в периферической крови........................................ ..........................................................57

2.5.2 Определение количества колоний на селезенке методикой эндогенного колониеобразования.......................................................................................................57

2.5.3 Определение количества колоний на селезенке методикой экзогенного колониеобразования.......................................................................................................58

2.6 Биохимические методы...........................................................................................60

2.6.1 Методы исследования биохимических показателей сыворотки крови...........60

2.6.2 Определение показателей системы глутатиона в эритроцитах периферической крови..................................................................................................61

2.6.3 Оценка антиоксидантной активности синтетического генистеина методом хеми люминесценции.....................................................................................................63

2.7 Оценка поведенческих реакций крыс в тесте «Открытое поле»........................63

2.8 Статистическая обработка результатов.................................................................64

ГЛАВА 3 ОЦЕНКА ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКОГО ГЕНИСТЕИНА...............................................................................................................66

3.1 Изучение основных показателей острой токсичности генистеина, растворенного в полиэтиленгликоле............................................................................66

3.2 Изучение основных показателей острой токсичности генистеина,

растворенного в диметилсульфоксиде.........................................................................71

ГЛАВА 4 ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОДИН А МИКИ СИНТЕТИЧЕСКОГО ГЕНИСТЕИНА...............................................................................................................76

4.1 Влияние генистеина на гематологические показатели крыс...............................76

4.2 Влияние генистеина на биохимические показатели крыс...................................80

4.3 Изучение антиоксидантных свойств генистеина на модели in vitro..................83

4.4 Влияние генистеина на состояние системы глутатиона в эритроцитах периферической крови крыс.........................................................................................84

4.5 Влияние генистеина на цитокиновый статус крыс..............................................89

4.6 Влияние генистеина на эстрогенный статус крыс................................................92

4.7 Влияние генистеина на поведение крыс................................................................93

ГЛАВА 5 ОЦЕНКА РАДИОЗАЩИТНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ СИНТЕТИЧЕСКОГО ГЕНИСТЕИНА ПРИ ОСТРОМ ВНЕШНЕМ РАДИАЦИОННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ.........................................................................96

5.1 Оценка радиозащитной эффективности генистеина при различных схемах применения препарата в условиях острого внешнего облучения............................96

5.2 Сравнительная оценка радиозащитной эффективности генистеина, мексидола, литана и цитохрома С по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных мышей........................................................99

5.3 Сравнительная оценка радиозащитной эффективности генистеина и Р-эстрадила по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных мышей.....................................................................................................104

5.4 Сравнительная оценка радиозащитной эффективности генистеина................106

и цистамина по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных мышей.....................................................................................................106

5.5 Влияние генистеина на функцию кроветворения облученных мышей, оцененную с применением методик эндогенного и экзогенного колониеобразования.....................................................................................................109

5.6 Влияние генистеина на гематологические показатели облученных крыс.......112

5.7 Влияние генистеина на состояние системы глутатиона и перекисного

окисления липидов в эритроцитах периферической крови облученных крыс.....119

ГЛАВА 6 ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ РЕАЛИЗАЦИИ РАДИОЗАЩИТНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕНИСТЕИНА (обсуждение полученных результатов) .... 126

ВЫВОДЫ......................................................................................................................146

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ......................................................................149

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..........................................................................................150

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................151

ВВЕДЕНИЕ

Использование источников ионизирующих излучений в промышленности, науке и медицине в ряде случаев может привести к сверхнормативному воздействию радиации как на отдельного человека, так и на популяцию в целом [10, 188, 228]. Не снижается опасность аварийного облучения при ликвидации последствий ядерных катастроф на объектах атомной энергетики [103, 230]. Примером тому могут служить радиационные аварии в США, Англии, Франции, СССР (в т.ч. на Чернобыльской АЭС) и России, Японии [38, 217]. Кроме того, существует вероятность ядерного и радиологического терроризма различных масштабов на атомных электростанциях и других объектах, использующих источники ионизирующих излучений, на фоне усложнившейся международно-политической ситуации, что неизбежно создает дополнительный риск радиоактивного загрязнения окружающей среды, поражения людей, животных и растительного мира [10, 78, 103]. Проблема радиационных поражений здоровых органов и тканей, которые нередко встречаются в результате проведения лучевой терапии опухолей, также не снимается с повестки дня [60, 188]. Кроме того, по мнению ряда авторов [65, 81], именно радиационный фактор может стать главным барьером на пути продвижения человека в космос. Все эти ситуации требуют дальнейшего совершенствования мероприятий по обеспечению радиационной безопасности персонала и населения, важным элементом которой является использование фармакологических средств противорадиационной защиты [14, 206]. Однако, разработанные к настоящему времени радиозащитные препараты далеки от совершенства, вследствие чего создание и испытание новых высокоэффективных медицинских средств противорадиационной защиты является одной из актуальных проблем современной радиобиологии, фармакологии и клинической фармакологии [31, 147].

Сейчас наиболее изученными и высокоэффективными фармакологическими средствами противорадиационной защиты являются радиопротекторы [13, 16, 125]. Однако их применение ограничено малой терапевтической широтой и, как

следствие, высокой токсичностью в оптимальных радиозащитных дозах, а также сроками их использования - только до радиационного воздействия [16, 147]. Средства ранней патогенетической терапии представлены единичными препаратами, к тому же имеющими умеренную радиозащитную эффективность [24, 25, 46]. Вследствие этого работы по поиску, разработке и созданию, а также экспериментальному (доклиническому) изучению безопасности, фармакодинамики и механизмов действия новых эффективных противолучевых лекарственных средств на животных и в опытах in vitro активно продолжаются [29, 31, 57, 125, 155]. При этом большое внимание уделяется веществам природного происхождения и их синтетическим аналогам, которые могут быть высокоэффективны как при профилактическом, так и лечебном их применении [166, 168, 222]. Особое значение придается тому, чтобы впервые синтезированный фармакологический препарат был не только высокоэффективным, но и безопасным и удобным в применении и мог использоваться в обычной медицинской практике, т.е. имел бы двойное назначение [27, 137, 149].

Степень разработанности темы исследования

В настоящее время многочисленные отечественные и зарубежные исследователи показывают перспективность использования для профилактики и терапии радиационных поражений ингибиторов свободнорадикальных реакций, т.е. антиоксидантов, которые, являясь эффективными регуляторами окислительных процессов, проявляют радиозащитные свойства при остром облучении животных в сублетальных и минимально летальных дозах [55, 72, 149]. Динамично развиваются исследования по оценке противолучевых свойств стимуляторов гемопоэза, в частности цитокинов и их индукторов [26, 39, 45, 172]. Не прекращается поиск средств профилактики и раннего лечения лучевых поражений среди веществ стероидной структуры, в частности, эстрогенов и их природных аналогов - фитоэстрогенов [29, 223, 237].

В настоящее время в качестве одного из наиболее перспективных радиозащитных средств рассматривается изофлавоноид сои - генистеин, полученный из природных источников растительного происхождения [193, 200]. Весьма интересным является тот факт, что для генистеина, по данным экспериментальных наблюдений, характерно наличие антиоксидантных свойств [97], стимулирующее влияние на продукцию цитокинов [237], а также умеренная эстрогенная активность [221]. Кроме того, препарат обладает и другими биологическими эффектами: регулирует пролиферацию и дифференцировку клеток [116, 233], повышает сопротивляемость организма при химиотерапии [216], индуцирует апоптоз опухолевых клеток [180, 187], подавляет ангиогенез новообразований [210, 238] и функции остеокластов [89], снижает активацию и пролиферацию лимфоцитов [186], оказывает влияние на тучные клетки и проявляет умеренные противовоспалительные свойства [86, 136, 215].

Кроме того, генистеин обнаруживает в эксперименте выраженную радиозащитную активность при хорошей переносимости [111, 152, 153, 154]. Однако возможности практического применения этого препарата ограничиваются его весьма недешевым производством из растительного сырья, а также трудностями, связанными с получением стабильного, хорошо очищенного препарата. Химическая структура генистеина изучена в достаточной степени [133, 184], и российским ученым удалось синтетическим путем получить вещество, полностью соответствующее природному аналогу. Однако экспериментальное (доклиническое) изучение острой токсичности, во многом определяющей безопасность применения препарата, исследование фармакодинамики и механизмов действия синтетического генистеина, а также оценка его радиозащитной эффективности в условиях острого облучения до настоящего времени не проводились, что определяет актуальность и послужило основанием для выполнения настоящей работы.

Цель исследования

Задачи исследования

2. Изучить влияние синтетического генистеина на морфологический состав периферической крови, биохимические показатели углеводного, белкового и липидного обменов, содержание провоспалительных цитокинов и (3-эстрадиола в сыворотке крови белых беспородных крыс.

5. Провести сравнительную оценку радиозащитной эффективности синтетического генистеина, антиоксидантов (мексидола, литана, цитохрома С), эстрогенов ф-эстрадиола) и серосодержащих радиопротекторов (цистамина) по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных мышей.

Научная новизна

Установлена плохая растворимость синтетического генистеина в воде, масле и ТВИНе-80. Показано, что генистеин хорошо растворяется в полиэтиленгликоле и диметилсульфоксиде, при этом, в отличие от полиэтиленгликоля, раствор препарата в диметилсульфоксиде в проведенных исследованиях не оказывал токсического влияния на организм мелких лабораторных животных. Определена численная характеристика токсичности препарата, растворенного в диметилсульфоксиде, на основании которой отечественный синтетический генистеин можно рассматривать как малотоксичное соединение.

Установлено, что однократное внутрибрюшинное введение синтетического генистеина не изменяет морфологического состава крови и не нарушает течения основных обменных процессов в организме животных. Выявлено, что на модели in vitro синтетический генистеин обладает антиоксидантными свойствами, выраженность которых уступает кверцетину, но сопоставима с таковыми у аскорбиновой кислоты. Показано, что внутрибрюшинное введение генистеина крысам сопровождается увеличением концентрации восстановленного глутатиона и активацией сопряженных ферментов, а также способствует увеличению содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке крови крыс через 1 и 24 ч после введения препарата. Установлено стимулирующее влияние генистеина на синтез и продукцию Р-эстрадиола, содержание которого в сыворотке крови крыс по сравнению с контролем было более чем в 2 раза выше уже через 1 ч после введения препарата. Показано, что введение синтетического генистеина не

сопровождается изменением эмоционального статуса и двигательной активности белых беспородных крыс.

Обнаружено, что синтетический генистеин обладает противолучевой эффективностью при остром внешнем радиационном воздействии. При этом выраженный защитный эффект наблюдался при внутрибрюшинном введении препарата за 1 ч до острого рентгеновского облучения в дозах СД5о-9о/зо- Введение препарата мышам за 24 ч до или через 1 ч после облучения, а также курсом из 5 инъекций - один раз в день в течение 5 сут после радиационного воздействия не оказывало существенного противолучевого эффекта.

Показано, что при профилактическом однократном применении за 1 ч до облучения синтетический генистеин более эффективно снижал летальность облученных в дозах СД50-90/30 мышей, чем мексидол, цитохром С или литан, обладал сопоставимой с Р-эстрадиолом радиозащитной эффект�

Информация о работе

Тарумов, Роман Алексеевич
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург, 2014
ВАК 03.01.01

Диссертация

Экспериментальная оценка радиозащитной эффективности генистеина при остром облучении - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы