Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование технологии изготовления радиозащитного полиантигена

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование технологии изготовления радиозащитного полиантигена"

На правах рукописи

005020545

Рахматуллина Гульназ Ильгизаровна

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ РАДИЗАЩИТНОГО ПОЛИАНТИГЕНА

03.01.01 -радиобиология 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДПР ^

Казань-2012

005020545

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)

Научные руководители: -доктор ветеринарных наук,

профессор

Низамов Рамзи Низамович

-доктор биологических наук, профессор

Конюхов Генадий Владимирович

Официальные оппоненты: -доктор ветеринарных наук,

профессор, завлаб, музей-штаммов ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» Садыков Нариман Султанович

-доктор биологических наук, профессор кафедры радиобиологии, ренгенологии и ГО Московской гос.академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина Пак Василий Васильевич

Ведущее учреждение: ФГУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита состоится «__»_ 2012 г в 10°° часов на заседание

диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный Городок-2, ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань).

Автореферат разослан «_» _ 2012 г. и размещен на

официальном сайте ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» www.vnivi.ru и на официальном сайте ВАК РФ www.vak2.ed.gov.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета

Степанов В.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В результате многолетних радиобиологических исследований установлено, что одним из главных врагов облученного организма является аутофлора, ведущая к обсеменению внутренних органов микробами, обуславливая пострадиационное развитие эндогенной инфекции вследствие резкого снижения иммунобиологической реактивности (Троицкий ВЛ., Туманян М.А., 1955; Киселев П.Н., 1956; Петров Р.В., 1957; Warren S.L., 1946). Детальные микробиологические исследования Петрова Р.В. (1952 - 1963), Киселева П.Н. и др. (1955 - 1963) показали, что учет количественного и качественного изменения аутомикрофлоры облученного организма является объективным тестом (индикатором) оценки нарушения иммунобиологической реактивности организма, что имеет существенное значение при разработки методов и средств диагностики, лечения и профилактики радиационных поражений (Иванов A.B. и др. 2008).

В результате детальных микробиологических исследований установлено, что пострадиационная дисфункция системы иммунобиологической реактивности сопровождается резким увеличением (до 25 раз) микробов аутофлоры в кишечнике, на коже, в полости рта и дыхательных путях, преобладающим видом среди которых является кишечная палочка (Клемпарская H.H. и др., 1964), а предварительное введение ее или компонентов (экзо-, эндотоксинов, полисахаридов) до облучения повышает радиорезистентность (выживаемость) организма (Мальцев В.Н., 1994; Бударков В.А., Сургучева Л.М., 2002; Смирнов A.M., Дорожкин В .И., Рубченков П.Н., 2011). Это важнейшее положение, установленное отечественными радиационными иммунологами, послужило основанием для разработки сотрудниками ФГБУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» радиозащитного полиантигена на основе Е. coli (МПАГ) и предложения его для специфической профилактикой радиационных поражений организма (Низамов Р.Н., Конюхов Г.В., 2004).

Однако, несмотря на высокую радиозащитную эффективность препарата, ему присущ ряд недостатков (сложность технологии изготовления, многокомпонентность, многостадийностъ, большая трудоемкость), что сдерживает серийный выпуск радиовакцины для широкого применения на практике, хотя необходимость указанного препарата в условиях чрезвычайных ситуаций (аварии на атомных реакторах, АЭС, подводных лодкках и других атомных установках) очевидна.

Сказанное определяет актуальность проблемы и диктует необходимость усовершенствования и унификации технологии изготовления известного радиозащитного препарата.

Цели п задачи. Целью настоящих исследований является усовершенствование технологии изготовления радиозащитного препарата на основе Е coli.

Исходя из цели, на разрешение были поставлены следующие задачи:

1. Определить возможность унификации способа получения известного радиозащигного препарата - микробного полиантигена.

2. Конструирование радиозащитного препарата на основе Е. coli.

3. Влияние разработанного препарата на организм интактных животных.

4. Испытание радиозащитных свойств препарата на облученных животных.

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом центра

«Радиационная безопасность» (№ госрегистрации 01990005332).

Научная новизна. На основании детального анализа технологии изготовления специфического радиозащитного препарата на базе антигенов Е. coli и хиноидного радиотоксина установлена возможность унификации способа получения целевого продукта. Согласно предложенной схеме сконструирован новый радиозащитный препарат на основе Е. coli, обеспечивающий пролонгированную профилактику радиационных поражений организма путем коррекции систем антиинфекционной и антиоксидантной защиты.

Научная новизна исследований подтверждена Патентом РФ № 2338546 от 20.11.2008г.

Теоретическая ценность работы. Полученные результаты расширяют сведения о ведущих механизмах противолучевого действия препаратов на основе микробных антигенов, обладающих способностью повышать резистентность организма к действию ионизирующей радиации путем коррекции иммунобиологической реактивности организма, нормализации состояния аутомикрофлоры, предотвращения пострадиационого дисбактериоза и развития эндогенной инфекции.

Практическая значимость определяется тем, что для специфической профилактики радиационных поражений организма предложен модифицированный вариант радиозащитного полиэнтигсна МПАГ - М. Результаты исследований использованы при составлении нормативно-методических документов: «Инструкции по изготовлению и контролю радиозащитного препарата», «Технических условий на радиозащкгный препарат» ТУ 009-004937.4.09, утвержденных директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и Начальником ГУВ КМ РТ в 2009 г.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных научных сессиях ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2005-2011гг., научно-практических конференциях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань, 2009-2010гг.), 2-м съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов (г. Казань, 2009), Международной научно-практической конференции по экспериментальной ветеринарной медицине (г. Харьков, 2010). Результаты основных этапов работы подтверждены внутрилабораторными комиссионными испытаниями с положительной оценкой.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 7 научных работ, в том числе 2-х изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Усовершенствование технологии изготовления микробного радиопротектора.

2. Радиозащитные свойства модифицированного варианта микробного полиантигена МГТАГ -М.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 151 странице компьютерного текста и она состоит из введения, 2 глав обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и приложений. Список использованной литературы включает 254 источника, в том числе - 58 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 22 таблицами.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Исследования выполнены в 2005-2011 гг. в лаборатории радиационной иммунологии отдела радиобиологии ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», Казань).

В проведении ряда комплексных исследований принимал участие кандидат биологических наук, с.н.с. A.C. Титов, которому выражаем искреннюю благодарность за оказанную помощь и плодотворное сотрудничество.

В экспериментальных исследованиях и комиссионных испытаниях были использованы:

Подопытные животные: 219 белых мышей живой массой 18-20 г, 136 белых крыс живой массой 180-200 г, 15 морских свинок живой массой 300-350 г, 51 кролик породы «Шиншилла» живой массой 2,5-3,5 кг.

Штаммы и микробные антигены: производственный штамм Е. coli «ПЛ-6», эпизоотический штамм Е. coli «ПЗ-З» № 1150/15 - возбудитель эшерихиозной диареи телят, полученные из коллекции штаммов лаборатории по изучению возбудителей особо опасных болезней ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»; для определения лизоиимной активности использовали стандартную культуру М. lysodeicticus. Для серологической типизации изолятов, выделенных из организма облученных и подвергнутых радиопрофилактике испытуемыми радиозащитными средствами животных использовали коммерческий набор типоспецифичексих агглютинирующих (О-, Н-, К- и А-) сывороток. В качестве стандартного радиозащитного средства использовали микробный полиантаген, изготовленный согласно ТУ 383-032-00492474-02, а в качестве потенциальных радиозащитных средств- экспериментальные серии препаратов собственного изготовления согласно усовершенствованной технологии.

Оборудование и реактивы. Для моделирования лучевой болезни у опытных животных использовали гамма-установку «Пума» с источником излучения 137Cs. Для индукции радиотоксинов в микробных клетках использовали гамма-установку «Исследователь» с источником излучения ^Со. Для определения активности антиоксидантных ферментов - спектрофотометр СФ-46 отечественного производства, колориметр фотоэлектрический ИРФ-16, магнитные мешалки, а также холодильники, термостаты, водяные бани, центрифуги и т.д.

В рутинных микробиологических и иммунологических исследованиях применяли стандартные растворы, питательные среды, метаболиты, необходимые химические растворы, сыворотки и антисыворотки.

Перед проведением основных опытов по усовершенствованию радиозащитного микробного препарата, тест-культуру Е. coli «ПЛ-6» выращивали на МПА в течение 20-24 ч при 37°С, после чего проверяли ее на чистоту, морфологическую и серологическую типичность, культуральные, ферментативные, гемолитические, колициногенные, патогенные свойства в соответствии с «Методическими указаниями бактериологической диагностики колибакгериоза животных» (утв. ГУВ МСХ СССР в 1981 г).

Моделирование лучевой болезни тяжелой степени у лабораторных животных осуществляли путем облучения их на гамма - установке «Пума». Животных облучали однократно при мощности экспозиционной дозы излучения 3,13xl0"s Кл/(кг'с) в дозах соответственно 7,7 Гр (белые мыши), 9,0 Гр (белые крысы) и 11,0 Гр (кролики).

Штамм-продуцент выращивали как на стандартных жидких (МПБ, бульон Хотгингера, ГПЭМ) и плотных (МПА) питательных средах, а также на средах с использованием стимулятора роста E.coli - 1,4-бензохинон гуанилгидразонтиосемикарбазона (Садыков Н.С., Низамов Р.Н., A.c. СССР № 1682394). Варьируя технологические параметры культивирования (время, pH, различные по составу питательные среды), получали 8 вариантов экспериментальных серий потенциальных радиозащитных препаратов. Унификацию технологии получения радиозащитного препарата осуществляли путем сопоставительного анализа технологических операций, их совместности, продолжительности и возможность исключения отдельных технологических параметров. Для экстренной оценки противолучевой активности полученных вариантов экспериментальных серий потенциальных радиозащитных препаратов использовали in vitro тест-систему - совместное культивирование облученных (5 Гр) лимфоцитов периферической крови и испытуемых радиозащитных средств. Критерием противолучевой активности испьпуемых препаратов служило сохранение жизнеспособности клеток по сравнению с контрольным препаратом. Определение токсичности и безвредности полученных потенциальных радиозащитных препаратов проводили в соответствии с «Рекомендациями по оценке безвредности и токсичности вакцинных и сывороточных препаратов» (Руководство ..., 1978), используя ИПМ - тест-изменение прироста массы.

Об эффективности испытуемых радиозащитных средств судили по клинико - гематологическим показателям: определяли содержание эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, лейкоформулы по общепринятым в гематологии методам (Жербин Е.А., Чухловин А.Б., 1989). Об изменении иммунологической реактивности организма на фоне применения испьпуемых препаратов судили по состоянию гуморального (синтез иммуноглобулинов) и клеточного (Т-, В-лимфоциты и их субпопуляции) звеньев иммунитета по Новикову Д.К. (1987), а также по изменению состава аутомикрофлоры - по Haenel Н. е.а. (1956) в

модификации Ахметзянова Ф.Х. (1966). Видовую идентификацию микроорганизмов проводили по Берджи (1997).

Оценку состояния протавомикробной защиты организма на фоне применения испытуемых препаратов осуществляли путем изучения факторов неспецифической защиты: фагоцитарной активности нейтрофипов - по Кост С.А. и Стенко М.И. (1967), лизоцимной активности сыворотки крови - по Дорофейчуку В .Г. (1986), бактерицидной активности - в in vitro - тесте по уменьшению числа жизнеспособных бактерий E.coli после контакта их с сывороткой крови лабораторных животных (Плохушко Е.Н., 2003).

Радиозащитную активность испытуемых препаратов определяли по интегральному показателю - 30-суточной выживаемости облученных в дозе ЛДюо/зо животных (Белоусова О.И., I960). При этом определяли содержание хиноидных радиотоксинов в РБФ-тесте по Гайнуллину Р.Р. (2009), липвдных радиотоксинов - по концентрации ТБК-активных соединений (Гончаренко М.С., Лаганова A.M., 1985), антиоксидантных ферментов - по М.А. Короток и др. (1988), состояние цитокиновой системы - по Ю.С. Лобковой и др. (1999).

Статистическую обработку полученного в ходе экспериментов цифрового материала осуществляли на компьютере с использованием прикладных программ Microsoft Excel, Word 2010.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение возможности усовершенствования технологии изготовления радиозащитного микробного полиантигена

Результаты детального анализа технологии изготовления известного радиозащитного препарата - микробного полиантигена (МПАГ) показали, что известная технология состоит из 4-х самостоятельных стадий подготовки отдельных компонентов полиантигена. Вместе с тем при этом имеет место повторение отдельных стадий (получение протектавного антигена и эшерихиозного анатоксина), которое является почти идентичным и отличается только по срокам контактирования микробных клеток и детоксиканта (формалина). Поэтому эти стадии мы сочли возможным объединить в единый технологический процесс.

Что касается стадии получения радиоантигена и последующей его конъюгации с белковым носителем - эшерихиозным экзотоксином, то эту стадию считаем возможным и целесообразным исключить из технологического процесса, поскольку облучение микробной биомассы в дозе 150 Гр перед формалинизацией индуцирует образование радиотоксинов, которые длительное время в стабильном состоянии остаются в микробной клетке и при последующей инкубации формалинизированных клеток, ввиду высокореакционной способности окисленных хинонов (хиноидного радиоантигена), они легко присоединяются к белковой части антигена - зшерихиозному анатоксину, осуществляя, тем самым, естественную конъюгацию низкомолекулярного химического соединения, к высокомолекулярному соединению, образуя надмолекулярный комплекс - гапген + белок (Ковалев И.Е., Полевая О.Ю., 1985). Справедливость высказанного

предположения нашло экспериментальное подтверждение в опытах по индикации радиоантигена и экзотоксина в водных и этаноловых экстрактах из облученных и формалинизированных микробных клеток в РБФ и РДП тест - системах с применением соответствующих антисывороток. При этом титры радиотоксина и экзотоксина в препаратах, приготовленных по известной и предложенной технологии не имели существенных отличий. Таким образом, в результате анализа технологии изготовления известного радиозащитного препарата -микробного полиантигена, установлена возможность унификации существующей технологии, путем исключения одной из сложных и трудоемких стадий -изготовление радиоантигена и последующей его конъюгации с белковым носителем - экзотоксином, а также совмещения стадий получения протективного антигена и анатоксина. Пострадиационное инкубирование облученных микробных клеток в присутствии детоксиканта (формалина) обеспечивает естественное ковалентное связывание гаптеновой части антигена (радиоантигена) с белковой молекулой анатоксина кишечной палочки, образуя полноценный белково-радиоантигенный комплекс ПА+АН+РА (протекгивный антиген + анатоксин + радиоантиген).

3.2 Изготовление экспериментальных образцов потенциальных радиозащитных препаратов с использованием усовершенствованной технологии

На первом этапе были проведены опыты по изготовлению экспериментальных образцов препаратов с использованием известной и модифицированной технологии путем выращивания Е. coli «ПЛ-6» на МПА, смыва биомассы, разведения до концентрации 1.2-Ю10 м.к./см\ у-облучения в дозе 150 Гр с последующим термостатированием культуры в течение 3,5-4,5 ч, добавления формалина (0,5%), повторного термостатирования в течение 10-12 суток, стандартизации препаратов по количеству микробных клеток - 2,5-1010 м.кУсм3 и стерилизации продукта путем у-облучения в дозе 3000 Гр.

Полученный по известной технологии препарат (МПАГ) использовали в качестве стандартного (контрольного) радиозащитного препарата. При получении модифицированного (усовершенствованного) варианта препарата, кроме того, мы использовали как обычную (МПА), так и специальную питательную среду (2,5-3,5 мае. % агара+0,5-1,5 мае % пептона + 0,0008-0,1 мае % 1,4 % бензохинон гуакилгидразонтиосемикарбазона - БХГТСК), а также жидкую питательную среду (бульон Хоттингера без и с добавлением 0,0008-0,1 мае. % 1,4% БХГТСК). Кроме того, для перевода зшерихиозного энтеротоксина в анатоксин, в качестве инактиватора использовали регламентированный препарат - формалин, а также его менее токсичный аналог - гексаметилентетрамин (ГМТМ).

В результате проведенных исследований были получены 8 вариантов потенциальных радиозащитных средств с использованием 4 видов питательных сред (МПА и МПА+БХГГСК, бульон Хоттингера - БХ, БХ+БХГГСК) и 2 видов детоксикантов (формалин, гексаметилентетрамин).

33 Изучение серологической активности, стерильности и безвредности полученных модифицированных вариантов радиозащитных средств

У полученных вариантов потенциальных радиозащитных средств проверяли наличие специфических антигенов (адгезивного, энтеротоксического и радиотоксического) с использованием регламентированных (антиадгезивной, антитоксической) и разработанной сотрудниками ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» антирадиотоксической сывороток в соответствующих тест-системах (РДП и РБФ).

Результаты серологического анализа полученных потенциальных радиовакцин представлены в таблице 1.

Таблица 1. Содержание протективного антигена, энтеротоксина и

Вариан Препарат, тученный на основе Содержание антигенов в препарате (титры log2)

т ПА (РДП) ЭНТ(РДП) РТ (РБФ)

I МПА 2,75±0,7 2,05±0,9 3,7±0,9

II МПА+БХГГСК 2,77±0,5 2,09±0,5 3,6±0,6

III БХ 2,71±0,3 2,10±0,7 3,5±0,1

IV БХ+БХГТСК 2,70±0,5 2,07±0,1 3,3±0,3

V Контроль (МПАГ) 2,73±0,9 2,03±0,5 3,3±0,7

ivlllrt. - JVIHW 114*11 lunnoiri tUUJÍ, U¿ X. ysjjL^^siA. - -- . *----- "I—> ------— ------1---

полиантиген, БХГГСК - бензохинонгуанилгидразонтиосемикарбазон, ПА -протективный антиген, РДП - реакция диффузионной преципитации, РБФ -реакция бентонитовой флокуляции.

Из данных таблицы видно, что все испытуемые препараты обладали серологической активностью, которая была обусловлена наличием протективного антигена (ПА), энтероотоксина (ЭНТ) и радиотоксина (РТ). Следовательно, изменение технологии получения радиозащитного препарата не оказывало влияния на его антигенный состав.

Изучение антигенной активности препаратов на морских свинках путем тестирования сывороток в РДП- и РБФ- тест системах показало, что все испытанные препараты вызывали синтез антител в организме иммунизированных животных. При этом установлено, что тары ашнадгезивных (АААТ), антитоксических (АНАТ) и антирадиотоксических (APTA) антител у вариантов МПАГ-М, полученных на основе Е. coli, выращенной на МПА и БХ со стимулятором роста (бензохинонгуанилгидразонтиосемикарбазон - БХГГСК) были выше по сравнению с препаратами, полученными на тех же средах без стимулятора, а также у стандартного препарата (МПАГ), полученного по

известной технологии.

Испытанные препараты, как при внутрикожном, так и накожном применении раздражающим и сенсибилизирующим действием не обладали.

Для определения токсичности радиозащитного препарата, полученного по новой технологии, в котором традиционный детоксикант - формалин был заменен гексаметилентетрамином, была проведена следующая серия опытов на растущих

мышах с использованием теста - изменения прироста массы (ИПМ). Препарат считали не токсичным, если через 24 ч общая масса животных была не менее их массы перед инъекцией и если к концу 7-го дня прибавка в массе на 1 мышь была не менее Зг и если все мыши оставались живыми.

Установлено, что препараты, приготовленные как на основе МПА + БХГГСК+ГМТМ, так и БХ+БХГГСК+ГМТМ, в малых дозах (2,5-106,2,5-107 м.к. / животное) отрицательного влияния на рост, развитие и выживаемость животных не оказывали, а с повышением дозы до 2-Ю8 м.кУживотное (1,75-Ю10м.к./кг) наблюдалось незначительное торможение (на 25%) прироста живой массы, а при дозе 2,5-109м.к/животное (1,25-10пм.кУкг) проявлялся слаботоксический эффект - торможение прироста живой массы на 29,5%, однако гибель животных при этом не наблюдалась.

Результаты изучения безвредности препаратов путем внутрибрюшинного введения белым мышам и морским свинкам в дозах по 0,5 см3 и 1,0 см3 соответственно показали, что смертность после инъекции препаратов не наблюдалась, общее состояние животных оставалось удовлетворительным. Результаты гематологических исследований, проведенных на морских свинках показали, что количество лейкоцитов, эритроцитов и лейкоформула не имели достоверных отличий от таковых у контрольных животных. Следовательно, испытуемые потенциальные радиозащитные препараты не оказывали отрицательного влияния на организм, что дает основание считать их безвредными.

Таким образом, полученные в процессе экспериментов модифицированные варианты потенциальных радиозащитных препаратов обладали серологической активностью, слабой токсичностью для животных, сенсибилизирующим и раздражающим действием не обладали, при введении в организм животных индуцировали синтез антиадгезивных, антитоксических и антирадиотоксических антител, при одновременном подкожном введении животным отрицательного влияния на клинико - гематологические показатели организма не оказывали. Полученные на первом этапе данные послужили основанием для проведения дальнейших исследований по изучению радиозащитных свойств изготовленных по модифицированной технологии препаратов на основе Е. coli штамм «ПЛ-6».

3.3.1.1 Оценка противолучевой активности радиозащитных препаратов в in vitro тест - системе - на облученных лимфоцитах периферической крови

Учитывая, что лимфоциты периферической крови, ввиду высокой радиопоражаемости, являются весьма удобной моделью для экстренной оценки радиозащитной активности испытуемых препаратов и с целью экономии поголовья ценных лабораторных животных, предварительные опыты проводили в условиях in-vitro тест-системы - на культуре клеток. При этом мы исходили из того, что исследование лимфоцитов в культуре клеток позволяет оценить их радиопоражаемость, дает информацию о динамике радиационного поражения на клеточном уровне и о возможности защиты их с помощью испытуемых потенциальных радиопротекторов (Иванов И.С., 2003).

Критерием оценки радиозащитной активности испытуемых препаратов служила выживаемость облученных клеток на фоне применения испытуемых препаратов, которую определяли по количеству окрашенных 0,01-0,02% эритрозином (погибших) и неокрашенных (живых) клеток периферической крови.

Результаты микроцитометрии мазков показали, что число окрашенных (погибших) лимфоцитов после облучения и инкубирования в присутствии испытуемых средств представляет флуктуирующую величину, зависящую как от состава испытуемого препарата, так и от времени внесения (прединкубирования, постинкубирования) их в инкубационную среду.

Установлено, что предварительная инкубация лимфоцитов в присутствии испытуемых средств, внесенных в среду инкубирования, оказывала на облученные в летальных дозах лимфоциты радиозащитный эффект, увеличивая выживаемость клеток до 69,3% (МПАГ-М иа основе БХ+БХГТСК+ГМТМ) и 68,7% (МПАГ-М на основе МПА+БХГТСК+ГМТМ).

Таким образом, результаты изучения радиозащитной активности препаратов, изготовленных по новой технологии на основе Е. coli, выращенной на твердой (МПА) и жидкой (бульон Хотгингера - БХ) питательных средах, показали, что они обладали примерно одинаковой активностью в in vitro тест-системе, обеспечивая выживаемость 68,7-69,3 % летально облученных клеток.

3.3.1.2 Изучение радиозащигной активности полученных по усовершенствованной технологии препаратов на белых мышах

Полученные в модельных опытах положительные результаты по оценке радиозащитной активности экспериментальных образцов потенциальных биорадиопротекторов на основе Е. coli послужили основанием для проведения опытов в условиях in vivo - на облученных гамма - лучами лабораторных животных.

Опыты проводили на 48 белых мышах, разделенных на 4 группы по 12 животных в каждой. Животным 1-5 групп однократно подкожно вводили препарат МПАГ-М, полученный путем выращивания Е coli на МПА с добавлением стимулятора роста - БХГТСК и использования детоксицирующего агента - гексаметилентетрамина (ГМТМ) вместо формалина, животным 2-й группы в аналогичных условиях вводили препарат МПАГ-М, полученный на среде Хотгингера с добавлением указанного стимулятора роста и детоксиканта; животным 3-й группы - регламентированный радиозащитный полиантиген (МПАГ) (контроль препарата). Животным 4-й группы препараты не вводили и они служили биологическим контролем. Препараты вводили в дозе по 0,1 см (2,5-109 м.кУкг) соответственно. Через 24 ч после иммунизации животных 1-й, 2-й и 3-й групп облучали на гамма-установке «Пума» в дозе 7,7 Гр. За животными вели наблюдение в течение 30 дней после облучения, регистрируя количество павших и выживших. Критерием радиозащитной активности препаратов служила 30-суточная выживаемость летально облученных животных.

Результаты исследований показали, что однократное подкожное введение испьпуемых препаратов за 24 ч до облучения обеспечивало 66,6%-ную выживаемость легально облученных животных. Параллельное использование

известного радиозащитного полиантигена (МПАГ) при этом оказалось малоэффективным - выживаемость составляла 16,7%, что уступает вновь полученным препаратам в 3,91 раза (Р<0,001).

Полученные в 1-й серии опытов на белых мышах положительные результаты послужили основанием для продолжения опытов по оценке радиозащитной активности препаратов в зависимости от интервала между иммунизацией и облучением. Для решения этой задачи опыты проводили в 14 вариантах (7 сроков иммунизации животных испытуемым - МПАГ-М и контрольным - МПАГ) на 102 белых мышах, которым за 3,5,7,10,14,28 и 60 сут до облучения в дозе 7,7 Гр однократно подкожно вводили препараты в дозе по 0,1 см3 (2,5-109 м.к7кг) соответственно.

Результаты опытов показали, что иммунизация мышей МПАГ-М за 5 сут до облучения предохраняла от радиационной гибели 83,3 % животных, в то время как в группе мышей, иммунизированных известным препаратом (МПАГ), процент защиты не превышал 33,3 %, СПЖ у привитых МПАГ-М животных на этот срок составлял - 9,6 против 5,1 в контроле (МПАГ) и 3,9 контроль облучения.

В отличие от предлагаемого, максимальная радиорезистентность при применении известного препарата (МПАГ), наступала у иммунизированных только за 14 дней до облучения. Максимальная радиорезистентность к летальному облучению животные обеих групп (1-я и 2-я) приобрели при иммунизации за 5-20 (1-я группа - МПАГ-М) и за 14-20 сут (2-я группа - МПАГ) до облучения.

Таким образом, в результате проведенных исследований по изучению радиозащитной активности препарата МПАГ-М, полученного по усовершенствованной технологии на белых мышах в 2-х повторностях установлено, что иммунизация животных с интервалом между инъекцией препарата и облучением в 1, 3, 5, 7, 10, 14, 28 и 60 дней у привитых животных формируется радиорезистентность к летальному облучению в дозах, вызывающих тяжелую и крайне тяжелую степень ОЛБ, обеспечивая выживаемость 66,6-83,3 % животных с одновременным увеличением показателя СПЖ в 3 и более раза (Р<0,01).

3.3.1.3 Изучение радиозащитной активности препарата МПАГ-М на белых крысах

Учитывая неодинаковую степень радиочувствительности и зависимость радиозащитного эффекта радиопротекторов от использованного вида животных, в следующей серии опытов изучали эффективность полученного по новой технологии препарата МПАГ-М на летально облученных белых крысах.

В первой серии опытов на белых крысах использовали 18 белых крыс с живой массой 150-180 г, которые были разделены на 3 группы по 6 животных в каждой. Животных 1-й группы за 24 ч до облучения подкожно однократно иммунизировали испытуемым препаратом МПАГ-М в дозе 0,5 мл (2,5'109 м.к./кг),

2-й группы - известным препаратом - МПАГ в аналогичных условиях. Животных

3-й группы не иммунизировали и она служила контролем облучения. Через 24 ч после иммунизации животных всех групп облучали на гамма-установке «Пума» в

дозе 9,0 Гр. Наблюдение за животными вели в течение 30 дней, регистрируя павших и выживших, устанавливали сроки продолжительности жизни, а также проводили патологоанатомическое вскрытие павших животных.

Результаты изучения радиозащитной активности препарата МПАГ-М на белых крысах показали, что предварительная иммунизация животных за 24 ч до облучения в летальной дозе обеспечивала защиту 66,6 % белых крыс от радиационной гибели при одновременном увеличении СПЖ в 1,81 раза (Р<0,05).

Предварительная иммунизация животных регламентированным радиозащигным препаратом (МПАГ), изготовленным по известный технологии, оказывала слабо выраженный радиозащитный эффект, защищая от радиационной гибели только 16,6 % животных при незначительном увеличении показателя СПЖ (на 0,8 дней) по сравнению с контролем облучения (6,1 день против 5,3 в контроле Р < 0,05).

Продолжая изучение радиозащитной активности препарата МПАГ-М на белых крысах, во 2-й серии опытов устанавливали оптимальный интервал времени иммунизации перед облучением и продолжительность резистентности у привитых животных после применения препарата.

Для решения поставленной задачи опыты проводили на 78 белых крысах. В 13 вариантах опытов (6 сроков иммунизации, два испытуемых препарата: МПАГ-М, МПАГ и контроль облучения), животным за 3, 5, 10, 20, 30 и 40 дней до облучения однократно подкожно вводили испытуемый и известный препараты в дозе по 0,5 см3 (2,3-109 м.кУкг). Через вышеуказанные сроки после иммунизации животных всех групп подвергали гамма-облучению на установке «Пума» в дозе 9,0 Гр (ЛДюо). Методика исследований и оценка эффективности препаратов были аналогичны таковым, что и в предыдущей серии опытов.

Результаты проведенных опытов показали, что препарат МПАГ-М является более активным, поскольку максимальная радиорезистентность (83%-ная выживаемость) у привитых им животных наступала при 5-ти дневном интервале времени между иммунизацией и облучением и этот уровень устойчивости сохранялся в течение - 5,10,15 и 20 дней до летального облучения.

Выживаемость привитых за 1, 3 и 5 сут до облучения известным (МПАГ) препаратом крыс при этом составляла 16,6 и 33,3% соответственно, что уступает усовершенствованному варианту радиопротектора в 5,01 и 2,50 раза (Р < 0,001).

При этом следует отметить, что оптимальный срок иммунизации животных известным препаратом приходится на 14-20 сут, а у усовершенствованного варианта - на 5-20 сут. При отсроченном применении обоих препаратов последовало незначительное (на 16,7 %) снижение протективных свойств: животные, иммунизированные за 30 и 40 дней до облучения, при последующем летальном облучении (9,0 Гр) оказались радиорезистентными - выживаемость их для обоих препаратов оказалась достаточно высокой, составляя 66,6 % соответственно.

Таким образом, при изучении радиозащитной активности полученного по усовершенствованной технологии препарата (МПАГ-М) на другом виде лабораторных животных получены данные, совпадающие с таковыми,

полученными на иммунизированных изучаемым препаратом белых мышах, т.е. выживаемость привитых испьпуемым препаратом за 1-40 дней до облучения составляла в пределах от 66,6 до 83,3 % с одновременным увеличением одного из основных показателей радиозащитного действия радиопротекторов - увеличения срока продолжительности жизни в 2-2,75 раза (Р < 0,01).

3.3.1.4 Изучение радиозащитной активности препарата МПАГ-М на кроликах

В связи с тем, что на двух видах лабораторных животных были получены достаточно убедительные данные по эффективности экстренной (за 1-30 суток до облучения) иммунизации белых мышей и белых крыс перед облучением, необходимо было изучить эффективность профилактического применения препарата за значительные сроки иммунизации (за 30,45 и 60 сут) до облучения.

С учетом сказанного, третью серию опытов проводили на 35 кроликах породы «Шиншилла» с живой массой 2,0-2,5 кг. Кроликов 1-й, 2-й, 3-й групп иммунизировали испытуемым препаратом (МПАГ-М) однократно подкожно в дозе 1,0 см3 (2,5 • 109 м.к./кг) за 30, 45 и 60 сут до облучения соответственно; кроликов 4-й, 5-й и 6-й групп в аналогичных условиях иммунизировали регламентированным радиозащитным препаратом (МПАГ) за 30, 45. и 60 сут до облучения соответственно; животных 7-й группы не иммунизировали и она служила контролем облучения. Через вышеуказанные сроки после иммунизации кроликов всех групп подвергали облучению на гамма -установке «Пума» в дозе 11,0 Гр (ЛДюо/зо)- Условия проведения опытов и учет результатов были аналогичны вышеописанным.

Результаты опытов показали, что иммунизация кроликов за 30-60 дней до облучения испьпуемым (МПАГ-М) и регламентированным (МПАГ) препаратами оказывала модифицирующее действие на течение ОЛБ у облученных в летальных дозах у-лучей кроликов, способствуя сохранению жизнеспособности 60 % животных. При этом оба использованных препарата обеспечивали одинаковую степень защиты, однако другой важный показатель противолучевой защиты - срок продолжительности жизни (СПЖ) павших животных в опытных (иммунизированных) и контрольной (облученные, неиммунизированные) группах имел значительные отличия в зависимости от использованного препарата.

3.4 Изучение механизма формирования радиорезистентности у животных на фоне применения препарата МПАГ-М

Полученные в модельных опытах in vitro - на культуре клеток (лимфоцитах) периферической крови и на 3 видах лабораторных животных положительные результаты по изучению радиозащитной активности усовершенствованного варианта препарата (МПАГ-М) послужили основанием для продолжения следующей серии опытов, целью которых являлось изучение механизма формирования радиорезистентности у радиопрофилакгированных указанным препаратом животных.

При проведении настоящих исследований мы учитывали, что в основе механизма радиозащитного действия веществ микробного происхождения лежит гемопротекторное и миелопротекторное действие, опосредованное через систему

регуляторов иммуногемопоэза - цитокинов. С учетом сказанного, в первой серии данного этапа исследований изучали реакцию системы крови и состояние кроветворения у облученных и радиопрофилактированных животных.

Для оценки гемопротекторного действия препарата МПАГ-М, опыты проводили на 27 белых мышах, разделенных на 3 группы по 9 животных в каждой. Животных 1-й группы за 10 сут до облучения в дозе 7,7 Гр однократно подкожно иммунизировали препаратом МПАГ-М в дозе 0,1 см (2,5-10 м.к./кг), животных 2-й и 3-й групп не иммунизировали - они служили контролем облучения (2-я группа) и биологическим контролем (3-я группа).

Изучение реакции системы крови, включающее морфологические изменения клеток периферической крови и клеточности костного мозга, селезенки и тимуса, проводили через 7, 14, 21 сут после облучения (в периоды разгара ОЛБ с развитием костномозгового синдрома и формирования радиорезистентности у облученных и радиопрофилактированных животных).

Результаты гематологических исследований показали, что иммунизация животных до облучения предупреждала пострадиационное опустошение органов гемопоэза (костного мозга, селезенки и тимуса) и ускоряла процессы восстановления костномозгового кроветворения, оказывая тем самым, гемо- и миелопротекторный эффект.

Повторение этих опытов на других видах лабораторных животных (белых крысах и кроликах) показало аналогичные результаты. При этом результаты биохимических исследований сывороток крови белых крыс с использованием ТБК- и РБФ- тест-систем показали, что протекторный эффект коррелировал с антирадиотоксическим действием препарата.

Установлено, что предварительная иммунизация животных МПАГ-М приводило к существенному торможению синтеза одного из ключевых токсических радикалов - липидных радиотоксинов, мишенью атаки которых являются клетки периферической крови (лимфоциты) и клетки иммуногемопоэза - гемопоэтические стволовые клетки костного мозга.

Ингибирование синтеза продуктов оксидативной модификации макромолекул (радиотоксинов) в иммунизированном МПАГ-М организме до облучения было обусловлено предотвращением снижения уровня антиоксидантных ферментов: каталазы (КАТ) и супероксвддисмутазы (СОД).

Согласно литературным данным, механизм гемо- и миелопротекторного, а также иммунокоррегирующего дейстаия препаратов на основе веществ микробного происхождения заключается в регуляции субпопуляционного состава Т-лимфоцитов, участвующих в кооперации с макрофагами в синтезе геморегуляторных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-6, колониестимулирующего фактора - КСФ, а также интерферонов) (Мальцев В.Н. и др., 1994).

С учетом изложенного нами были проведены исследования по изучению субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови облученных на фоне профилактического применения препарата МПАГ-М на кроликах.

Установлено, что летальное (11,0 Гр) облучение кроликов приводило к существенному изменению количественного соотношения как Т- и В- клеток, так

и субпопуляций Т-клеток. Так, уже начиная с 3 сут после облучения кроликов, последовало достоверное снижение Т-хелперов при одновременном увеличении Т-супрессоров.

Указанная разнонаправленность изменения субпопуляционного состава Т-клеток при воздействии на организм стресс-факторов (патогенные, токсические, физические агенты) является важнейшим показателем функционирования клеточного звена иммунитета и характеризуется как хелперно-супрессорное соотношение (Th/Ts) или как иммунорегуляторный индекс (ИИ).

Проанализированные в динамике данные этого соотношения показали, что, по мере развития ОЛБ последовало резкое уменьшение (в 2 и более раза, Р < 0,01) соотношения Th/Ts, которое не восстанавливалось вплоть до гибели животных

Резкое уменьшение хелперно-супрессорного соотношения Т- лимфоцитов в 3-й стадии ОЛБ связано с развитием в облученном организме эндогенной инфекции, поскольку уменьшение этого показателя свидетельствует об ослаблении факторов естественной резистентности животных к инфекциям (Клемпарская H.H., 1978).

Применение радиозащитного препарата МПАГ-М до облучения оказывало на организм иммунокоррегирующий эффект, предотвращая развитие иммуносупрессии.

Продолжая исследования по изучению влияния вновь полученного радиозащитного препарата на систему иммунитета облученных кроликов, параллельно в сыворотке крови определяли содержание иммуноглобулинов, лизоцимной, бактерицидной активности сыворотки (БАСК), а также изучали функциональную активность лимфоцитов (РБТЛ) и фагоцитов (фагоцитарный индекс).

Результаты исследований показали, что иммунизация кроликов до летального облучения предотвращала угнетение факторов неспецифической резистентности организма, сохраняя исходный уровень активности изучаемых показателей. Сохранение бластгрансформирующей активности лимфоцитов под воздействием препарата нашло отражение на их основной функции - синтезе иммуноглобулинов, содержание которых у иммунопрофилактированных и облученных животных к 20-м сут опыта незначительно отличалось от контрольного уровня.

Иммунотропное действие микробного радиопротектора - МПАГ-М нашло подтверждение при изучении состояния антиинфекционной резистентности организма, которое адекватно отражает уровень аутофлоры кишечника, фекалий, кожных покровов. При этом мы учитывали, что стрессовое воздействие одного из мощных экологических факторов - ионизирующей радиации на организм, сопровождается существенным изменением иммунобиологической реактивности, одним из главных (индикаторных) показателен которой является развитие эндогенной инфекции при лучевой болезни (Клемпарская H.H., 1966).

С учетом изложенного, в опытах на кроликах антиинфекционную резистентность изучали по количественному составу аутомикрофлоры кишечника путем отбора проб фекалий. При бактериологических исследованиях фекалий

определяли общее количество аэробной и анаэробной микрофлоры, их соотношения, удельный вес гемолитических вариантов кишечной палочки, количество бифидобактерий, лактобацилл, дрожжеподобных грибов рода Candida и стафилококков в 1г фекалий.

Результаты микробиологических исследований показали, что применение препарата МПАГ-М до летального облучения ингибировало размножение и экспаницию условно-патогенной микрофлоры кишечника, стимулируя антиинфекционную защиту пораженного ионизирующей радиацией организма. При этом достоверного снижения количества КОЕ анаэробов, в частности, бифидобактерий и лактобакггерий, не происходило, что нашло отражение на выживаемости летально облученных животных. Полученные данные согласуются с результатами предыдущих исследований по изучению факторов неспецифической резистентности организма, стимулированных применением испытуемого радиозащитного препарата.

Учитывая литературные сведения о том, что вещества микробного происхождения являются индукторами медиаторов иммуногемопоэза - цитокллов и интерферонов (Рождественский JI.M., 1997), вырабатываемых стимулированными лимфоцитами и макрофагами, и оказывающих радиозащитный эффект, в завершающей серии опытов проводили исследования по определению содержания важнейших медиаторов иммуногенеза -интерферона (ИФН) и интерлейкина - 1(ИЛ-1), результаты которых представлены в табл.2.

Таблица 2 - Уровень интерлейкина (ИЛ-1) и интерферона (ИФН) (нг/мл) в сыворотке крови иммунизированных МПАГ-М за 10 сут до облучения и облученных (11,0 Гр) кроликов_'

Показатель Группа Срок исследования, сут

ж-х исход 7 14 21

1 21,1±4,9 20,9±3,1 21,0±2,5 21,1±3,9

ИНФ-1 2 20,7±3,1 11,7±2,5* 9,3±0,9* 6,3±1,3**

3 20,9±4,1 17,1±5,6 16,9±7,1 17,1±5,3

1 53,5±2,9 54,1±3,5 53,9±3,3 54,1±2,8

ИЛ-1 2 54,0±3,7 28,7±2,9* * 22,9±3,7* * 11,5±2,1* *

3 53,8±4,5 43,1±5,5 42,9±4,7 43,1±4,3

* - Р <0,05; ** - Р < 0,001; 1-я группа - контрольная; 2-я группа -облученная; 3-я радиопрофилакгированная группа.

Из данных таблицы видно, что иммунизация кроликов препаратом МПАГ-М за 10 сут до облучения оказывала регулирующее влияние на цитокиновую систему макроорганизма, предупреждая радиоиндуцированное угнетение синтеза интерлейкина -1 и интерферона.

Таким образом, заблаговременная подкожная иммунизация животных радиозащитным препаратом МПАГ-М, полученным по усовершенствованной

технологии, оказывала радиопротекгорный эффект, обеспечивая 60-80 %-ную защиту животных от радиационной гибели. При этом установлено, что преимуществом нового радиозащитного средства перед известным (МПАГ) является возможность индукции экстренной резистентности животных перед облучением (за 24 ч до облучения), что исключалось при использовании известного радиопротектора, полученного на основе Е. coli.

На основании проведенных исследований можно заключить, что в опытах на трех видах лабораторных животных (белые мыши, белые крысы, кролики) установлено, что облучение их в летальных дозах (7,7 Гр, 9,0Гр и 11,0 Гр соответственно) вызывает возникновение острой лучевой болезни (ОЛБ) с развитием костномозгового синдрома, сопровождающегося гемо-, миело- и иммунотоксическим эффектом. Заблаговременное (за 1-60 сут) применение испытуемого средства предотвращало развитие в облученном организме одного из грозных симптомов костномозговой формы ОЛБ- панцитопении и миелосупрессии, а в дальнейшем - генерализации кишечной аутоинфекции и сепсиса, что нашло отражение на интегральном показателе исхода ОЛБ -выживаемости летально облученных животных в 60-80% случаев.

Результаты проведенных исследований и межлабораторных комиссионных испытаний легли в основу разработанных «Технических условий» и «Инструкции по изготовлению и контролю радиозащитного препарата», утвержденных в установленном порядке. Способ изготовления радиозащитного препарата защищен патентом РФ 2338546 от 20.11.2008 г.

4 ВЫВОДЫ

1. Путем исключения отдельных этапов (изолирование, очистка, конъюгирование радиотоксина с белковым носителем) и объединения стадий получения протективного антигена и анатоксина Е. coli в непрерывный процесс, осуществлена унификация изготовления известного радиозащитного препарата -микробного полиантигена.

2. Препарат МПАГ-М, полученный согласно усовершенствованной технологии путем выращивания штамма-продуцента на мясо-пептонном агаре со стимулятором роста - бензохинонгуанилгидразонтиосемикарбазоном из расчета 0,0008 мас.%, в модельной in vitro тест-системе оказывал радиозащитный эффект, обеспечивая 68,7%-ную выживаемость летально (5 Гр) облученных лимфоцитов.

3. Использование гексаметилентетрамина в качестве детоксиканта из расчета 0,4-0,5 мас.% вместо токсического соединения - 40%-ного формалина в известном препарате, приводило к снижению его токсичности.

4. Внутрибрюшинное введение препарата МПАГ-М белым мышам в дозах 0,5 см3 и морским свинкам подкожно по 1,0 см3 (10-кратное превышение иммунизирующей дозы 0,02 мл/кг), не оказывало отрицательного (токсического) влияния на животных - общее состояние, количество форменных элементов периферической крови не имели достоверных отличий от таковых контрольных животных.

5. Однократное подкожное введение препарата МПАГ-М белым мышам, белым крысам и кроликам в экспериментально установленной иммунизирующей

дозе - 0,02 мл/кг за 1-60 сут до летального облучения создавало радиорезистентность, обеспечивая 60-80%-ную выживаемость животных.

6. Динамика формирования радиорезистентности на фоне применения препарата МПАГ-М носила трехфазный характер: повышение этого показателя до 3 сут (60%-ная защита), достижение максимума (80%-ная защита в периоде с 5-20 сут), снижение этого показателя до исходного уровня (60%) через 30 сут, которое удерживалось на этом уровне до 60 сут (срок наблюдения).

7. Механизм формирования радиорезистентности у привитых препаратом МПАГ-М животных реализовался путем усиления геморегуляторных цитокинов (ИЛ-1, ИНФ), коррекции дисбаланса иммунорегуляторного индекса (Th/Ts = 2,59 против 1,13 в контроле облучения), сохранения лизоцимной (0,38 ед. против 0,15 у облученных), бактерицидной (0,98 против 0,30 у облученных) и фагоцитарной активности (33,9 против 1,5% в контроле облучения), снижения количества условно-патогенных энтеробактерий (2,1 1о& против 4,3 1о& у облученных) в кишечнике, предупреждения генерализации кишечной аутоинфекции и сепсиса, ведущих к повышению выживаемости летально облученных животных.

8. Экстренное формирование радиорезистентности на фоне применения препарата МПАГ-М обеспечивается за счет ускоренного синтеза перехватчиков токсических радикалов - цитокинов, индуцированных радиоинактивированнымн микробными клетками Е. coli.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для создания экстренной и пролонгированной радиорезистентности организма, в ветеринарную практику предложен препарат МПАГ-М, который применяют однократно подкожно в дозе 5-6 мл мелким и 7-10 мл крупным животным за 1 -60 сут до радиационного воздействия.

Изготовление и применение препарата регламентируется разработанной нами нормативно-методической документацией (Технические условия на радиозащитный препарат, утвервденный Нач. ГУВ КМ РТ и Инструкция по изготовлению радиозащитного препарата, утв. ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 2009г с оотв етств снн о)

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Нефедова, Р.В. Разработка тест-системы для радиационного иммуномониторинга / Р.В. Нефедова, Р.Н. Низамов, Д.Т. Шарифуллина, A.C. Титов, Г.И. Рахматуллина, К.Н. Вагин // Матер, межд. научно-практ. конф. «Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность». - Казань, 2010. - С. 232.

2. Титов, A.C. Использование веществ микробного происхождения для повышения иммунной реактивности животных /A.C. Титов, Р.Н. Низамов, Д.Т. Шарифуллина, Р.В. Нефедова, К.Н. Вагин, Г.И. Рахматуллина // Матер, межд. научно-практ. конф. «Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность». - Казань, 2010. - С. 339.

3. Низамов, Р.Н. Изучение антиаллергенной активности продуктов метаболизма бифидобактерий /Р.Н. Низамов, Г.В. Конюхов, Д.Т. Шарифуллина,

Р.В. Нефедова, Г.И. Рахматуллина, К.Н. Вагин // Ветеринарна медицина: МЬквщомчий тематический науковий зб1рник. - Хармв, 2010. - С. 127-128.

4. Низамов, Р.Н. Использование веществ микробного прооисхождения для повышения радиорезистентности животных /Р.Н. Низамов, Г.В. Конюхов, Д.Т. Шарифуллина, Р.В. Нефедова, К.Н. Вагин, Г.И. Рахматуллина // Ветеринарна медицина: М1жвщомчий тематический науковий зб1рник. - Харив, 2010. - С. 314315.

5. Низамов, Р.Н. Иммуноферментная тест-система на основе микробного антигена - радиотоксина для серодиагностики ОЛБ / Р-Н. Низамов, Р.В. Нефедова, Д.Т. Шарифуллина, Г.И. Рахматуллина, К.Н. Вагин // Ветеринарна медицина: М1жвщомчий тематический науковий збфник. - Харыв, 2010. - С. 340341.

6. Патент РФ № 2338546 «Способ получения препарата для профилактики и лечения радиационных поражений организма» / А.В. Иванов, Р.Н. Низамов, Г.В. Конюхов, Н.Б. Тарасова, И.Р. Юнусов, Г.И. Рахматуллина. - Бюлл. №32 от 20.11.2008.

7. Вагин, К.Н. Продукты метаболизма микробов для лечения и профилактики острой лучевой болезни / К.Н. Вагин, Р.Н. Низамов, Г.В. Конюхов, Г.И. Рахматуллина // Ученые записки: Казанской Государственной Академии Ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2011. - С. 27-32.

Рахматуллина Гульназ Ильгизаровна

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ РАДИЗАЩИТНОГО ПОЛИАНТИГЕНА

03.01.01 -радиобиология 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2012

Подписано в печать 13.03.2012 Заказ 1303/2 Формат 60x84/16. Гарнитура Times New Roman Усл. печ. л. 1,5. Бумага офсетная. Тираж 80 экз. Отпечатано с оригинал-макета в типографии ФГБУ «ФЦГРБ-ВНИВИ» 420075, г.Казань-75, Научный городок-2

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рахматуллина, Гульназ Ильгизаровна, Казань

61 12-3/1200

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФГБУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ»

(ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)

На правах рукописи

РАХМАТУЛЛИНА ГУЛЬНАЗ ИЛЬГИЗАРОВНА

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ РАДИОЗАЩИТНОГО ПОЛИАНТИГЕНА

03.01.01 - радиобиология 06.02.02. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РТ д. в. н., профессор Низамов Р. Н. Заслуженный деятель науки РТ д. б. н. профессор Конюхов Г.В.

Казань-2012

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

СОДЕРЖАНИЕ........................................................ 2

___U

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ......................................... 4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ......................... 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................. 9

1.1. Влияние ионизирующих излучений на иммунобиологическую реактивность организма................................9

1.2. Использование веществ микробного происхождения в качестве радиозащитных средств......................................................................28

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................................39

2.1. Материалы и методы исследований..............................................................39

2.1.1. Материалы............................................................... 39

2.1.2. Методы исследований................................................. 40

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 43

3.1. Теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение возможности усовершенствования технологии изготовления радиозащитного микробного полиантигена........................................................... 43

3.2. Получение радиозащитных препаратов на основе Е. coli «ПЛ-6» по известной и модифицированной технологии...... 47

3.3. Изучение серологической активности, стерильности и безвредности полученных модифицированных вариантов радиозащитных средств............................................. 50

3.3.1 Изучение радиозащитных свойств разработанных по усовершенствованной технологии препаратов на основе E.coli на лабораторных животных.................................. 61

3.3.1.1. Оценка противолучевой активности радиозащитных препаратов в in vitro тест-системе - на облученных

лимфоцитах периферической крови................................ 62

3.3.1.2. Изучение радиозащитной активности полученных по усовершенствованной технологии препаратов на белых мышах.................................................................... 66

3.3.1.3. Изучение радиозащитной активности МПАГ-М на белых крысах..................................................................... 71

3.3.1.4. Изучение радиозащитной активности МПАГ-М на кроликах.................................................................. 77

3.4. Изучение механизма формирования радиорезистентности у животных на фоне применения биорадиопротектора МПАГ-М................................................................ 81

3.4.1. Изучение механизма гемо- и миелопротекторного действия препарата на белых мышах и белых крысах................................................................... 81

3.4.2. Антирадиотоксическое действие препарата МПАГ-

М.......................................................................... 87

3.4.3. Изучение механизма формирования радиорезистентности у иммунизированных МПАГ-М кроликов......................... 91

3.4.3.1. Состояние крови у иммунизированных МПАГ-М кроликов 91

3.4.3.2. Изучение влияния препарата МПАГ-М на факторы неспецифической резистентности организма................... 96

3.4.3.3. Изучение влияния препарата МПАГ-М на

иммунобиологическую реактивность организма................ 99

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ........... 105

ВЫВОДЫ................................................................ 120

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.............................. 122

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............... 123

ПРИЛОЖЕНИЕ........................................................ 149

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген

АИФ - аутомикрофлора

АМФК - аутомикрофлора кишечника, кожи

АМФОО - аутомикрофлора облученного организма

АНТ - анатоксины

АТБД - антительный бентонитовый диагностикум

БХГГСК - бензохинон гуанилгидразонтиосемикарбазон

ВМП - вещества микробного происхождения

ВСАФО - видовой состав аутофлоры организма

гмтм - гексаметилентетрамин

Гр - грей

18 О - иммуноглобулин класса в

ИИРО - индикатор изменения реактивности организма

ил - интерлейкин

ИРО - иммунологическая реактивность организма

ИРП - индикатор радиационного поражения

ИСОРО - индикатор состояния общей резистентности организма

ИФА - иммуноферментный анализ

КАТ - каталаза

КАФ - кишечная аутомикрофлора

НСАФОО -нормализация состояния аутофлоры облученного

организма

ОЛБ - острая лучевая болезнь

ОММ - оксидативная модификация макромолекул

ПА - протективный антиген

ПАГМ - полиантиген микробный

ПАФО - показатель аутофлоры организма

ПОАС - прооксидантно-антиоксидантная система

ПСАИИ - показатель состояния антиинфекционного иммунитета

ПЭИ - причины экзогенной инфекции

РИАФ - радиоиндуцированные изменения аутомикрофлоры

РИГА - реакция непрямой гемагглютинации

сод - супероксиддисмутаза

РТ - радиотоксины

спж - средняя продолжительность жизни

СРО - состояние реактивности организма

ТАМФК - тест аутомикрофлоры кожи, кишечника

ЭИ - эндогенная инфекция.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В результате многолетних

радиобиологических исследований установлено, что одним из главных врагов облученного организма является аутофлора, ведущая к обсеменению внутренних органов микробами, обуславливая пострадиационное развитие эндогенной инфекции вследствие резкого снижения иммунобиологической реактивности (Троицкий B.JL, Туманян М.А., 1955; Киселев П.Н., 1956; Петров Р.В., 1957; Warren S.L., 1946). Детальные микробиологические исследования, Петрова Р.В. (1952 - 1963), Киселева П.Н. и др. (1955 - 1963) показали, что учет количественного и качественного изменения аутомикрофлоры облученного организма является объективным тестом (индикатором) оценки нарушения иммунобиологической реактивности организма, что имеет существенное значение при разработке методов и средств диагностик, лечения и профилактики радиационных поражений (Иванов A.B. и др., 2008).

В результате детальных микробиологических исследований установлено, что пострадиационная дисфункция системы иммунобиологической реактивности сопровождается резким увеличением (до 25 раз) микробов аутофлоры в кишечнике, на коже, в полости рта и дыхательных путях, преобладающим видом среди которых является кишечная палочка (Клемпарская H.H. и др., 1964), а предварительное введение ее или компонентов (экзо-, эндотоксинов, полисахаридов) до облучения повышает радиорезистентность (выживаемость) организма (Мальцев В.Н., 1994; Бударков В.А., Сургучева J1.M., 2002). Это важнейшее положение, установленное отечественными радиационными иммунологами, послужило основанием для разработки сотрудниками ФГБУ «ФЦТРБ -ВНИВИ» радиозащитного полиантигена на основе Е. coli (МПАГ) и предложения его для специфической профилактикой радиационных поражений организма (Низамов Р.Н., Конюхов Г.В., 2004).

Однако, несмотря на высокую радиозащитную эффективность препарата, ему присущ ряд недостатков (сложность технологии изготовления, многокомпонентность, многостадийность, большая трудоемкость), что сдерживает серийный выпуск радиовакцины для широкого применения на практике, хотя необходимость указанного препарата в условиях чрезвычайных ситуаций (аварии на атомных реакторах, АЭС, подводных лодках и других атомных установках) очевидна.

Сказанное определяет актуальность проблемы и диктует необходимость усовершенствования и унификации технологии изготовления известного радиозащитного препарата.

Цели и задачи. Целью настоящих исследований является усовершенствование технологии изготовления радиозащитного препарата на основе E.coli.

Исходя из цели, на разрешение были поставлены следующие задачи:

1. Определить возможность унификации способа получения известного радиозащитного препарата - микробного полиантигена.

2. Конструирование радиозащитного препарата на основе E.coli.

3.Влияние разработанного препарата на организм интактных животных.

4. Испытание радиозащитных свойств препарата на облученных животных.

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом центра «Радиационная безопасность» (№ госрегистрации 01990005332).

Научная новизна. На основании детального анализа технологии изготовления специфического радиозащитного препарата на базе антигенов E.coli и хиноидного радиотоксина установлена возможность унификации способа получения целевого продукта. Сконструирован новый радиозащитный препарат на основе E.coli, обеспечивающий пролонгированную профилактику радиационных поражений организма

путем коррекции систем антиинфекционной и антиоксидантной защиты.

6

Научная новизна исследований подтверждена Патентом РФ № 2338546 от 20.11.2008г.

Теоретическая ценность работы. Полученные результаты расширяют сведения о ведущих механизмах противолучевого действия препаратов на основе микробных антигенов, обладающих способностью повышать резистентность организма к действию ионизирующей радиации путем коррекции иммунобиологической реактивности организма, нормализации состояния аутомикрофлоры, предотвращения пострадиационого дисбактериоза и развития эндогенной инфекции.

Практическая значимость определяется тем, что для специфической профилактики радиационных поражений организма предложен модифицированный вариант радиозащитного полиантигена МПАГ - М. Результаты исследований использованы при составлении нормативно-методических документов: «Инструкции по изготовлению и контролю радиозащитного препарата», «Технических условий на радиозащитный препарат» ТУ 009-004937.4.09, утвержденных директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и Начальником ГУВ КМ РТ в 2009 г.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных научных сессиях ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2005-2011гг., научно-практических конференциях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань, 2009-2010гг.), 2-м съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов (г. Казань, 2009), Международной научно-практической конференции по экспериментальной ветеринарной медицине (г. Харьков, 2010). Результаты основных этапов работы подтверждены внутрилабораторными комиссионными испытаниями с положительной оценкой.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 7 научных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Усовершенствование технологии изготовления микробного радиопротектора.

2. Радиозащитные свойства модифицированного варианта микробного полиантигена МПАГ -М.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 149 странице компьютерного текста и она состоит из введения, 2 глав

г* с о

обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и приложений. Список использованной литературы включает 251 источника, в том числе - 58 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 22 таблицами.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Влияние ионизирующих излучений на иммунобиологическую реактивность организма

Вскоре после открытия рентгеновских лучей многие исследователи направили свое внимание на вопрос о том, каким образом этот новый физический агент действует на защитные механизмы живых организмов (Киселев H.H. и др.; 1955, 1956, 1963; Клемпарская H.H. и др., 1952, 1958, 1961, 1962, 1963, 1964, 1969; Троицкий В.Л. и др., 1955, 1956, 1957, 1958; Петров Р.В. 1956, 1957, 1962, 1963). В результате этих исследований стало известно, что при этом происходит повышение чувствительности облученных животных к инфекциям, к которым они в нормальных условиях резистентны, вероятно, из-за врожденного иммунитета (Киселев П.Н. и др., 1969; Клемпарская H.H. 1966, 1968, 1973, 1978; Иванов A.A. и др., 1968, 1972, 1973, 1975, 1976; Петров Р.В., 1965, 1970; Сосова В.Ф. 1965; Троицкий В.Л. и др., 1965, 1967, 1974). Это, в частности, относится к инфекциям, вызванным нормальной кишечной флорой (Шальнова Г.А. и др., 1962, 1966, 1972, 1975, 1978; Warren S.L., Whipple G.H., 1923, 1946; Chrom S.A. 1935; Miller C.P., 1950; GonsheryL., 1953).

Началом изучения состояния аутофлоры облученного организма, безусловно, считаются работы по изучению эндогенной инфекции, неизбежно возникающей при этом заболевании (Warren S.L., Whipple G.H., 1923; Chrom S.A. 1935; Miller C.P., 1950).

Большое количество радиобиологических исследований показало, что ионизирующая радиация вызывает разрушение многих клеточных структур и изменяет деятельность почти всех физиологических систем организма (Гемпельман Л., 1954; Гашек М., Ленгерова А., 1962; Петров Р.В.. 1962; 1970; Коррекция..., 1980; Шубик В.М.. 1977; Горизонтов П.Д., Клемпарская H.H. 1971; Иммунотерапия..., 1981). В результате этого нарушаются взаимоотношения между организмом и населяющей его микрофлорой, что приводит к развитию инфекционных процессов, обусловленных внедрением

и размножением в тканях организма микробов аутофлоры, т.е. явлению эндогенной инфекции (Клемпарская H.H. и др., 1958; Варенко Ю.С. 1964; Адо А.Д.. 1963; Мальцев В.Н., Пинегин Б.В. и др.. 1984; Нормализующий ..., 1987; Гольцев И.А., 1981; Сосова В.Ф. 1956; Туманян М.А. 1956; Мейсель М.Н., 1955).

Развитие инфекционных процессов во время лучевых поражений не

может не отражаться на жизнедеятельности организма. Клинические

наблюдения над людьми, пострадавшими при взрывах атомных бомб в

Хиросиме и Нагасаки (Mikamo V., 1956; Козлова A.B. 1957; Зедгенидзе Г.А.

1960; Croukite Е.Р., 1955, 1956; Tsuge V., 1956; Ouchterson A.W., Warren S.,

1956; BrueerM., 1959; Warren S., Ouchterson A.W. 1956; Warren S., 1946; Bond

P.V. 1971), показали наличие у них воспалительных процессов в легких,

ангин и заболеваний желудочно - кишечного тракта аутоинфекционной

природы (Гемпельман JI. и др., 1954; Howland I.W., 1961; Osborne I.W. 1954;

Harris S., 1954; Silverman M.S. 1963).

Развивающийся при этом аутоинфекционный процесс оказывает

существенное влияние на летальность после облучения, значительно

сокращает сроки жизни животных, отягощает течение лучевой болезни

(Троицкий В Л., Туманян М.А., 1965; Клемпарская H.H., 1966; Иванов A.A.

1978, 1990; Мальцев В.Н. и др., 1971, 1972, 1976, 1978, 1983, 1994, 1997;

Петрова Р.В., 1989; Шальнова Г.А. и др., 1981, 1984, 1997; Шубик В.М., 1976,

1977, 1978, 1982, 1983, 1987, 1991; Уланова В.М. 1972, 1973, 1974; Каулен

Д.Р., 1965; Ausworth Е., 1962, 1988). При этом радиационная гибель

животных наступает на фоне бактериемии, вызванной микробами

нормальной микрофлоры кишечника (Киселев П.Н., 1955; Троицкий B.JL,

Туманян М.А., 1958; Сосова В.Ф., 1956; Петров Р.В., 1957; Bennet L.R., 1951;

Smith W.W., 1952; Hammound C.W., 1955; Bradner W.T., 1955; Wedgwood R.I.,

1959; Furth F, 1952; Vincetl.G. 1955; Dixon F.I, 1960).

Пострадиационная бактериемия развивается не тотчас после лучевого

воздействия, а лишь спустя 2-4 дня, наблюдается в течение длительного

10

времени, обусловлена проникновением в кровь и инвазией органов и тканей облученных животных в основном микроорганизмами нормальной кишечной микрофлоры (Троицкий B.JL, 1957; Gonshery L., 1953; Laurence J.H., 1957; Bennet L.R., 1951; Hamuroud C.W., 1955).

По мере развития лучевой болезни происходит изменение количественного и качественного состава аутомикрофлоры (Warren S., 1956), а в атональный период в крови и внутренних органах облученных животных обнаруживаются кишечная палочка, стафилококки, энтерококки, стрептококки и грамположительные спороносные микробы (бациллы) в значительных количествах, что свидетельствует о развитии бактериемии (Bennet L.R., 1951).

Полученные данные цитированных исследователей дали полное основание считать, что бактериемия является одним из наиболее ярких проявлений снижения естественного иммунитета облученного организма к инфекции. Считая лучевую бактериемию проявлением аутоинфекционного процесса, Miller С.Р. (1950), Gosheru L. (1953), Hammoud C.W., Bradner W.T. (1955) придавали большое значение роли инфекции в лучевом синдроме. Они подробно изучили влияние дозы облучения на время проявления бактериемии и ее продолжительности, виды микробов, высевающихся из крови облученных мышей, количественную зависимость между положительными бактериальными находками и гибелью животных.

Проводя исследования по изучению зависимости дозы облучения и наступления пострадиационной бактериемии, Gosheru L. (1953) установил, что между этими показателями существует обратная корреляция.

Согласно данным Miller С.Р. (1950), наибольшая частота

положительных высевов крови (50 %) при дозе 400 Р наблюдалась в течение

от 8-го до 15-го дня после облучения; при этом в посевах крови и селезенки

были выделены культуры паракишечной (42 %) и кишечной (22 %) палочки,

протей (13 %) синегнойной палочки (9 %), а - стрептококков (6 %),

грамотрицательной палочки (3 %), Bact. Alcaligenes (2 %) и анаэробов (0,3

11

%). Все эти микробы входили в состав нормальной микрофлоры кишечника необлученных мышей, однако из крови выделялся только один из перечисленных видов микроорганизмов (в 91 % случаев) и только в 9 % случаев - два вида микробов.

Анализируя полученные данные, вышецитированные авторы пытались ответить на вопрос: является ли инфекция только конечным результатом лучевого поражения у погибшего животного или она, однажды начавшись, неизбежно приводит к гибели? Проведенные исследования позволили прийти к выводу, что пострадиационная бактериемия - это септич�