Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка радиозащитного препарата на основе метаболитов E.coli

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка радиозащитного препарата на основе метаболитов E.coli"

Вагин Константин Николаевич

РАЗРАБОТКА РАДИОЗАЩИТНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ МЕТАБОЛИТОВ Е.СОЫ

03.01.01 - радиобиология 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 ЯНВ 2072

Казань-2011

005007561

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФТЦРБ-ВНИВИ») г.Казань

Научные руководители: - доктор ветеринарных наук, профессор

Низамов Рамзи Низамович

- доктор биологических наук Тарасова Наталья Борисовна

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук, профессор

Хисматуллина Наиля Анваровна

- доктор биологических наук Юсупова Галия Расыховна

Ведущее учреждение: ФГОБ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия».

Защита диссертации состоится «17» января 2012 г. в 10 ч на заседании диссертационного совета ДС-220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г.Казань-75, Научный городок-2, ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г.Казань).

Автореферат разослан « /7 » 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Использование средств микробного происхождения в целях повышения радиорезистентности организма и эффективности лечения лучевой болезни актуально в связи с проблемами радиационного загрязнения и опасности техногенных катастроф. Особенностью этих средств является широкий спектр действия в сочетании с отсутствием выраженной токсичности.

Отечественными и зарубежными исследователями при изучении различных аспектов механизма противолучевого действия накоплен экспериментальный материал, свидетельствующий о способности веществ микробного происхождения (ВМП) повышать радиорезистентность организма млекопитающих к облучению (Мальцев В.Н. и др., 1978; Иванов A.A. и др., 1991; Андрущенко В.Н. и др., 1996). Различные микробные антигены обладают способностью снижать смертность облученных животных и выраженность проявлений экспериментальной острой лучевой болезни за счет активизации фагоцитарной функции клеток системы мононуклеаров в крови и тканях, повышения устойчивости к экзогенным инфекциям, способности к образованию антител за счет увеличения числа антителопродуцирующих клеток. В связи с этим поиск веществ микробного происхождения для повышения радиорезистентности является одним из важнейших направлений решения проблемы профилактики и терапии острой лучевой болезни.

В «ФЦТРБ-ВНИВИ» проведены многочисленные исследования по изучению радиозащитной эффективности ВМП (Иванов A.B., Низамов Р.Н., Конюхов Г.В., 2009). Разработана технология изготовления композиций на основе E.coli, обеспечивающая 70 %-ную защиту организма при ее профилактическом применении (Киршин В.А. и др., 2001). Однако применение композиции с лечебной целью усугубляло течение острой лучевой болезни (ОЛБ), что связано с наличием в ее составе живых микробных клеток. Технология изготовления микробного полиантигена предполагала выращивание микроба-продуцента на твердой питательной среде, которая после смыва биомассы не использовалась, что значительно удорожало себестоимость конечного продукта.

Вместе с тем, из данных литературы известно, что микроорганизмы в процессе роста на жидких питательных средах экспрессируют уникальный набор биологически активных веществ (Ткаченко Е.И. и др., 2005). Так, E.coli в процессе жизнедеятельности продуцирует антибактериальные вещества, ферменты, антигены, энтеро- и экзотоксины (Зароза В.Г., 1991), цитокины (Пепоян А.З. и др., 2001), которые в отдельности и в сочетании друг с другом обладают радиозащитными свойствами (Диковенко Е.А. и др., 1971; Дуда В.И. и др., 1980; Мальцев В.Н. и др., 1994). В доступной литературе нет данных по использованию продуктов метаболизма в качестве радиозащитного средства при выращивании микроба E.coli на жидких питательных средах. С учетом

перспективности данной проблемы нами предприняты настоящие исследования.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработка радиозащитного препарата на основе продуктов метаболизма E.coli. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определение оптимальных условий культивирования E.coli, обеспечивающих синтез продуктов метаболизма микроба.

2. Оценка биологического действия метаболитов E.coli на организм интактных животных.

3. Изучение радиозащитных свойств препарата на основе продуктов метаболизма тест-микроба на облученных животных.

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом института «Радиационная безопасность» (№ госрегистрации 01990005332).

Научная новизна. Впервые научно обоснована и экспериментально подтверждена возможность получения и использования продуктов метаболизма E.coli, выделяемых микробом в культуральную жидкость, в качестве радиозащитного средства.

С учетом действия активных субстанций в составе продуктов метаболизма E.coli создан радиозащитный препарат нового поколения, обладающий как лечебным, так и профилактическим свойствами при парентеральном применении в условиях радиационного стресса.

Установлено, что формирование радиорезистентности организма к облучению на фоне применения разработанных средств реализуется путем предупреждения пострадиационной аутоантигенемии, радиотоксинемии, коррекции гемопоэтической, иммунной и антиоксидантной систем организма.

Теоретическая ценность работы. Полученные результаты расширяют представление о механизмах противолучевого действия продуктов на основе микробных метаболитов, экспрессируемых в процессе их жизнедеятельности -культивирования на жидких питательных средах. Биологически активные вещества, входящие в состав метаболитов, вырабатываемых E.coli, адаптированы друг к другу, проявляют эффект синергизма и в результате взаимодействия с клетками макроорганизма, оказывают благоприятное влияние на иммунную, гемопоэтическую и антиоксидантную системы, что способствует повышению радиорезистентности животных при воздействии ионизирующей радиации.

Практическая значимость работы определяется тем, что на основе метаболитов E.coli разработан и предложен в ветеринарную практику препарат для повышения радиорезистентности организма, изготовление и применение которого регламентируется «Рекомендациями по применению радиозащитного препарата», утв. директором Центра 22.06.2010 г.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных научных сессиях учёного совета по

итогам НИР за 2009-2011 гг., научно-практических конференциях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г.Казань, 2008-2011 гг.), 2-м съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов (г.Казань, 2009), межд. научно-практ. конф. «Актуальные проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» (Москва, 2011), 3 съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России (Санкт-Петербург, 2011). Результаты основных этапов работы подтверждены внутрилабораторными комиссионными испытаниями с положительной оценкой.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в т.ч. 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимальные условия получения микробных метаболитов E.coli.

2. Конструирование потенциального радиозащитного средства на основе продуктов метаболизма кишечной палочки.

3. Радиозащитные свойства препарата на основе продуктов метаболизма кишечной палочки.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах компьютерного текста, содержит 16 таблиц и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения и приложение. Список литературы состоит из 249 библиографических источников, в т.ч. 112-зарубежных авторов.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы исследований

Диссертационная работа выполнена в отделе радиобиологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в 2009-2011 гг.

В опытах было использовано 595 животных, в т.ч. 412 белых мышей живой массой 18-20 г, 99 белых крыс живой массой 150-180 г, 15 морских свинок живой массой 300-400 г и 69 кроликов живой массой 2-2,5 кг.

В работе использовали 1 производственный (E.coli шт. ПЛ-6, №1154115 эшерихиозной диареи поросят) и 3 эпизоотических (E.coli шт. УК-2, №1153/15, возбудитель диареи поросят; шт. ПЗ-З, №1150/15, возбудитель диареи телят; шт. КВ-1, №1156/15, возбудитель эшерихиоза поросят) штамма, полученных из музея штаммов ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Для идентификации выделенных из организма облученных животных изолятов и определения колициногенности исходного штамма-продуцента, использовали индикаторные штаммы E.coli К-12, E.coli JK 116, лизоцимной активности - стандартную культуру M.lysodeicticus, серологической типизации изолятов, выделенных из организма облученных и подвергнутых лечению и профилактике испытуемыми противорадиационными средствами животных, -

коммерческий набор типоспецифических агглютинирующих (О-, Н-, К- и А-) сывороток.

В исследованиях по культивированию и изучению ферментативных свойств штамма-продуцента использовали жидкие (МПБ, бульон Хоттингера, среда ГПЭМ) и плотные (МПА, кровяной агар, набор питательных средств с лактозой, маннитом, глюкозой, сахарозой, желатином, цитратно-аммонийную и среду Симмонса, агар с сернокислым железом) питательные среды, рекомендованные Государственной фармакопеей XI издания (1990) и руководством по доклиническим методам исследования фармакологических веществ (2000).

В качестве потенциальных радиационных средств испытывали 72 варианта культуральной жидкости, полученных из вышеперечисленных культуральных сред в различные сроки (через 18, 24 ч, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 сут) культивирования штамма-продуцента, в качестве контрольных лечебно-профилактических препаратов - радиозащитный микробный полиантиген (МПАГ) и противорадиационный лечебно-профилактический иммуноглобулин (ПЛПИ).

Для моделирования радиационных поражений животных использовали гамма-установку «Пума» с источником излучения цезий-137 при мощности экспозиционной дозы 3,13xl0"s Кп(кг*с), для облучения микробных препаратов - гамма-установку «Исследователь» с источником излучения кобальт-60.

Исследования по получению продуктов микробного метаболизма проводили на основе штамма «ПЛ-6» E.coli, продуцирующего комплекс биологически активных веществ (Зароза В.Г., 1991).

Изучение исходного радиорезистентного мутанта E.coli осуществляли согласно методике Wsiqlat S.J.L., Hill F.S. (1968) путем облучения тест-культуры гамма-лучами кобальта-60.

Содержание ДНК в исходной культуре изучали по Burton К. (1957), супероксиддисмутазы (СОД) - по Макаренко E.B. (1988), каталазы - по Королюк М.А. и др. (1988), содержание цистеина - в нингидриновой пробе методом бумажной хроматографии, изучение компонентного состава культуральной жидкости, биомассы и их ассоциации - методом колоночной хроматографии по Ратниковой И.А. (2010).

Культивирование штамма «ПЛ-6» E.coli для получения продуктов микробного метаболизма проводили на жидкой питательной среде в соответствии с методической и технической документацией (Справочник.... 1982, «Методические указания...» 1981; Перт С.Дж., 1978). Основными показателями качества полученных вариантов культуральной жидкости служили величина pH, выход биомассы (%), концентрация клеток (хЮ кг/см ), каталазная (KT), пероксидазная, супероксиддисмутазная (СОД), формиатдегидрогеназная (ФДГ) и антибактериальная (АНБ) активности.

Токсичность, безвредность, раздражающее действие и энтеротоксичность продуктов метаболизма E.coli определяли согласно методическим рекомендациям Першина Г.Н. (1971) и «Методическим указаниям....»(1986, 1989).

Испытания лечебно-профилактического действия экспериментальных образцов культуральной жидкости проводили на облученных в дозах 7,7 Гр (белые мыши), 9,0 Гр (белые крысы) и 11,0 Гр (кролики) лабораторных животных, которым за 1-10 сут до и через 1-10 сут после облучения подкожно однократно вводили испытуемые препараты в дозах 10-50 мг/кг (по сухому веществу). Эффективность препаратов оценивали по клинико-гематологическим и иммунологическим показателям, течению ОЛБ, выживаемости и срокам продолжительности жизни павших животных, содержание гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, лимфоцитов, тромбоцитов, цветного показателя и лейкограмму - по общепринятым методам (Жербин Е.А., Чухловин А.Б., 1989).

Влияние продуктов метаболизма E.coli на неспецифическую резистентность организма изучали путем определения лизоцимной и бактерицидной активности сыворотки крови, содержания Т- и В- лимфоцитов, фагоцитарной активности нейтрофилов в НСТ-тесте, состояние прооксидантно-антиоксидантной системы - по уровню МДА по методу Гончаренко М.С. и Латиновой А.М. (1985), хиноидных радиотоксинов - в РИГА тесте по Рыцаю Т., 1960.

Выделение липидов из кишечной палочки и из культуральных жидкостей проводили по методу Кейтса с использованием фосфованилинового и эталонного реактивов (Lachema), а идентификацию основных классов биосурфактантов - методом тонкослойной хроматографии с использованием качественной реакции на нейтральные липиды, фосфолипиды, гликолипиды и липопептиды по Ратниковой И.А. (2010).

Полученный цифровой материал подвергали статистической обработке с использованием общепринятых параметрических методов, степень достоверности определяли по t-критерию Стьюдента с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel (2000).

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИИ

3.1 Определение соответствия биологических свойств штамма «ПЛ-6» E.coli производственным с целью изготовления на его основе радиозащитных препаратов

На первом этапе исследований проводили изучение культурально-морфологических, антигенных, ферментативных, энтеротоксигенных, дегидрогеназных и колициногенных свойств штамма «ПЛ-6» E.coli.

Установлено, что микробы изучаемого штамма представляли собой грамотрицательные, не спорообразующие палочки, располагающиеся в мазках одиночно. В мясопептонном бульоне (МПБ) штамм «ПЛ-6» E.coli вызывал

интенсивное помутнение, а на плотной питательной среде (МПА) образовывал сочные, блестящие, вогнутые, гладкие с ровными краями колонии круглой формы; обладал выраженной ферментативной активностью - разлагал лактозу, глюкозу, сахарозу, манит, не образовывал сероводород, не разжижал желатин, не синтезировал цитраты, продуцировал фермент р-гемолизин.

Изучаемая тест-культура содержала 20,1±0,3х10"6 моль/мин сукцинатдегидрогеназы и 13,6±0,5х10"6 моль/мин формиатдегидрогеназы, не обладала способностью вырабатывать и продуцировать антиоксидантные ферменты, но продуцировала адгезивный антиген К 88, обладала ДНК-азной, лизоцимной и колициногенной активностями. ЛД50 для белых мышей составляла 1x105 микробных клеток.

3.2 Изучение возможности усиления продукции антиоксидантных ферментов потенциальным штаммом «ПЛ-6» E.coli

На первом этапе проводили опыты по определению радиорезистентности штамма «ПЛ-6» E.coli. Микробы тест-штамма выращивали в термостате в пробирках со скошенной питательной средой в течение 1-2 сут при 37'С. Выращенную культуру смывали и разводили физиологическим раствором до концентрации 1х109м.к./мл и подвергали однократному облучению гамма-лучами на установке «Исследователь» с источником излучения 60Со в дозах 31, 62, 125,250, 500, 1000, 2000, 3000, 3500 и 4000 Гр.

Установлено, что доза облучения, понижающая число микробов в 10 раз, составляла 31 Гр; Д60 - 2000 Гр; Д90 - 3000 Гр; Д100 - 3500 Гр.

По результатам исследований получен стабильный радиорезистентный вариант кишечной палочки - штамм «rLi-6»(R10) E.coli, отличающийся от исходного высокой радиорезистентностью, выживающий при дозе 7000 Гр, что превышает исходный уровень в 2,5 раза. Радиорезистентность сопровождалась одновременным изменением морфологических свойств в виде значительного (до 7 раз) увеличения длины клеток.

Дальнейшие исследования включали изучение содержания ДНК, антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы, антиокислительного фермента - каталазы, аминокислоты цистеина у радиорезистентного штамма «roi-6»(R|o) E.coli.

Результаты проведенных биохимических исследований представлены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 видно, что ионизирующее излучение вызывало синтез микробом как клеточных (связанной с мембраной), так освобожденных и экспрессируемых в межклеточное пространство (культуральную жидкость) ферментов каталазы и супероксиддисмутазы.

Под воздействием ионизирующего излучения происходило изменение метаболизма аминокислот, что сопровождалось увеличением синтеза цистеина в 2,16 раза и 2-кратным увеличением синтеза серина и глицина.

Таблица 1- Содержание ДНК, СОД, КАТ в клетках и культуральной жидкости (КЖ) интактного и радиорезистентного штаммов Е.соП_

Вариант E.coli Показатель

ДНК мкг/109мк. СОД мкмоль/г КАТ мкат/г/мл АП С"' Mf'

E.coli ПЛ-6 суспензия 8,5±0,09 0,31 ±0,07 - 0,11*10~3±0,01

КЖ 3,3±0,033 0,09±0,001 - 0,03*10"э±0,01

E.coli (R|0) суспензия 15,3±0,17 1,95±0,15 21,51 ±0,75 0,24*10'3±0,01

КЖ 8,7±0,06 0,97±0,09 27,38±0,59 0,05*10~3±0,01

АП - активность пероксидазы; СОД - супероксиддисмутаза; КАТ -катал аз а.

Полученный на первом этапе радиорезистентный мутант «WI-6»(Ri0) E.coli в дальнейшем был использован в качестве продуцента биологически активных веществ - потенциальных радиозащитных средств микробного происхождения.

3.3 Определение оптимальных условий культивирования тест-штамма для получения продуктов метаболизма с высоким содержанием биологически активных веществ (БАВ)

В дальнейших исследованиях устанавливали оптимальные условия культивирования выбранных штаммов (производственного - «ПЛ-6» E.coli и его радиомодифицированого варианта «nJI-6»(R]0) E.coli) в жидкой питательной среде, критерии оценки качества полученных продуктов метаболизма использованных вариантов микроба и конструирования на их основе экспериментальных образцов радиотерапевтического и радиозащитного препаратов; проводили сравнительное изучение биологических свойств культуральных жидкостей исследуемых штаммов в зависимости от состава испытательной среды и времени культивирования.

При выращивании изучаемой культуры в жидких питательных средах с различным составом положительные результаты были получены при использовании мясопептонного бульона. Использование бульона Хоттингера и среды ГПЭМ оказывало ингибирующее воздействие на рост и размножение этой культуры: основные характеристики (концентрация клеток и значение pH) значительно уступали таковыми при выращивании на МПБ. Высокие ростовые качества МПБ объясняются рациональным подбором питательных веществ, поэтому указанная среда нами была использована в дальнейших опытах для культивирования E.coli.

3.4 Конструирование радиозащитного препарата на основе веществ микробного и минерального происхождения

Установлено, что при культивировании E.coli на жидких питательных средах в культуральную жидкость выделяются биологически активные вещества - белки, липиды, углеводы, ферменты, аминокислоты и др., обладающие как антибактериальным, так и радиозащитными свойствами.

Обе фракции бактериальной культуры (биомасса, культуральная жидкость) как в отдельности, так и в сочетании обладали биологической активностью при совместном культивировании облученных гамма-лучами лимфоцитов периферической крови с нативными клетками E.coli и (или) культуральной жидкости.

Поскольку выделение энтеротоксинов кишечной палочки в культуральную жидкость в начальные сроки выращивания минимальное, при конструировании радиозащитного средства на основе культуральной жидкости E.coli дезактиватор (нейтрализатор) энтеротоксина не применяли, поскольку совместное культивирование лимфоцитов с культуральной жидкостью на основе кишечной палочки токсического влияния на клетки крови не оказывало. При введении 2х109 микробных клеток на одну мышь гибели животных не наблюдалось. Летальная доза чистого препарата составляла 5 мкг на мышь, т.е. 250 мкг/кг, что свидетельствует о весьма высокой токсичности эндотоксина E.coli. При длительном культивировании необходимо было перевести эндотоксин E.coli в анатоксин с использованием для этой цели формалина.

При конструировании радиозащитного препарата учитывали, что в настоящее время создаются молекулярные «конструкторы» нанопрепаратов, в которых есть нацеливающая часть и терапевтический (диагностический) агент. С учетом этого, были сконструированы композиции на основе продуктов метаболизма E.coli и природных минералов. В качестве нацеливающей части использовали надосадочную культуральную жидкость, содержащую продукты метаболизма E.coli, и биомассу культуры; в качестве депонирующих, абсорбирующих и метаболизмрегулирующих компонентов - природные минералы - гидросиликат и гидроокись алюминия, в качестве токсиннейтрализующего агента - 40%-ный раствор формальдегида.

Были составлены следующие радиозащитные композиции: 1) бактериальная масса E.coli с культуральной жидкостью 90 см3 + 10 см3 6 %-ного раствора гидросиликата алюминия; 2) бактериальная масса + культуральная жидкость 90 см3 + 10 см3 2 %-ного раствора гидроокиси алюминия; 3) культуральная жидкость с биомассой 99,5 см3 + 0,5 см3 40%-ного раствора формалина; 4) культуральная жидкость 90 см3 + 10 см3 6 %-ного раствора гидросиликата алюминия; 5) культуральная жидкость 90 см3 + 10 см3 2 %-ного раствора гидроокиси алюминия. Указанные композиции для полного конъюгирования помещали в термостат при температуре 37°С при постоянном перемешивании на шуттель-аппарате, выдерживали 30 мин, а затем подвергали

лучевой стерилизации на гамма-установке «Исследователь» в дозе 7000 Гр и использовали в дальнейшем в качестве потенциальных радиозащитных средств.

В составленных композициях с использованием регламентированных тест-систем (РА, РДП) и соответствующих антисывороток проверяли наличие протективного, адгезивного и токсического антигенов.

Установлено, что титры протективного антигена, энтеротоксина и адгезивного антигена в препаратах № 1, 2 и 3 были почти одинаковыми, в препаратах № 4, 5 их содержание было ниже, однако обе фракции продуктов метаболизма E.coli (клеточная и внеклеточная) обладали достаточно выраженной серологической активностью. Как в клеточной, так и во внеклеточной фракции обнаружены протективный, адгезивный антигены и энтеротоксины (анатоксин).

Полученные препараты перед испытанием на радиозащитную эффективность подвергали контролю на стерильность, безвредность и адгезирующую способность. Показано, что гибели животных после применения препаратов не наблюдалось, общее состояние их оставалось удовлетворительным. Испытуемые препараты не обладали и раздражающим действием.

3.5 Изучение радиозащитных свойств препаратов на основе метаболизма E.coli на лабораторных животных

Учитывая неодинаковую степень радиочувствительности у различных видов животных и зависимость результативного эффекта радиопротекторов от испытуемого вида животных, на следующем этапе проводили опыты по изучению радиозащитных свойств потенциальных радиозащитных препаратов на основе продуктов метаболизма E.coli, природных минералов и депонирующих веществ.

В опытах использовали 120 белых мышей живой массой 18-20 г, разделенных на 12 групп по 10 животных в каждой. Моделирование тяжелой степени лучевой болезни у животных осуществляли путем однократного внешнего облучения их на гамма-установке «Пума» в дозе 7,7 Гр. Испытуемые препараты применяли за 24 до и через 24 ч после облучения

Результаты проведенных исследований показали, что применение препаратов № 1, 2, 3, 4 и 5 в двух вариантах оказывало радиозащитный эффект, обеспечивая выживание летально облученных животных в 60-80 % случаев при радиационной гибели всех облученных животных в контрольной группе.

Установлено, что при однократном подкожном использовании препаратов в профилактической (за 24 ч до облучения схеме, варианты 1,2,3,4 и 5) схеме оказывало радиомодифицирующий эффект, повышая выживаемость летально облученных животных с 60 до 80 %. Наиболее высокая выживаемость отмечалась при однократном подкожном введении препарата № 1 (суспензия клеток E.coli в культуральной жидкости с добавлением гидросиликата алюминия из расчета 10% к объему) и препарата № 3 (суспензия клеток E.coli в

культуральной жидкости с добавлением к смеси 0,5 % формалина), которые обеспечивали выживаемость 80 % летально облученных животных. Менее выраженный радиозащитный эффект был достигнут при профилактическом применении препаратов № 2 (суспензия клеток Е.соП культуральной жидкости с добавлением гидроокиси алюминия), № 4 (культуральная жидкость с добавлением гидросиликата алюминия) и № 5 (культуральная жидкость с добавлением гидроокиси алюминия), которые обеспечивали выживаемость до 60 % летально облученных животных.

Препараты № 1 и № 2 оказались высокоэффективными и в лечебной схеме применения, повышая выживаемость летально облученных животных до 80% при радиационной гибели облученных не леченых животных. Менее выраженный лечебный эффект был достигнут при применении препаратов № 3 (суспензия клеток Е.соП + раствор формалина), № 4 (культуральная жидкость + гидросиликат алюминия) и № 5 (культуральная жидкость + гидроокись алюминия), которые защищали от радиационной гибели 60 % животных, облученных в дозе 7,7 Гр.

Полученные в первой серии опытов положительные результаты послужили основанием для продолжения следующего этапа исследований, задачей которых является изучение радиозащитной активности испытуемых препаратов при различных интервалах применения их до и после облучения на различных животных. Кроме того, необходимо было установить оптимальный интервал времени для создания радиорезистентности у животных при предварительном и отсроченном применении препаратов.

Исследования, проведенные на белых мышах показали, что из испытанных 5 схем применения оптимальной оказалась схема 3, предполагающая двукратное применение препаратов № 1 и № 4 на 5 сут после облучения, что обеспечивало 80 %-ную выживаемость облученных животных на 1, 3 и 5 сут и 70 %-ную выживаемость - на 7 и 10 сут после облучения. Использование других схем применения испытуемых препаратов было менее эффективным как при однократном, так и при двукратном применении -выживаемость не превышала 50 %.

Результаты повторных исследований на белых крысах показали, что как предварительное (за 10-1 сут до облучения), так последующее (через 24 ч, 5, 10 сут после облучения) применение препарата № 1 (суспензия клеток у Е.соН в культуральной жидкости + гидросиликат алюминия) оказывают радиомодифицирующее действие, обеспечивая выживаемость 66,6-83,3 % летально облученных животных при 100%-ной гибели не леченых и не профилактированных. Максимальный радиозащитный эффект проявлялся при использовании препарата № 1 за 24 ч до облучения и через 24 ч после облучения - выживаемость составляла 83,3 %. Достаточный радиозащитный эффект изучаемый препарат проявлял и при его введении за 5 и 10 сут до

облучения, и через 5 и 10 сут после радиационного воздействия, обеспечивая выживаемость 66,6 % животных.

Таким образом, в результате проведенных исследований по изучению радиозащитной активности препарата на основе продуктов метаболизма Е.соН и природного минерала на двух видах лабораторных животных установлено, что, как предварительная иммунизация животных, с интервалом между инъекцией препарата и облучением в 1, 5 и 10 дней, так и последующее за облучением экстренное (через 1-3 сут) и отсроченное (5-10 сут) применение его с лечебной целью формируют у животных устойчивость к облучению в дозах, вызывающих тяжелую степень ОЛБ, обеспечивая 50-60 % выживаемость с одновременным увеличением СПЖ павших животных в 3,1-4,2 раза (Р <0,05).

Третью серию опытов проводили на 54 кроликах породы «Шиншилла» живой массой 2,0-2,5 кг в шести вариантах опытов.

Проведенные исследования подтвердили наличие у препарата № 1 противолучевой терапевтической эффективности. Он был высоким как при экстренном (первые 1-3 сут), так и отсроченном (на 5-10 сут) применении при ОЛБ, защищая 80-60 % животных. По терапевтической активности изучаемый препарат превосходил противорадиационный лечебно-профилактический иммуноглобулин, у которого высокий лечебный эффект проявлялся при экстренном (первые 1-3 сут радиационного поражения) применении, но снижался при отсроченном (на 5-10 сут) введении, защищая 50-23,3 % животных.

3.6 Изучение механизма формирования радиорезистентности у животных на фоне применения препарата на основе продуктов метаболизма Е.соН и природных минералов

На следующем этапе работы изучали реакцию системы крови и состояние кроветворения в условиях лучевого воздействия на организм и характер влияния препарата на основе продуктов метаболизма Е.соН в сочетании с микрочастицами минерала - гидросиликата алюминия.

Результаты анализа состояния системы крови у всех изучаемых животных на воздействие летального облучения показали развитие тяжелой панцитопении, выражавшейся в существенном снижении уровня циркулирующих лейкоцитов, лимфоцитов, нейтрофилов и эритроцитов. Гематоксический эффект обучения начинал развиваться уже в первые сутки после облучения, постепенно нарастая, достигая максимальных значений к периоду разгара костно-мозгового синдрома (7-9 сут). К концу опыта восстановления гематологических показателей не последовало. Развитие пострадиационной панцитопении периферической крови животных привело к нарушению функции центральных и периферических органов гемопоэза: костного мозга, тимуса, селезенки.

Применение испытуемого средства с лечебной целью однократно подкожно в дозе 20 мг/кг (по сухому веществу) через 24 ч после облучения

оказывало гемапротективный эффект, сохраняя необходимый уровень клеток периферической крови в пределах физиологической нормы (таблица 2).

Таблица 2 - Реакция системы крови мышей, облученных и леченных препаратом на основе продуктов метаболизма Е.соН

Показатель Группа Исход Срок исследования, сут

9 21 30

Численность клеток в косном мозге бедренной кости, х10 6 1 24,1±2,1 19,7±2,9 20,9±2,5 29,8±1,5

2 23,9±1,7 3,1±0,9* 3,2±0,7* -

3 24,0±2,9 24,1±3,7 23,9±3,3 24,2±3,5

Эритроидные клетки в косном мозге бедренной кости. х106 1 5,59±0,55 5,45±0,47 4,33±2.27 5,51±0,79

2 5,55±0,49 3,15±0,11* 5,50±0.59 -

3 5,61±0,67 5,59±0,78 3,09±0,17* 5,59±0,53

Тромбоциты, х 109 /л 1 363,1±24,3 265,3±26,5 878,5±24,7 292,5±31,3

2 364,5±21,9 181,1±31,3 177,3±24,9 -

3 361,0±32,5 360,3±29,1 363,0±29.1 362,3±31,5

Эритроциты, хЮ12 /л 1 8,1±0,5 7,7±0,3 7,8±0,1 7,9±0,5

2 8,3±0,9 6,2±1,7 6,0±0,3 -

3 8,3±0,8 8,4±0,5 8,5±0,7 8,4±0,9

Гемоглобин, г/л 1 111,5±3,9 105,1±2,7 107,9±3,3 109,1±3,5

2 112,3±4,5 78,9±3,9* 74,7±4,5 -

3 110,9±4,1 111,5±0,1 110,1±5,1 111,9±7,7

Нейтрофильные клетки в косном мозге бедренной кости, хЮ6 1 10,3±0,7 6,9±0,9 7,3±0,7 8,1±0,5

2 10,4±0,3 4,3±0,3* 4,1±0,9* -

3 10,5±0,5 10,3±0,5 10,1 ±0,3 10,4±0,9

Нейтрофилы в крови, х109/л 1 1,3±0,5 0,80±0,10 0,90±0,09 1,1±0,3

2 1,1±0,7 0,49±0,10* 0,57±0,30* -

3 1,4±0,3 1,20±0,50 1,10±0,70 1,3±0,1

Лимфоидные клетки в косном мозге бедренной кости. хЮ 6 1 3,4±0,5 2,70±0,60 2,90±0,90 3,1±0,7

2 3,5±0,7 0,90±0,10* 0,69±0,50* -

3 3,5±0,3 3,40±0,90 3,50±0,50 3,5±0,3

Лимфоциты в крови, хЮ'/л 1 2,0±0,5 1,20±0,30 1,50±0,10 1,80±0,30

2 1,8±0,3 0,37±0,50 0,55±0,09 -

3 1,9±0,2 1,83±0,30 1,90±0,10 1,87±0,50

Масса тимуса, мг 1 20,7±1,7 17,9±0,1 18,1±0,3 18,7±0,5

2 21,1±0,3 10,1±0,1 9,3±0,3 -

3 20,5±0,1 21,0±0,3 20,3±0,1 20,5±0,5

Лейкоциты, х10 9/л 1 6,50±0,47 4,50±0,70 4,70±0,90 4,90±0,30

2 6,30±0,51 0,95±0,10 0,93±0,63 0,98±0,49

3 6,40±0,58 6,10±0,55 6,30±0,63 6,50±0,49

Масса селезенки, мг 1 71,3±6,7 60,3±3,3 63,10±2Д 65,3±1,9

2 69,5±7,1 28,9±1,2* 29,1±1,1 -

3 70,1±5,9 69,5±3.5 70,9±3,3 71,0±3,9

Эндогенные КОЕ с 1 5,9±1,7 4,8±0,5* 4,9±0,1* 5,7±0,5

2 6,0±1,3 2,1 ±0,3* 1,9±0,1* -

3 5,7±1,5 5,9±1,1 6,0±1,5 6,0±1,7

Лимфоидные клетки в селезенке, х106 1 351±34 347±35 349±29 350±37

2 360±29 94±11* 91±15* -

3 365±31 361±33 363±27 366±21

Тимоциты в тимусе, х10 6 1 158±25 141±19 143±21 149±15

2 157±31 55±13* 52±23 -

3 155±13 159±31 160±25 16Ш7

Гемапротективный эффект испытуемого средства был обусловлен его детоксицирующим эффектом, что наглядно демонстрируется полученными данными.

Результаты цитологических исследований костномозгового пунктата у животных, облученных и профилактированных испытуемым препаратом, показали, что используемое средство препятствовало опустошению костного мозга.

Таким образом, введение в облученный организм продуктов метаболизма Е.соИ оказывало стимулирующее действие на цитокиновую систему организма, усиливая выработку гемарегулирующих медиаторов иммуногемопоэза, что коррелировало с большей выживаемостью животных, ингибируя иммунотоксические эффекты облучения - панцитопению и миелодипрессию.

Учитывая, что одним из механизмов гематоксического действия ионизирующего излучения является апоптотическая гибель лимфоцитов под воздействием радиотоксических веществ - хиноидных и липидных радиотоксинов, представляло интерес изучение состояния прооксидантно-антиоксидантной системы у летально облученных животных на фоне применения испытуемого препарата.

Установлено, что тотальное облучение лабораторных животных вызывает острую лучевую болезнь с развитием костномозгового синдрома, сопровождающегося гема- и радикальной патологией. Применение продуктов метаболизма E.coli в сочетании с микрочастицами природного минерала (абсорбента наночастиц ферментов, аминокислот, белокподобных частиц) в первые (1-10) сут и заблаговременно (за 10-1 сут) до облучения в дозе 20 мг/кг (по сухому веществу) предотвращало развитие панцитопении и миелодепрессии, а также ингибировало свободнорадикальные процессы у летально облученных животных.

4 ВЫВОДЫ

1. Производственный штамм «ПЛ-6» E.coli обладает типичными для данного вида культурально-морфологическими, биохимическими и антигенными свойствами, однако не способен синтезировать ферменты антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазу и каталазу.

2. Путем облучения штамма «ПЛ-6» E.coli последовательно увеличивающимися дозами ионизирующего излучения получен радиорезистентный вариант штамма «ПЛ-6» E.coli - «rUI-6»(Ri0), отличающийся от исходного морфологическими (удлинение клеток от 3 до 7 раз) и биохимическими (высокая каталазная, пероксидазная и супероксиддисмутазная активности, способность синтеза цистеина и увеличение содержания ДНК) свойствами.

3. Путем варьирования параметров культивирования (температуры, рН, времени экспозиции) штамма-продуцента на разных питательных средах (мясопептонном бульоне, бульоне Хотгингера, гидролизате плацентарном эмбрионально маточном) получены 72 варианта микробной биомассы и культуральной жидкости, предварительная оценка биологической эффективности которых была осуществлена в модельной in vitro тест-системе.

4. Максимальный выход биомассы и синтез продуктов метаболизма E.coli достигаются при культивировании штамма-продуцента на мясопептонном бульоне в течение 48 ч при температуре 37°С и рН 8,12.

5. В модельной in vitro тест-системе (облученные в дозе 5,0 Гр лимфоциты + продукты метаболизма E.coli) установлено, что как клеточная (биомасса), так и бесклеточная (культуральная жидкость) фракции при внесении в культивируемые лимфоциты до и после облучения оказывают радиозащитный эффект, обеспечивая 70,0 %-ную и более выживаемость облученных лимфоцитов.

6. Препарат на основе суспензии E.coli, культуральной жидкости и природных минералов как при профилактическом (за 10-1 сут), так и лечебном (через 1-10 сут) вариантах применения обеспечивает выживаемость более 70 % облученных лабораторных (белых мышей; белых крыс; кроликов) животных.

7. Механизм формирования радиорезистентности у животных на фоне применения продуктов метаболизма E.coli осуществляется путем

ингибирования панцитопении и миелодепрессии, коррекции функции цитокиновой, прооксидантно-антиоксидантной системы и системы гемопоэза: количество миелокариоцитов в бедренной кости у мышей, получавших препарат, превышало контрольные показатели в 3,2 раза, тромбоцитов - в 1,83; эритроцитов - в 1,69; гемоглобина - в 1,34; нейтрофилов - в 1,49; лимфоидных клеток в косном мозге - в 4,23; содержание КОЕс - в 3,1 и тимоцитов - в 2,92 раза. У облученных леченых животных масса селезенки, тимуса и клеточность этих органов были значительно выше, чем у только облученных белых мышей.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для лечения и профилактики радиационных поражений организма в ветеринарную практику предложены лечебно-профилактические радиозащитные комплексы на основе продуктов метаболизма E.coh и природных минералов (гидросиликата и гидроокиси алюминия), обеспечивающие 70%-ную и более выживаемость летально облученных животных при однократном подкожном применении в дозе 20 мг/кг по сухому веществу.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Вагин, К.Н. Терапия и профилактика радиотоксемии /К.Н.Вагин А.С.Титов, Р.В.Нефедова, Д.Т.Шарифуллина //Матер. 2-го съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России. 9-12 июня 2009 г. - Казань. - С. 28.

2. Низамов, Р.Н. Изучение биологических свойств штамма «ПЛ-6» E.coli '/Р.Н.Низамов, К.Н.Вагин //Матер, межд. научно-практ. конф. «Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая

безопасность» - Казань, 2010. - С. 249.

3. Титов, A.C. Использование веществ микробного происхождения для повышения иммунной реактивности животных /А.С.Титов, Р.Н.Низамов, Д Т.Шарифуллина, Р.В.Нефедова, К.Н.Вагин, Г.И.Рахматуллина //Матер, межд. научно-практ. конф. «Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность» - Казань 2010. - С. 339.

4 Низамов, Р.Н. Изучение антиаллергенной активности продуктов метаболизма бифидобакгерий /Р.Н.Низамов, Г.В.Конюхов, Д.Т.Шарифуллина, Р В Нефедова, Г.И.Рахматуллина, К.Н.Вагин //Ветеринарная медицина. Национальная академия аграрных наук Украины. Национальный научный центр «Институт экспериментальной клинической ветеринарнои медицины». Научный тематический сборник 94. - Харьков, 2010. - С. 127.

5 Низамов, Р.Н. Использование веществ микробного происхождения для профилактики и лечения ОЛБ животных /Р.Н.Низамов, Г.В.Конюхов, Д Т Шарифуллина, Р.В.Нефедова, К.Н.Вагин, Г.И.Рахматуллина //Ветеринарная медицина. Национальная академия аграрных наук Украины. Национальный научный центр «Институт экспериментальной клинической ветеринарнои медицины». Научный тематический сборник 94. - Харьков, 2010. - С. 314.

6. Конюхов, Г.В. Использование веществ микробного происхождения в качестве радиозащитных средств /Г.В.Конюхов, К.Н.Вагин //Гигиена и санитария. -2011. - № 6. - С. 32-35.

7. Вагин, К.Н. Препараты на основе продуктов метаболизма Е.соН при радиационных поражениях животных /К.Н.Вагин, Р.Н.Низамов, Г.В.Конюхов, Н.Б.Тарасова, А.С.Титов //Матер.З съезда фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» - СПб: Изд-во СПбГАВМ, 2011. - С. 88-90.

8. Вагин, К.Н. Изучение биологических свойств радиомодифицированного варианта Е.соН с целью изготовления на его основе средств для лечения и профилактики острой лучевой болезни /К.Н.Вагин //Матер, межд. научно-практ. конф. «Актуальные проблемы современной ветеринарии», поев. 65-летию ветеринарной науки Кубани. Ч. 1. - Краснодар 2011.-С. 168-170.

9. Низамов, Р.Н. Радиозащитная активность природного адаптогена в условиях радиационного стресса /Р.Н.Низамов, Р.Р.Гайзатуллин, Г.И.Рахматуллина, К.Н.Вагин /Гигиена и санитария - 2011. - № 6.-36-38.

10. Конюхов, Г.В. Биотехнология и ее значение в создании радиозащитных препаратов /Г.В.Конюхов, Р.Н.Низамов, Н.Б.Тарасова, К.Н.Вагин, Р.Р.Гайзатуллин /Ветеринарный врач. - 2011. - № 6. - С. 24-26.

11. Вагин, К.Н. Продукты метаболизма микробов для лечения и профилактики острой лучевой болезни /К.Н.Вагин, Р.Н.Низамов, Г.В.Конюхов, Г.И.Рахматуллина //Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана -2010. - Т. 206. - С. 27-31.

Вагин Константин Николаевич

РАЗРАБОТКА РАДИОЗАЩИТНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ МЕТАБОЛИТОВ Е.СОЫ

03.01.01 - радиобиология 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2011

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань,ул. Журналистое, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональны.и территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 09.12.2011 г. Печ.л.1,1 Заказ № К-7094. Тиралс НО экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризографам.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вагин, Константин Николаевич, Казань

61 12-3/361

ФГБУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ» (г.Казань)

РАЗРАБОТКА РАДИОЗАЩИТНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ

МЕТАБОЛИТОВ Е.СОЫ

03.01.01- радиобиология 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

ВАГИН КОНСТАНТИН НИКОЛАЕВИЧ

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

заслуженный деятель науки РТ, доктор ветеринарных наук, профессор Низамов Р.Н.,

доктор биологических наук Тарасова Н.Б.

Казань - 2011

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген

AT - антитело

АНТ - анатоксин

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

АНРФ - антирадикальные ферменты

АТЭД - антительный эритроцитарный диагностикум

БАВ - биологически активные вещества

ВМП - вещества микробного происхождения

Гр - грей

ГПЭМ - гидролизат плацентарный эмбрионально-маточный

ИГ - иммуноглобулин

ИЛ - интерлейкин

JITP - липидные радиотоксины

КАТ - каталазная активность

КЖ - культуральная жидкость

КОЕс - колониеобразующая единица селезенки

МДА - малоновый диальдегид

МПА - мясопептонный агар

МПАГ - микробный полиантиген

МПБ - мясопептонный бульон

НМ - наружная мембрана бактериальной клетки

HCT - нитросиний тетразолий

ОММ - оксидативная модификация макромолекул

ОЛБ - острая лучевая болезнь

ОМЛ - показатель отека мышиной лапы

ПА - протективный антиген

ПАОС - прооксидантно-антиоксидантная система

ПМЕс - продукты метаболизма E.coli

РА - реакция агглютинации

РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов

РБФ - реакция бентонитовой флокуляции

РИГА - реакция непрямой гемагглютинации

РТ - радиотоксин

ФА - ферментативная активность

ФДГ - формиатдегидрогеназа

САОЗ - система антиоксидантной защиты

сдг - сукцинатдегидрогеназа

СМФ -система мононуклеарных фагоцитов

спж - средняя продолжительность жизни

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ХРТ - хиноидный радиотоксин

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 6

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

2.1 Микроорганизмы-продуценты биологически активных веществ 10

2.1.1 Общая характеристика продуцентов биологически активных 24 веществ

2.2 Применение веществ микробного происхождения в качестве 33 радиозащитных средств

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 43

3.1 Материалы и методы исследований 43

3.1.1 Материалы исследований 43

3.1.2 Методы исследований 44

4 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 49

4.1 Определение соответствия производственному биологических 49 свойств штамма «ПЛ-6» E.coli для изготовления на его основе радиозащитных препаратов

4.2 Изучение возможности усиления продукции антиоксидантных 51 ферментов штаммом «ПЛ-6»Е.соН

4.3 Получение продуктов метаболизма E.coli на жидких 56 питательных средах

4.3.1 Биологические основы создания радиозащитного препарата на 56 основе продуктов метаболизма E.coli

4.3.1.1 Определение оптимальных условий культивирования тест- 61 штамма «ПЛ-6» E.coli для получения продуктов метаболизма с высоким содержанием биологически активных веществ

4.3.2 Конструирование радиозащитного препарата на основе 64 веществ микробного и минерального происхождения

4.3.3 Изучение радиозащитных свойств препаратов на основе 70 продуктов метаболизма E.coli на лабораторных животных

4.3.3.1 Оценка радиозащитных свойств комплексных препаратов на 70 основе метаболитов E.coli на белых мышах

4.3.3.2 Оценка радиозащитной эффективности препаратов на основе 78 метаболитов E.coli и природных минералов на белых крысах

4.3.3.3 Оценка радиозащитной активности препаратов на основе 80 метаболитов E.coli и природных минералов на кроликах

4.3.4 Изучение механизмов формирования радиорезистентности у 84 животных на фоне применения препаратов на основе продуктов метаболизма E.coli и микрочастиц природных минералов

5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 96

6 ВЫВОДЫ 111

7 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 113

8 СПИСОК ИПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 114

9 ПРИЛОЖЕНИЕ 139

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Использование средств микробного происхождения в целях повышения радиорезистентности организма и эффективности лечения лучевой болезни актуально в связи с проблемами радиационного загрязнения и опасности техногенных катастроф. Особенностью этих средств является широкий спектр действия в сочетании с отсутствием выраженной токсичности.

Отечественными и зарубежными исследователями при изучении различных аспектов механизма противолучевого действия накоплен экспериментальный материал, свидетельствующий о способности веществ микробного происхождения (ВМП) повышать радиорезистентность организма млекопитающих к облучению (Мальцев В.Н. и др., 1978; Иванов A.A. и др., 1991; Андрущенко В.Н. и др., 1996). Различные микробные антигены обладают способностью снижать смертность облученных животных и выраженность проявлений экспериментальной острой лучевой болезни за счет активизации фагоцитарной функции клеток системы мононуклеаров в крови и тканях, повышения устойчивости к экзогенным инфекциям, способности к образованию антител за счет увеличения числа антителопродуцирующих клеток. В связи с этим поиск веществ микробного происхождения для повышения радиорезистентности является одним из важнейших направлений решения проблемы профилактики и терапии острой лучевой болезни.

В «ФЦТРБ-ВНИВИ» проведены многочисленные исследования по изучению радиозащитной эффективности ВМП (Мухаметшин И.Р., 2002; Нигматуллин И.Н., 2007; Хафизов А.И., 2007; Иванов A.B., Низамов Р.Н., Конюхов Г.В., 2009). Разработана технология изготовления композиций на основе E.coli, обеспечивающая 70 %-ную защиту организма при ее профилактическом применении (Киршин В.А. и др., 2001). Однако применение композиции с лечебной целью усугубляло течение острой лучевой болезни (ОЛБ), что связано с наличием в ее составе живых микробных клеток.

Технология изготовления микробного полиантигена предполагала выращивание микроба-продуцента на твердой питательной среде, которая после смыва биомассы не использовалась, что значительно удорожало себестоимость конечного продукта.

Вместе с тем, из данных литературы известно, что микроорганизмы в процессе роста на жидких питательных средах экспрессируют уникальный набор биологически активных веществ (Ткаченко Е.И. и др., 2005). Так, E.coli в процессе жизнедеятельности продуцирует антибактериальные вещества, ферменты, антигены, энтеро- и экзотоксины (Зароза В.Г., 1991), цитокины (Пепоян А.З. и др., 2001), которые в отдельности и в сочетании друг с другом обладают радиозащитными свойствами (Дуплищева А.П. и др., 1965; Диковенко Е.А. и др., 1971; Дуда В.И. и др., 1980;Мальцев В.Н. и др., 1994). В доступной литературе нет данных по использованию продуктов метаболизма в качестве радиозащитного средства при выращивании микроба E.coli на жидких питательных средах. С учетом перспективности данной проблемы нами предприняты настоящие исследования.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработка радиозащитного препарата на основе продуктов метаболизма E.coli. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определение оптимальных условий культивирования E.coli, обеспечивающих синтез продуктов метаболизма микроба.

2. Оценка биологического действия метаболитов E.coli на организм интактных животных.

3. Изучение радиозащитных свойств препарата на основе продуктов метаболизма тест-микроба на облученных животных.

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом института «Радиационная безопасность» (№ госрегистрации 01990005332).

Научная новизна. Впервые научно обоснована и экспериментально подтверждена возможность получения и использования продуктов метаболизма

E.coli, выделяемых микробом в культуральную жидкость, в качестве радиозащитного средства.

С учетом действия активных субстанций в составе продуктов метаболизма E.coli создан радиозащитный препарат нового поколения, обладающий: как лечебным, так и профилактическим свойствами при парентеральном применении в условиях радиационного стресса.

Установлено, что формирование радиорезистентности организма к облучению на фоне применения разработанных средств реализуется путем предупреждения пострадиационной аутоантигенемии, радиотоксинемии, коррекции гемопоэтической, иммунной и антиоксидантной систем организма.

Теоретическая ценность работы. Полученные результаты расширяют представление о механизмах противолучевого действия продуктов на основе микробных метаболитов, экспрессируемых в процессе их жизнедеятельности -культивирования на жидких питательных средах. Биологически активные вещества, входящие в состав метаболитов, вырабатываемых E.coli, адаптированы друг к другу, проявляют эффект синергизма и в результате взаимодействия с клетками макроорганизма, оказывают благоприятное влияние на иммунную, гемопоэтическую и антиоксидантную системы, что способствует повышению радиорезистентности животных при воздействии ионизирующей радиации.

Практическая значимость работы определяется тем, что на основе метаболитов E.coli разработан и предложен в ветеринарную практику препарат для повышения радиорезистентности организма, изготовление и применение которого регламентируется «Рекомендациями по применению....», утвержденными в установленном порядке.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных научных сессиях учёного совета по итогам НЙР за 2009-2011 гг., научно-практических конференциях ФЕБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г.Казань, 2008-2011 гг.), 2-м съезде ветеринарных

фармакологов и токсикологов (г.Казань, 2009), межд. научно-практ. конф. «Актуальные проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» (Москва, 2011), 3 съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России (Санкт-Петербург, 2011). Результаты основных этапов работы подтверждены внутрилабораторными комиссионными испытаниями с положительной оценкой.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в т.ч. 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимальные условия получения микробных метаболитов E.coli.

2. Конструирование потенциального радиозащитного средства на основе продуктов метаболизма кишечной палочки.

3. Радиозащитные свойства препарата на основе продуктов метаболизма кишечной палочки.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах компьютерного текста, содержит 16 таблиц и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения и приложение. Список литературы состоит из 249 библиографических источников, в т.ч. 112 -зарубежных авторов.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Микроорганизмы-продуценты биологически активных веществ и их общая характеристика

Биологически активные вещества (БАВ) микробного происхождения с каждым годом приобретают все большее значение, а число промышленно полезных видов микроорганизмов возросло до многих десятков раз. Теперь трудно представить себе жизнь человека без хлеба, многочисленных продуктов и сыра, без солений, маринадов, и еще труднее вообразить себе существование людей, лишенных при необходимости терапевтических средств (стрептомицина, пенициллина, тетрациклина, эритромицина и др.) (Блинов Н.П, 1989).

В развитых странах мира осуществляется микробный синтез многих аминокислот, нашедших широкое применение в различных областях народного хозяйства и в медицине (Сычева Е.В. и др., 2003, 2004, 2006, 2007, 2008). Одна лишь Япония в 1971 г. производила в год 200 тыс. тонн глюконата натрия, 10 тыс. тонн лизина и разное количество аминокислот (Морозов М.П., 1972). Пути реализации названых веществ весьма многообразны. Так, аминокислотная обработка разных сортов мяса заметно улучшает его качество, Ь-диоксифенилаланин (Ь-ДОФА) с определенным учетом используется при лечении болезни Паркинсона и психических заболеваний; на основе полимеризации аминокислот разработано новое волокно, напоминающее по своему строению натуральный шелк. Некоторые аминокислоты используются для создания фунгицидов, повышающих устойчивость злаковых и других растений к грибковым заболеваниям и, кроме этого, не загрязняющих окружающую среду и ускоряющих рост растений. На основе аминокислот создана аминокислотная смола, использующаяся в качестве сырья для производства искусственной кожи, а также получено низкокислотное мыло, устраняющее трещины в коже, косметическую интоксикацию и экзему у лиц, связанных с постоянной мойкой посуды (Полтев В.И., 1963; Лункер М., 1979).

Все большее внимание привлекают к себе микробные ферменты -биологические катализаторы, без которых не обходится ни одна живая клетка организма (Готтшалк Г., 1982). Ряд из них нашел применение в медицине (гиалуронидаза, L-аспарагиназа и т.д.), косметологии (протеазы), пищевой промышленности (карбогидразы) и в других отраслях (Лункер М., 1979). Мировая потребность в энзимах для этих целей составляла 15 тыс. тонн в год (Frenkel R., 1975).

Во многих странах налажено производство микробного кормового и пищевого белка, ряда микробных полисахаридов для медицинских целей, разработаны методы получения из микроорганизмов нуклеиновых кислот, составляющих их нуклеотидов и т.д. (Милыптейн O.A., Вульф Л.Я., 1972).

Наиболее важными компонентами, синтезируемыми микроорганизмами и экспрессируемыми в питательные среды, являются вещества с антигенными свойствами, ключевую роль среди которых играют экзотоксины (Eckert N.P. е.а., 1972).

Ценными продуктами микроорганизмов, играющими важнейшую роль в инфекционной патологии человека и животных, являются растворимые антигены, которые широко используются в диагностике, лечении и профилактике ряда инфекционных заболеваний (Фиш Н.Г., 1977; Далин М.В., 1980). Во многих странах уже давно ведется промышленное производство основных токсинов бактерий, антигенов, препараты которых используются как в качестве прививочных, так и антигенных материалов, для получения гипериммунных сывороток, используемых с диагностической и лечебной целями (Караев Я.М., 2008).

Последние изыскания показали, что микробные культуральные фильтраты могут быть вызывать у лабораторных животных типичные клинические признаки проявления столбняка, эшерихиозной диареи, сибиреязвенной эдемы и т.д. (Езепчук Ю.В., 1972).

Стало ясно, что развитие патологических процессов при микробных инфекционных заболеваниях вызвано продуктами метаболизма (жизнедеятельности) микробов, ядовитыми для макроорганизма. Антисыворотки, полученные против токсинов, оказались способными блокировать поражающее действие этих ядов, обеспечивая тем самым лечебный эффект, а применение их в серологическом анализе позволяет обнаруживать и идентифицировать соответствующих возбудителей инфекционных болезней (Далин М.В., 1967; Фиш Н.Г., 1977).

Микробиологи рассматривают микробные токсины как продукты жизнедеятельности бактериальных клеток и различают три их группы. В первую входят продукты, вырабатываемые в процессе жизнедеятельности микроба. Эту группу принято называть секретируемыми, или растворимыми, микробными экзотоксинами. Ко второй группе относят токсические продукты, прочно связанные со стромой микробной клетки и переходящие в культуральный фильтрат только после гибели микробной популяции при аутолизе. Для обозначения микробов такого типа обычно используют термин «экзотоксин». Токсические вещества, непрочно связанные со стромой микробной клетки и в определенной степени диффундирующие в среду культивирования, обозначают как микробные мезотоксины (Sack R. е.а., 1977).

Кроме вышеперечисленных продуктов метаболизма микробов, экспрессируемых в культуральную жидкость или микроокружение (кровь, лимфу, органы и ткани организма), к ним относятся высокоактивные реакционно способные функциональные молекулы-ферменты, осуществляющие биологический катализ субстратов (Готтшалк Г., 1982; Зенгбуш П., 1982). Клетки микробов (как и других организмов) образуют множество ферментов, которые связаны с мембранами, осуществляющими важнейшие биохимические процессы дыхания и окислительного фосфорилирования, синтез и катаболизм (Srere P.A., 1975).

В настоящее время многие ферменты получают в чистом виде для медицинских и ветеринарных целей (Блинов Н.П., 1989). Для примера можно привести 32 наименования ферментов, полученных в 1972 г. американской биохимической компанией при помощи микроорганизмов 25 разных видов. Сугубо приближенные сведения об объеме производства ферментов в США составили свыше 80 млн. долларов, из них 6 млн. приходится на энзимы, используемые в медицине, 25 млн. - на энзимы для пищевой промышленности, 35 млн. - на ферменты, включающие моющие средства (Калунянц К.А., 1972).

В СССР с помощью микроорганизмов вырабатывалось в год в среднем свыше 10 наименований энзимов (амилоризины, аминосубтилин, мальт