Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование радиозащитной эффективности цитокинов и механизмов ее реализации

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Исследование радиозащитной эффективности цитокинов и механизмов ее реализации"

' .л- ' '•!/

о З^Ф'В ^

На правах рукописи

ВЕЛЬСКИЙ Сергей Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЕ РАДИОЗАЩИТНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЦИТОКИНОВ И МЕХАНИЗМОВ ЕЕ РЕАЛИЗАЦИИ

03.00.1Н — экология 03.00.01 —радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте военной медицины МО РФ.

\

Н а у ч н ы с р у к о н о д и т е л н:

доктор медицинских наук профессор Легеза В. И., доктор медицинских наук Антушевич А. Е.

О ф и ц и а л ь н ы е о п нонет и: доктор медицинских наук Смирнов Н. А.,

доктор медицинских наук профессор член-корр. Российской академии технологических наук Владимиров В. Г.

Ведущая организации — 1 ЦНИИ Министерства Обороны РФ.

Защита диссертации состоится 20 февраля 1997 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 106.05.01 в НИИ ВМ МО РФ (195043, Санкт-Петербург, ул. Лесопарковая, 4).

Автореферат разослан « » января 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Р. Б. ГОЛЬДИН

Акт;/.; иь Iюсть проблемы.

В ряду экологически значимых факторов ионизирующие излучения занимают особое место ц связи с тяжестью ранних и отдаленных последствий их воздействия на организм. До сих пор не исключена возможность применения в военных конфликтах ядерного оружия взрывного действия и нейтронных боеприпасов. Аварии на ЧАЭС и в хранилищах промышленных радиоактивных отходов наглядно показали, что и в мирное время могут возникать ситуации, сопряженные с массовым воздействием на личный состав Вооруженных Сил и гражданское население летальных и так называемых "малых" доз радиации.

Указанные обстоятельства на много лет вперед определяют необходимость разработки медикаментозных средств профилактики и лечения лучевых поражений, эффективных в самых различных ситуациях. Поэтому разработка медицинских средств защиты от воздействия ионизирующего излучения остается актуальной задачей, стоящей перед современной радиобиологией.

Наряду с поиском традиционных медикаментозных средств химической противорадиационной защиты, ("классических" радиопротекторов) , внимание исследователей привлекают новые подходы к повышению радиорезистентности организмаГЛегеза В.И., Абдуль Ю.А.,1993]. Как установлено в последние годы, механизмы радиозащитного действия ряда соединений могут определяться не только временным ингибированием, но и активацией некоторых биологических процессов в клетках, тканях и организма в целом [Владимиров В.Г., Красильников И.И., 1994, Рождественский Л.М., 1994]. Отбор противолучевых средств такого рода основан на поиске биологически активных веществ, повышающих общий уровень неспецифической Резистентности организма, обеспечивающих таким образом защиту и

скорейшее восстановление костномозгового кроветворения при радиационных поражениях. Это предопределяет перспективность разработки препаратов, способствующих защите и восстановлению гемоим-мунопоэза при облучении.

Один из классов биологически активных веществ, привлекающих внимание исследователей в этом плане, представлен гемопоэтина-ми(цитокинами):гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирую-щим фактором(ГМ-КСФ), интерлейкинами-1,2(ИЛ-1,ИЛ-2), интерферо-нами(ИНФ) и т.д. Известно, что цитокины являются полипептидами, продуцируемыми различными типами клеток и регулирующими рост, дифференцировку и функциональную активность !слеток[Вядро М.М., Навашин С.М., 1989]. Их нередко называют клеточными гормонами.

Показана радиозащитная эффективность некоторых из этих веществ при остром облучении[Бойко В.Н., Легеза В.И., Антушевич А.Е., Чигарева Н.Г. и др., 1995, Рогачева С.А., Симбирцев A.C., Муксинова К.Н. и др., 1994, 1995, Neta R., Douches S., Oppenhelm J.J., 1986,1989]. В то же время установлено, что далеко не все цитокины в равной мере защищают животных от радиации[Бойко В.Н., Жолус Р.Б., Петров A.C.,' 1993, Neta R., Vogel S.N., Oppenheim J.J., Douches D., 1986, 1988]. Противоречивы и окончательно не определены показания к их применению в качестве иротиволучевых средств(оптимальные дозы, сроки применения, виды поражения и т.д.),' явно недостаточны представления о механизмах реализации радиозащитного действия цитокинов. Все эти вопросы и обусловили актуальность настоящей работы, посвященной экспериментальному обоснованию показаний к использованию цитокинов в качестве средств профилактики лучевых поражений.

Цель и основные задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось исследование радиозащитной эффективности цитокинов при различных условиях облучения и механизмов реализации их противолучевого действия.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи:

- исследовать влияние препаратов на основе цитокинов на выживаемость животных при облучении с различной мощностью дозы;

- оценить влияние цитокинов на пострадиационные изменения кроветворения и иммунитета у облученных животных;

-- уточнить характер индуцированных цитокинами сдвигов в системе гемопоэза, обусловливающих повышение радиорезистентности организма.

Научная новизна исследования.

В работе показана способность цитокинов из группы интерлейкинов (ИЛ- 1, 2, ТНФ , лимфокинин) повышать радиорезистентность организма при облучении с различной мощностью дозы. Установлено, что комплекс интерлейкинов(лимфокинин) обладает радиозащитным действием как при остром, так и при пролонгированном лучевом поражении в широком диапазоне доз. Получены новые данные о механизмах реализации радиозащитного действия интерлейкинов, включающих способность стимулировать пролиферативную и миграционную активность- стволовых кроветворных клеток, ускорять восстановление кроветворения, оказывать нормализующее действие на иммунный статус организма после облучения, активизировать биосинтетические процессы, увеличивать скорость дифференцировки гемопоэтичес-ких клеток.

Практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований уточнены сроки применения и дозы цитокинов, оптимгшьныс для проявления их радиозащитного эффекта при различных вариантах лучевого воздействия. Определены наиболее эффективные в качестве радиозащитных средств цитокины из группы интерлейкинов. Уточнены показания к применению цитокинов при лучевой патологии - защита от сублетальных и среднелетальных доз облучения и воздействия ионизирующих излучений с различной мощностью дозы.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Цитокины из группы интерлейкинов оказывают радиозащитное действие при облучении с различной мощностью дозы и, главным образом, в диапазоне доз облучения ЬБ50/30 - Ь085/30.

2. Противолучевое действие цитокинов связано с их способностью стимулировать пролиферативную и миграционную активность стволовых кроветворных клеток, ускорять восстановление кроветворения, иммунного статуса организма после облучения, активизировать биосинтетические процессы, увеличивать скорость дифференци-ровки гемопоэтических клеток.

Апробация и реализация результатов работы.

Результаты работы доложены на научных конференциях в НИИ военной медицины ( Санкт-Петербург,1996) и в ВМедА ( Санкт-Петербург, 1995), а также на Всероссийской конференции " Гистогенез и регенерация тканей" (Санкт-Петербург, 1995) и Всеармейской конференции "Актуальные вопросы гематологии"(Санкт-Петербург, 1995). В целом диссертация апробирована на Научном совещании 1 НИУ НИИ военной медицины. Материалы диссертации нашли отражение в 4 научных публикациях. Отдельные фрагменты работы вошли в состав к.-х отчетов по плановым темам НИР.

Структура и обьем работы.

Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, имеет традиционную структуру и содержит 15 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 140 источников (97 отечественных и 43 зарубежных).

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Общая характеристика экспериментального материала.

Опыты проведены на 1300 беспородных и 200 линейных (линия СВА) мышах-самцах с массой тела 18-22г.. Животных получали из центрального питомника АМН РФ "Рапполово". Перед опытом мыши находились под наблюдением в течение 7-10 сут. Животных содержали в условиях обычного режима вивария на стандартном пищевом рационе по 15-20 мышей в клетке.

Животных подвергали однократному гамма-облучению на установке ИГУР-1 при мощности дозы 1.5 Гр/мин.(5,25; 6,0; 6,75; 7,5Гр), а также на установке ЦЭГО с мощностью дозы 0,02Гр/мин. (7,5; 8,25; 8,75Гр).

В ходе исследования оценивали радиозащитную эффективность цитокинов 3-х основных групп: группы интерферонов - препараты лейкоцитарного интерферона(интерлок, лейкинферон), группы интер-лейкинов (ШЫЬ, ИЛ-2, ТНФ) и комплексный препарат цитокинов -лимфокинин, который представляет смесь интерлейкинов(ИЛ-2,1,6 и ТНФ). Все препараты, растворенные в 0,2 мл физ.р-ра, вводили за 24ч или 1ч до облучения внутрибрюшинно в следующих дозировках: ТНФ - Змкг/кг, ИЛ-1Ь - 1мкг/кг, ИЛ-2 - 500Ед/мышь, лимфокинин -ЮООЕД/мышь, интерлок - 250ЕД/мыгаь, лейкинферон - 500ЕД/мышь. Животным контрольных групп вводили 0,2 мл физ.р-ра. Оптимальные дозировки и время введения были установлены в предварительных

гъМ

экспериментах.

В качестве "классических" радиопротекторов для сравнительного анализа использованы - цистамин( 225 мг/кг (по соли) за 20 мин до облучения, внутрибрюшинно) и - индралин( 25 мг/кг за 15 мин до облучения, энтерально).

Наблюдение за животными осуществляли в течение ЗО-сут после радиационного воздействия. Учитывали выживаемость подопытных животных, оценивали состояние гемопоэза, иммунной системы, активность некоторых ферментов в гемопоэтических клетках селезенки.

Общая схема экспериментов и характеристика опытов представлены в таблицах 1 и 2.

Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента.

Таблица 1

Схема исследования радиозащитного действия препаратов цитокинового ряда и "классических" радиопротекторов при различных условиях облучения

Опыт Препарат Введение препарата (до облучения) Облучение Доза/Мощ-сть Гр/(Гр/мин)

1. (ИЛ-1Ь, лк.ида, рИЛ-2,ТНФ) 24ч 1ч 6,0Гр/ (1,5Гр/мин)

2. Лимфокинин Цистамин Индралин 24ч ,1ч 20мин 15мин 5,25;6,0 6,75;7,5 Гр/ (1,5 Гр/мин)

3. Лимфокинин Цистамин Индралин 24ч ,1ч 20мин 15мин 7,5; 8,25 8,75Гр/ (0,02Гр/мин)

Схема оценки отдельных компонентов гемопоэза, иммуногенеза и функционально-метаболической активности гемо-поэтических клеток облученных животных при изучении радиозащитного действия цитокинов

Цель исследования

Исследуемые показатели

Методы исследования

Сроки после возд-я

Изучение этапов гемопоэза и иммуногенеза

Состояние стволового пула и свойств СКК

Исследование числа

миелокариоцитов

Состояние клеток лейкоцитарного ряда

Оценка функцио-нально-метабо-лической активности клеток иммунной системы и гемопоэза

СТВОЛОВОЙ ПУЛ:

Количество

стволовых

кроветворных

клеток(СКК)

Пролиферативная активность СКК

Миграция СКК из костного мозга

ПРОЛИФЕРИРУЮЩИЙ И СОВРЕВАВДИЙ ПУЛ

Число миелокариоцитов

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПУЛ

Число лейкоцитов в периферической крови

Выявление структурных изменений селезенки

Оценка иммунного ответа по числу АОК в селезенке

Определение активности оксидоредуктаз и концентрации рибонуклеопро-теидов в гемо-поэтических клетках

Методы эндо- и экзогенного колониеобразова-ния

Till и McCulloch

Динамика нараста ния КОЕс

Подсчет ЯСК в бедренной кости

Метод подсчета в камере

Окраска мазков по Романовскому-Гимза

Метод окраски гематоксилин-эозином парафиновых срезов Метод локального гемолиза в геле агарозы по (Ерне)

Тетразолиевый метод по(ПирсЭ.)

Реакция с галло-цианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону.

0,9 8,12 сут.

7,9,11-сут.

О,1,3,£ 12,20-сут.

0,1,3,£ 12,20-сут.

1,3,7-сут.

0,5-сут.

1,3,7-сут.

N

1

2

г*

2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Влияние цитокинов на выживаемость облученных животных.

Сравнительное изучение радиозащитной эффективности различных цитокинов (ТНФ, ИЛ-1Ь, ИЛ-2, лимфокшшн, лейкинферон, интер-лок) проведено при облучении мышей в дозе 6,0 Гр (Ю70/30) с мощностью дозы 1,5 Гр/мин. Среди изученных препаратов наибольшей противолучевой активностью при избранной модели облучения обладали цитокины из группы интерлейкинов - ИЛ-1Ь, ИЛ-2, ТНФ и особенно комплексный препарат интерлейкинов лимфокинин(табл.3). Эти препараты при их профилактическом применении повышали выживаемость животных на 30-45%, тогда как препараты интерферонов при аналогичных условиях не обладали значимым противолучевым действием. Наибольшая радиозащитная эффективность у препаратов при профилактическом применении наблюдалась при их введении за 24ч до радиационного воздействия, что согласуется с данными литературы [Бойко В.Н., Шадрин О.В., Деревянченко И.Г и др.,1994]. При введении препаратов за 1ч до облучения их радиозащитная эффективность снижалась.

С целью дальнейшего уточнения показаний к применению цитокинов в качестве радиозащитных средств на втором этапе исследования была осуществлена сравнительная оценка противолучевых свойств наиболее эффективного из цитокинов(лимфокинина) и табельных радиопротекторов - цистамина и индралина при облучении в широком диапазоне доз при различной мощности дозы.

Оказалось, что в условиях острого облучения животных в дозах ЛД50-85/30 радиозащитное действие лимфокинина было сопоставимо с "классическими" радиопротекторами(цистамином и индрали-ном). При облучении в минимальной абсолютно летальной дозе отчетливо проявлялось преимущество серосодержащих и сосудосуживаю-

Таблица 3

Влияние цитокинов на выживаемость мышей при облучении в дозе 6,ОГр(мощность дозы 1,5Гр/мин)

Группа опытов Доза препарата Время введения до обл.,ч Выживаемость, %

Контроль Физ.р-р — - 30+5,0

ТНФ Змкг/кг Змкг/кг 24 1 60+7,5 * 50+6,0 *

ИЛ-1Ь 1МКГ/КГ 1МКГ/КГ 24 1 55+6,5 * 45+5,5

ИЛ-2 500ЕД/М 500ЕД/М 24 1 55+7,0 * 30+5,5

Лимфоки-нин ЮООЕд/м ЮООЕд/м 24 1 70+6,0 * 60+6,5 *

Интерлок 250Ед/м 250Ед/м 24 1 40+8,5 30+7,0

Лейкинфе рон 500Ед/м 500Ед/м 24 1 40+8,0 25+7,0

* - различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,05

Таблица 4

Влияние лимфокинина, цистамина и индралина на выживаемость мышей при выеокомощностном облучении (1,5 Гр/мин)

Группы опытов Время введ-я до обл Выживаемость(%)при облучении в различных дозах

5,25Гр 6, ОГр б,75Гр 7, 5Гр

Контроль — 50+4,5 30+6,0 15+4,5 0

Цистамин 20МИН 70+10,0 * 70+7,0 * 65+9,0 * 55+9,0 а

Индралин 15мин 60+11,0 50+11,0 * 40+11,0 а 40+11,0 а

Лимфоки-нин 24 ч 1ч 80+9,0 * 70+7,0 * 70110.0 а 60+6,5 * 60+11,0 -а 50+7,0 а 10+6,5 * 15+7,5 а

* - различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,05

1дих препаратов перед лимфокинином. Если последний защищал лишь 10-15 % животных, то "классические" радиопротекторы -40-55%(таб.4).

Наиболее отчетливо преимущество цитокинов перед табельными радиопротекторами проявлялось при низкомощностном облучении. Известно, что при снижении мощности дозы облучения радиозащитная эффективность "классических" радиопротекторов снижается СКорыт-ный B.C., Толстых Е.И., 1993]. Введение лимфокинина мышам, подвергнутым воздействию ионизирующего излучения с мощностью дозы 0,02 Гр/мин в диапазоне доз от LD60/30 до LD80/30, повышало выживаемость животных по сравнению с контрольными в среднем на 30%, тогда как "классические" радиопротекторы в этих условиях не оказывали радиозащитного действия(табл.5).

Таблица 5

Влияние лимфокинина, цистамина и индралина на выживаемость беспородных мышей при низкомощностном облучении (0,02Гр/мин)

Группы опытов Время введ-я до об л Выживаемость,(%)

7,5Гр 8,25Гр 8,75Гр

Контроль — 42+6,5 33+7,5 20+5,5

Цистамин 20мин 50+7,5 20+5,0 15+5,5

Индралин 15мин 50+9,0 35+8,5 20+8,5

Лимфокинин 24ч 1ч 73+8,0 * 60+6,0 * 63+8,5 * 55+7,5 * 52+6,5 * 35+7,0

* - различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,05

Таким образом, в отличие от "классических" радиопротекто-ров(цистамин, индралин), препараты цитокиновой группы и в частности лимфокинин проявляют радиозащитную эффективность как при остром, так и при пролонгированном облучении. Применение лимфокинина оказалось -наиболее эффективным в диапазоне доз Ш50-85/30 высоко- и низкомощностного облучения.

2.2. Влияние лимфокинипа на пострадиационные нарушения системы кроветворения и иммуногенеза.

Лимфокинин в условиях профилактического введения существенно модифицировал динамику постлучевого панцитопенического синдрома.

Как видно из таблицы 6, введение цитокина за 24ч до воздействия радиации в дозе ЬБ70/30 не оказывало влияния на темп развития лейкопении после облучения на 1-е сут., однако в дальнейшем существенно замедляло процесс снижения числа лейкоцитов. Так, на 3-й сут. после облучения у мышей опытной группы число лейкоцитов в крови сохранялось на значительно более высоком уровне. Если в контроле число лейкоцитов снизилось до 0,3*Ю9/л, то у животных, которым профилактически вводили цитокин, оно было два раза выше - 0,7*109/л.

Начало процесса восстановления числа лейкоцитов в "опытной группе" отмечалось уже к 8 сут после облучения, тогда как в контроле - лишь на 12 сут. В итоге к этому сроку количество лейкоцитов у мышей, которым вводили цитокин, было в 2 раза выше, чем у нелеченых животных. Таким образом, под влиянием лимфокинипа не только замедлялось развитие лейкопении, но и существенно ускорялся темп восстановления количества лейкоцитов в периферической крови. Указанные эффекты цитокина были обусловлены, главным образом, его влиянием на гранулоцитарньш росток гемопоэза.

Лимфокинин способствовал также более быстрому восстановлению содержания миелокариоцитов, уменьшал степень опустошения костного мезга в разгаре заболевания, т.е. повышал радиорезистентность популяции костномозговых клеток(табл.7).

Влияние лимфокинина на количество лейкоцитов(гранулоцитов, лимфоцитов и моноцитов) в периферической крови у мышей, облученных в дозе 6,0Гр(Ь070/30) (мощность дозы 1,5 Гр/мин)

Показатель *10э/л Группы опытов До облучения После облучения, сут.

1 3 8 12 20

Лейкоциты Контроль Препарат 7,8+0,7 1,2+0,2 0,3+0,1 0,4+0,05 0,7+0,1 7,4+0,3 1,1+0,1 0,7+0,1* 1,2+0,2* 1,6+0,2* 7,6+0,3

Гранулоци- тарные леикоциты Контроль Препарат 4,3+0,8 0,7+0,1 0,1+0,01 0,1+0,02 0,25+0,02 4,2+0,4 0,6+0,1 0,6+0,1* 0,7+0,2* 0,9+0,2* 4,5+0,4

."лмфоциты ' моноциты Контроль Препарат 2,9+0,5 0,2+0,02 0,1+0,02 0,15+0,02 0,4+0,05 2,5+0,3 0,1+0,01 0,1+0,01 0,4+0,05* 0,6+0,05* 2,8+0,4

различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,05

Влияние лимфокинина на количество миелокариоцитов в бедренной кости мышей СБА, облученных в дозе 6,ОГр(Ш70/30) (мощность дозы 1,5 Гр/мин)

Группы опытов Количество миелокариоцитов в бедренной кости *10б/бедро

До облучения После облучения, сут.

1 3 8 12 ' 20

Контроль 20,0+0,5 6,2+0,4 2,0+0,2 3,3+0,6 4,5+0,5 18,6+0,6

Лимфокинин 6,0+0,4 2,4+0,2 6,8+0,5* 8,9+0,6а 18,0+0,7 |

* - различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,05

Лимфокинин способствовал увеличению количества эндогенных

колоний в селезенке облученных животных (табл.8). Причем увеличение количества эндогенных КОЕ при применении лимфокинина наблюдалось в диапазоне доз [1)50-85/30. Данные по изменению количества эндогенных колоний коррелировали с выживаемостью животных, облученных в тех же дозах. Это подтверждает положение, что стволовые кроветворные клетки являются детерминантой выживаемости организма в диапазоне доз облучения, вызывающих костномозговую форму ОЛБ [Бонд В., 1974, Горизонтов П.Д., 1983, Коноплянни-ков А.Г., 1984].

Таблица 8

Влияние лимфокинина на количество эндогенных КОЕ-с у мышей, облученных в различных дозах

Группы опытов Доза облучения, Гр

5,25 6,0 6,75 7,5

Контроль 12,3+1,2 6,5+0,7 3,6+0,5 2,5+0,3

Лимфокинин 20,3+1,6* 14,5+0,8* 6,8+0,6* 3,0+0,3

* - различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,05 Лимфокинин усиливал пролиферацию стволовых кроветворных

клеток. При исследовании влияния лимфокинина на количество экзогенных КиЕ на 8 и 12 сут после облучения оказалось, что цитокин

увеличивал количество экзогенных КОЕ в бедренной кости в 1,5 и 2,0 раза по сравнению с контролем(табл.9). Ускорение пролиферации и дифференцировки СКК под влиянием лимфокинина подтверждается и увеличением прироста числа эндогенных колоний в селезенке в период 7-9 сут(табл.10).

Приведенные данные свидетельствуют, что лимфокинин оказывает влияние не только на функциональный и созревающий пулы гемо-поэза, но и модифицирует процессы в стволовом пуле кроветворения. Препарат способствует как большей сохранности указанной клеточной популяции, так и увеличению ее количественного состава, что в свою очередь приводит к повышению численности очагов кроветворения и более быстрому восстановлению гемопоэза в целом.

Таблица 9

Влияние лифокинина на количество экзогенных КОЕ-с у мышей СБА после облучения в дозе 6,0Гр(Щ70/30)

Группы Кол-во Время пос- Количество

опытов животных ле облуче- КОЕ-с в

ния, сут. бедр.кости

Контроль

необлученные 15 - 4330+110

Контроль 7 8 98,2+20,5 *

(облучение)

10 12 405,5+40,5 *

Лимфокинин 9 8 150,3+36,6 *

10 12 761,0+97,2 **

* - различия достоверны по сравнению с контролем необлученных особей, р<0,05

** - различия достоверны по сравнению с контролем облученных особей, р<0,05

Это возможно за счет увеличения миграционных свойств ранних ге-мопоэтических предшественников, усиления пролиферативных свойств СКК и фиксирующих свойств стромы кроветворных органов. Указанное предположение подтверждается результатами экспериментов по исследованию влиянии лимфокинина на динамику изменения количества эндо- и экзо-КОЕ после облучения.

Таблица 10

Влияние лимфокинина на динамику прироста количества эндогенных КОЕ-с мышей СБА, облученных в дозе 6,0Гр(Ц)70/30)

Группа опытов Количество КОЕ-с после облучения, сут

7 9 11

Контроль (облучение) 2,7+0,5 (25) 6,5+0,7 (22) 13,2+0,7 (12)

Лимфокинин 5,9+0,6* (22) 14,5+0,8* (Т8) 21,5+0,8* (10)

* - различия достоверны по сравнению с контролем, р<0,05 в скобках - количество животных

Лимфокинин в условиях острого поражения иммунной системы, вызванного ионизирующим излучением, значительно ослаблял угнетение антителообразования. Как видно из табл.11, предварительная инъекция лимфокинина облученным мышам способствовала снижению тяжести постлучевого поражения иммунной системы , что выразилось в трех-четырехкратном увеличении количества АОК по сравнению с облученным контролем. Очевидно,что лимфокинин, также, как и другие препараты цитокинов способен активизировать защитно-компенсаторные реакции, направленные на нормализацию функции иммунной системы облученных животных.

Принимая во внимание результаты, полученные при исследовании влияния лимфокинина на колониеобразующую способность клеток костного мозга, можно предположить, что увеличение количества АОК у облученных животных также связано со стимулирующим влиянием цитокина на пул стволовых кроветворных клеток. Поскольку известно, что стволовые кроветворные клетки-предшественники становятся на путь иммунопозза под влиянием стимулированных антигеном лимфоцитов [Каулен Д. Р.. Санин А.В., 1982, Козлов В.А., Журавкин И.Н., 1982, Петров Р.В., 1986], можно предположить возможность

целенаправленного воздействия интерлейкинов на дифференцировку стволовых полипотентных клеток.

Таблица 11

Влияние лимфокинина на выход антителообразующих клеток(АОК) в селезенке на 5 сут после облучения мышей в дозе 6,0Гр.

Группы опытов Кол-во животных Вес селезенки, (мг) АОК на селезенку АОК на 10Б ЯСК селезенки

Контроль необлученные 10 108,0+7,3 12800+1600 107,1+10,3

Контроль облучение 26 39,0+2,7 * 1791+351 * 14,0+1,7 *

Лимфокинин 15 47,5+2,5 * ** 6052+750 * ** 44,5+4,6 * **

* - различия достоверны по сравнению с необлученным контролем,

р<0,05

** - различия достоверны по сравнению с контролем облучения, р<0,05

Таким образом, приведенные в настоящем разделе данные свидетельствуют, что под влиянием лимфокинина усиливается миграционная и пролиферативная активность стволовых кроветворных клеток, ускоряется восстановление костного мозга и в последующем клеток функционального пула кроветворения.

2.3. Влияние лимфокинина на структурные и гистохимические изменения селезенки, вызванные облучением.

Для более углубленного изучения механизмов реализации радиозащитного действия лимфокинина было исследовано его влияние на метаболические процессы в дифференцирующихся клетках колоний и стромы селезенки с учетом их тканевого взаимодействия в постлучевой период.

Как показали проведенные исследования, к 3 сут после облучения плотность клеточной инфильтрации фолликулов селезенки мышей, которым вводили препарат, была несколько большей, чем в контроле, а к 7 сут у них наблюдался процесс активного колони-

еобразования и дифференцировки клеток. Выявленные различия коррелировали с показателями клеточного состава периферической крови и клеточности костного мозга.

Наличие на 7 сут после облучения высокодисперсных колоний в селезенке животных, получавших лимфокинин, свидетельствует о наличии у препарата цитопротективного действия. Появление же пара-вазальных колоний является морфологическим эквивалентом повышения миграционной активности кроветворных клеток при применении цитокинов. Эти данные подтверждаются результатами экзо- и эндогенного колониеобразования.

Важное значение в механизмах вызываемого цитокинами состояния радиорезистентности может иметь выявленная активация Г-6-ФДГ (табл.12), свидетельствующая о повышении интенсивности окисления глюкозы в пентозофосфатном цикле и, следовательно о стимуляции биосинтетических процессов, в частности, синтеза макроэргов, нуклеотидов, белков и др. Известно, что пентозный цикл является необходимым фактором регенерации тканей, а также способствует осуществлению других восстановительных синтезов, повреждаемых при облучении ШонкаИ.К., Поспишил Я.В., 1970]. Согласно полученным нами данным цитометрии рибонуклеопротеидов, их концентрация в цитоплазме клеток при применении лимфокинина была достоверно выше, чем у животных контрольных групп(табл.13). Следовательно, активацию Г-6-ФДГ можно расценивать как проявление компенсаторных процессов, активируемых препаратом. Содержание рибонуклеопротеидов в клетках является важным показателем состояния компенсаторно-приспособительных реакций. По мнению Меерсона (1981г) анализ каждого из звеньев цепи ДНК-РНК-белок необходим для оценки степени "надежности" адаптации. Армирования ее структурного следа.

Таблица 12

Влияние лимфокинина на активность дегидрогеназ в клетках колоний лимфоидных фолликулов селезенки мышей, облученных в дозе 6,0 Гр (7 сут после облучения)

Группы опытов Активность фермента, усл. ед.

лдг сдг Г-6-ФДГ

Виоконтроль 0,483+0,051 0,610+0,071 0,518+0,064

Контроль облучения 0,843+0,114 * 0,232+0,039 * 0,281+0,039 *

Лимфокинин 0,652+0,081 0,597+0,094** * 0,714+0,049**

* - различия достоверны по сравнению с биоконтролем, р<0,05 ** - то же по сравнению с контролем облучения, р<0,05

Таблица 13

Влияние лимфокинина на концентрацию рибонуклеопротеидов в цитоплазме клеток колоний селезенки мышей, облученных в дозе 6,0 Гр

Группы опытов Содержание РНП (усл.ед.) после облучения, сут.

3 7

Контроль облучения 0,214+0,017* 0,271+0,019*

Лимфокинин 0,234+0,024* 0,679+0,015* **

* - различия достоверны по сравнению с биоконтролем, р<0,05

** - то же по сравнению с контролем облучения, р<0,05 Содержание РНП в биоконтроле 0,484+0,031 усл.ед.

Показано, что интерлейкины имеют свои мембранные рецепторы, активация которых опосредует процессы биосинтеза белков и экспрессии определенных генов [Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 1992]. Возможно, именно этот механизм лежит в основе их цитопро-тективного действия.

Таким образом, при гистологическом и гистохимическом исследовании селезенки выявлено положительное влияние лимфокинина на восстановление процесса кроветворения после острого облучения. Полученные результаты позволяют предположить существование эффектов интерлейкинов, проявляющихся на метаболическом уровне и приводящих к активации защитных механизмов клеток и ускорению их дифференцировки.

2.4. Влияние лимфокинина на состояние гемо- и иммунопоэза необлученных животных.

Для расшифровки механизмов формирования радиорезистентного состояния под влиянием лимфокинина была проведена количественная и качественная оценка изменений, происходящих с гемопоэтическими клетками-предшественниками, а также с состоянием количества мие-локариоцитов и лейкоцитов в крови спустя 1 сут после введения препарата, т.е. в сроки когда формировался эндогенный фон повышенной радиоустойчивости.

Как показали эксперименты, число лейкоцитов в периферической крови через 1 сут после введения лимфокинина было на 20% выше, чем у животных которым препарат не вводили(табл.14). Это повышение происходило главным образом за счет нейтрофильных грану-лоцитов. По-видимому, данное свойство препарата связано с наличием в его составе таких цитокинов , как-ИЛ-1,6, ФИО, поскольку известно, что в механизме нейтрофилеза , индуцированного ИЛ-1 и

ФИО, основную роль играют факторы, способствующие увеличению популяции нейтрофилов за счет усиления размножения клеток предшественников [Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., Воробьев A.A., 1992]. Наиболее эффективными в этом отношении являются колониес-тимулирующие факторы, поддерживающие рост гранулоцитарных и гра-нулоцитарно-макрофагальных колоний. Имеются убедительные доказательства, что ИЛ-11 и Ь, ФНО-1 и Ь, ИЛ-б являются индукторами синтеза ГМ-КСФ и Г-КСФ [Broudy V.C., Kaushansky К., 1987, Broudy V.С., Kaushansky К., 1986, Neta R., Oppenheim J.J., 1988]. Преимущество применения интерлейкинов по сравнению с колониестимулм-рующими факторами состоит в том, что их введение вызывает индукцию ГМ-КСФ, сохраняющуюся в течении длительного времени, тогда как однократное введение КСФ , в связи с незначительным временем сохранения его в сыворотке крови, не приводит к ожидаемым результатам [Manori I., Kushilevsky А., 1986].

Нельзя исключить и другие механизмы нейтрофилеза, которые связаны с выбросом в кровоток зрелых клеток из костного мозга или других источников(селезенка, печень и т.д.). Это предположение подтверждается данными, полученными при исследовании количества миелокариоцитов в костном мозге животных, которым вводили лимфокинин(табл.14). Под влиянием цитокина число миелокариоцитов уменьшалось, что может быть связано с выбросом в кровь резервного пула созревающих гранулоцитов. Способность повышать количество лейкоцитов в периферической крови присуща многим соединениям, повышающим неспецифическую резистентность организма: продигиоза-ну, пирогеналу, декстран-сульфату, и др. [Плапельес Х.Х. 1978, Ross W.M., Martes A.S., van Bekkum D.N., 1982]. Предполагается, что под влиянием этих соединений происходит временное усиление мобилизации лейкоцитов из кроветворных органов и как следствие

со::,;;л'-тся повышенный "клеточный Фон" к моменту лучевого воздействия. Кроме того, повышение миграционной способности лейкоцитов и других гемопоэтических клеток приводит к тому, что большее количество клеток находится в процессе циркуляции и во взаимодействии с другими органами и тканями Шатт Х.М. , Малони М.А. 1988].

Лимфокинин существенно модифицировал содержание экзогенных КОЕ у необлученных животных. Спустя 1сут после его введения в костном мозге накапливалось на 18% КОЕ меньше, чем у контрольных животных, тогда как в селезенке наблюдалась противоположная картина - число КОЕ в этом органе увеличилось на 20% по сравнению с контролем(табл.14). Указанное явление может быть обусловлено усилением миграционных свойств СКК и их перераспределением между костным мозгом , селезенкой и циркулирующим пулом.

Табица 14

Вшние т(оинш на изиенеш немтори гелашошрсш « шушотесш пошатеш г »«ей СБА

Групп» 1о«-во 101-80 |од-во Юл-во 1о>-во 101-80 АО! на

остов «ей1-гов гранцо- Ш|-Т0В !0Е-с в [01-с в 1С! в бед. селеэету

«103/1 ЦКТОВ ион-тов бедренной сел-1е кости

*109/л <109/1 10СТК »106/бедро

1онгр. ?,84.0,7 4,310,8 2,910,5 43301110 638142 20.0Ю,5 12800Ц600

Л! 9,910,6» 7,110,7* 2,710,4 3573Ц601 656145» И, 619,6* 1940011500»

I - различи! достоверны по сравнен«« с ювтрсиев, р(0,05

Однако полностью объяснить количественные изменения содержания КОЕ в костном мозге необлученных мышей только усилением миграции не представляется возможным. Значительную роль в этом процессе могут играть изменения дифференцировки, пролиферации, фиксирующих свойств стромы селезенки, состояния гемопоэзиндуци-рующего микроокружения и изменения фаз ¡щеточного цикла в пуле СКК и ранних гемопоэтических предшественников [Владимиров В.Г.,

Пожарисская Т.Д., Смирнова С.М., 1991, Коноплянников А.Г., 19843. Известно, например что полинуклеотиды могут увеличивать фиксирующие свойства стромы селезенки [Коноплянников А.Г.,Коноп-лянникова O.A., Семина О.В., 1974]. Наконец, принимая во внимание, что методом экзогенного колониеобразования регистрируются стволовые кроветворные клетки, находящиеся в состоянии покоя [Переверзев А.Е., 1986], можно предположить, что цитокины изменяют клеточный цикл стволовых кроветворных ¡теток, способствуя их накоплению в фазе Go. Последнее обстоятельство обеспечивает высокую резистентность данной клеточной популяции [Коноплянников А.Г., 1984, Ярмоненко С.П. 1988]. В настоящее время считается, что восстановление гемопозза после облучения, особенно в сублетальных дозах, связано со вступлением в деление значительного числа СКК, находившихся в момент лучевого воздействия в бо-фазе клеточного цикла [Коноплянников А.Г., 1984, Мурашов Б.П., Королев В.И., 1993].

В целом результаты исследования свидетельствуют о том, что под влиянием лимфокинина происходят количественные и качественные изменения в различных пулах кроветворения(стволовом, проли-ферирующем, созревающем и функциональном), заключающиеся прежде всего в запуске покоящихся стволовых клеток кроветворной системы в цикл пролиферации и временном увеличении размеров их пула. При этом '.вследствие изменения величины пула стволовых клеток, динамики их пролиферации, направления дифференцировки, интенсивности циркуляции стволовых клеток и клеток предшественников, эффективности реколонизации опустошенных участков и т.д., модифицируются многие стандартные реакции гемопоэза и иммуногенеза на воздействие ионизирующего излучения . что сопровождается повышением радиорезистентности организма в целом.

ВЫВОДЫ

1. Цитокины интерлейкинового ряда( ИЛ-1, ИЛ-2, ТНФ и лимфокинин) при профилактическом применении за 24ч до облучения повышают выживаемость мышей, подвергнутых острому облучению в Ц)70/30, на 30-45%. Наиболее эффективным среди изученных препаратов является лимфокинин.

2. В условиях острого облучения мышей в 11)50-85/30 лимфокинин в оптимальные для проявления радиозащитного эффекта сроки по выраженности противолучевого действия не уступает "классическим" радиопротекторам цистамину и индралину, а при протяженном облучении существенно их превосходит.

3. Профилактическое введение лимфокинина уменьшает выраженность постлучевой лейкопении, существенно ускоряет темп восстановления числа лейкоцитов в крови и миелокариоцитов. Лимфокинин стимулирует колониеобразующую способность клеток костного мозга облученных животных, снижает повреждающее действие радиации на выход антителообразующих клеток в селезенке.

4. При морфологическом и гистохимическом исследовании установлено, что лимфокинин проявляет свое радиозащитное действие на метаболическом уровне , воздействуя на процессы, приводящие к активации защитных механизмов гемопоэтических клеток и ускорению их дифференцировки.

fi. Лимфокинин спустя 24ч после его введения иеоблученным животным вызывает повышение миграционной и пролиферативной активности ранних гемопоэтических предшественников, повышает величину пула стволовых клеток, увеличивает скорость и изменяет направление их дифференцировки, усиливает интенсивность циркуляции стволовых клеток и эффективность реколонизации опустошенных участков кроветворения и т.д. Указанные изменения могут способствовать реализации радиозащитного действия лимфокинина.

Список работ , опубликованных по теме диссертации

1. Методы оценки эффективности радиопротекторов // В сборнике тезисов " Актуальные проблемы медицинских средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава вооруженных сил", 1994. - С. 12 - 13.( Соавт. Бойко В.Н., Смирнова С.М., Жолус Р.В.)

2. Влияние цитокинов на гемопоэз облученного организма // " Гистогенез и регенерация тканей":Материалы конф., Санкт-Петербург: 1995 г. - С.56.( Соавт. Чепур C.B., Антушевич А.Е., Бойко В.Н.)

3. Влияние комплекса цитокинов на стволовой пул кроветворения облученного организма// Актуальные проблемы гематологии¡Материалы конф., ВМедА, 1995 г. - С. 111. ( Соавт. Антушевич А.Е., Бойко В.Н.)

4. Влияние комплекса цитокинов на иммунную систему облученного организма // в сб.: "Чернобыль - 10 лет спустя", материалы научно-практической конференции Северо-Западного региона России, 24-25 апреля 1996 г.- СПб.: СПбГПМА, 1996,- с.108.( Соавт. Анту-шог.ич А.Е., Леев С.П., Бойко В.Н. , Морозова И.Н.)