Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Радиобиологические эффекты модификаторов эндогенного синтеза оксида азота

ВАК РФ 03.01.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Радиобиологические эффекты модификаторов эндогенного синтеза оксида азота"

На правах рукописи

МАКАРЧУК Виктория Михайловна

РАДИОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ МОДИФИКАТОРОВ ЭНДОГЕННОГО СИНТЕЗА ОКСИДА АЗОТА

03.01.01 - радиобиология

13 ПАП 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Обнинск, 2015

005568464

005568464

Работа выполнена в Медицинском радиологическом научном центре им. А.Ф.Цыба — филиале федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный медицинский исследовательский центр им. П.А.Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации (МРНЦ им. А.Ф. Цыба-филиал ФГБУ «ФМИЦим. П.А. Герцена» Минздрава России).

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук по специальности 03.01.01 -Радиобиология Филимонова Марина Владимировна

Официальные оппоненты:

- Гераськин Станислав Алексеевич, доктор биологических наук, профессор, ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт радиологии и агроэкологии» Федерального агентства научных организаций, заведующий лабораторией радиобиологии и экотоксикологии растений;

- Гребенюк Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, Институт дополнительного профессионального образования «Экстремальная медицина» ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М.Никифорова» МЧС России, ректор Института.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение Государственный научный центр «Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И.Бурназяна» ФМБА России.

Защита состоится 23 июня 2015 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.132.01 при Медицинском радиологическом научном центре им. А.Ф.Цыба - филиале Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 249036, Калужская область, г. Обнинск, ул. Королёва, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медицинского радиологического научного центра им. А.Ф.Цыба.

Автореферат разослан « X Ь » апреля 2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Палыга Геннадий Фёдорович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Широкомасштабное использование источников ионизирующих излучений в различных областях жизнедеятельности человека сохраняет опасность лучевого поражения. В этой связи проблема фармакологической радиационной защиты приобретает всё большую актуальность. Нерешённой остаётся проблема защиты нормальных тканей у онкологических больных, получающих лучевую терапию, поскольку прогноз и качество жизни таких пациентов нередко определяются не прогрессированием опухолевого процесса, а развитием лучевых повреждений. Известно значительное число соединений, проявляющих противолучевую активность. Большинство радиопротекторов оказывают эффективное действие при применении в дозах, близких к максимально переносимым, что существенно затрудняет их использование в онкологической практике. Однако вазоактивные радиопротекторы, реализующие своё действие путём индукции циркуляторной и тканевой гипоксии, по мнению специалистов, могут быть приемлемыми для клинического применения. Детально изученное участие оксида азота (NO) в регуляции сосудистого тонуса и периферической гемодинамики позволяет рассматривать вещества, влияющие на выработку эндогенного NO, в качестве радиомодифицирующих средств. В этой связи заслуживают внимания производные изотиомочевин (ИТМ) с NOS-ингибирующим действием, среди которых выявлены соединения, обладающие вазотропной и противолучевой активностью.

Цели исследования:

Изучение радиозащитных свойств новых оригинальных ингибиторов синтаз оксида азота (NOS-ингибиторов), их фармакодинамического взаимодействия с донорами N0, другими вазоактивными и противолучевыми средствами и оценка их способности к селективной защите нормальных тканей при радиотерапии опухолей.

Задачи исследования:

1. Выделить в ряду новых М-ацил.Б-алкил-замещённых производных ИТМ с NOS-ингибирующей активностью соединения с умеренной токсичностью, перспективные для дальнейших исследований.

2. Провести первичную оценку противолучевой активности этих соединений по тесту выживаемости мелких лабораторных животных при воздействии у-излучения в летальных дозах. Выделить 1-2 наиболее перспективных соединения для детальных исследований.

3. Оценить влияние изучаемых ингибиторов NOS и фармакологических доноров NO на гемодинамику интактных нормотензивных животных.

4. Провести для наиболее перспективных соединений оценку фармакологических показателей противолучевой активности: диапазона оптимальных противолучевых доз, терапевтической широты, фактора изменения дозы.

5. Исследовать противолучевую эффективность наиболее перспективных соединений при их применении в сочетании с известными радиопротекторами различных классов.

6. Исследовать противолучевую эффективность наиболее перспективных соединений при их применении в сочетании с фармакологическими донорами оксида азота.

7.Изучить на моделях лучевой терапии саркомы М-1 влияние наиболее перспективных соединений на опухолевый рост, противоопухолевую эффективность у-излучения и развитие острых лучевых реакций кожи.

Научная новизна и практическая значимость работы

В результате проведенных исследований получены приоритетные данные о радиозащитных свойствах новых №ацил-8-алкил-замещённых ИТМ, не описанных ранее в научной и патентной литературе. Показано, что эти умеренно токсичные соединения обладают свойствами вазоактивных гипоксических радиопротекторов. Впервые исследована способность ингибиторов NOS к фармакодинамическому взаимодействию с радиопротекторами других классов. Подтверждены предположения о возможности повышения радиозащитного эффекта NOS-ингибиторов при сочетанном постлучевом применении фармакологических доноров оксида азота. Впервые экспериментально исследована способность ингибиторов NOS селективно защищать немалигнизированные ткани при радиотерапии новообразований.

Изучение радиобиологических эффектов модификаторов эндогенного N0 позволяет расширить представления не только о механизмах изменения чувствительности биологических объектов к радиационному воздействию, но и о путях модификации радиобиологических эффектов. Результаты исследований показали, что ингибиторы NOS обладают свойствами вазоактивных гипоксических радиопротекторов. Противолучевая эффективность и широта радиозащитного действия наиболее активных соединений, их способность повышать эффективность существующих радиопротекторов и обеспечивать селективную защиту нормальных тканей при радиотерапии свидетельствуют, что ингибиторы NOS могут стать основой нового класса радиопротекторов экстренного действия и средств профилактики осложнений лучевой терапии.

Методология и методы исследований

Экспериментальные исследования выполнены на 2200 самцах мышей-гибридов Fi (CBAxC57Bl/6j) в возрасте 3-4 месяца и 110 самцах крыс линии Wistar (KYO) в возрасте 3 месяца. Животные получены из питомника лабораторных животных ФГБУН НЦБМТ ФМБА России (филиал «Андреевка»). Они были здоровы, имели ветеринарный сертификат качества и состояния здоровья, и прошли 20-суточный карантин в виварии МРНЦ им. А.Ф. Цыба. Все экспериментальные работы с лабораторными животными выполнены в соответствии с общепринятыми нормами обращения с животными, на основе

стандартных операционных процедур, принятых в МРНЦ им. А.Ф. Цыба, которые соответствуют правилам Европейской Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для научных целей (European Convention for the Protection of Vertebrate Animais Used for Expérimental and other Scientific Purposes (ETS 123). Strasbourg, 1986).

В работе использованы Ы-ацил-З-алкил-замещённые ИТМ с доказанными NOS-ингибирующими свойствами (соединения под шифрами Т1020, Т1023, Т1032, Т1046, Т1049), синтезированные в лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ им. А.Ф. Цыба.

При сравнительной оценке противолучевых свойств изучаемых производных ИТМ и исследовании их фармакодинамического взаимодействия с другими противолучевыми средствами использованы известные радиопротекторы из групп аминотиолов - цистамина дигидрохлорид («Сигма-Алдрич», Москва), и индолил-алкиламинов - серотонина адипинат (ЗАО «JIOPP», Москва), мексамин («Сигма-Алдрич», Москва) и индралин (ФГУП НПЦ «Фармзащита» ФМБА России).

При оценке противолучевых свойств изучаемых производных ИТМ при сочетанном применении с донорами NO использован нитропруссид натрия («Сигма-Алдрич», Москва).

Оценку острой токсичности новых соединений проводили экспресс-методом Прозоровского и пробит-логарифмическим методом Литчфилда-Уилкоксона на самцах мышей-гибридов Fi (СВА х C57Bl/6j).

При исследовании вазотропной активности модификаторов эндогенного синтеза оксида азота у наркотизированных крыс-самцов Wistar регистрировали значения частоты сердечных сокращений (ЧСС), дыхательных движений (ЧДД), систолического и диастолического артериального давления (АДс и АДд) в левой сонной артерии. Измеряли минутный объём крови (МОК) методом термо-дилюции. В дальнейшем, при анализе гемодинамики проводили расчёт стандартных показателей - сердечного индекса (СИ), ударного объёма (УО) и удельного периферического сопротивления сосудов (УПСС) по следующим формулам:

СИ = МОК/ППТ; УО = МОК/ЧСС-ЮОО; УПСС = 80 (АДсР-ЦВД)/СИ, где, ППТ - площадь поверхности тела; АДср = АДд + (АДс - АДд)/3 - среднее артериальное давление, ЦВД - центральное венозное давление.

Для оценки радиобиологических эффектов животных подвергали воздействию у-излучения 60Со на установке Луч (Россия). Общее однократное облучение мышей проводили при мощности дозы 0,4 - 0,8 Гр/мин. Локальное однократное облучение опухолевого узла у крыс с привитой саркомой М-1 - 0,5 Гр/мин.

Противолучевое действие химических соединений оценивали по тестам 30-суточной выживаемости, селезёночного экзогенного и эндогенного колониеобразования при введении за 15-20 минут до облучения.

Оценку способности изучаемых соединений к селективной защите немалиг-низированных тканей проводили на модели лучевой терапии саркомы М-1 у крыс. Облучение опухоли осуществляли на 11-е сутки после перевивки, когда

опухолевый узел достигал объёма 0,8-1,2 см3. Для анализа динамики роста саркомы проводили расчёт объёмов опухолевых узлов в эллиптическом приближении, рассчитывали индексы роста и длительность задержки роста опухоли. Тяжесть и течение острых лучевых поражений кожи оценивали по клинико-морфологической классификации Радиотерапевтической онкологической группы и Европейской организации по исследованию и лечению рака RTOG/EORTC-95.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программ Excel 2003 (Microsoft, США) и Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США) с расчётом среднего значения, стандартного отклонения и ошибки среднего. Статистические межгрупповые различия оценивали с помощью критериев множественного сравнения Даннета и Данна, и парного U-критерия Манна-Уитни. Для оценки различий средних показателей выживаемости животных использован точный критерий Фишера. Во всех случаях различие рассматривалось как статистически значимое при р<0,05.

Положения, выносимые на защиту

1. Новые, оригинальные Ы-ацил-Б-алкил-замещённые производные ИТМ, обладающие способностью к ингибированию NOS, являются умеренно токсичными соединениями.

2. Изучаемые производные ИТМ в дозах 1/6-1/5 ЛД16 вызывают фазные изменения гемодинамики нормотензивных животных подобные тем, которые индуцируют вазоактивные серотонин- и адренергические радиопротекторы: кратковременный гипертензивный эффект и далее - развитие брадикардии и гипотонии при сохранении высокого сосудистого тонуса, сопровождающиеся значительным и длительным ослаблением системного кровотока, способным приводить к развитию тканевой гипоксии.

3. Среди исследованных производных ИТМ наиболее стабильное и выраженное противолучевое действие проявляет производное Т1023. Это соединение обладает большей, в сравнении с аминоалкилтиолами, терапевтической широтой (около 5,5-6) и в оптимальной радиозащитной дозе, составляющей 1/4 ЛД16, обеспечивает противолучевое действие, не уступающее в эффективности действию существующих радиопротекторов (ФИД - 1,4-1,8).

4. Соединение Т1023 значительно повышает противолучевую эффективность существующих серотонин- и адренергических радиопротекторов, обладающих сходным вазотропным действием. Причём усиление противолучевого эффекта соединение Т1023 вызывает даже в малых дозах, самостоятельно не обладающих радиозащитным действием.

5. Подтверждена способность доноров оксида азота усиливать эффективность гипоксических радиопротекторов в постлучевой период.

6. Гипоксический механизм противолучевого действия позволяет соединению Т1023 осуществлять селективную защиту немалигнизированных тканей при лучевой терапии солидных опухолей, без ослабления противоопухолевой эффективности радиационного воздействия.

Степень достоверности и апробация результатов Все научные положения и выводы диссертационной работы сформулированы на основе анализа и обобщения большого экспериментального материала. Достоверность полученных результатов определяется использованием адекватных и объективных методов исследования и статистической обработки получаемых результатов.

Результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VIII международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2010), I всероссийской научной конференции "Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия" (Санкт-Петербург, 2010), УШ региональной научной конференции "Техногенные системы и экологический риск" (Обнинск, 2011), российской научной конференции "Острые проблемы разработки противолучевых средств: консерватизм или модернизация" (Москва, 2012), International conference «Radiation safety challengers in the 21th Century» (Yerevan, 2012), VII региональной конференции "Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии" (Томск, 2013), первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых "Проблемы разработки новых лекарственных средств". (Москва, 2013), научно-практической конференции «Перспективные технологии медицинского обеспечения вооружённых сил Российской Федерации» (Санкт-Петербург, 2013), Third International Conference on Radioecology & Environmental Radioactivity; ICRER 2014; (Barcelona, 2014), VII Съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2014).

Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения Исследования проводились в рамках плановых тем НИР МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиала ФГБУ «ФМИЦ им. П.А. Герцена» Минздрава России "Синтез новых химических субстанций среди диалкиламинометильных производных индола и в ряду производных изотиомочевины, изучение их радиомодифицирую-щего, противоопухолевого, противовирусного, интрфероногенного и антишокового действия" (УДК 547.99 № госрегистрации 01201154445) и "Изучение молекулярных, клеточных и системных механизмов действия ионизирующей и неионизирующей радиации на биологические объекты" (УДК 577.2.043:539.1 № госрегистрации 01201262731), в которых автор диссертационной работы являлся соисполнителем.

Публикации

По результатам проведенных исследований опубликовано 16 научных работ, в том числе 5 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК МОиН РФ.

Личный вклад автора Автор принимала непосредственное участие в планировании, организации и выполнении экспериментальных исследований по изучению токсичности, вазоактивных и радиомодифицирующих свойств модификаторов эндогенного синтеза NO, проводила учёт и оценку полученных результатов, их статистическую

обработку, участвовала в обобщении и анализе экспериментальных данных, обсуждении результатов в публикациях и докладах. Написание диссертации выполнено автором лично.

Объём и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. В работе приведены 23 таблицы и 10 рисунков. Список литературы содержит 211 библиографических источников, из них 76 отечественных и 135 иностранных публикации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе изучались токсические, вазоактивные и противолучевые свойства синтезированных в лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ им. А.Ф.Цыба - филиала ФГБУ «ФМИЦ им. П.А.Герцена» Минздрава России новых, оригинальных №ацил-В-алкил-замещённых ИТМ, не описанных ранее в патентной и научной литературе. Данные о молекулярной структуре этих соединений приведены в таблице 1.

Таблица 1. Молекулярная структура изучаемых >1,8-замещённых изотиомочевин.

/МН2

R-CON=C НВг

_S-R,

Соединение Ri r2

№циклобутанкарбонил-8-этил-ИТМ гидробромид, далее в тексте Т1020 С4Н7 СН2-СН3

№изобутаноил-8-изопропил-ИТМ гидробромид, далее в тексте Т1023 СН(СН3)2 СН(СН3)2

№изобутаноил-8-этил-ИТМ гидробромид, далее в тексте Т1032 СН(СН3)2 СН2-СН3

№пальмитинатоил-5-этил-ИТМ гидробромид, далее в тексте Т1046 СНз(СН2)14 СН2-СН3

№циклобутанкарбонил-8-изопропил-ИТМ гидробромид, далее в тексте Т1049 С4Н7 СН(СН3)2

В исследованиях, проведенных в этой лаборатории, показано, что изучаемые вещества являются эффективными ингибиторами NOS, причём Т1023 отличалось выраженной селективностью в отношении ингибирования eNOS и

iNOS. Эти данные позволили ожидать у изучаемых производных ИТМ наличие вазотропной и радиомодифицирующей активности и явились основанием для выполнения настоящей работы.

При оценке острой токсичности изучаемых соединений с помощью методов Прозоровского и Литчфилда-Уилкоксона выявлено, что все соединения согласно ГОСТ 12.1.007-76 относятся к классу умеренно токсичных веществ. В ряду исследованных соединений отмечалась тенденция к снижению токсичности с ростом объёма N-замещающего ацильного радикала. Так, у соединений Т1023 и Т1032, содержащих в своей структуре N-изобутаноил, показатели ЛД50 составляли 350-450 мг/кг, у соединений Т1020 и Т1049, содержащих в структуре N-циклобутанкарбонил, показатели ЛД50 составляли 750-850 мг/кг, а у соединения Т1046, содержащего в структуре N-пальмитинатоил, ЛД50 составляет 800-1000 мг/кг. Возможно, эта тенденция обусловлена ростом молекулярной массы в такой последовательности соединений.

В пользу относительной безопасности изученных соединений свидетельствует их способность подавлять активность изоформ NOS более чем на 50% при использовании в дозах, на 1-2 порядка ниже токсических.

При исследовании влияния изучаемых соединений на гемодинамику наркотизированных нормотензивных крыс выявлено наличие выраженного вазопрессорного действия, подобно известным вазоактивным радиопротекторам с гипоксическим механизмом. Так, однократное внутрибрюшинное (в/б) введение соединения Т1023 вызывало значительное и длительное повышение периферического сопротивления сосудов, сопровождавшееся фазными изменениями в гемодинамике. В первые минуты после инъекции Т1023 быстро нарастало АД, что вызывало рефлекторное замедление сердечного ритма, предотвращавшее возрастание давления, а в дальнейшем, на фоне брадикардии развивалась гипотония при сохранении повышенного тонуса сосудов. Если при введении Т1023 в небольших дозах (1/30-1/20 ЛД,6) УПСС возрастало на 35% и барорефлекторная реакция была умеренной, то при введении этого соединения в дозах порядка 1/5 ЛД16 УПСС возрастало на 75-80% и реакция была более выраженной, а также наблюдалось значительное ослабление системного кровотока на 40-45% в течение 90 минут.

Столь значительное ослабление системного кровотока в случае применения Т1023 в высокой дозе, несомненно, может способствовать развитию гипоксии. Косвенным подтверждением гипоксического механизма противолучевого действия изучаемых производных ИТМ является сходство влияния на гемодинамику нормотензивных животных соединения Т1023 и серотонина, который в радиозащитных дозах вызывает аналогичные фазные изменения.

Сравнительная оценка противолучевой активности изучаемых соединений при однократном в/б введении в дозах 1/8-1/2 ЛД16 за 15-20 мин до облучения проведена по параметрам 30-суточной выживаемости мышей при воздействии у-излу-чения в дозе 10 Гр. Результаты этих исследований показали, что противолучевая

активность изучаемых соединений в значительной степени зависит от их NOS-ингибирующих свойств. Так, соединение Т1046, являющееся наиболее слабым ингибитором NOS в ряду изучаемых соединений, в использованных дозах практически не оказывало радиозащитного действия — наблюдалось лищь умеренное повышение средней продолжительности жизни. Наиболее выраженное противолучевое действие оказывали соединения Т1020 и Т1023, являющиеся в этом ряду и наиболее активными ингибиторами NOS. В данных опытах эти соединения в дозах порядка 1/8 ЛД16 обеспечивали 60-75% выживаемость облучённых животных (таблица 2).

Таблица 2 — Сравнительная оценка противолучевых эффектов изучаемых производных ИТМ и цистамина по тесту 30-суточной выживаемости мышей F| (СБА х Cj7Bl/6j) при воздействии у-излучения в дозе 10 Гр (М±ст)

№ Группа Доза соединения 30-суточная СПЖ,

опыта мг/кг отЛД,6 выживаемость сутки

I Контроль - - 0% (0/15) 10,2 ± 2,2

Цистамин 225 - 93% (14/15) 1 14,5 ±2,1 2

Т1020 88 350 1/8 1/2 75% (12/15) 1 27% (4/15) 01 16,0 ± 4,2 2 13,2 ±2,9

Т1023 40 1/8 64% (9/14) 1 16,4 ±3,6 2

150 1/2 20% (3/15) 01 9,3 ± 2,9

Т1032 45 180 1/8 1/2 20% (3/15)01 50% (7/14) 1 9,2 ± 2,9 7,7 ±3,4

Т1049 90 355 1/8 1/2 13% (2/15) 01 7% (1/15) 01 15,4 ±3,7 2 12,0 ±3,1

П Контроль - - 0% (0/15) 7,7 ± 2,4

Т1046 95 380 1/8 1/2 0% (0/15) 0% (0/15) 8,3 ±3,1 11,3 ±1,6 2

Примечания: статистически значимое различие по точному критерию Фишера:

1 - с контролем; 01 - с группой, получавшей цистамин;

2 — статистически значимое различие с контролем по критерию Данна.

Данные, полученные при изучении дозовой зависимости противолучевой эффективности двух новых производных ИТМ, позволили рассматривать в качестве оптимальных радиозащитных доз: для соединения Т1020 - 88 мг/кг (1/8 от величины ЛД16), для Т1023 - 75 мг/кг (1/4 от величины ЛД16).

С целью окончательного выбора наиболее перспективного соединения было проведено три независимых эксперимента по изучению 30-суточной выживаемости мышей Р| (СВА х С57В1/6]), облучённых в дозах 9 и 10 Гр, при применении Т1020 в дозе 88 мг/кг и Т1023 в дозе 75 мг/кг. Результаты этих исследований показали, что соединение Т1020 оказывает нестабильное

противолучевое действие, и во многих случаях его радиозащитный эффект практически отсутствовал. В то же время соединение Т1023 в трёхкратной повторности оказывало выраженное противолучевое действие - при облучении в дозе 9 Гр защищало более 90% животных, а при дозе 10 Гр - 40-70%.

Обобщение результатов предварительных исследований противолучевых свойств изучаемых Ы,5-замещённых изотиомочевин позволило выделить соединение Т1023 как перспективное для дальнейших детальных исследований. Полученные в независимых экспериментах данные о влиянии этого соединения на 30-суточную выживаемость мышей, облучённых в дозе 10 Гр, и выживаемость клоногенных клеток костного мозга мышей, облучённых в дозе 5 Гр, по тесту селезёночных экзоколоний, свидетельствовали, что в отличие от серосодержащих радиопротекторов, эффективно действующих только в субтоксических дозах, статистически значимое противолучевое действие соединения Т1023 наблюдалось уже при использовании в дозе 1/8 ЛД16 (40 мг/кг), достигало максимума в области 1/4 ЛД)6 (75 мг/кг), и при более высоких дозах Т1023 радиозащитный эффект оставался практически неизменным. Результаты этих исследований позволили рассматривать дозу Т1023 75 мг/кг в качестве оптимальной радиозащитной дозы для данного вида животных.

Количественные показатели противолучевой эффективности (ФИД) для соединения Т1023 в данной работе определяли по тестам 30-суточной выживаемости животных и выживаемости гемопоэтических клоногенных клеток методом селезёночных экзоколоний. В таблице 3 приведены данные 30-суточной выживаемости контрольных мышей и мышей, получавших перед облучением Т1023. Расчёт ЛД50 у-излучения по этим данным дал следующие оценки: для контрольных животных - 7,13 (6,62+7,64) Гр; для подопытных животных - 10,22 (9,61+10,93) Гр. Величина ФИД, рассчитанная по отношению этих ЛД50, составила 1,44 (1,26+1,65). На рисунке 1 представлены данные двух независимых опытов по выживаемости гемопоэтических клоногенных клеток. Согласно этим данным показатели ФИД составили 1,81 (1,29+2,38) и 1,56 (1,21+1,94). Эти результаты подтверждают высказанное нами ранее предположение, что изучаемые К-ацил-Б-алкил-замещённые ИТМ, обладающие способностью к ингибированию NOS, могут в малотоксичных дозах оказывать противолучевое действие, не уступающее в эффективности действию существующих радиопротекторов.

Хотя противолучевой эффект ингибиторов NOS, как и у аминотиолов, реализуется без участия клеточных рецепторов, они, судя по всему, обладают большей радиозащитной широтой, чем серосодержащие радиопротекторы. Так, показатели терапевтической широты Т1023 составили 5,5-6, что в 2-3 раза превышает соответствующие показатели аминотиолов - например, терапевтический индекс цистамина для мышей составляет 3,3 (2,8-3,7). Возможно, это обусловлено наличием в процессах развития противолучевого эффекта ингибиторов NOS специфической молекулярной мишени - эндотелиальной изоформы NOS, изменение активности которой в определённой мере усиливает биохимический сигнал.

Таблица 3 - Показатели 30-суточной выживаемости контрольных и подопытных _мышей р! (СВА х С57В1/бр при воздействии у-излучения_

Доза у-излучения, Гр Выживаемость, %

Контроль Т1023, 75 мг/кг

6 100,0(15/15) -

7 53,3 (8/15) 100,0 (15/15)

8 20,0(3/15) 93,3 (14/15)

9 0(0/15) 93,3 (14/15)

10 - 66,7(10/15)

11 - 20,0 (3/15)

Рисунок 1 - Влияние Т1023 в дозе 75 мг/кг на выживаемость клоногенных клеток костного мозга мышей Б] (СВА х С57В1/6]) при воздействии у-излучения

(тест селезёночных экзоколоний). А, Б - данные двух экспериментов. 1 - контрольные, 2 - подопытные животные. Кривыми показаны соответствующие ^-линейные регрессии (во всех случаях г - в пределах 0,95-0,99).

При более детальном исследовании радиозащитного "потенциала" соединения Т1023 (по тесту селезёночных эндоколоний) выявлено наличие фармако-динамического взаимодействия между этим МЭБ-ингибитором и такими радиопротекторами как цистамин, серотонин, мексамин, индралин. В этих исследованиях взаимодействие Т1023 и цистамина носило отчётливый антагонистический характер (рисунок 2). По нашему мнению, такой эффект, воспроизведённый в повторных опытах, может быть обусловлен как разнонаправленным вазотропным действием этих веществ, так и особенностями вазопрессорного действия производных ИТМ, но в любом случае нуждается в детальном изучении.

цистамин: 0 150 О 150 о 150 0 150

Т1023: О О 90 90 О 0 90 90

Рисунок 2 - Влияние Т1023 и цистамина при их раздельном и сочетанном применении на число селезёночных эндоколоний у мышей Fi (СВА х C57Bl/6j) на 8 сутки после воздействия у-излучения в дозе 6 Гр. Статистически значимые различия по критерию Данна: 1 - с контролем; 2-е группами, получавшими Т1023 и цистамин раздельно.

В то же время радиозащитный эффект при последовательном введении одного из вазоактивных радиопротекторов и соединения Т1023 был статистически значимо выше противолучевых эффектов этих соединений при их раздельном применении. Важно, что соединение Т1023 вызывало усиление противолучевых эффектов серотонина и мексамина (рисунок 3) и при применении в малых дозах (1/8 ЛД16), а индралина (рисунок 4) даже в случае применения соединения Т1023 в дозе 1/12 ЛД16, при введении в которой Т1023 самостоятельно не оказывает противолучевого действия. В радиозащитных дозах Т1023 вызывает изменения гемодинамики, аналогичные тем, которые наблюдаются при применении эффективных доз серотонин- и адренергических радиопротекторов, также вызывающих повышение сосудистого тонуса. Однако молекулярные механизмы вазопрессорного действия при этом качественно различаются. Если серотонин- и адренергические средства, взаимодействуя с соответствующими рецепторами, оказывают прямое прессорное влияние на миоциты, то ингибиторы NOS оказывают прессорное действие опосредованно, блокируя влияние на миоциты эндогенных вазодилятаторов. Судя по всему, эти принципиально различные пути вазопрессорного действия способны взаимно усиливать влияние на сосудистый тонус, что, на наш взгляд, обусловило выраженное усиление противолучевых эффектов серотонина, мексамина и индралина в сочетании с Т1023, которое наблюдалось в данных исследованиях. Причём тот факт, что статистически значимое повышение противолучевой эффективности соединение Т1023 вызывает даже в малых дозах, самостоятельно не оказывающих радиозащитного действия, свидетельствует, что ингибиторы NOS могут являться фармаколо-

гическими адъювантами, способными создать новые возможности в разработке фармакологически приемлемых противолучевых средств.

серотонин: О 150 0 150 0 0 0 150 75 150 мексамин: 0 0 О 20 20 20

71023 : 0 0 75 75 О 40 75 0 75 40 Т1023: 0 40 75 0 75 40

Рисунок 3 - Влияние Т1023 и серотонина или мексамина при их раздельном и сочетанном применении на число селезёночных эндоколоний у мышей (СВА х С57В1/6[) на 8 сутки после воздействия у-излучения в дозе 6 Гр. Статистически значимые различия по критерию Данна: 1 - с контролем; 2-е группами, получавшими Т1023 и серотонин или мексамин раздельно.

индралин: 0 75 0 75 0 0 0 50 50 50 0 0 40 0 0 20 40 40 40 Т1023: 0 0 75 75 0 40 75 0 75 40 0 25 0 40 75 25 75 40 25

Рисунок 4 - Влияние Т1023 и индралина при их раздельном и сочетанном применении на число селезёночных эндоколоний у мышей Б) (СВА х С57В1/6]) на 8 сутки после воздействия у-излучения в дозе 6 Гр. Статистически значимые различия по критерию Данна: 1 - с контролем; 2-е группами, получавшими Т1023 и индралин раздельно.

В последние годы показан феномен "ишемии/реперфузии", свидетельствующий о повышении противолучевой эффективности гипоксического радиопротектора донором оксида азота, применённым после облучения. В данной

работе этот эффект воспроизведён при взаимодействии Т1023 с нитропруссидом натрия. Применение донора N0 сразу после облучения значительно повысило противолучевую эффективность Т1023 (рисунок 5) - при самостоятельном применении Т1023 выживаемость мышей составляла 40%, а в сочетании с нитропруссидом этот показатель увеличился до 70%. Природа этого явления не ясна. Возможно, оксидативный стресс, развивающийся при ишемии/реперфузии, в ранний постлучевой период способствует регенерации системы кроветворения - стимулирует миграцию и "расселение" стволовых клеток. Кроме того, до конца не изученным остаётся вопрос о прямом влиянии эндогенного оксида азота на миграцию и способность к дифференцировке стволовых кроветворных клеток.

—А— Т1023 + 10 Гр + нитропруссид натрия

—#—11023 + 10 Гр 1

Т 10 Гр + нитропруссид натрия 10 Гр

зг 100

3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 Время наблюдения, сутки

Рисунок 5 - Влияние Т1023 в дозе 75 мг/кг и нитропруссида натрия в дозе 0,7 мг/кг при сочетанном и раздельном применении на 30-суточную выживаемость (а) и среднюю продолжительность жизни (б) мышей F, (СВА х C57BI/6j) при воздействии у-излучения в дозе 10 Гр.

Важные результаты получены также в исследованиях на модели лучевой терапии радиорезистентной саркомы М-1. Однократное введение Т1023 в оптимальной радиозащитной дозе перед облучением в дозах 32 и 36 Гр не модифицировало радиочувствительность опухоли и не снижало противоопухолевую эффективность лучевого воздействия. Но при этом Т1023 значительно снижало клинико-морфологическую тяжесть острых лучевых реакций кожи, ограничивая повреждение глубоких слоёв кожи и подлежащих тканей (рисунок 6). Эти данные убедительно свидетельствуют, что гипоксический механизм противолучевого действия ингибиторов NOS позволяет им в значительной степени селективно защищать немалигнизированные ткани при лучевой терапии новообразований.

Рисунок 6 - Острые лучевые реакции кожи при облучении в дозе 32 Гр у крыс Wistar в контрольной группе (А, В), и у животных, получавших Т1023 (Б, Г). (А, Б) - 11-е сутки после облучения. В контрольной группе - отёк кожи, сливной

влажный эпидермит; в подопытной группе - эритема, островковый влажный эпидермит. (В, Г) - 25-е сутки после облучения. В контрольной группе - стадия регенерации эксудативного эпидермита, полная эпиляция шёрстного покрова; в подопытной группе - проявления лучевых реакций отсутствуют.

Конечно, полная селективность гипоксических радиопротекторов к нормальным тканям, скорее всего, малодостижима. Тем не менее, подходы к их рациональному применению в настоящее время формируются. Так, специалистами RTOG/EORTC в последние годы выработаны протоколы применения в онкологической практике средств профилактики радио- и химиотерапии, предназначенные для оценки и минимизации возможных рисков.

Полученные данные свидетельствуют, что эффективные ингибиторы NOS могут стать основой нового класса вазоактивных радиопротекторов и средств профилактики осложнений лучевой терапии, а также явиться ценными фармакологическими адъювантами, способными повышать эффективность J некоторых существующих противолучевых средств. Соединение Т1023, несомненно, является перспективным для дальнейшей разработки в качестве радиопротектора. Важным направлением будущих исследований является изучение способности доноров оксида азота в сочетании с гипоксическими радиопротекторами к постлучевой модификации радиобиологических эффектов. Эти исследования представляют не только теоретический интерес, но и могут открыть новые возможности в радиационной защите.

выводы

1. Исследованные оригинальные Ы-ацил-Б-алкил-замещённые производные ИТМ, обладающие NOS-ингибирующими свойствами, являются умеренно токсичными соединениями. Их введение в дозах 1/6-1/5 от ЛД16 нормотензивным животным вызывает изменения гемодинамики, способные приводить к развитию тканевой гипоксии.

2. Наиболее выраженную противолучевую активность среди исследованных веществ проявляет соединение Т1023. Это вещество имеет большую, в сравнении с аминотиоловыми радиопротекторами, терапевтическую широту (5,5-6) и в оптимальной радиозащитной дозе (1/4 ЛД1б) оказывает противолучевое действие, не уступающее в эффективности действию существующих радиопротекторов (ФИД - 1,4-1,8).

3. Соединение Т1023 статистически значимо повышает противолучевую эффективность серотонин- и адренергических радиопротекторов, обладающих сходным вазотропным действием. При этом усиление противолучевых эффектов наблюдается даже при применении Т1023 в малых дозах, самостоятельно не обладающих радиозащитным действием.

4. Применение доноров N0 в постлучевом периоде усиливает противолучевое действие соединения Т1023.

5. Гипоксический механизм противолучевого действия позволяет соединению Т1023 оказывать селективную защиту немалигнизированных тканей при лучевой терапии перевиваемой саркомы М-1 без ослабления противоопухолевой эффективности лучевого воздействия.

Основные публикации по теме диссертации

1. Макарчук, В.М. Антигиповолемическое действие N-nponnonwi-S-monpo-пил-изотиомочевины гидробромида при септическом шоке у крыс-самцов Wistar /В.М. Макарчук, С.Я. Проскуряков, М.В. Филимонова, В.И. Суринова, Л.И. Шевченко, С.И. Орленко //Сборник научных работ лауреатов конкурса им. Е.Р. Дашковой. - Калуга, КГУ им. К.Э.Циолковского. - 2010. - Вып. 4. - С.34-42.

2. Филимонова, М.В. Влияние №пропионил-5-изопропил-изотиомочевины на продукцию биогенного оксида азота (N0) и гемодинамические параметры животных при эндотоксическом шоке /М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко, В.И. Суринова, С.П. Орленко, В.М. Макарчук, С.Я. Проскуряков //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2011. - № 9. - С.35-39.

3. Филимонова, М.В Радиозащитные свойства производных изотиомочевины с NO-ингибирующим механизмом действия /М.В. Филимонова, С.Я. Проскуряков, Л.И. Шевченко, A.C. Шевчук, Г.А. Лушникова, В.М. Макарчук, Е.В.Арзамасцев, В.ИЛаба, К.И.Малиновская, ЕЛЛевицкая //Радиационная биология. Радиоэкология. - 2012. - № 6. - С.593-601.

4. Filimonova, M.V. Vasopressive and radioprotective effects of NOS inhibitors - iso-thiourea derivatives /M.V. Filimonova, T.P. Trofimova, L.I. Shevchenko, S.E. Ulyanenko,

V.M. Makarchuk, M.N. Kuznetsova, A.S. Shevchuk, G.A. Lushnikova//Radiation safety challengers in the 21th century. International conference - Yerevan, 2012. - P. 33-35.

5. Филимонова, M.B. Радиозащитные свойства ингибиторов NO-синтаз из класса линейных 8,№замещённых изотиомочевины /М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко, А.С. Шевчук, Г.А. Лушникова, В.М. Макарчук //Острые проблемы разработки противолучевых средств: консерватизм или модернизация: тезисы Российской научной конференции 13-14 ноября 2012 года. - Москва. - 2012. - С.61.

6. Плотникова, Е.Д. Молекулярное моделирование, рентгеноструктурный анализ и изучение iNOS-ингибирующей активности гидрохлорида З-имино-2,4-диазабицикло[3.3.1]нонан-1 -ола /Е.Д. Плотникова, Е.В. Нуриева, Д.И. Перегуд, М.В. Онуфриев, Н.В. Гуляева, В.М. Макарчук, М.В. Филимонова, Н.С. Зефиров, О.Н. Зефирова //Журнал органической химии. - 2013. - Т. 49, № 8. - С.1128-1131.

7. Макарчук, В.М. Изучение вазопрессорных свойств конкурентных ингибиторов NOS на модели тяжёлого геморрагического шока /В.М. Макарчук, Е.А. Чес-накова, Н.Г. Гычкова, А.В. Плотникова, Л.И. Шевченко, М.В. Филимонова //Первая Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых "Проблемы разработки новых лекарственных средств": Тезисы докладов - Москва, 2013. - С. 63.

8. Филимонова, М.В. К вопросу о механизме радиозащитного действия ингибиторов NO-синтаз /М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко, Т.П. Трофимова, В.М. Макарчук, А.С. Шевчук, Г.А Лушникова //Радиационная биология. Радиоэкология. - 2014. - Т. 54. - №5. - С.500-506.

9. Филимонова, М.В. Изучение противоопухолевых и радиомодифицирующих свойств NOS-ингибитора Т1023 на модели лучевой терапии /М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко, В.М. Макарчук, Е.А. Чеснакова //VП съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность): тезисы докладов. Москва: РУДН, 2014. - С. 127.

10. Филимонова, М.В. Радиозащитные свойства модификаторов эндогенного синтеза оксида азота / М.В. Филимонова, Л.И. Шевченко, В.М. Макарчук, Е.А. Чеснакова, Г.А. Лушникова //VII съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность): тезисы докладов. Москва: РУДН, 2014. - С. 177.

11. Филимонова, М.В. Экспериментальное исследование противоопухолевой активности нового ингибитора синтаз оксида азота Т1023 /М.В. Филимонова, В.В. Южаков, Л.И. Шевченко, Л.Н. Бандурко, Л.Е. Севанькаева, В.М. Макарчук, Е.А. Чеснакова, А.С. Шевчук, М.Г. Цыганова, Н.К. Фомина, И.Э. Ингель, В.И. Суринова //Молекулярная медицина. - 2015. - № 5. - С.61-64.

Результаты исследований стали предметом патента Российской Федерации:

Вазоконстрикторное средство : пат. 2475479 Рос. Федерация : МПК51 С 07 С 335/38 / Филимонова М.В., Шевченко Л.И., Макарчук В.М., Шевчук А.С., Лушникова Г.А.; патентообладатель МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «ФМИЦ им. П.А. Герцена» Минздрава России. - N 2011152553/04; заявл. 23.12.2011; опубл. 20.02.2013, Бюл. N 5.

Заказ № 676 от 20.04.2015. Тираж 100 экз. Объём 1 п.л. Формат 60x84 'Дб- Печать офсетная.

Отпечатано в МП «Обнинская типография» 249035 Калужская обл., г. Обнинск, ул. Комарова, 6