Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Повреждение генетических структур клеток тканей мышей после комбинированного воздействия ионов кадмия и y-радиации

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Повреждение генетических структур клеток тканей мышей после комбинированного воздействия ионов кадмия и y-радиации"

- 6 МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

УДК 574/577:539.16:575

ПРИВЕЗЕНЦЕВ КИРИЛЛ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

ПОВРЕЖДЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ СТРУКТУР КЛЕТОК ТКАНЕЙ МЫШЕЙ ПОСЛЕ КОМБИНИРОВАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНОВ КАДМИЯ И у-РАДИАЦИИ

03.00.01-Радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1998

Работа выполнена в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики Российской Академии Наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор А. И. Газиев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор И. И. Пелевина доктор химических наук, профессор А. М. Серебряный

Ведущее учреждение: Институт биофизики клетки РАН,

г. Пущино

Защита диссертации состоится "/(о " 1993 г. в ¿Ужасов

на заседании диссертационного Совета СД.053.05.74. в Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу. 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские поры, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Отзывы просим направлять по адресу. 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, Биологичесмлй факультет, Диссертационный совет Д.053.05.74.

Автореферат разослан

'tií- Х^уЦи998 г.

Ученый сектретарь специализированного совета доктор биологических наук, профессор О. Р. Колье

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение комбинированного действия физических и химических факторов на организм является одной из ключевых задач радиобиологии. Радиационное зафязнение окружающей среды происходит на фоне повышающегося содержания в ней различных мутагенов, канцерогенов и токсических отходов промышленности. При определении допустимых норм загрязнения и оценке риска для человека и биоценозов от повышающихся уровней радиации необходимо учитывать возможный синергизм действия радиации и химических агентов (StrefTer, Muller, 1984).

Кадмий (Cd) относится к группе тяжелых металлов, обладающих высокой общей токсичностью, генотоксичностыо и канцерогенноетъю (Friberg et al., 1979; IARC, 1993). Способность Cd вызывать хромосомный мутагенез in vitro, а также у животных и человека была отмечена в ряде работ (Paton, Alison, 1972; Bassendowska-Karska, Zawadzka-Kos, 1987; Leonard, 1966), но точные механизмы генотоксичности Cd еще неизвестны С другой стороны, в ряде работ было показано, что Cd может оказывать радиолротекторное действие на уровне отдельных клеток in vitro и на уровне целостного организма (Renan, Oowman, 1089; Matsubara et al., 1S87 ). Это явление, как считают, связано с иццукцией металлотионеинов (МТ). МТ-белкм имеющие низкую молекулярную массу (< 10 кДа), высокое содержание цистеина (около 30 %), термостабильные, способны связывать тяжелые металлы (2n, Cd, Cu, Bi, и пр.) через два металлотиолатных кластера. Точная роль МТ в организме не установлена, но известно, что они играют центральную роль б детоксификации тяжелых металлов, регуляции помеостаза Zn (Hamer, 1986) и в реакции на различные стрессы химической и физической природы (Sato, Bremner, 1993; Robson et al., 1992).

Как известно, важнейшим критерием оценки реакции организмов на воздействие ионизирующей радиации является радиочувствительность, которая, в свою очередь, зависит от ряда факторов и, в частности, от функционировании систем репарации ДНК. Репарация ДНК-фундаментальный клеточный феномен, заключающийся в восстановлении на гиеной структуры ДНК с участием мультиферментных комплексов. Репарация тесно связана с жизнедеятельностью клеток как в норме, так и при воздействии физических и химических факторе® (Wood, 1996). Процессы репарации ДНК тесно связаны с энергетическим метаболизмом, старением, превращением нормальных клеток в опухолевые, рядом наследственных заболеваний (Modridi, 1994; Sanear, 1996; Hanasvatt, 1994). Клетки лимфоидньсх тканей, осуществляющих функцию иммунного надзора, могут представлять "слабое звено" органу,¿ма в случав действия мутагенных и канцерогенных факторов внешней среды. Нарушен-ла иммунитета делает организм более восприимчивым к различного типа инфекциям и препятствует элиминации опухолевых клеток. С другой стороны, опухолевая трансформация

лимфовдных тканей ведет к развитию таких заболеваний как лейкозы.

Таким образом, изучение влияния «метанного действия Cd и -^радиации на повреждение и репарацию ДНК в лимфоедных тканях является проблемой большой важности.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выявление закономерностей повреждения и возможной репарации генетических структур в клетках лимфоедных тканей мышей после комбинированного действия Cd и у-радиации. В соответствии с этом были поставлены следующие задачи:

1. Изучить образование и репарацию однойитевых разрывов (ОР) и щелочелабипьных сайтов в ДНК лимфоидных клеток мышей после воздействия ионов Cd2* и ^радиации.

2. Путем анализа частоты микроядер (МЯ) выяснить возможность образования хромосомных повреждений в клетках костного мозга этих же мышей.

3. Изучить влияние ионов Cd'" на активацию индуцибельных реларашшых ответов клеток.

Научная новизна полученных результатов. Впервые изучены процессы поореждения и

репарации ДНК при действии хлорида Cd и ^чзблучения in vivo. Продемонстрирована кинетика восстаког-пения ДНК от повреждений, индуцированных хлоридом Cd в лимфоидных тканях.

Показано, что при комбинированном воздействии Cd и ^облучения, выход повреждений ДНК зависит от времени мераду обработкой хлоридом Cd и последующим облучением. Обработка мышей хлоридом Cd оказывает радиозащитный эффект, выражающийся в снижении начального уровня повреждений и ускорении репарации повреждений ДНК, индуцированных ^облучением.

Установлено, что хроническое воздействие хлорида Cd в нелетальных дозах не приводит к увеличению частоты хромосомных аберраций типа МЯ и не влияет на выход этих же повреждений при хроническом облучении ионизирующей радиацией. В то же время, как острая, так и хроническая предварительная обработка мышей хлоридом Cd приводит к индукции адаптивного репаративного ответа in vivo. Вместе с тем, хлорид Cd подавляет адаптивный репаративный ответ на малые дозы ионизирующего облучения и не влияет на другой индуцибельный ответ, SOS-ответ, в бактериальных клетках.

Все изложенные результаты получены впервые и не имеют аналогов в литературе.

Практическое значение полученных результатов. В работе было показано, что Cd в нелетальных дозах и концентрациях вызывает повреэдения ДНК, которые могут быть определены с помощью экспресс-тестов. На наш взгляд, представляется целесообразным использование метода электрофореза нуклеоида одиночных клеток для оценки генотоксическсто потенциала окружающей среды. С другой стороны, в работе убедительно продемонстрирован радиозащитный эффект солей Cd, связанный, вероятно с индукцией МТ. Хотя Cd является канцерогеном per se, известны нетоксические индукторы МТ. В связи с этим, мажет быть рекомендовано изыскание и внедрение в диэтологою нетсксических индукторов МТ для предотвращения заболеваний, связанных с воздействием ионизирующей радиации у персонала

АЭС и лиц проживающих на загрязненных радионуклидами территориях. * '

Личный вклад соискателя. Все эксперименты, представленные в диссертации, проведены автором самостоятельно. Диссертантом использована установка для анализа поврежден нос ти ДНК методом электрофореза нуклеоида одиночных клеток, созданная н. с. лаборатории молекулярной радиобиологии ИТЭБ РАН Н. П. Сиротой и теоретические концепции научного руководителя д. б. н. профессора А. И. Газиева.

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации докладывались на семинарах лаборатории молекулярной радиобиологии ИТЭБ РАН, отдела биохимических адптаций гидробионтоа ИнБЮМ НАНУ, кафедры биохимии Симферопольского Госуниверситета, на II Радиобиологическом Съезде (г. Киев, 20-25 сентября, 1993), на конференции NATO Advanced Study Institute Molecular and Applied Aspects of Oxidative Drug Metabolizing Enzymes (August 31-September 11, 1997, Tekitwa, Antalya, Turkey), на конференции NATO Advanced Study liistitute Damage and Repair Oxygen Radical Effects, Cellular Protection and Biological Consequences (October 14-24,1997, Tekirova, Antalya, Turkey).

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в четърех с гатъях и семи тезисах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на ///страницах машинописного текста, состоит из введения, разделов, выводов и списка использованных источников. Текст содержит -^"рисунков. Список использованных источников включает наименований, в том ' числе /5-У работ зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

РАЗДЕЛ 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В литературном обзоре охарактеризованы механизмы повреждения и репарации ДНК при действии ионизирующего излучения. Репарация ДНК является сложной и гибкой фундаментальной системой внутриклеточных реакций, тесно взаимосвязанной с механизмами хранения, передачи и реализации наследственной информации. Существует несколько путей репарации, находящихся под слоимым и разветвленным генетическим контролем, обеспечивающих восстановление практически любых типов повреждений, возникающих при действии ионизирующего излучения.

Далее, в обзоре кратко освещены проблемы комбинированного действия тяжелых металлов и ионизирующей радиации.

В последнем разделе обзора описаны биологические эффекты Cd, включая канцерогенность и генотокеичностъ.

Несмотря на то, что за последнее время достигнут значительный прогресс в изучении механизмои повреждения и реппрации ДНК, в этой области существует ряд проблем.

Сравнительно мало известно о формировании и репарации повреждений ДНК при действии тяжелых металлов ¡n vivo. Не изучено функционирование систем репарации ДНК при комбинированном воздействии тяжелых металлов и радиации ¡n vivo. Особый интерес представляет исследование активации индуцибельных путей репарации.

РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Z1. Животные, выдопеша лимфоидиых клеток, бактериальные клеш«

В работе использовались самцы мышей линии С57В1/6 (возраст 6-6 под, масса 22-25 г), полученные из питомника "Столбовая" (РАМН). Фракцию лимфоцитоз из крови и солидных тканей изолировали как описано в работе (Хейфец, Абалкин, 1973).

Штамм Е. cotí РОЗ7 (Г thr leu his-4 pyrD thi gaiE ga!K (galT) lac U169 sri300::Tn10 фоВ ¡psL sfiA::Mud (Ap, lac)c ts rfa uvrA ttp::Muc*Proc) был получен из коллекции ИБФМ РАН. Бактериальные клетки выращивали как указано (Quiílardet, Hofnung, 1385).

2.2. Обработка клеток и животных ионами СсУ*

Клетки Е. coii PQ37 инкубировались с Cd в течение 1 ч при 37°С Конечные концентрации Cd2* в инкубационной среде составляли 2/105-2хЮ3 мг/мл.

Лимфоциты периферической крови (ЛПК) in vitro инкубировались с Cd в течение 1 ч при 37 °С в среде Игла. Конечные концентрации Cd2* в инкубационной среде составляли 2/105-2/101 ' мг/мл.

Животные ¡n vivo при остром воздействии получали однократную внутрибрюшинную инъекцию хлорида Cd в дозе 1 мг Cd2*/Kr массы тела. При хрошчесдам воздействии Cd2* поступал с питьевой водой в течение 32 сут при концентрации 5 мг Cd3'/п.

2.3. у-облучениа

Внешнее острое облучение проводили т-квантами на установке "ГУПОС" (,37Cs) при мощности дозы 2,75 Гр/мин. Хроническое облучение проводили в специализированном экспериментальном помещении от источника шСз при мощности дозы 1,3 мГр^ в течение 32 суток.

2.4. Ультрафиолетовое облучение и SOS-хромотест

Клетки Е. coii PQ37 облучались ультрафиолетом с длиной волны 254 ни пампами БУВ-30 в дозе 25 Дж/м2 при мощности дозы 100 Дж/ м3хмин.

SOS-хромотест проводили в соответствии с работой (Quiílardet, Hofnung, 1985). SOS-ответ выражали с помощью фактора индукции, |(с). При 1(с)>1,5 тестируемый агент считали дающим положительный ответ в SOS-хромотесте (Quiílardet, Hofnung, 1985).

2.5. Определенна повревдэнности ДНК методом электрофореза нуклеоцца ("Комета-тес»")

Электрофорез нуклеоида проводили как описано ранее (Сирота и др., 1991) с модификациями согласно (Прмвезенцев и др., 1995). Величину повреждённости ДНК (степень релаксации нуклеоида, целостность нуклеоида) выражали в условных единицах, l„, в процентах значения люминесценции после щелочного электрофореза, относительно люминесценции ДНК этих же клеток, но без электрофореза: l„ = I. / lc х100%, где 1,-ееличина люминесценции ДНК клеток, подвергнутых электрофорезу, 1с-величина люминесценции ДНК клеток без электрофореза.

2.6. Анализ З'ОН концов в ДНК методом ник-трансляции

Ник-трансляция проводилась как описано в работе (Iseki, 1986).

Z7. Анализ микроядер

Процедуру проводили в соответствии с работой (Heddle etal., 1983),

2.8. Статистическая обработка

Цифровой материал обрабатывали статистически. Данные представлены в виде средних значений и стандартных ошибок средних значений (x±SJ. На рисунках показаны границы доверительных интервалов при Р=95% (вертикальные линии).

РАЗДЕЛ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Ловреодениа и репарация ДНК при действии ионоа Cd*

Для исследования способности ионов Cd" вызывать повреждения, регистрируемые методом комета-тест, нами были проведены предварительные эксперименты in «ira. ЛПК инкубировались в среде Игла на протяжении 1 ч с различными концентрациями Cd. Мы наблюдали индущию структурных повреждений в ДНК ЛПК во всём диапазоне исследуемых концентраций. Степень релаксации зависела от концентрации ионов Cd" почта линейно. Используемые концентрации вызывали сравнительно низкий уровень' повреждений, который тем не менее достоверно отличался от контроля. При дальнейшей инкубации клеток в среде не содержащей Cd, репарации повреждений не происходило.

Результаты исследования влияния Cd на индукцию структурных повреждений в ДНК лимфоидных клеток ¡n vivo представлены на рис. 3.1. Для удобства представления данных все величины пересчитаны относительно контрольных величин (животные не обрабатывались Cd), принятых за 100 %.

В клетках из разных тканей наблюдается различная динамика поереиедения и репарации ДНК. Спустя 2 ч после мнъекции максимальная степень релаксации нуклеоида наблквдатась в ЛПК и спленоцитах, минимальная-« тимоцитах. Через 24 ч после воздействия наблюдалась репарация повреждений ДНК в ЛПК. В спленоцитах уровень повреждений оставался баз изменений, а в тимоцитах отмечалось снижение целослюсти нуклеоида. Через 48' ч после

инъекции хлорида Сс1 существенных повреждений в ДНК ЛПК не наблюдалось, тогда как в ДНК спленоцитов степень повреждённое™ остаётся такой же как и через 2 ч после инъекции. В тимоцитах мы регистрируем к 46 ч дальнейшую деградацию ДНК. Спустя 72 ч в ЛПК мышей после воздействия С<1 происходила почти полная репарация ДНК, в слленоцитах не отмечалось восстановления до контрольного уровня, а в тимоцитах степень повреждённости нуклеоцда достигала максимальной величины.

Рис. 3.1. Зависимость степени релаксации нуклеоида (1„) лимфоидных клеток от времени после инъекции хлорида Сс1 в дозе 1 мг Сдг*/нг массы тела; по вертикали- 1„, по горизонтали-время после инъекции, ч.; 1—ЛПК, 2-спленоциты, 3-тимоциты.

Введение хлорида Cd вызывает резко выраженный цитогенетический эффект, что свидетельствует о повреждении ядерной ДНК клеток костного мозга. Частота МЯ при этом равна 11,33 против 2,17 в контроле (Р<0,05).

Вероятш, повреждения, регистрируемые методом "Комета-тест" являются следствием работы инцизионных нуклеаз иМли ДНК-гликозилзз-АР-»донуклеаз, репарнрукхцих комплексы Cd-фосфат и Cd-оснсеание или модифицированные основания ДНК. В пользу этого предположения свидетельствует работа Михайловой и соавторов (Mikhailova et al,, 1997). В эюй работе было показано, что в лймфобластоидных клетках ионы Cd2* в концентрации 5-35 мкМ вызывают индукцию 8-гмдрокси-дезоксигуанозина и ОР, причем коэффициент корреляции дня этих параметров составлял 0,932.

Для Еыяшенпя химической природы концевых групп ОР ДНК, возникающих при воздействии Cd была использована реакция ник-трансляции in situ. Доза хлорида Cd, вызывающая релаксацию нуклеоида приводит к значительному увеличению числа З'ОН-концов в ДНК ЛПК по сравнению с контролем. Следовательно, no i-ратей мере часть повреждений ДНК, индуцированных некими Cd2* представляет собой истинные ОР ДНК, с З'ОН (руппами на концах.

Отсутствие репарации ДНК in vitro при дальнейшей инкубации в среде не содержащей Cd может объясняться одновременным накоплением ОР при апоптозе и их репарацией. При концентрациях иона Cd2* 10 мкМ впоптоз был зарегистрирован в Т-кпетках линии СЕМ-012 и изолированных ядрах печени крупного рогатого скота (el Azzouzi et al., 1994; Lohman, Beyersmann, 1993). Учитывая низкую активность ферментов репарации ДНК в лимфоцитах (Saucier, Laval, 1933) межно допустить, что образуемые дополнительные повреждения генома, при переводе клеток в на бзссьпзороточную минимальную среду, приводят к насыщению репаративных систем.

Различная динамика повреждения и репарации ДНК в лимфоидных клетках из различных тканей объясняется, по нашему мнению, в первую очередь не различиями в скорости репарации ДНК в различных типах лимфоцитов, a различней динамикой накопления Cd в исследованных тканях. В работе (Lucis, Aterman, 1972) показано, что при однократной ит^екции ,09Cd концентрация Cd в крови экспериментальных животных была ниже чем в селезенке и в тимусе.

Формирование Г»1Я при действии Cd может быть объяснено двояко. Известно, что химические соединения, взаимодействующие с веретеном деления индуцируют МЯ в полихроматофильных эритроцитах грызунов и лимфоцитах человека (Heddle et а).,1983; Migfore et al., 1987). С другой стороны, считается, что в основе формирования хромосомных повреждений лежат ОР или ДР ДНК, которые не регврировались до начала последующего митоза клеток Поэтому, индукция МЯ п полихроматофипьных эритроцитах мышей, обработанных Cd очевидно обусловлена в'хщишсаенисм медпе» iho рйпаруруемъа игм нересорируемых ОР и ДР в ДНК.

3.2. Повреждение и репарация ДНК при комбинированном действии ионов и ионизирующей радиации

Известно, что обработка животных веществами, способными вызвать синтез МТ, перед облучением, вызывает повышение выживаемости. Разные исследователи (Котеров и др., 1993; МаЬиЬага е1 а!., 1987; МаЬиЬага е1 а1., 1987) указывают различное время между МТ-инцуцирукхцей обработкой и облучением для достижения максимального защитного эффекта. Учитывая наши данные о способности Сс1 индуцировать повреждения ДНК мы предположили, что в зависимости от времени между инъекцией хлорида Сс1 и облучением он будет оказывать либо защитный либо сенсибилизирующий эффект. Для проверки этого предположения мы изучили зависимость целостности нуклеоида от времени между инъекцией хлорида Сс1 и последующим ■уч)блучечием. Данные представлены на рис. 3.2. Для сравнения показана степень релаксации спустя 1 час после -^облучения.

10 0 {-

Рис. 32. Зависимость степени релаксации нукпеоцда (1„) ЛПК (1), спленоцитов (2) и тимоцитов (3) от времени межд, инъекцией хлорида Сс1 и последующим -^облучением животных в дозе 10 Гр; по оси абсцисо-еремя между инъекцией хлорида Сй и облучением, ч; по оси ординат-1п (%). Зона ограниченная пунктирными линиями соответствует 95 % доверительному интервалу для вариантов с облучением без обработки хлоридом С&

Спустя 2 ч после инъекции хлорида Cd наблюдается увеличение степени релаксации нуклеоида даже по сравнению с радиационным контролем. Максимальный защитный эффект в ЛПК, регистрируемый по степени релаксации нуклеоода, наблюдается спустя 48 ч после инъекции хлорида Cd. А спустя 72 ч после введения животным хлорида Cd защитный эффект не регистрируется. В спленоцитах максимальный эффект радиорезистентности наблюдался спустя 48 ч после инъекции Cd хлорида, так же как и в случае с ЛПК. В отличие от других типов клеток, в тимоцитах степень радиационночкадуцфованной релаксации нуклеоида минимальна спустя 24, а не 48 ч поело инъекции хлорида Cd, к 48 ч защитный эффект снижается, а к 72 ч не обнаруживается.

Полученный радиозащитный эффект Cd, регистрируемый по снижению репарации нуклеовда, межет быть объяснен либо за счет уменьшения исходного уровня попрехедеьности ДНК после облучения, либо за счгт повышения эффективности репарации. Для проверки этого предположения мы изучили динамику репарации во всех использованных тми типах клеток. Т. к. защитный эффект наблюдался в двух из трех исследованных топах клеток спустя 48 ч после инъекции, то для дальнейших исследований мы выбрали именно этот срок.

Результаты опытов показывают, что сразу после облучения в ДНК ЛПК и спленоцитов мышей, предварительно обработанных хлоридом Cd, наблюдается тенденция к уменьшению количества повреждений в сравнении с необработанными животными. Тем не менее, спуски 1 ч, при комбинированной обработке, в этих клетках отмечается достоверное снижение уровня поврежденности ДНК за счет ускорения репарации, по сравнению с животными не получавшими хлорид Cd. В тимоцитах мышей, обработанных Cd, первоначальное количество поерехздений меньше, но репарация проходит медленнее по сравнению с таковой у необработанных животных.

Обнаруженное нами влияние ионов Cd на повреждение и репарацию ДНК в лимфоцдных клетках ставит вопрос о возможных механизмах этого эффекта. Известно, что синтез МТ может происходить в лимфоидных клетках (Peavy, Fairchiid, 1987; Huerta et al., 1989). Так как индукция МТ происходит в условиях окислительного стресса, то предполагается, что МТ ифают роль перехватчика свободных радикалов (Sato, Bremner, 1993). Радиационно-химические исследования in vitro показывают, что CdVZrvMT является эффективным радиопротектором в случае повреждения сахарофосфатного остова ДНК (Greenstock et al., 1987). На основании литературных данных можно предположить, что МТ могут уменьшать начальной выход радиацисшно-индуцированных повреждений путем перехвата ОН-радикалое (Mel, Reurter, 1969: Thomalley, Vasak, 1985). С другой стороны, известно, что воздействие на клетку канцерогенов или UV-обпучения ведет к экспрессии МТ-генов (Angel et al., 1986; Fomace et al., 1988), что поедполагает косвенное участие МТ в регуляции процессов репарации ДНК. МТ »«гут регулировать экспрессию генов (Zeng et al., 1991) или же прямо регулировать активность Zn-зависимых ферментов путем переноса на них ионэ Zn (Udom, Brady, 1980). Так кж ряд

ферментов, участвующих в репарации, являются Zn-зависимыми, то высокий уровень МТ действительно может способствовать репарации ДНК. Вместе с тем, результаты исследований позволяют также предполагать, что возможно ионы тяжелых металлов, повреждающие ДНК, наряду с активацией экспрессии МТ-тенов активируют и гены, контролирующие репарацию ДНК.

3.3. Влияние острого и хронического воздействия ионов Cú2* и у-радиации на образование МЯ в клетках костного мозга мышей

' Повышение выживаемости облученных животных, предварительно обработанных Cd в дозах 0,75-3 мг Cd3*/Kr, может быть связано с индукцией перекрестного адаптивного ответа. Поэтому, для дальнейшего исследования комбинированного действия Cd и j-облучения мы использовали общепринятую экспериментальную модель изучения адаптивного ответа: микроядерный тест in vivo. Введение хлорида Cd в дозе 1 мг Cd/кг приводит к достоверному возрастанию числа МЯ (11,33±0,67) по сравнению с контролем (2,17±0,48). В то же время, ^облучение в дозе 1,7 Гр дает гораздо более выраженный эффект цитогенетического повреждения (67,33±0,88). При комбинированном воздействии, то есть при -/-облучении животных, предварительно обработанных хлоридом Cd за 24 ч до облучения, наблюдается уменьшение частоты МЯ (32,86±0,51)по сравнению с ожидаемой суммарной (78).

При хронической обработке мышей хлоридом Cd в нетоксических концентрациях (5 мг/л) статистически достоверного увеличения частоты МЯ не наблюдается (рис. 3.3).

100

10

о

Рис. 3.3. Индукция микроядер в полихроматофильных эритроцитах при хроническом воздействии хлорида Cd и радиации; по вертикали-количество микроядер на 1000 клеток; 1-дантроль; 2-хлоред Cd в питьевой воде, 5 мг Са27л, 32 суг, З-хроничесхое облучение, 1 Гр, 32 суг, 4-хроническое комбинированное действие хлорида ОЗ и радиации; 5-хроническое действие хлорида Cd и острого облучения, 1 Гр; 6-острое облучение, 1 Гр.

При хроническом действии радиации наблюдается рост числа МЯ в полихроматофильных эритроцитах, как по сравнению с контролем, так и по сравнению с результатами, полученными при действии хлорида Cd. Тем не менее, острое у-об лучение в той же дозе приводит к более значительному цитогенетическому повреждению. Добавление хлорида Cd в питьевую воду хронически облученных мышей не вызывает роста количества МЯ в клетках костного мозга. Если же по окончанию хронического действия Cd животные облучались острой дозой 1 Гр, то количество МЯ в полихроматофильных эритроцитах было у них ниже, чем у тех, которые не получали хлорид Cd. Здесь мы вцдим индукцию радиорезистентности по образованию МЯ в полихроматофильных клетках костного мозга мышей, предварительно хронически получавших хлорид Cd.

При хроническом действии хлорида Cd отсутствие выраженного эффекта цитогенетического поврехедения может быть объяснено за счет параллельно протекающих процессов восстановления повреждений, которые ответственны за формирование МЯ. Вероятно, из тех же соображений объясняется отсутствие дополнительных повреждений при комбинированном хроническом воздействии по сравнению с хроническим у-облучением.

В основе развития адаптивного ответа лежит активация генома при воздействии токсических факторов в малых дозах (Wolff et а!., 1989). Выше было показано, что Cd индуцирует ОР ДНК в эукариотических клетках, возможно благодаря генерации свободных радикалов (Ochi et al., 1983; Snyder, 1988). Вместе с тем, известно, что Cd в низких концентрациях стимулирует синтез ДНК (Von Zglinicki et al., 1992). Наблюдаемое нами снижение уровня цитогенетических повреждений три хроническом действии хлорида Cd и последующем остром у-облучении может объясняться индущией специфического адаптивного ответа, сигналом для которого является повреждение ДНК.

Не исключено, что наблюдаемое при действии хлорида Cd и остром /облучении снижение количества МЯ обусловлено радиозащитным действием МТ, которые синтезируются при как при остром, так и хроническом действии Cd и других тяжелых металлов (Sugihira et al., 1988; Doz et al., 1992).

3.4. Влияние ионов Cd2* на индуцибельные системы репарации ДНК

В предыдущих разделах было показано, что воздействие Cd вызывает резистентность к последующему острому -^облучению. Для выяснения природы описанной нами реакции мы исследовали влияние ионов CdJ* на известные системы индуцибельной репарации ДНК: адаптивный ответ к малым дозам ионизирующей радиации и SOS-ответ.

На рис. 3.4. приведены результаты экспериментов по изучению влияния хронического действия хлорида Cd на развитие адаптивного ответа к ионизирующей радиации.

10

1

1

Рис. 3.4. Влияние хронического действия Сс1 на развитие адаптивного ответа к малым дозам у-облучения; по вертикапи-копичество микроядер на 1000 клеток; 1-контроль; 2-хроническое облучение, 1 Гр, 32 сут; 3-острое облучение, 1 Гр; 4-последоеательное хроническое (1 Гр) и острое ^облучение (1 Гр); 5-сочетание комбинированного хронического и острого у-облучения с хроническим воздействием хлорида С4 5 мг Сдъ1ип в питьевой воде, 32 сут; ^-ожидаемый выход МЯ при суммировании от хронического и острого облучения.

Радиоадаптивный ответ был зарегистрирован при анализе частоты МЯ в полихроматофильных эритроцитах мышей, хронически облученных при мощности дозы 1,3 мГр/ч в течение 32 сут, и последующем облучении повреждающей острой дозой 1 Гр. Адаптивный ответ проявлялся в уменьшении частоты МЯ в полихроматофильных эритроцитах при последовательном воздействии низкоинтенстивным хроническим и острым повреждающим у-облучением по сравнению с ожидаемым выходом МЯ при облучении животных отдельно в хроническом и остром режиме. Хроническое воздействие Сс1 в сочетании с хроническим облучением приводит к ингибированию адаптивного ответа. Тем не менее, наблюдаемая частота МЯ при хроническом воздействии ионов Сс12* и ^облучения и последующем остром облучении не превышает суммарную ожидаемую величину. Фактически, частота МЯ в клетках костного мозга при хроническом комбинированном воздействии низкоинтенсивной у-радиации и ионов С<1г* и последующем повреледающем остром облучении но отличается от данных, поучаемых только при остром -,-облучении в дозе 1 Гр. Таким образом, введение ионов Сй2> через питьевую воду в организм мышей приводит к угнетению адаптивного ответа, индуцируемого при хроническом низкоинтенсивнсм облучении животных.

В связи с полученными данными в этой серии экспериментов, было интересно проанализировать возможность влияния ионов СсГ* на другой хорошо изученный на бактериях

индуцчбельный процесс-SOS-oTEST.

Результаты экспериментов показали, что при действии ионов Cd2* на клетки Е. coli PQ37 не наблюдается индукции 505-отвата. Повышение концентрации Cd в инкубационной среде на три порядка не оказывает сколь либо заметного влияния на величину l(c). Облучение UV254 приводит к ярко выраженной индукции SOS-ответа. Тем не менее, при добавлении ионов Cd2* в инкубационную среду не отмечается статистически достоверных отличий от позитивного контроля. Можно говорить лишь о некоторой тенденции к ингибированию SOS-ответа. Таким образом ионы Cd2* не оказывают влияния на развитие SOS-ответа в клетках Е. coli.

Представленные данные позволяют предположить, что механизм развития адаптивного ответа на действие Сс) отличается от механизма развития адаптивного ответа на малые деза ионизирующей радиации. Если в адаптивный ответ на действие Cd извлечены те же ферменты, что и в случае адаптивного ответа на малые дозы радиации, то снесение дополнительного количества повреждений должно приводит к усиленной экспрессии соответствующих генов и, следовательно, к усилению адаптивного ответа. Тем не менее, наблюдается обратная картина.

Представляется маловероятным, что происходит насыщение систем репарации ДНК за счет дополнительных поврг>едений при действии ионоз Cd2* на фоне хронического облучения. Если бы это бьШо.так, то комбинированное хроническое воздействие Cd и ^облучения приводило бы к усилению цитогензтического поврездения по сравнению с хронячесадм -^облучением, но этого нэ наблюдается (Рис. 3.3). Вероятно, наблюдаемое подавление адаптивного ответа на малые дозы ионизирующей радиации обусловлено либо прямым ингибированием ферментов репарации ДНК, лйбо нарушением экспрессии генов их кодирующих.

Существуют данные об ингебирующем действии Cd на синтез ДНК, РНК и белкоз в различных линиях клеток (Von Zglinicki et al., 1992; Nocentini, 1937). Получены прямые экспериментальные доказательства того, что Cd ингибирует репарацию повреждений, индуцированных УФ-сблучением, матпметансульфокатом и бензо[а]пиреном (Nocentini, 1937; Hartwg et al., 1996; Hartmann, Speit, 1996; Lynn et aJ, 1997), a также Fpg-чувствительных сайтов (Orfy, Halwig, 1997).

Показано, что Cd подавляет активность ДНК-полимеразы (S in vitro путем прямого взаимодействия с ферментом (Роргпое, Schmaeler, 1979). Следствием такого взаимодействия может являться замена 2л (кофактора всех ДНК-лолимерзз) на Cd. Вполне вероятно, что Cd гложет,замещать Zri и в других реппикативных и репаративных ферментах.

Извеслю, что Cd имеет противоопухолевую активность (Waalkes et al., 1991; Waalkes et al., 1993). В рпце работ отмечено ингибирующеэ действие Cd на синтез ДНК и пролиферацию, вызванную ростовыми факторами и митогенами (Tang et «I., 1991; Otsuka, Ohsrr.va, 1991). Поскольку адаптивный ответ на малые дссы у-облучения связан с активацией ДНК-лслимераз (Кожановская и др., 1990), то не исключено, что в основе ингибирования адаптивного ответа и

роста опухолевых клеток ионами Cd лежат одни и те же процессы, а именно действие Cd на гены и/или их продукты, необходимые как для процессов репликации, так и репарации ДНК,

Ионы Cd2* не индуцировали SOS-ответ в условиях нашего эксперимента на бактериях. Ни одна ил используемых концентраций не могла ингибироватъ рост бактерий и тем самым подавить SOS-ответ (Rayner, Sadler, 1989). Отсутствие SOS-ответа обычно объясняется подавлением инициации SOS-функций (Jin, 1993; Rehrauer et al., 1996). Тем не менее, инкубация Е. coli в среде, содержащей ионы Cd2*, перед облучением UV2M приводит лишь к статистически недостоверному снижению индукции SOS-ответа.

Развигие SOS-ответа прямо связано с уровнем поврежденности генома (Takahashi et al., 1988), в том числе с индукцией ОР (Walker, 1985). По данным (Quillardet et al., 1989) в Е. сой SOS -ответ возникает при дозе уоблучения «5 Гр. При этой дозе выход ОР составляет ~ 14 на геном. Концентрация 1-2 мкМ Cd индуцирует 28 ОР на однонитевую ДНК Е. coli (Mitra, Berstein, 1978). Диапазон концентраций Cd использованный в наших экспериментах и в работе (Mitra, Bernstein, 1978) перекрывается. В то же время, показано, что возникновение сколь либо значительного уровня повреждения ДНК наступает только спустя 2 ч инкубации клеток Е. coir в присутствие Cd2* (Mitra, Bernstein, 1978). В наших экспериментах это время составляло 1 ч. Таким образом, отсутствие влияния Cd на развитие SOS-ответа в наших экспериментах вероятнее всего объясняется недостаточным уровнем поврежденности ДНК за счет недостаточного времени инкубации.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в основа генотоксического действия Cd на лимфоидные клетки мышей лежит способность Cd индуцировать щелочалабильные сайты и ОР в ДНК, часть которьи имеет З'ОН-концы. Эти типы повреждений в лимфоидных клетках репарируются in vivo. Динамика повреждения и репарации ДНК в различных типах лимфоидных клеток имеет тканеслецифичный характер и зависит от концентрации Cd в ткани.

2. Установлено образование МЯ в полихроматофильных клетках костного мозга мышей под действием Cd. Формирование этих цитогенетичесхих повреждений связано с возникновением медленно репарируемых или нерепарируемых разрывов в ДНК.

3. Показано, что при последовательном комбинированном воздействии Cd и у-радиации на мышей чаблюдается радиозащитный эффект по повреждению ДНК, который зависит от времени между инъекцией хлорида Cd и последующим уоблучением. Максимальный радиозащитный эффект наблюдается спустя 48 ч после инъекции, в ЛПК и спленоцитах, и спустя 24 ч в тимоцитах. Радиозащитный эффект, опосредованный Cd, обусловлен уменьшением начального выхода повреждений ДНК и ускорением репарации повреждений.

4. Установлено, что хроническое поступление в организм мышей хлорида Cd в нетоксической дозе в течение месяца не приводит к увелйчегмю частоты МЯ в полихроматофильных эритроцитах и не влияет на выход этих повреждений при хроническом -^облучении животных при мощности дозы 1,3 мГрА< в течение того же времени. •

5. Как острое, так и хроническое предварительное воздействие на мышей хлорида Cd приводит к снижению частоты МЯ, наблюдаемых при последующем остром -¡«облучении животных, что указывает на индукцию Cd радиорезистентного адаптивного ответа в клетках мышей. Однако, при сочетанием хроническом воздействии Cd и -^радиации в малых дозах ье обнаруживается индукции адаптивного ответа, выявляемого при последующем остром облучении.

6. Обработка клеток Е. coli хлоридом Cd (2*10^-2х10'3 мг Cd37wn) в течение 1 ч не приводит к индукции в них SOS-ответа и не влияет на развитие SOS-ответа индуцируемого UV-облучением.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Привезенцеа К. В., Мипонова И. Н., Безлепкин В. Г. Оценка токсических и генотоксическмх эффектов Cd и Ni в альготеста и SOS-хромотесте IIУспехи Соерем. Биопогии.-1995.-Т. 115, Вып. 6.-С. 759-764.

2. Привезенцев К. В., Сирота Н.П., Газиев А. И. Влияние сочетанного воздействия Cd и ^радиации на повреждение и репарацию ДНК в лимфоидных тканях мышей // Радиационная Биополя. Радиосшпогия.-1998.-Т. 38, Вып. 2.-С. 234-240

3. Привезенцеа К. В., Сирота Н.П., Газиев А. И. Исследование генотоксических эффектов кадмия h vivo II Цитология и Генетика.-199в.-Т. 30, № З.-С. 45-51.

4. Привезенцеа К. В, Влияние острого и хронического воздействия кадмия и граднации на образования микроядер в клетках костного мозга мышей II Цитология и Генетика.-1997.-Т. 31, № 1 .-С. 11-16.

5. Privezentzev С. V., Sirofa N. Р., Fomento L. A Combined action of cadmium and gam/na-¡tracfefton on eukaryoüc genome II 25th Ann. Meeting of the Europ. Society tor Radiat Biol., Stockholm, 1993.-P.-{P05:12].

6. Мипонова И. H., Привезенцеа К. В., Сирота Н.П., Фоменко Л. А., Безлепкин В. Г., Газиев А И. Сравнительное изучение эффектов сочетанного действия радиации и тяжелых металлов с примэнэшкйл разлумных биотсстоа II Радаобиол'. съезд. Киев, 20-25 сент., 1993: Тез. Докл,-Рущино, 1993.-С. 665-667.

7. Сирота Н. П., Привезенцеа К. В. Изучение повреждения ДНК лимфоидных клеток мышей при действии ионо8 кадмия и ^радиация // Радиобиол. съезд. Киго, 20-25 cea., 1593: Тез. Докл.-Пущино, 1993.-С. 923-924.

8. Privezentzev C. V., Bezlepkin V. "3., Sirota N. P., Gaziev A I. Comparative studies of biological responses to Cd exposure using several short -term assays //17th Ann. Conference of tlie Europ. Society »or Comparative Physiol. Biochem., Antwerp, 1996.-P. 192.

9. Privezentzev C. V., Sirota N. P., Gaziev A I. The possible rote of DNA repair in Cd-induced defence systems // 17th Ann. Conference of the Europ. Society for Comparative Physiol. Biochem., Antwerp, 1996.-P. 70.

10. Privezentzev C. V., Sirota N. P., Bezlepkin V. G. The role of genetic mechanisms in cadmium carcinogenicity II NATO ASI Molecular and Applied Aspects of Oxidative Drug Metabolizing Enzymes, Tekirova, 1997.-P. 101.

11. Privezentzev C. V., Sirota N. P., Bezlepkin V. G., Gaziev A. I. The influence of cadmium on different pathways of DNA damage and repair induced UV- and irradiation II NATO ASI Damage and Repair Oxygen Radical Effects, Cellular Protection and Biological Consequences, Tekirova, 1997.-P.

117.