Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие металлотионеинов в формировании ответной реакции растительных и животных клеток на действие ү-излучения и ионов кадмия

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Участие металлотионеинов в формировании ответной реакции растительных и животных клеток на действие ү-излучения и ионов кадмия"

На правах рукописи

Данилин Илья Анатольевич

Участие металлотионеинов в формировании ответной реакции растительных и животных клеток на действие у-излучения и ионов кадмия

Специальность 03.00.01 - "Радиобиология"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск-2004

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии Российской академии сельскохозяйственных наук и Обнинском Государственном техническом университете атомной энергетики

Научные руководители:

Доктор биологических наук

Доктор биологических наук, профессор

Гераськин Станислав Алексеевич Сынзыныс Борис Иванович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Рябченко Николай Ильич

Кандидат биологических наук Мирзоев Эльдениз Балабек оглы

Ведущая организация: Институт химической физики им. академика Н.Н. Семенова РАН, Москва

Защита диссертации с о с _ 4г. в

ОЗо Т

С/ ' часов на заседании Диссертационного совета Д 006.068.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии.

249032, Калужская обл., г. Обнинск, Киевское шоссе, 109 км, ВНИИСХРАЭ, Диссертационный совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии.

Автореферат разослан _2004 г

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Санжарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Важным классом белков, участвующих в формировании ответной реакции клетки на стрессовое воздействие, являются металлотионеины (МТ) (Sanita di Toppi, 1999; DeMoor, Koropatnick, 2000). MT растений имеют специфические особенности, отличающие их от МТ млекопитающих. Согласно принятой классификации (Fowler et al., 1987), МТ в растительной клетке называются фитохелатинами (РСП). Наличие в промоторном участке МТ-генов сайтов, реагирующих на изменения концентрации ионов тяжелых металлов и свободных радикалов (Andrews et al., 1999), а также увеличение количества МТ после облучения (Bakka et al., 1982; Matsubara, 1988; Котеров и др., 1998) позволяет предположить, что МТ участвуют в реакции клетки на воздействие не только тяжелых металлов, но и ионизирующего излучения.

В современной практике экологического мониторинга в основном используют физико-химические методы анализа, которые позволяют лишь косвенно судить о действии поллютантов на живую природу. Другой подход к решению этой проблемы связан с использованием методов биологического мониторинга, которые дают прямую информацию об опасности загрязнения окружающей среды. К преимуществам биологического мониторинга относится также то, что полученная с его помощью информация позволяет дать интегральную картину, учитывающую всю совокупность действующих факторов, а также синергические и антагонистические эффекты их взаимодействия, в том числе и тех, которые не отслеживают контролирующие уровень техногенного загрязнения службы, поскольку они ориентированы на анализ фиксированной номенклатуры техногенных токсикантов. Использование в целях биологического мониторинга уровня МТ в органах и тканях растений и животных позволяет прямо оценить биологическое действие физических и химических агентов окружающей среды. Следовательно, изучение участия МТ в формировании ответной реакции растительных и животных клеток на действие -излучения и ионов кадмия (Cd) представляет не только теоретический, но и практический интерес.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлся анализ участия МТ в формировании ответной реакции растительных и животных клеток на раздельное и сочетанное действие у-излучения и ионов Cd.J3,nn достижения поставленной цели необходимо было

r ÜllbilMOTtKA j О»

1. Изучить изменение удельного содержания МТ в печени мышей при раздельном и сочетанном действии ионов Cd и у-излучения.

2. Изучить изменение удельного содержания РС„ в корешках проростков ячменя при раздельном и сочетанном действии ионов Cd и у-излучения.

3. Изучить изменение удельного содержания МТ в органах и тканях двустворчатых моллюсков при раздельном и сочетанном действии ионов Cd и у-излучения.

4. Оценить эффективность использования уровня МТ в органах и тканях растений и животных в целях экологического мониторинга и анализа комбинированного действия факторов разной природы.

Положения, выносимые на защиту:

1. Гамма-излучение вызывает увеличение уровня фитохелатинов в проростках ярового ячменя;

2. Сочетанное действие у-излучения и ионов Cd в изученном диапазоне доз и концентраций приводит к синергическому увеличению удельного содержания МТ в жабрах моллюсков (АпобоМа sp.) и антагонизму в печени мышей и проростках ярового ячменя.

Научная новизна. Впервые показано, что у-излучение увеличивает уровень фитохелатинов в проростках ярового ячменя. Показано, что комбинированное действие у-излучения и ионов Cd в исследуемых дозах и концентрациях приводит к достоверному антагонистическому эффекту по уровню фитохелатинов.

Продемонстрировано достоверное синергическое увеличение уровня МТ в жабрах моллюсков (Апобоп1а sp.) при комбинированном действии у-излучения и ионов Cd. Установлено отсутствие в исследованном диапазоне зависимости содержания МТ в жабрах моллюсков (Апобоп1а sp.) от дозы у-излучения.

Показано, что комбинированное действие у-излучения и ионов Cd в исследуемых дозах и концентрациях приводит к достоверному антагонистическому эффекту по уровню МТ в печени мышей. Установлено, что предварительное введение подкожно раствора хлорида кадмия увеличивает выживаемость подвергнутых воздействию у-излучения мышей.

Практическая значимость работы. Результаты представленных в диссертационной работе лабораторных и полевых экспериментов

свидетельствуют о высокой эффективности и информативности использования удельного содержания МТ в органах и тканях моллюсков в качестве биоиндикационного параметра в программах биологического мониторинга антропогенно загрязненных территорий.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международном конгрессе "Энергетика - 3000" (Обнинск, 1998), всероссийской конференции "50 лет производства и применения изотопов в России" (Обнинск, 1998), международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы экологии на рубеже третьего тысячелетия и пути их решения" (Брянск, 1999), конференции "Радиация и биосфера" (Обнинск, 2000), IV съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001), VIII Российской научной конференции "Радиационная защита и радиационная безопасность в ядерных технологиях" (Обнинск, 2002), международной конференции "Геоэкологические проблемы загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами" (Тула, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы и трех приложений. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 103 публикации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы двустворчатые моллюски беззубки (Anodonta sp.) и перловицы (Unio sp.j, отловленные в р. Протве, вблизи г. Обнинска Калужской обл., моллюски прудовики (Lymnaea sp.), катушки (Planorbahus sp.), шаровки (Sphaerum sp.), отловленные в Белкинском пруду, г. Обнинска Калужской обл. Моделирование загрязнения водоема кадмием проводили в лабораторных условиях, для чего моллюсков беззубок (Anodonta sp.) культивировали в аквариумах с водопроводной водой, содержащей ионы Cd в концентрации 0.2 и 1 мг/л. Моллюсков подвергали острому облучению в дозах 25, 50, 150 Гр при мощности дозы 37.8 Гр/ч (установка "Gamma Cell-220", Канада), затем

помещали в аквариум с водопроводной водой. Определение МТ проводили через 24 ч и 8 суток после облучения. Использовали 90 моллюсков на вариант.

Для оценки комбинированного действия ионов Cd и у-излучения моллюсков сначала содержали в аквариуме, постоянно поддерживая концентрацию ионов Cd равной 0.2 мг/л, затем облучали в дозе 25 Гр, выдерживали в чистой водопроводной воде 8 суток и определяли удельное содержание МТ. За сутки до анализа содержания МТ оценивали состояние организма моллюсков по фильтрующей способности. Для этого моллюсков из опытной и контрольной групп помещали в окрашенную тушью воду ("ГАММА", ТУ 6-15-458-86), 50 мкл туши на 200 мл воды; через сутки производили визуальное сравнение окраски воды. Препарирование мягкого тела моллюска осуществляли согласно анатомическому атласу внутреннего строения (Цихон-Луканина, 1987). Извлеченные органы (жабры, печень, почки и мантия) очищали от посторонних включений и взвешивали. До начала анализа пробы хранили при температуре -40°С. Использовали 30 моллюсков на вариант.

Для исследования действия у-излучения на уровень МТ мышей облучали (установка "Gamma Cell-220", Канада) в дозах 9 и 10 Гр при мощности дозы 37.8 Гр/ч. В этом опыте были следующие группы мышей: контрольная группа; облученные в дозе 9 Гр; облученные в дозе 10 Гр; группа сочетанного действия CdCb 1 мг/кг массы мыши подкожно и у-облучение в дозе 9 Гр; группа сочетанного действия CdCb 1 мг/кг массы мыши - подкожно и у-облучение в дозе 10 Гр. Использовали по 5 мышей на группу. Двум последним группам вводили раствор CdCb, через сутки облучали, через 43 ч забивали и извлекали печень для анализа.

В опытах по определению временной зависимости выживаемости мышей после действия CdCb в концентрации 2 мг/кг массы мыши и у-облучения в дозе 9 Гр использовали беспородных мышей-самок. Раствор CdCb вводили подкожно ежедневно в течение 4-х суток. Облучение проводили при мощности дозы 37.8 Гр/ч (установка "Gamma Cell-220", Канада), через сутки после последнего

введения Cd. Наблюдение вели 25 суток. Мышей, которым предварительно вводили раствор CdCb, сравнивали с облученными мышами. Ежедневно отмечали число павших мышей в каждой группе. Количество мышей в группе 15. Выживаемость определяли в процентах как отношение количества выживших мышей на данные сутки к начальному количеству мышей в группе.

В исследовании также использовали семена ярового ячменя Hordeum vulgare L. сорта Зазерский 85 первой репродукции урожая 2000 года. Масса 1000 семян 45.1 г, влажность 9.3%. Для обеспечения равномерности набухания и синхронизации делений клеток семена в течение суток выдерживали при температуре +4°С в стаканчиках с дистиллированной водой. Для изучения индукции РСП у-излучением наклюнувшиеся семена (через 18 ч проращивания) облучали в дозе 15 сГр при мощности дозы 0.5 Гр/ч (установка "Луч-2", ^Со, Россия). Для изучения индукции МТ при воздействии кадмия после замачивания семена помещали в растворы с концентрацией ионов Cd 112 и 1120 мг/л. Использовали 1200 семян на вариант. Через 24 ч, по достижении корешками длины 10-15 мм, их отрезали и использовали для анализа.

Измерение уровня МТ проводили радиохимическим методом по методике, описанной в (Eaton, Cherian, 1991) с небольшой модификацией (в качестве индикатора использовали 109CdCl2 и CdCb в 0.01 М Трис-НС1-буфере, рН 1.4, суммарная концентрация Cd2+ в смеси 2.0 мкг/мл, радиоактивность 40.0 кБк/мл).

Гель-фильтрацию образцов тканей растений проводили на колонке ("Whatman", Англия), заполненной Sephadex G-50. Объем пробы для гель-фильтрации был равен 1 мл полученного супернатанта + 3 капли индикатора феноловый красный. Длина колонки 1 м. Скорость потока элюента 56 мл/ч. Объем собираемой фракции - 1 мл. Элюент - 10 мМ Трис-HCl буфер, содержащий 0.1 М NaCI, рН 8. Измерение оптической плотности полученных фракций проводили при длине волны 254 нм относительно буфера. Для определения SH-групп в аликвоты каждой фракции с колонки объемом 3 мл вносили по 0.02 мл реактива Эллмана (раствор 3.96 мг 5.5'-дитиобис (2-нитробензойная кислота) в 10 мл буфера), перемешивали и определяли оптическую плотность при длине волны 412 нм относительно контрольной пробы (Веревкина и др., 1911). Содержание кадмия в белковых фракциях после гель-фильтрации определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии.

Экспериментальные данные подвергали статистической обработке; использовалась методика статистического анализа эмпирических распределений (Гераськин и др., 1994), позволяющая определить оптимальный объем выборки, необходимый для получения оценок изучаемых параметров с заданной точностью.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Удельное содержание металлотионеинов при действии ионов кадмия и у-излучения в органах и тканях моллюсков Anodonta sp.

Загрязнение воды кадмием. При внесении в среду обитания моллюсков ионов Cd в концентрации 0.2 мг/л наблюдается накопление МТ в жабрах (рис. 1А), мантии и других внутренних органах беззубок с течением времени. Однако достоверное увеличение уровня МТ, в зависимости от исследуемого органа, происходит только на 6-е сутки культивирования. К 16 суткам во всех органах отмечается 2-3-кратное увеличение содержания МТ (рис. 1). При. увеличении концентрации ионов Cd в воде до 1 мг/л уровень МТ во всех исследованных органах повышается примерно в 2 раза, однако это увеличение становится достоверным по сравнению с контролем лишь к 6-ым суткам (рис. 1Б - Г).

Из представленных на рис. 1 результатов следует, что под воздействием ионов Cd происходит увеличение синтеза МТ в органах и тканях моллюсков. Аналогичные результаты были получены (Bebianno, Langston, 1999) на морских моллюсках Mytilus edulis в лабораторных аквариумах с растворенными в морской воде солями Cd (100 мкг/л). Из полученных в нашей работе результатов следует, что необходимо порядка 6 суток для того, чтобы контакт с ионами тяжелых металлов приводил к достоверному увеличению содержания МТ в тканях моллюсков.

Острое у-облучение. В первые сутки после облучения наблюдалось уменьшение удельного содержания МТ в жабрах, печени и мантии моллюсков по сравнению с контролем (табл. 1). Вероятно, к этому моменту клетки моллюска израсходовали имевшийся запас МТ на связывание образовавшихся при облучении свободных радикалов. Затем, синтез этих белков увеличивается, и к 8-м суткам уровень МТ достоверно возрастает по сравнению с контролем (табл. 1). Такой характер изменения содержания МТ в тканях моллюска показывает, что повышение его содержания на 8-е сутки после облучения обусловлено увеличением синтеза de novo, а не уменьшением деградации существующих белков.

Рис.1. Динамика удельного содержания МТ в органах АпобоМа sp. при действии ионов СС.

По оси ординат - содержание МТ, мкг/г; по оси абсцисс - время, сутки. А - жабры; Б - печень; В - мантия; Г - почки. 1 - контроль; 2 -1 мг/л ССС12; 3 - 0.2 мг/л ССае. * Отличие от контроля достоверно, р<0.05.

Таблица 1.

Изменение удельного содержания МТ в органах и тканях Anodonta ер. после у-облучения в дозе 25 Гр

Орган/ Ткань Содержание МТ, мкг/г

1 сутки 8 сутки

Контроль 25 Гр Контроль 25 Гр

Жабры 2.54+0.77 2.08+0.37 2.2+0.4 3.61+0.65*

Печень 2.87+0.95 1.34+0.08* 2.6±0.8 4.51+0.17*

Почки 14.85±5.04 18.6+3.60 11.2+2.6 41.36+10 6*

Мантия 3.67+0.81 2.34+0.14* 4.3+0.75 7.39+0.83*

* Отличие от контроля достоверно, р<0.05.

На рис. 2 представлена зависимость уровня МТ от дозы острого у-облучения. В литературе имеются сведения (Котеров, Филиппович, 1995) о количестве МТ в клетках мышей в зависимости от величины дозы облучения, однако в наших опытах индуцированный облучением уровень МТ, хотя и превышал достоверно контрольное значение при всех использованных значениях экспозиции, но не проявлял зависимости от величины дозы (рис. 2). При этом также не отмечено, по крайней мере в течение 8 суток, изменений в фильтрующей способности моллюсков, которую определяли по замутненности окрашенной тушью воды: вода с тушью обесцвечивалась моллюском вне зависимости от полученной дозы.

Комбинированное действие у-излучения и Об. Из табл. 2 видно, что у-облучение в дозе 25 Гр приводило к достоверному повышению уровня МТ в жабрах. Однако если облучению предшествовало содержание моллюсков в воде с 0.2 мг/л Сс!С12 (что само ~ по себе приводит к достоверному увеличению содержания МТ в жабрах в 2.48 раза), то уровень МТ превышал контроль в 8.3 раза. Расчет значения коэффициента взаимодействия и проверка значимости его отличия от единицы позволяют утверждать, что в данном случае наблюдался достоверный синергический эффект: Кж=3.50, р<0.05. Аналогичные в качественном отношении результаты были получены при изучении (М^эиЬага, 1988) индуцированных комбинированным действием кадмия и у-облучения эффектов в печени мышей.

Таблица 2.

Удельное содержание МТ в жабрах /\nodonfa эр. при действии хлорида кадмия и у-излучения

Концентрация Ионов Сс1, мг/л Доза, Гр Содержание МТ в жабрах моллюсков, мкг/г

контроль опыт

0 25 2.20±0.44 3.61Ю.65*

0.2 0 2.50±0.32 6.20+0.82*

0.2 25 2.45±0.41 20.35±0.65*

* Отличие от контроля достоверно, р<0.05.

Удельное содержание металлотионеинов в печени мышей после у-облучения и введения ионов кадмия

Воздействие ионов Сб. На рис. 3 представлены данные об изменении удельного содержания МТ в печени мышей после введения подкожно раствора CdCb. Видно, что такое воздействие вызывает у животных достоверное увеличение МТ уже через 3 ч после введения. Приведенные данные свидетельствуют об эффективности введения раствора CdCb в количестве 1 мг/кг веса животного подкожно как индуктора МТ в печени мышей.

Рис. 3. Динамика удельного содержания МТ в печени мышей после введения раствора CdCb подкожно: 1 - контроль, 2 - CdCb в концентрации 1 мг/кг.

По оси ординат - удельное содержание МТ, мкг/г; по оси абсцисс -время, ч.

*Отличие от контроля достоверно, р<0.05.

Острое /облучение. В табл. 3 представлены данные о количестве МТ в печени мышей после однократного острого облучения в дозах 9 и 10 Гр через 43 ч. Видно, что удельное содержание МТ в печени мышей увеличивается примерно в 1.53 и 1.47 раза соответственно при данных условиях облучения, что согласуется с результатами (Котеров и др., 1997).

Временная зависимость выживаемости мышей после у-облучения и введения кадмия. Результаты наших экспериментов показывают, что четырехкратное подкожное введение раствора CdCb перед у-облучением в дозе 9 Гр вызывает радиопротекторный эффект. К 14-ым суткам темпы снижения выживаемости замедляются, а к 19-ым суткам выживаемость выходит на плато -

Таблица 3.

Удельное содержание МТ в печени мышей при действии хлорида кадмия и у- излучения

Концентрация СсЮЬ, мг/кг Массы мыши Доза, Гр Содержание МТ в печени мышей, мкг/г

Контроль Опыт

1 0 23.4±3.4 220.2+35.4*

0 9 22.3±2.8 34.2+5.8*

1 9 21.8±3.5 66.9+18.1*

0 10 23.2±2.2 34.3+7.3*

1 10 22.8±2.3 65.5±17.3*

* Отличие от контроля достоверно, р<0.05.

достигает 40% - и более не изменяется. Наблюдаемое увеличение выживаемости, вероятно, связано с увеличением уровня МТ в костном мозге (Котеров, Сазыкин, Филиппович, 1993), а также в печени мышей при действии ионов Cd. Подобная связь, выраженная значительно слабее по сравнению с костным мозгом мышей, была показана в работе (Котеров, Сазыкин, Филиппович, 1993).

Установленное нами увеличение содержания МТ в печени мышей позволяет предположить, что повышение выживаемости мышей на 40% связано с радиопротекторными свойствами МТ. В пользу этого предположения свидетельствуют имеющиеся в литературе- сведения о радиационно-индуцированном синтезе МТ в клетках млекопитающих (Котеров, Сазыкин, Филиппович, 1993; Matsubara, 1988; Котеров, Сазыкин, 1994).

Комбинированное действие Лизлучения и Сб. Из табл. 3 следует, что совместное введение раствора CdCfe и воздействие у-излучения, приводит к достоверному (р<0.05) антагонистическому эффекту К№=0.216 - 1 мгСс!/кг + у, 9 Гр и К«,=0.205 - 1мгСс1/кг + у, 10 Гр. Этот результат обусловлен существенным снижением индуцированного в условиях комбинированного действия уровня МТ по сравнению с действием одного кадмия. В то же время, если сравнивать с контролем, то в условиях комбинированного действия происходит почти 3-х кратное и статистически достоверное увеличение содержания МТ. Т.е. на сочетанное действие столь различающихся по механизмам своего

биологического действия агентов клетка отвечает значительным увеличением синтеза эндогенных защитных веществ.

В зависимости от объекта исследования, а также в зависимости от органа, могут наблюдаются разные эффекты. В работе (Котеров и др., 1997) в клетках костного мозга мышей при одновременном воздействии ионов Cd и -/--облучения наблюдался аддитивный эффект. В той же работе показан антагонистический эффект в печени мышей, подвергнутых комбинированному воздействию CdCb и у-излучения, воспроизведенный в нашем эксперименте. Вероятно результат комбинированного действия ионизирующего излучения и тяжелых металлов на синтез МТ зависит от количества синтезируемых изоформ МТ в данном органе или ткани, способности ионизирующего излучения подавлять экспрессию той или иной изоформы МТ и соотношения доз и концентрации действующих агентов.

Удельное содержание фитохелатинов в клетках ячменя (Hordeum vulgare L.)

Раздельное действие. Поскольку одним из наиболее эффективных индукторов фитохелатинов (РСП) является Cd (Grill et al., 1987; Maitani et al., 1996), с целью проверки присутствия этих белков в проростках ячменя была изучена индукция РСП двумя концентрациями Cd - 112 и 1120 мг/л. Из представленных на рис. 4А результатов этого эксперимента видно, что наблюдается одновременное увеличение оптической плотности, содержания SH-групп и Cd при выходе из колонки низкомолекулярных соединений (фракции 2125). Поскольку оптическая плотность при длине волны 254 нм и повышенное содержание SH-групп во фракции является характерным признаком PCn (Grill et all., 1985), полученные в нашем эксперименте результаты свидетельствуют об их присутствии в проростках ячменя. Аналогичные данные были получены при изучении индукции РСП ионами тяжелых металлов в корешках Rubia tinctorium L и Rauvolfia serpentina (Grill et all., 1985).

Изменение оптической плотности и содержания SH-групп при действии на проростки ячменя у-излучения в дозе 75 сГр носит аналогичный характер (рис. 4Б). Максимальные значения этих показателей также наблюдаются во фракциях 21-25. В табл. 4 представлены значения оптической плотности в соответствующих максимуму кривых фракциях при проращивании семян ячменя. в условиях разных воздействий. Статистический анализ показал, что воздействие

18 19 20 21 22 25 24 25 % 27 28

Рис. 4. Профиль элюции белков (I) и БИ-групп (III), содержание Сс1 (II) после гель-

фильтрации экстрактов корневой меристемы проростков.

А) проращивание в среде с СС (1120 мг/л), Б) облучение в дозе 75 сГр.

По оси ординат слева - оптическая плотность (при длине волны 254 нм); по оси

ординат справа - оптическая плотность (при длине волны 412 нм) и концентрация

ионов СС, мг/л; по оси абсцисс - номер фракции.

изученных факторов на проростки ячменя ведет к достоверному увеличению оптической плотности фракций 22-24, что свидетельствует о стимуляции синтеза РСп.

Величины оптической плотности в вариантах с различающейся в 10 раз концентрацией Cd 112 и 1120 мг/л практически совпадают (табл. 4). Можно предложить разные объяснения этого факта. С одной стороны, это может свидетельствовать об отсутствии зависимости уровня индуцированного кадмием синтеза РС„ от его концентрации в изученном диапазоне. Не исключено, что продемонстрированное в нашем эксперименте отсутствие увеличения синтеза. РСП с ростом концентрации Cd объясняется токсическим действием более высоких концентраций этого тяжелого металла. В пользу этого предположения свидетельствует наблюдавшееся в этом варианте эксперимента подавление роста корешков проростков. Действительно, в работе (Zhu et al., 1999) воздействие ионов Cd в концентрации 16.8 мг/л вело к задержке роста растений индийской горчицы Indian Mustard. Однако в нашем эксперименте и работе (Maitani et al., 1996) воздействие 112 мг/л ионов Cd не являлось фактором задержки роста растений.

Таблица 4.

Оптическая плотность экстрактов проростков ячменя в зависимости от характера воздействия

1 Вариант опыта Номер фракции

22 23 24

Контроль 0.155+0.012 0.233±0.018 0.175+0.026

Cd, 112 мг/л 0.275±0.027* 0.308±0.020* 0.242+0.019*

, Cd, 1120 мг/л 0.228±0.002* 0.295Ю.053 0.234+0.066

! у-излуч., 75 сГр 0.255±0.040* 0.325+0.006* 0.256+0.035*

* Отличие от контроля достоверно, р<0.05.

На рис. 5 сопоставлены профили элюции, полученные при длине волны 254 нм при действии ионов Сс1 в концентрации 112 мг/л и у-излучения в дозе 75 сГр, из которого следует отсутствие изменений в характере кривой поглощения при у-облучении и воздействии ионов СС - стрессоров, различающихся механизмами биологического действия. Отметим, что по величине эффекта вариант с облучением мало отличается от вариантов с СС.

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Рис. 5. Профили элюции низкомолекулярных белков после гель-фильтрации экстрактов корешков проростков при воздействии СС или у- излучения. 1 - контроль; 2 - воздействие СС в концентрации 112 мг/л; 3 - у-облучение в дозе 75 сГр.

По оси ординат - оптическая плотность (при длине волны 254 нм); по оси абсцисс - номер фракции.

Комбинированное действие. В табл. 5 представлены оцененные методом радиоактивных индикаторов значения удельного содержания РСП в корешках проростков ячменя при раздельном и комбинированном действии кадмия и излучения, из которых следует, что удельное содержание достоверно увеличивается при всех изученных видах воздействия. При совместном воздействии ионов СС и ионизирующего излучения уровень РСП оказался ниже ожидаемого из модели аддитивного сложения эффектов. Расчет коэффициента взаимодействия показал, что в данном случае имеет место антагонизм: К»»=0.44, р<0.05. Антагонистический характер эффекта обусловлен существенным снижением индуцированного в условиях комбинированного действия уровня по сравнению с действием одного кадмия.

Таблица 5.

Удельное содержание РСП в корешках проростков ячменя

Воздействие Удельное содержание РС„, мкг/г сухой массы

Cd у-излучение

0 0 11.7±3.2

112 мг/л 0 360.1+192.7*

0 75 сГр 29.7±8.8*

112 мг/л 75 СГр 170.5+82.8*

* Отличие от контроля достоверно, р<0.05.

Уровень металлотионеинов в органах и тканях моллюсков как перспективный маркер комбинированного действия физических и химических агентов

Распределение металлотионеинов в органах и тканях моллюсков разных видов. Разные виды животных обладают разной способностью синтезировать МТ. Моллюски являются природными фильтраторами, обладают разной способностью поглощать из воды растворенные химические вещества, в том числе и тяжелые металлы. Полученные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют об отсутствии достоверных отличий удельного содержания МТ в органах и тканях перловицы и беззубки. Однако нужно отметить, что уровень МТ в мантии и внутренних органах беззубки несколько ниже, чем у перловицы (рис. 6).

Возможно, это связано с различиями в характере питания и местах обитания этих моллюсков. Напомним, что перловицы, в отличие от беззубок, предпочитают более илистое дно, что обуславливает различия в рационе питания. Известно, например, что поглощение Cd из морской воды устрицами усиливается с увеличением количества пищи (Hardy et. al., 1984). Авторы объясняют это тем, что присутствие корма в виде фитопланктона инициирует увеличение потока воды через устрицы. Следовательно, исследование устриц в отсутствие источника питания может привести к заниженной оценке поглощения Cd и, как следствие, содержания МТ.

В нашем эксперименте условия питания моллюсков были одинаковыми, поэтому незначительные различия в уровне МТ могут объясняться, вероятно, внутривидовым полиморфизмом. Различия в индукции МТ были показаны для

моллюсков Масота balthica и bttonna littorea в работах Langston и Zhou (1987a, b). Тем не менее, при проведении биоиндикационных исследований можно принять, что уровень МТ у моллюсков перловица и беззубка находится на одном уровне.

6 -543 -2 -1 -О -

жабры мантия внутренние

органы

Рис. 6. Удельное содержание МТ в органах и тканях моллюсков перловица (I П и беззубка ( ЦЩ), отловленных в р. Протва вблизи места сброса сточных вод ФЭИ. По оси ординат - удельное содержание МТ, мкг/г.

Измерение уровня МТ у моллюсков перловица и беззубка, обитающих в отличающихся по скорости течения, типу дна (илистое, песчаное), обилию корма, но обладающих одинаковым качеством воды (II класс, определенный методом Ф. Вудивисса) водоемах, показало отсутствие различий. Уровень МТ у обитающих в Белкинском пруду моллюсков катушка, прудовик, шаровка практически не различался и по величине составлял около 2 мкг/г мягкой ткани (рис. 7).

Изменение уровня МТ в жабрах моллюска с возрастом. До настоящего времени удельное содержание МТ моллюска определяли без учета их возрастных особенностей. Однако возраст животного влияет на его способность поглощать ионы тяжелых металлов и синтезировать МТ. Например, Wier и Walter (1976) подвергли пресноводную улитку Physa gyrina воздействию хлорида кадмия в концентрации 1.3 мг/л и определили, что средняя скорость поглощения Cd составила 0.55 мг/кг/ч в течение 24 ч наблюдения. Было показано, что при одной

J_ ,

1 1 1

Рис. 7. Удельное содержание МТ у моллюсков разных видов.

По оси ординат - удельное содержание МТ, мкг/г;

по оси абсцисс: 1 - катушка; 2 - прудовик; 3 - шаровка; 4 - беззубка.

и той же экспозиции чем старше улитки, тем меньше они поглощали Cd. Поскольку накопление Cd в тканях моллюска способно индуцировать синтез МТ, логично предположить, что у более молодых особей уровень МТ должен быть более высоким, чем у старых.

Количество МТ в речных моллюсках разного возраста (и, соответственно, массы) зависит от массы мягкой ткани (коэффициент корреляции - 0.7;

=0.272), тогда как удельное содержание МТ не зависит от данного параметра (коэффициент корреляции - 0.25; г<гоо1=0.272) и, следовательно, от возраста беззубки (рис. 8, рис. 9). Поэтому, можно принять, что удельное содержание МТ практически не зависит от возраста моллюска. При проведении биомониторинга это позволит в значительной мере сократить время исследования и упростить проведение пробоотбора моллюсков.

20

Рис. 8. Удельное содержание МТ в моллюске-беззубка в зависимости от его массы. По оси ординат - удельное содержание МТ, мкг/г; по оси абсцисс - вес мягкой ткани, г.

16

14 -

12 -

ю -

8

6 ■

4 ■

2

о -о

Рис. 9. Суммарное содержание МТ в моллюске-беззубка в зависимости от его массы. По оси ординат - содержание МТ, мкг; по оси абсцисс -вес мягкой ткани, г.

Полевые исследования

В течение 1995-1998 гг. проводилось биотестирование участка р. Протвы вблизи сброса сточных вод Физико-Энергетического Института (ФЭИ). Сточные воды ФЭИ, в случае их недостаточной очистки, могут содержать ионы тяжелых металлов и радионуклиды в следовых количествах. Параллельно проводилось измерение биотического индекса (Вудивисс, 1977).

Гидробиологическое обследование участка р. Протвы в районе сброса сточных вод ФЭИ и в районе городских очистных сооружений проведено в 1995 г. Установлено, что содержание МТ в моллюсках, обитающих в районе сброса сточных вод ФЭИ, превышало в октябре-ноябре 1995 г. аналогичный показатель, характерный для контрольной зоны р. Протвы, в 5.76 раза (табл. 6).

Дальнейшие наблюдения свидетельствуют, что со временем содержание МТ в моллюсках снижалось и достигало контрольного уровня. Максимальное содержание МТ в ноябре 1995 г. мы объясняем возможным локальным выбросом сточных вод недостаточной степени очистки. Методом гамма-спектроскопии показано отсутствие повышенного содержания радионуклидов. Контролем служил уровень МТ у моллюсков, собранных на участке р. Протвы возле городского пляжа.

С помощью биотического индекса (Вудивисс, 1977) установлено, что качество воды в районе сброса сточных вод ФЭИ на период измерений соответствовало III классу (умеренно загрязненная). В то время как в рекреационной зоне класс качества воды был II (чистая).

Таблица 6.

Динамика удельного содержание МТ в ткани моллюсков в осенне-зимний период 1995 г.

Место сбора моллюсков Удельное содержание МТ мкг/г

октябрь ноябрь Декабрь

Городской пляж (контроль) 1.75±0.22 1.50+0.30 1.23±0.23

Сброс сточных вод ФЭИ 2.52Ю.48 8.6411.16* 1.56+0.4

Сброс сточных вод городских очистных сооружений 1.4Ю.38 2.2+0.3 1.3±0.43

Отличие от контроля достоверно, р<0.05.

Было также отмечено, что уже через 200 м вниз по течению р. Протвы от места сброса сточных вод ФЭИ уровень МТ у моллюсков был сравним с

контролем. Это свидетельствует о способности экосистемы реки к самоочищению и о высокой чувствительности предлагаемого метода биотестирования поверхностных вод:

Проведенными нами в течение 1996-1998 гг. исследованиями не было зафиксировано аналогичных всплесков-уровня МТ у моллюсков. Биотический индекс Ф. Вудивисса также не изменился. Это еще раз подчеркивает селективность предложенного нами метода, т.к. метод Ф. Вудивисса ориентирован, прежде всего, на органическое загрязнение в то время как индукция МТ может быть обусловлена как тяжелыми металлами и радионуклидами, так и органическими соединениями.

При наблюдении за популяцией катушки, обитающей в Белкинском пруду г. Обнинска, были отмечены изменения в удельном содержании МТ (рис. 10А). С начала сентября до середины ноября 1995 г. удельное содержание МТ увеличилось в 5 раз,- что, вероятно, связано с увеличением дождевого стока в пруд с городских улиц, содержащего свинец и другие поллютанты.

А) Б)

1 2 3 4 9 6 7

Рис. 10. Сезонные изменения удельного содержания МТ у моллюсков видов катушка (А) и прудовик (Б) в Белкинском пруду. По оси ординат - удельное содержание МТ, мкг/г; по оси абсцисс - даты отлова моллюсков:

(А): 1-01.09.95; 2-27.09.95; 3-04.11.95; 4-13.11.95; 5-04.02.96; 6-18.02.96; 7 - 02.03.96, отличие достоверно по сравнению с данными от 01.09.95, р<0.05. (Б): 1 - 01.09.95; 2 - 27.09.95; 3 - 13.11.95; 4 - 02.03.96.

Затем количество МТ в тканях моллюска вида катушка снижается, и к марту 1996 г. практически достигает первоначального значения При этом содержание МТ в тканях моллюсков прудовиков, отловленных в тот же период времени и в тех же самых местах водоема, столь сильно не изменяется (рис. 10Б). Видовые различия могут быть связаны как с характером питания и различием занимаемых экологических ниш, так и с разной способностью к активации контролирующих синтез МТ генов. Следует учитывать, что за период наблюдения (с сентября по март) класс качества воды, определенный по разнообразию микрозообентоса, изменился с III (умеренное загрязнение) до IV (сильное загрязнение).

Представленные результаты свидетельствуют об эффективности и информативности использования удельного содержания МТ в органах и тканях моллюсков в качестве биоиндикационного параметра в программах биологического мониторинга антропогенно загрязненных территорий.

Выводы

1. Раздельное воздействие у-излучения в дозах 9 и 10 Гр и ионов СС в концентрации 1 мг/кг достоверно увеличивает удельное содержание МТ в печени мышей по сравнению с контролем. Сочетанное действие у-излучения и ионов СС в тех же дозах и концентрациях приводит к антагонизму.

2. Раздельное воздействие у-излучения в дозе 75 сГр и ионов СС в концентрациях 112 и 1120 мг/л приводит к достоверному увеличению количества фитохелатинов в корешках проростков ячменя. Сочетанное действие у-излучения и ионов СС в тех же дозах и концентрациях приводит к антагонизму.

3. Удельное содержание МТ в жабрах моллюсков (ЛпобоМа ер.) при раздельном действии у-излучения в дозах 25, 50 и 150 Гр и ионов СС в концентрациях 0 2 и 1 мг/л увеличивается по сравнению с контролем. Сочетанное действие у-излучения в дозе 25 Гр и ионов СС в концентрации 0.2 мг/л приводит к синергизму.

4. Увеличение пострадиационной выживаемости мышей на 40% после предварительного введения раствора СССЬ обусловлено активацией неспецифических защитных систем, в частности, стимуляцией синтеза МТ в печени мышей.

5. Обоснованы возрастные и видовые критерии пробоотбора моллюсков, позволяющие повысить эффективность, технологичность биомониторинга антропогенного загрязнения водоемов.

6. Результаты представленных в диссертационной работе лабораторных и полевых экспериментов свидетельствуют о высокой эффективности и информативности использования удельного содержания МТ в органах и тканях моллюсков в качестве биоиндикационного параметра в программах биологического мониторинга.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Данилин И.А., Сынзыныс Б.И., Ротт Г.М. Экологический мониторинг загрязнения водоемов тяжелыми металлами и радионуклидами по уровню белков-металлотионеинов в органах двустворчатых моллюсков // Ядерная энергетика. Известия вузов. 1998. N 6. С. 9-14.

2. Данилин И.А., Миронович В.Л., Сынзыныс Б.И. Анализ возрастной структуры популяции двустворчатых моллюсков для целей мониторинга реки Протва // Материалы Международного постоянно действующего научно-технического семинара "Экологическая безопасность регионов России". Пенза, 1998. С. 37.

3. Данилин И.А., Сынзыныс Б.И., Ротт Г.М. Индукция белков-металлотионеинов в мягких тканях двустворчатых моллюсков как показатель загрязнения пресноводных водоемов тяжелыми металлами и радионуклидами // Тез. докл. Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы экологии на рубеже третьего тысячелетия и пути их решения". Брянск, 1999. Часть I. С. 454"60.

4. Данилин И.А., Дикарев В.Г. Фитохелатины - биохимические маркеры антропогенного загрязнения // Тез. докл. Конференции "Радиация и биосфера". Обнинск, 2000. С. 74-76.

5. Данилин И.А., Сынзыныс Б.И., Козьмин Г.В., Ротт Г.М. Синергический эффект синтеза белков-металлотионеинов у моллюсков Anodonta ер. при комбинированном воздействии кадмия и гамма-облучения // Сочетанное действие факторов радиационной и нерадиационной природы на растительные

и животные организмы. Тр. Института Биологии Коми НЦ УрО РАН. Сыктывкар, 2000. С. 54-61.

6. Данилин И.А., Дикарев В.Г. Индукция синтеза фитохелатинов малыми дозами гамма-излучения и ионами кадмия // Тез. докл. IV Съезда по радиационным исследованиям. Москва, 2001. Т. 2. С. 385.

7. Данилин И.А., Сынзыныс Б.И., Козьмин Г.В., Ротт Г.М. Экспериментальное обоснование нового метода биотестирования пресноводных водоемов по содержанию белков-металлотионеинов в органах и тканях двустворчатых моллюсков // Экология. 2002. N 5. С. 383-386.

8. Данилин И.А., Дикарев В.Г, Гераськин С.А., Сынзыныс Б.И. Уровень металлотионеинов в тканях животных и растений как перспективный маркер радиационного и химического воздействия // Тез. докл. VIII Российской научной конференции "Радиационная защита и радиационная безопасность в ядерных технологиях". Обнинск, 2002. С. 380-383.

9. Данилин И.А., Дикарев В.Г., Гераськин С.А. у-излучение увеличивает синтез фитохелатинов в проростках ярового ячменя // Радиационная биология. Радиоэкология. 2004. Т. 44. N 1. С. 91-94.

10. Сморызанова р.А, Сынзыныс Б.И., Данилин И.А., Баранова О.А. Содержание металлотионеинов в тканях и опухолях мышей при комбинированном действии кадмия и у-излучения. Увеличение радиорезистентности мышей с повышенным уровнем металлотионеинов // Радиационная биология. Радиоэкология. 2004. Т. 44. N2. С. 185-188.

И.Удалова А.А., Гераськин С.А., Данилин И.А., Дикарев В.Г, Дикарева Н.С., Васильев Д. В. Изучение закономерностей формирования цитогенетических и цитотоксических эффектов, а также индукции белков металлотионеинов при действии низких доз гамма-излучения и низких концентраций кадмия // Труды регионального конкурса научных проектов в области естественных наук. Вып. 5. Калуга, 2004 (в печати).

12. Данилин И.А., Дикарев В.Г, Гераськин С.А., Репина А.О. Измерение уровня металлотионеинов для оценки воздействия тяжелых металлов на окружающую среду // Тез. докл. Международной конференции "Геоэкологические проблемы загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами". Тула: ТулГУ, 2003. С. 912.

€-47 99

заказ № 1061 от 3.03.2004 г. тираж 100 экз.

249037 Россия, Калужская обл., г. Обнинск, ул. Красных Зорь, д. 26. "Печатный салон", тел.: (08439) 912-84

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Данилин, Илья Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. УЧАСТИЕ МЕТАЛЛОТИОНЕИНОВ В ФОРМИРОВАНИИ ОТВЕТНОЙ РЕАКЦИИ КЛЕТКИ НА СТРЕССОВЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ. (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Характеристика металлотионеинов.

1.2. Механизмы синтеза металлотионеинов при формировании ответной реакции клетки на действие ионизирующего излучения и ионов тяжелых металлов.

1.3. Функции металлотионеинов в растительной и животной клетке.

1.3.1. Роль металлотионеинов в защите клеток от токсического действия тяжелых металлов.

1.3.2. Роль металлотионеинов в защите клеток от окислительного стресса.

1.3.3. Уровень металлотионеинов и частота спонтанных мутаций.

1.4. Уровень металлотионеинов в тканях моллюсков и растений как биоиндикационный параметр.

1.4.1. Уровень металлотионеинов у водных моллюсков как индикатор загрязнения среды их обитания тяжелыми металлами и радионуклидами.

1.4.2. Изменение содержания РСП в растительных клетках в ответ на присутствие в среде обитания повышенных концентраций тяжелых металлов и радионуклидов.

1.5. Количественная оценка уровня металлотионеинов в

Глава 2. 2.1. 2.2.

Глава 3. 3.1. условиях сочетанного действия тяжелых металлов и ионизирующего излучения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования.

Схемы экспериментов.

Метод выделения и определения содержания металлотионеинов у животных.

Методы выделения и оценки содержания металлотионеинов в растениях.

Оценка качества воды с помощью биотического индекса зообентоса по методу Ф.

Вудивисса.

Методика анализа отклика биологической системы на комбинированное воздействие и статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Удельное содержание металлотионеинов при действии у-излучения и ионов кадмия в органах и тканях моллюсков Anodonta sp.

Удельное содержание металлотионеинов в печени мышей после у-облучения и введения ионов кадмия.

Удельное содержание белков фитохелатинов в клетках проростков ячменя (Hordeum vulgare L.) при действии у-излучения и ионов кадмия.

Анализ механизмов синтеза металлотионеинов, приводящих к нелинейным эффектам при комбинированном действии у-излучения и ионов кадмия.

3.5. Анализ участия металлотионеинов в формировании ответной реакции растительных и животных клеток на действие у-излучения и ионов кадмия.

Ч/ 3.6. Уровень металлотионеинов в органах моллюсков и тканях растений как перспективный маркер комбинированного действия физических и химических агентов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие металлотионеинов в формировании ответной реакции растительных и животных клеток на действие ү-излучения и ионов кадмия"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Важным классом белков, участвующих в формировании ответной реакции клетки на стрессовое воздействие, являются металлотионеины (МТ) (Sanita di Toppi; DeMoor, Koropatnick). МТ растений имеют специфические особенности, отличающие их от МТ млекопитающих. Согласно принятой классификации (Fowler et al.), МТ в растительной клетке называются фитохелатинами (РС„). Наличие в промоторном участке МТ-генов сайтов, реагирующих на изменения концентрации ионов тяжелых металлов и свободных радикалов (Andrews et al.), а также увеличение количества МТ после облучения (Котеров и др.; Bakka et al.; Matsubara) позволяет предположить, что МТ участвуют в реакции клетки на воздействие не только тяжелых металлов, но и ионизирующего излучения.

В современной практике экологического мониторинга в основном используют физико-химические методы анализа, которые позволяют лишь косвенно судить о действии поллютантов на живую природу. Другой подход к решению этой проблемы связан с использованием методов биологического мониторинга, которые дают прямую информацию об опасности загрязнения окружающей среды. К преимуществам биологического мониторинга относится также то, что полученная с его помощью информация позволяет дать интегральную картину, учитывающую всю совокупность действующих факторов, а также синергические и антагонистические эффекты их взаимодействия, в том числе и тех, которые не отслеживают контролирующие уровень техногенного загрязнения службы, поскольку они ориентированы на анализ фиксированной номенклатуры техногенных токсикантов. Использование в целях биологического мониторинга уровня МТ в органах и тканях растений и животных позволяет прямо оценить биологическое действие физических и химических агентов окружающей среды. Следовательно, изучение участия МТ в формировании ответной реакции растительных и животных клеток на действие у-излучения и ионов кадмия (Сё) представляет не только теоретический, но и практический интерес.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью настоящей работы являлся анализ участия МТ в формировании ответной реакции растительных и животных клеток на раздельное и сочетанное действие у-излучения и ионов Сё. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить изменение удельного содержания МТ в печени мышей при раздельном и сочетанием действии ионов Сё и у-излучения.

2. Изучить изменение удельного содержания РС„ в корешках проростков ячменя при раздельном и сочетанном действии ионов Сё и у-излучения.

3. Изучить изменение удельного содержания МТ в органах и тканях двустворчатых моллюсков при раздельном и сочетанием действии ионов С<1 и у-излучения.

4. Оценить эффективность использования уровня МТ в органах и тканях растений и животных в целях экологического мониторинга и анализа комбинированного действия факторов разной природы.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Гамма-излучение вызывает увеличение уровня фитохелатинов в проростках ярового ячменя.

2. Сочетанное действие у-излучения и ионов Сс1 в изученном диапазоне доз и концентраций приводит к синергическому увеличению удельного содержания МТ в жабрах моллюсков (Апос1оМа эр.) и антагонизму в печени мышей и проростках ярового ячменя.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые показано, что у-излучение увеличивает уровень фитохелатинов в проростках ярового ячменя. Показано, что комбинированное действие у-излучения и ионов Сс! в исследуемых дозах и концентрациях приводит к достоверному антагонистическому эффекту по уровню фитохелатинов.

Продемонстрировано достоверное синергическое увеличение уровня МТ в жабрах моллюсков (АпойогЛа Бр.) при комбинированном действии уизлучения и ионов С& Установлено отсутствие в исследованном диапазоне зависимости содержания МТ в жабрах моллюсков (АпойоЫа Бр.) от дозы у-излучения.

Показано, что комбинированное действие у-излучения и ионов С<1 в исследуемых дозах и концентрациях приводит к достоверному антагонистическому эффекту по уровню МТ в печени мышей. Установлено, что предварительное введение подкожно раствора хлорида кадмия увеличивает выживаемость подвергнутых воздействию у-излучения мышей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Результаты представленных в диссертационной работе лабораторных и полевых экспериментов свидетельствуют о высокой эффективности и информативности использования удельного содержания МТ в органах и тканях моллюсков в качестве биоиндикационного параметра в программах биологического мониторинга антропогенно загрязненных территорий.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на международном конгрессе "Энергетика - 3000" (Обнинск, 1998), всероссийской конференции "50 лет производства и применения изотопов в России" (Обнинск, 1998), международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы экологии на рубеже третьего тысячелетия и пути их решения" (Брянск, 1999), конференции "Радиация и биосфера" (Обнинск, 2000), IV съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001), VIII Российской научной конференции "Радиационная защита и радиационная безопасность в ядерных технологиях" (Обнинск, 2002), международной конференции "Геоэкологические проблемы загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами" (Тула, 2003).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы и трех приложении. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 103 публикации.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Данилин, Илья Анатольевич

ВЫВОДЫ

1. Раздельное воздействие у-излучения в дозах 9 и 10 Гр и ионов Cd в концентрации 1 мг/кг достоверно увеличивает удельное содержание МТ в печени мышей по сравнению с контролем. Сочетанное действие у-излучения и ионов Cd в тех же дозах и концентрациях приводит к антагонизму.

2. Раздельное воздействие у-излучения в дозе 75 сГр и ионов Cd в концентрациях 112 и 1120 мг/л приводит к достоверному увеличению количества фитохелатинов в корешках проростков ячменя. Сочетанное действие у-излучения и ионов Cd в тех же дозах и концентрациях приводит к антагонизму.

3. Удельное содержание МТ в жабрах моллюсков (Anodonta sp.) при раздельном действии у-излучения в дозах 25, 50 и 150 Гр и ионов Cd в концентрациях 0.2 и 1 мг/л увеличивается по сравнению с контролем. Сочетанное действие у-излучения в дозе 25 Гр и ионов Cd в концентрации 0.2 мг/л приводит к синергизму.

4. Увеличение пострадиационной выживаемости мышей на 40% после предварительного введения раствора CdC^ обусловлено активацией неспецифических защитных систем, в частности, стимуляцией синтеза МТ в печени мышей.

5. Обоснованы возрастные и видовые критерии пробоотбора моллюсков, позволяющие повысить эффективность, технологичность биомониторинга антропогенного загрязнения водоемов.

6. Результаты представленных в диссертационной работе лабораторных и полевых экспериментов свидетельствуют о высокой эффективности и информативности использования удельного содержания МТ в органах и тканях моллюсков в качестве биоиндикационного параметра в программах биологического мониторинга.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе установлено, что воздействие у-излучения приводит к увеличению содержания МТ в клетках позвоночных и беспозвоночных животных и растений. Эти эффекты ионизирующего излучения имеют единую генетически детерминированную природу, так как сходные реакции возникают у организмов, пути эволюции которых разошлись многие миллионы лет назад — позвоночные млекопитающие (мыши), беспозвоночные животные (моллюски), растения (ячмень). Участие МТ в реакции клетки на действие тяжелых металлов, в частности Zn, Cd (De Moor, Koropatnick, 2000), а также установленные факты увеличения МТ при радиационном воздействии позволяют предположить, что МТ участвуют в формировании ответной реакции на окислительный стресс, вызванный действием ионизирующего излучения и ионами тяжелых металлов.

Установлены нелинейные эффекты комбинированного действия ионов Cd и ионизирующего излучения на уровень МТ в клетках разных органов и тканей моллюсков, в печени мышей и корешках проростков ячменя. Исследованные в работе животные и растения принадлежат к разным царствам живого мира, что позволяет предположить общее происхождение внутриклеточных систем генетического контроля биосинтеза металлсвязывающих белков в клетках растений, беспозвоночных и позвоночных животных. Эти системы играют важную роль в сложном процессе формирования ответной реакции клетки на внешнее повреждающее воздействие. Впервые показано, что воздействие ионизирующего излучения на проростки ячменя приводит к достоверному увеличению удельного содержания МТ. Показано, что воздействие ионизирующего излучения по-разному влияет на уровень МТ в органах и тканях двустворчатых моллюсков. Этот результат подтверждает данные ряда работ (Котеров, Филиппович, 1995; Котеров и др., 1997) о способности разных органов животных синтезировать определенные изоформы МТ. Тем не менее, остается открытым вопрос о механизмах увеличения уровня МТ при комбинированном воздействии ионов Сё и ионизирующего излучения. В настоящее время считается, что синтез МТ ионами тяжелых металлов опосредован взаимодействием факторов транскрипции с МТ-генами, а увеличение уровня МТ ионизирующим излучением связано с амплификацией генов МТ. Однако, вероятно, на уровень МТ в клетках растений и животных, наблюдаемый при комбинированном воздействии, влияет конкуренция этих двух процессов. Возможно, что ионизирующее излучение ингибирует синтез МТ, а результирующий уровень МТ зависит от способности органа или ткани синтезировать ту или иную изоформу МТ. Все это - направления дальнейших исследований механизмов синтеза МТ.

В работе показана эффективность и информативность использования уровня МТ в органах животных и тканях растений в качестве тест-системы в программах биологического мониторинга антропогенно загрязненных территорий. Для биоиндикации водоемов в качестве тест-объекта предлагается использовать двустворчатых моллюсков, а для анализа воздействия загрязнителей на растительные сообщества может быть использован ячмень.

Как показали лабораторные исследования, индукция МТ вызывается воздействием ионов Cd, о чем имеются данные и других авторов (Grill et al., 1985; Keltjens, Beusichem, 1998). Радиационная стимуляция синтеза МТ в настоящей работе была показана впервые. Поэтому, вероятно, МТ могут стать маркером не только химического, но и радиоактивного загрязнения.

Недостатком метода может стать отсутствие дозовой зависимости при радиационном воздействии, а также отложенный во времени характер процесса увеличения уровня МТ. В частности, для концентрации Cd 1мг/л достоверное увеличение в жабрах моллюска наблюдалось только через 3 суток. Это ограничивает использование указанного параметра в качестве биологического дозиметра, но не влияет на эффективность его использования в программах биоиндикации.

Наши результаты, а также литературные данные (Roesijadi, 1994; Bebianno, Langston, 1999) свидетельствуют о том, что повышенный уровень МТ диагностируется в тканях организмов, которые длительное время контактируют с тяжелыми металлами или другими загрязнителями окружающей среды. Поэтому предлагаемый метод биоиндикации может быть использован для оценки экологического состояния экосистем, характеризующихся хроническим комплексным загрязнением.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Данилин, Илья Анатольевич, Обнинск

1. Гераськин С.А., Дикарев В.Г., Дикарева Н.С., Мельников Б.П., Арышева С.П. Индукция аберраций хромосом в листовой меристеме при комбинированном воздействии облучения и тяжелых металлов.

2. Котеров А.Н., Сазыкин А.Ю. Содержание металлотионеинов в костном мозге и печени мышей и в лимфоцитах человека после общего у-облучения // Радиац. биология. Радиоэкология. 1994. Т.34. Вып. 2. С. 190-195.

3. Котеров А.Н., Сазыкин А.Ю., Филиппович И.В. Связь между содержанием металлотионеином в костном мозге, печени и выживаемостью облученных мышей после введения хлористого кадмия //Радиобиология. 1993. Т. 33. Вып. 1. С. 122-127.

4. Котеров А.Н., Требенок З.А., Пушкарева Н.Б., Никольский A.B. Влияние цинк-металлотионеина на перекисное окисление липидов в клетоках костного мозга грызунов // Радиац. биология. Радиоэкология 1998а. Т. 38. Вып. 3. С. 426-430.

5. Котеров А.Н., Требенок З.А., Филиппович И.В. Защита мышей от ионизирующей радиации экзогенным цинк-металлотионеином // Бюл. экспер. биол. 1994. Т. 118. № 8. С. 139-141.

6. Котеров А.Н., Филиппович И.В. Радиоадаптивный ответ in vitro нестимулированных лимфоцитов крыс по металлотионеиновому тесту // Радиац. биология. Радиоэкол. 2002. Т. 42. №. 2. С. 130-135.

7. Котеров А.Н., Филиппович И.В. Радиобиология металлотионеинов // Радиац. биология. Радиоэкол. 1995. Т. 35. Вып. 2. С. 162-180.

8. Никольский A.B., Котеров А.Н. Радиоадаптивный ответ клеток млекопитающих // Мед. радиология. Радиац. безопасность. 1999. Т. 44. №6. С. 5-18.

9. Норбаев Ш.Ш, Норбаев H.H. Содержание глутатиона у семян растений, растущих на урансодержащих почвах // Тез. докл. Материалы VI всесоюзного совещания по микродозиметрии. Канев, 14-25 апреля 1989. С. 138-139.

10. Плавильщиков H.H. Определитель насекомых. М., 1994.

11. Плевина И.И., Афанасьев Г.Г., Алещенко A.B., Курнешова JI.E., Носкин В.А., Носкин JI.A., Семенова Л.П., Серебряный А.М.

12. Радиоиндуцированный адаптивный ответ у детей и влияние на него внешних и внутренних факторов // Радиац. биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39. № 1.С. 106-112.

13. Римский-Корсаков М.Н., Райков Б.Е. Зоологические экскурсии. М.: Топикал, 1994. С. 210-356.

14. Ротт Г.М., Сморызанова O.A., Романцова В.А. Свойство радиации в малых дозах и низкоинтенсивного ионизирующего излучения вызывать индукцию металлотионеинов //Радиац. биология. Радиоэкология. 1995. Вып. 4. С. 507-510.

15. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинскихисследованиях//М: Медицина, 1975. 295 с.

16. Филиппович И.В. Феномен адаптивного ответа клеток в радиобиологии //Радиобиология. 1991. Т. 31. Вып. 6. С. 803-814.

17. Францевич И.И., Паньков И.В., Ермаков А.А. и др. Моллюски -индикаторы загрязнения среды радионуклидами // Экология. 1995. № 1. С.57-62.

18. Цихон-Луканина Е.А. Трофология водных моллюсков. М.: Наука, 1987. 176 с.

19. Abdullah A.N.S., Cheah С. S., Muiphy J. D. Isolation and characterisation of two divergent type 3 metallothioneins from oil palm, Elaeis guirteensis И Plant Physiol, and Biochem. 2002. V. 40. P. 255-263.

20. Abel J., de Ruiter N. Inhibition of hydroxyl-radical-generated DNA degradation by metallothionein // Toxicol. Lett. 1989. V. 47. P. 191-196.

21. Abrahamson S.L., Speiser D.M., Ow D.W. A gelelectrophoresis assay for phytochelatin// Anal. Biochem. 1992. V. 200. P. 239-243.

22. Ariza M.E., Bijur G.N., Williams M.V. Lead and mercury mutagenesis: role of H2C>2, superoxide dismutase, and xanthine oxidase // Environ. Mol. Mutagen. V. 31. 1998. P. 352-361.

23. Bairoch A., Apweiler R. The SWISS-PROT protein sequence data bank and its supplement TrEMBL. Nucl. Acid. Res. 1996. V. 24. P. 21-25.

24. Bakka A., Johnsen A.S., Endersen L., Rugstad H.E. Radioresistance in cells with high content of metallothionein // Experientia. 1982. V. 38. P. 381-383.

25. Bebianno M.J., Langston W.J. Metallothionein induction in mussels exposed to a metal mixture // Metallothionein IV. Ed. C. Klaassen. Basel: Birkhauser Verlag, 1999. P.187-194.

26. Bernhard W.R. Kagi H.R. Purification and characterization of atypical cadmium-binding polypeptides from Zea mays II Experientia. 1987. V. 52. P. 309-315.

27. Chan H.M., Satoh M., Zalups R.K., Cherian M.G. Exogenous metallothionein and renal toxicity of cadmium and mercury in rats // Toxicology. 1992. V. 76. P. 15-26.

28. Cherian M.G., Lau J.C., Apostolova M.D., Cai L. The nuclear-cytoplasmic presence of metallothionein in the cell during differentiation and development // Metallothionein IV. Ed. C. Klaassen. Basel: Birkhauser Verlag, 1999. P. 291-294.

29. Choudhuri S., McKim J.M., Klaassen C.D. Role of hepatic lysosomes in the degradation of metallothionein // Toxicology and applied pharmacology 1992. V. 115. P. 64-71.

30. Christer H. Regulation of metallothionein in teleost fish during metal exposure. Goteborg, 1991. P. 47-53.

31. De Moor J.M., Koropatnick J.D. Metals and cellular signaling in mammalian cells // Cell.mol. Biol. 2000. V. 46. № 2. P. 367-381.

32. Dunn M.A., Blalock T.L., Cousins R. J. Metallothionein // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1987. V. 185. P. 107-119.

33. Eaton D.L., Toal B.F. Evaluation of the Cd/Hemoglobin affinity assay for the rapid determination of metallothionein in biological tissues // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1982. V. 66. P. 134-142.

34. Evans I.M., Gatehouse L.N., Robinson N.J., Croy R.R.D. A gene from pea (Pisum sativum L.) with homology to metallothionein genes // FEBS Lett. 1990. V. 262. P. 29-32.

35. Fowler B.A., Hindebrand C.E., Kojima Y., Webb M. Nomenclature of metallothionein//Exp. Suppl. 1987. V. 52. P. 19-22.

36. Gekeler W., Grill E., Winnacker E.-L., Zenk M.N. Algae sequester heavy metals via synthesis of phytochelatin complexes // Arch. Microbiol. 1988. V. 150. P. 197-202.

37. Gekeler W., Grill E., Winnacker E.-L., Zenk M.N. Survey of the plant kingdom for the ability to bind heavy metals through phytochelatins // Z. Naturforsch. 1989. V. 44c. P. 361-369.

38. Goncharova E.I., Rossman T.G. A role for metallothionein and zinc in spontaneous mutagenesis // Cancer Res. 1994. V. 54. P. 5318-5323.

39. Gries G.E., Wagner G.J. Association of nickel versus transport of cadmium and calcium in tonoplast vesicles of oat roots // Planta. 1998. V. 204. P. 390396.

40. Grill E., Gekeler W., Winnacker E.-L., Zenk M.N. Homo-pnytochelatins are heavy meta-binding peptides of homo-GSH containing Fabales II FEBS Lett. 1986. V. 205. P. 47-50.

41. Grill E., Winnacker E-L., Zenk M.H. Phytochelatins, a class of heavy-metal-binding peptides from plants, are functionally analogous to metallothioneins II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1987. V. 84. P. 439-443.

42. Günes C., Heuchel R., Georgiev O., Muller K.-H., Marino S., Aguzzi A., Bluthmann H., Schaffher W. Liver degeneration and embryonic lethality in mouse null mutants for the metal-responsive transcriptional activator MTF-1

43. Metallothionein IV. Ed. C. Klaassen. Basel: Birkhauser Verlag, 1999. P. 223-226.

44. Hamer D.H. Metallothionein // Ann. Rev. Biochem. 1986. V. 55. P. 913951.

45. Hamilton S.J., Mehrle P.M. Metallotionein in fish: review of its importance in assessing stress from metal contaminants // Trans. Am. Fish. Soc. 1986. V. 115. P. 596-609.

46. Hardy J.T., Sullivan M.F., Crecelius E.A., Arts C.W. Transfer of cadmium in phytoplancton-oyster-mouse-food chain. // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1984. V. 13. P. 419-425.

47. Hogstrand C., Haux C. Metallotionein as an indicator of heavy metal exposure in two subtropical fish species // J. exp. Mar. Biol. Ecol. 1990. V.• 138. P. 69-84.

48. Howden, R., Cobbett, C.S. Cadmium-sensitive mutants of Arabidopsis thaliam. II Plant Physiol. 1992. V. 99. P. 100-107.

49. Johnson J.A., Moehlenkamp J.D., Chu W., Bittel D., Andrews G.K. Activation of mouse metallothionein I promoter by cadmium in human neuroblastoma cells // Metallothionein IV. Ed. C. Klaassen. Basel: Birkhauser Verlag, 1999. P. 233-236.

50. Kagi J.H.R., Schaffer A. Biochemistry of metallothionein // Biochem. 1988. V. 27. P. 8509-8515.

51. Kagi J.H.R., Vallee B.L. Metallothionein: a cadmium- and zinc- containingprotein from equine renal cortex // J. Biol. Chem. 1960. V. 235. P. 34603465.

52. Karin M. Metallothioneins: proteins in search of function // Cell. 1985. V. 41. P. 9-10.

53. Keltjens W.G., Beusichem M.L. Phytoche latins as biomarkers for heavy metal toxicity in maize: single metal effects of copper and cadmium // J. of plant nutrition. 1998. V. 21(4). P. 635-648.

54. Klapheck S., Chrost B., Starke J., Zimmermann H. y-Glutamylcysteinylserine: a new homologue of glutathione in plants of the Family Poaceae I I Bot. Acta. 1992. V. 105. P. 174-179.

55. Kneer R., Zenk M.H. Phytochelatins protect plant enzymes from heavy metal poisoning//Phytochemistry. 1992. V. 31. P. 2663-2667.

56. Koropatnick J., Leiibbrandt M., Cherian M.G. Organ-specific metallothionein induction in mice by x irradiation // Radiat. Res. 1989. V. 119. P. 356-365.

57. Krotz R.M., Evangelou B.P., Wagner G.J. Relation-ships between cadmium, zinc, Cd-binding peptide, and organic acid in tobacco suspension cells // Plant Physiol. 1989. V. 91. P. 780-787.

58. Kubota H., Sato K., Yamada T., Maitani T. Phytochelatins (class III metallotioneins) and their desglycyl peptides induced by cadmium in normal root cultures of Rubia tinctorum L. // Plant Science. 1995. V. 106. P. 157166.

59. Langston W.L., Zhou M. Cadmium accumulation, distribution and elimination in the bivalve Macoma balthica: neither metallothionein nor metallothionein — like proteins are involved // Mar. Environ. Res., 1987b. V. 21. P. 225-237.

60. Langston W.L., Zhou M. Cadmium accumulation, distribution and metabolism in the gastropod Littorina littorea: the role of metal-binding proteins II J. Mar. Biol. Assoc. UK. 1987a. V. 67. P. 585-601.

61. Loeffler S., Hochberger A., Grill E., Gekeler W., Winnacker E.-L., Zenk M.H. Termination of the phytochelatin synthase reaction through sequestration of heavy metals by the reaction product // FEBS Lett. 1989. V. 258. P. 42-46.

62. Maitani T., Kubota H., Sato K., Yamada T. The composition of metals bound to class III metallotionein (phytochelatin and its desglycyl peptide) induced by varios metals in root cultures of Rubia tinctorium II Plant Physiol. 1996. V. 110. P. 1145-1150.

63. Matsubara J. Metallothionein induction: a measure of radioprotective action II Health Physics. 1988. V. 55. P. 433-436.

64. Mehra R.K., Winge D.R. Cu(I) binding to the Schizosaccharomyces pombe y-glutamyl peptides varing in chain lengths I I Arch. Biochem.Biophys. 1988. V. 265. P. 381-389.

65. Meuwly P., Thibault P., Rauser W.E. y-Glutamylcysteinylglutamic acid a new homologue of glutathione in maize seedlings exposed to cadmium // Febs Lett. 1993. V. 336. P. 472-476.

66. Min K.-S., Nishida K., Nakahara Y., Onosaka S. Protective effect of metallothionein on DNA damage induced by hydrogen peroxide and ferric ion-nitrilotriacetic acid // Metallothionein IV. Ed. C. Klaassen. Basel: Birkhauser Verlag, 1999. P. 529-534.

67. Milinda J.R., Thomas M.A., Thurman D.A., Tomsett A.B. Metallothionein genes from the flowering plant Mimulus guttatus II FEBS Lett. 1990. V. 260. P. 277-280.

68. Ochi T., Miyaura S. Cytotoxicity of an organic hydroperoxide and cellular antioxidant defense system against hydroperoxides in cultured mammalian cells//Toxicology. 1989. V. 55. P. 69-82.

69. Olsson P.-E., Gerpe M., Kling P. Functional and regulatory aspects of teleost metallothionein // Metallothionein IV. Ed. C. Klaassen. Basel: Birkhauser Verlag, 1999. P. 179-185.

70. Olson P.-E., Hax C. Increased hepatic metallotionein content correlates to cadmium accumulation in environmentally exposed perch (Perca fluviatilis) II Aquat. Toxicol. 1986. V. 9. P. 231-242.

71. Quesada A.R., Byrnes R.W., Krezoski S.O., Petering D.H. Direct reaction of H2 02 with sulfhydryl groups in HL-6022 cells: zinc-metallothionein and other sites // Arch. Biochem. Biophys. 1996. V. 334. P. 241-250.

72. Raspor B., Pavicic J., Kozar S., Kwokal Z., Paic M., Odzak N., Udjevic I., Kljakovic Z. Assessment of metal exposure of marine edible mussels by means of a biomarker // Metallothionein IV. Ed. C. Klaassen. Basel: Birkhauser Verlag, 1999. P. 629-632.

73. Rauser W.E. Phytochelatins // Annu. Rev. Biochem. 1990. V. 59. P. 61-86.

74. Reddy G.N. Heavy metal inducible proteins and metallothionein genes in higher plants // Biochem. Arch. 1992. V. 8. P. 87-93.

75. Robinson N J., Tommey A.M, Kuske C, Jackson P.J. Plant metallothioneins //Biochem. 1993. V.195. P. 1-10.

76. Roesijadi G. Metallothionein and its role in toxic metal regulation // Comp. Biochem. Phisiol. 1996. V. 113:2. P. 117-123.

77. Roesijadi G. Metallothionein indication as a measure of response to metal exposure in aquatic animals // Environ. Health. Perspect. 1994. V. 73. P. 8390.

78. Roesijadi G. Metallothioneins in metal regulation and toxicity in aquatic animals II Aquat. Toxic. 1992. V. 22. P. 81-114.

79. Rossman T.G., Goncharova E.I. Effects of metallothionein expression on development of drug resistance // Metallothionein IV. Ed. C. Klaassen. Basel: Birkhauser Verlag, 1999. P. 573-576.

80. Rossman T.G., Goncharova E.I. Spontaneous mutagenesis in mammalian cells is caused mainly by oxidative events and can be blocked by antioxidants and metallothionein//Mutation Research. V. 402. 1998. P. 103110.

81. Salt D.E., Wagner G.J. Cadmium transport across tonoplast of vescicles from oat roots // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 12297-12302.

82. Sanita" di Toppi L., Gabbrielli R. Response to cadmium in higher plants // Environmental and Experimental Botany. 1999. V. 41. P. 105-130.

83. Sato M., Bremner I. Oxygen free radicals and metallothionein // Free Radic. Biol. Med. 1993. V. 14. P.325-337.

84. Scheller H.V., Huang B., Hatch E., Goldsbrough P.B. Phytochelatin syntesis and glutathione levels in response to heavy metals in tomato cells // Plant Physiol. 1987. V. 83. P. 1031-1035.

85. Schutzendubel A., Nikolova P., Rudolf C., Polle A. Cadmium and H202-induced oxidative stress in Populusxcanescens root I I Plant Physiol. Biochem. 2002. V. 40. P. 577-584.

86. Stohs S.J., Bagchi D. Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions // Free Radical Biology & Medicine. 1995. V. 18. P. 321-336.

87. Vogeli-Lange R., Wagner G J. Relationship between cadmium, glutathione and cadmium-binding peptides (phytochelatins)in leaves of intact tobacco seedlings//Plant Sci. 1996. V. 114. P. 11-18.

88. Wier C.F., Walter W.M. Toxicity of cadmium in the freshwater snail, Physa gyrina II J. Environ. Qual. 1976. V.5. P. 359-362.

89. Zenk M.H. Heavy metal detoxification in higher plants a review // Gene. 1996. V. 179. P. 21-30.

90. Zhou J., Goldsbrough P.B. Structure, organization and expression of the metallothionein gene family in Arabidopsis I I Mol. Gen. Genet. 1995. V. 248. P. 318-328.

91. Zhu Y.L., Pilon-Smits E.A.H., Jouanin L., Terry N. Overexpression of glutathione synthetase in indian mustard enhances cadmium accumulation and tolerance // Plant Physiol. 1999. V. 119. P. 73-79.