Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДНК-белковые сшивки в лейкоцитах крови и клетках различных органов мелких млекопитающих, обитающих на территории пункта захоронения радиоактивных отходов, при экспериментальном воздействии -излучения и тяжелых металлов

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "ДНК-белковые сшивки в лейкоцитах крови и клетках различных органов мелких млекопитающих, обитающих на территории пункта захоронения радиоактивных отходов, при экспериментальном воздействии -излучения и тяжелых металлов"

РГи од

3 и ш ¡^

На правах рукописи

ОСИПОВ Андреян Николаевич

ДНК-БЕЛКОВЫЕ СШИВКИ В ЛЕЙКОЦИТАХ КРОВИ И КЛЕТКАХ РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНОВ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ,

ОБИТАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ ПУНКТА ЗАХОРОНЕНИЯ РАДИОАКТИВНЫХ ОТХОДОВ, И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ у-ИЗЛУЧЕНИЯ И ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

03. 00. 01 - Радиобиология

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск - 1998

Работа выполнена в Московском государственном предприятии -объединенный эколого-технологический и научно-исследовательский центр по обезвреживанию РАО и охране окружающей среды (МосНПО «Радон»).

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация -

доктор биологических наук В.Д. Сыпин, МосНПО «Радон», кандидат химических наук Г.Я. Коломийцева,

Институт физико-химической биологии

им. А.Н. Белозерского,

при МГУ им. М.В. Ломоносова.

доктор биологических наук профессор А.И. Журавлев, Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина, доктор биологических наук Л.Н. Ульяненко,

ВНИИ сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии.

Государственный научный центр РФ -Институт биофизики, г. Москва.

Защита состоится « 2^у> марта 1998 года в часов на заседании Диссертационного совета по радиобиологии Д 120.81.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии Российской академии сельскохозяйственных наук по адрес>': 249020, Калужская обл., г. Обнинск, ВНИИСХРАЭ, Диссертационный совет Д 120.81.01.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии.

Отзывы просьба направлять по адресу: 249020, Калужская обл., г. Обнинск, ВНИИСХРАЭ, Диссертационный совет Д 120.81.01.

Автореферат разослан « fí' » февраля 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Н.И.Санжарова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Отрицательной стороной технического прогресса является постоянно нарастающее загрязнение окружающей среды, в частности, радионуклидами и тяжелыми металлами.

Раднонуклнды и тяжелые металлы, находящиеся в окружающей среде оказывают, зачастую, негативное влияние на живые организмы, причем, основной мишенью действия ионизирующей радиации являются уникальные управляющие клеточные системы - макромолекулы ДНК. В эукариотических клетках ДНК существует и функционирует в комплексе с белками, образуя сложно организованную структуру - хроматин. В свете исследований последних лет становится все очевиднее, что воздействие как физических так и химических агентов, изменяющих характер тонких ДНК-белковых взаимодействий в клетках млекопитающих, может привести к серьезным функциональным последствиям. Одно из них - образование ДНК-белковых сшивок (ДБС) (Fornace A.J. et al., 1977, 1979; Oleinick N.L. et al., 1987). При формировании ДБ С происходит «пришивание» белка к ДНК, по-видимому, посредством ковалентной связи. Строгие доказательства коваленгной природы ДБС единичны (Shetlar M.D. 1980) и, в большинстве случаев, о наличии ковалентной связи судят лишь на основании ее устойчивости к воздействию диссоциирующих и денатурирующих агентов, невозможности отделения белка от ДНК различными физико-химическими методами (Murthi К.К. et al., 1993). Несмотря на то, что количественный выход ДБС, по сравнению с количественными выходами таких повреждений ДНК как однонитевые разрывы, не высок, репарация ДБС, особенно в неактивных областях хроматина, происходт- гораздо медленнее репарации одношггевых разрывов ДНК (Chiu S.M. et al., 1984, 1986). Биологическое значение образования ДБС in vivo в настоящее время недостаточно изучено, но, очевидно, что прочная фиксация нормальных нековалентных ДНК-белковых структур нарушает функции ядерного хроматина, в частности, репликацию и транскрипцию, и может привести к серьезным генетическим последствиям (мутагенез, канцерогенез, апоптоз и т.д.) (Oleinick N.L. et al., 1989; Costa M. et al., 1993).

Знание причин образования ДБС и наличие экспресс-методов их количественного анализа позволило бы оценить возможность использования ДБС в качестве биомаркера на присутствие в среде обитания и воздействия на живой организм сшивающего агента, а также как ранний индикатор генотоксичности окружающей среды.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключалась в оценке возможности использования ДНК-белковых сшивок в качестве биоиндикатора воздействия на организм млекопитающих таких факторов геноток-сичности окружающей среды, как ионизирующая радиация и тяжелые металлы.

Исходя из этого были определены конкретные задачи исследований:

- разработать модификации метода количественного определения ДНК-белковых сшивок, применимые для оценки уровня ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах и клетках лимфоидных органов млекопитающих, обитающих на загрязненных радионуклидами территориях;

- изучить количественные особенности образования и репарации ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов животных, подвергшихся фракционированному воздействию у-излучения;

- изучить закономерности образования и репарации ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов животных, подвергшихся острому и хроническому воздействию тяжелых металлов;

- изучить влияние комбинированного воздействия тяжелых металлов и у-излучения на уровень ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов животных;

- использовать полученные результаты и выводы, сделанные на их основе, для постановки исследований по оценке возможного влияния пункта захоронения радиоактивных отходов на уровень ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах и клетках лимфоидных органов обитающих там мелких млекопитающих.

Научная новизна. Впервые проведены исследования изменений уровней ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов мышей при фракционированном воздействии у-излучениЯ, установлены закономерности их образования в зависимости от вида клеток.

Впервые для количественной оценки ДНК-белковых сшивок, индуцированных у-излучением, был применен метод Оз-К+ осаждения.

Установлены закономерности изменений уровней ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов мышей при остром и хроническом воздействии солей кадмия, свинца и цинка в различных дозах.

Впервые проведено исследование уровней ДНК-белковых сшивок при комбинированном воздействия у-излучения и тяжелых металлов (кадмий, свинец и цинк). Установлено, что комбинированное воздействие тяжелых металлов и у-излучения может приводить к активизации защитных механизмов, предотвращающих образование ДНК-белковых сшивок и (или) ускоряющих их репарацию.

Впервые проведено количественное определение ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах и клетках лимфоидных органов мелких млекопитающих, обитающих на территории пункта захоронения радиоактивных отходов;

Теоретическое и практическое значение работы. На большом количестве исследуемых объектов показано, что ДНК-белковые сшивки - универсальный отклик на воздействие ионизирующего излучения и (или) тяжелых металлов.

На основании результатов проведенных исследований обосновывается предположение, что комбинированное воздействие ионов тяжелых металлов и у-нзлучения вызывает активизацию защитных механизмов клеток, предотвращающих образование ДБС и (или) ускоряющих репарацию этого типа повреждений ДНК. »

Разработаны модификации методики Э5-К+ осаждения для определения ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах и клетках внутренних органов, позволяющие определять ДНК-белковые сшивки, индуцированные ионизирующим излучением.

В результате исследований, проведенных на территориях загрязненных радионуклидами, показано, что количество ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах и клетках лимфоидных органов достоверно коррелирует с содержанием (3-излучающих нуклидов в организме животных.

Проведенные исследования позволяют предположить, что уровень ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах крови мышевидных грызунов является чувствительным тестом для оценки влияния техногенных радионуклидных загрязнений на организм мышевидных грызунов и может служить предпосылкой для разработки метода биологической индикации радиационного поражения живых организмов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Третьем съезде по радиационным исследованиям «Радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность» (Москва, 14-17 октября 1997г.).

Публикация работ. По материалам диссертации опубликовано три и принято в печать три статьи.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения , выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 158 источников, в том числе 136 иностранных. Работа содержит 21 таблицу и 21 рисунок.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Исследования были выполнены на 290 мышах-самцах линии ВАЬВ/с исходной массой 20-22 г, полученных из питомника «Столбовая» (РАМН), а также на 434 диких мышах и полевках.

Экспериментальная часть работы состояла из трех серий опытов. Экспериментальных животных (мыши-самцы линии ВАЬВ/с) разделили на группы по 4-5 мышей в каждой. Мышей содержали на стандартном рационе вивария.

1. Исследования изменений уровней ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов животных при фракционированном воздействии у-излучения. Общее облучение животных проводили на установке «Панорама-Зс» с подвижным излучателем. Источник у-излучения - 137Се. Дозиметрию осуществляли, используя клинический дозиметр с ионизационной камерой УА-К-253 (Кафедра радиобиологии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина). Мышей облучали фракционировано, при мощности дозы 5 мГр/мин, по 20 минут через одни сутки. Суммарные дозы, полученные животными за 10, 20 и 30 суток, составляли 0,5; 1 и 1,5 Гр, соответственно.

Через 10, 20 и 30 суток с начала эксперимента мышей декапигировали. Для исследования из тушек мышей извлекали тимус, селезенку, головной мозг, печень и помещали в жидкий азот.

2. Исследование образования и репарации ДНК-белковых сшивок инду-шгрованных действием кадмия, свинца и цинка. Соли металлов, растворенные в изотоническом растворе ЫаС1, вводили подкожно в объеме 0,5 мл. Контрольным животным был введен эквивалентный объем изотонического раствора №С1.

Кровь собирали в пробирки с гепарином. Подсчет лейкоцитов производили на приборе «Пикоскель» фирмы «Мес11сог» (Венгрия). Выделение лейкоцитов из крови мышей проводили путем селективного лизиса эритроцитов нонами аммония (Хант С., 1990). Осадок лейкоцитов ресуспендировали в фос-фатно-солевом буфере до конечной концентрации 1-2х10б клеток/мл.

3. Исследования комбинированного воздействия у-излучения и тяжелых металлов на ДНК-белковые сшивки в клетках внутренних органов и лейкоцитах животных. Хлорид кадмия, ацетат свинца и сульфат цинка растворяли в воде до конечной концентрации по ионам кадмия - 0,01 мг/л, свинца - 0,3 мг/л и цинка - 10 мг/кг, что соответствует 10 ПДК в питьевой воде (ГОСТ 287482). Растворы солей металлов давали животным взамен питьевой воды.

Фракционированное облучение мышей проводили как описано выше.

Через 10, 20 и 30 суток с начала эксперимента мьпиен декапитировали. Для исследований из тушек животных извлекали тимус, селезенку, головной мозг и печень и помещали в жидкий азот.

На территории пункта захоронения радиоактивных отходов (ГОРО) Сергиево-Посадского филиала МосНПО«Радон» мышевидных грызунов отлавливали на участках с у-фоном 3,58-28,67х10"'2 А/кг (50-400 мкР/ч).

На территории лаборатории биологической оценки экологических техногенных аномалий, расположенной в лесопарке «Кузьминки» г. Москвы, исследовались грызуны, обитающие в зоне расположения хранилища радиоактивных отходов (ХРАО). ХРАО построено по спецпроекту в 1956 году и представляет собой железобетонный бункер. По расчетам, выполненным летом 1993 г., в хранилище находятся радиоактивные отходы, содержащие в основном 90Sr, общей активностью 4,44x10ю Бк (1,2 Ки). Уровни у-фона на территории ХРАО находятся в пределах 7,17-10,75х10'3 А/кг (10-15 мкР/час), а уровни поверхностного ß-загрязнения колеблются в пределах 20-70 частиц/мин х см2.

В качестве контроля использовали грызунов, пойманных на территориях санитарно-защитной зоны (СЗЗ) Сергиево-Посадского филиала МосНПО«Радон» и лесопарков г. Москва («Кузьминки», «Поровское-Стрешнево», «Лосиный остров»), где уровень у-фона составлял 5,73-7,17х1013 А/кг (8 - 10 мкР/ч), плотность потока ß-излучения 10-20 частиц/ мин х см2.

Специальными трапиковыми ловушками на исследуемых территориях были отловлены 335 полевых мышей (Apodemus agrarius) и 99 рыжих полевок (Clethrionomys glareolus). Пойманных животных взвешивали, определяли содержание эритроцитов и лейкоцитов в крови, подсчитывали лейко-грамму по общепринятым методикам.

В исследованиях использовали метод определения ДБС, предложенный Zhitkovich A. and Costa M. (1992), в нашей модификации. В основе метода - диссоциация нековалентиых ДНК-белковых комплексов посредством жесткой обработки додецилсульфатом натрия и селективное осаждение ДНК, содержащей прочные ДНК-белковые комплексы путем, добавления KCl до концентрации 0,1 М. Для определения ДБС отбирали по 100 мкл суспензии лейкоцитов(1 -2 x10е клеток/мл) или по 100 мг замороженных в жидком азоте и измельченных до порошкообразного состояния органов. Размер фрагментов ДНК после механической фрагментации контролировали, используя метод горизонтального электрофореза в геле агарозы (Sharp P. et al., 1973).

Для измерения однонитевых разрывов ДНК и щелочнолабиль-ных сайтов в лейкоцитах мышей использовали кинетический метод, определяя с помощью флуоресцентного красителя Hoechst 33258 по методу

Kanter P.M. and Shwartz H.S. (1982) процентное содержание двунигевой Д после контролируемого щелочного расплетания ДНК лейкоцитов.

Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре Hitachi-124 (Японп используя е258=6750 M'Vcm'1 (Johnson К. et al., 1972). Малые колнчес ДНК определяли с использованием реактива Hoechst 33258 на Дй флуориметре ТКО-ЮО фирмы «Hoefer Scientific Instruments» (США).

Определение суммарной р- и а-активности тела мышевидных грызу! проводилось путем радиометрии золы на установке НТ 1000 W Aipha/B System фирмы «Canberra Nuclear» (США).

Содержание металлов определяли атомно-абсорбционным методом спектрометре С-115М1.

2.2. Результаты исследований

Закономерности образования ДНК-белковых сшивок в клетках внутренних органов. мышей, подвергшихся

фракционированному воздействию у-излучения

Данные, полученные в результате эксперимента, показали, что фракц] нированное воздействие у-излучения приводит к образованию ДБС в клеп тимуса, селезенки, головного мозга и печени мышей. Для количественной : рактеристики ДБС был введен коэффициент сшивания кдвс, равный othol нию величины ДБС в клетках облученных животных к величине ДБС в кл ках контрольных животных. Полагают, что присутствие фоновых ДБС в кл ках необлученных животных - это следствие нормального клеточного мета! лизма (Oleinik N.L. et al., 1987).

При фракционированном воздействии у-излучении с увеличением epei ни облучения и, соответственно, суммарной поглощенной дозы происхо; увеличение значения кдас для клеток лимфоидных органов и головного моз (рис. 1, кривые 1-3), тогда как для клеток печени наблюдается другая карти Для клеток этого органа значение кдвс остается равным -1 в течении 20 су; (1 Гр) и лишь на 30 сутки (1,5 Гр) происходит незначительное увеличс! значения кдвс (рис. 1, кривая 4).

В литературе отсутствуют данные об изменении уровня ДБС в клеп при фракционированном общем облучении животных, однако известно, ■ печень - орган с медленно пролиферирующими клетками и для обнаружен выраженных необратимых морфологических изменений в клетках печени т буются дозы рентгеновского излучения более 10 Гр, а в случае фракциошг ванного облучения в 3-6 раз более высокие (НКДАР ООН 1982). toiei лимфоидных органов, напротив, являются активно пролиферирующими соответственно, в большей степени подвержены повреждающе воздействию ионизирующего излучения, Небезынтересно отметить, что чс одни сутки после однократного общего облучения крыс в дозе 6 Гр, отмечае полная репарация у-нндуцированных ДБС в клетках в клетках пече]

тогда как в клетках лимфоидных органов уровень ДБС возрастает (Осипов А.Н., Коломинцева Г.Я. 1996). Предполагается, что ионизирующее излучение индуцирует в клетках лимфоидных органов процессы, приводящие, в частности, к увеличению уровня ДБС. В клетках головного мозга увеличение уровня ДБС менее выражено, чем в лимфоидных органах. Однако уровень ДБС все же довольно высок, что может объясняться низкой скоростью репарации вследствие замедленной метаболической активности, а также тем, что нервная ткань подвергается вторичным повреждениям в связи с большим потоком измененных и извращенных импульсов от рецепторов с периферии, также подвергшихся воздействию у-излучения (Белов А.Д., КиршинВ.А. 1987).

сутки

Рис. 1. Изменение кдвс при фракционированном воздействии у-излучения для клеток различных органов мышеи. 1 - тимус, 2 - селезенка, 3 - головной мозг, 4 - печень.

В порядке убывания значения кдас на 30 сутки исследованные органы можно разделить на 3 группы. К первой группе относятся лимфоидные органы, ко второй - головной мозг и к третьей -печень. Примечательно, что сделанное размещение органов по изменениям уровня ДБС, полностью совпадает с классификацией тех же органов по пострадиационным изменениям обмена веществ (Осняч B.C. и др. 1978), вследствие этого можно сделать вывод о том, что изменения количества ДБС зависят от интенсивности и глубины метаболических процессов, инициируемых облучением в живых клетках.

ДНК-белковые сшивки в лейкоцитах мышей, индуцированные действием ¿и, Сс1 и РЬ

Для того, чтобы проследить за изменением уровня ДБС в период после введения металлов, нами были выбраны соли тяжелых металлов в дозах, соответствующих ЬБ50/30 для данных животных.

Результаты экспериментов показали, что однократное подкожное введение растворов РЬ(СНзСОО)2, Сс1С12 и 2пБ04 в вышеуказанных дозах приводит к увеличению уровня ДБС в лейкоцитах мышей.

Количество ДБС в лейкоцитах определялось через 3 часа, 1 сутки, 5 суток и 15 суток после введения растворов солей тяжелых металлов. Помимо измерения уровня ДБС в лейкоцитах, нами также определялись такие показатели, как общее количество лейкоцитов и лейкоформула.

Было отмечено, что после введения растворов солей 2п, РЬ или Сс1 в вышеуказанных дозах у мышей отмечался нейтрофильный лейкоцитоз, сменяющийся с течением времени лейкопенией. Такие изменения обычно наблюдаются при отравлении тяжелыми металлами. При свинцовой интоксикации (см. табл.1) лейкоцитоз отмечается уже в первые часы после введения раствора РЬ(СН3СОО)2, который через сутки сменяется устойчивой лейкопенией. При интоксикации солями Ъху и Сс1 лейкоцитоз наступает позже (таб. 1). Вероятно, на это влияет физиологическое связывание Zn2+ и его аналога С<32+ с транспортными белками крови, что сглаживает токсическое действие в первые часы после введения. Интересно отметить, что при введении Сс1С12 к концу периода наблюдения (15 суток) наблюдается восстановление числа лейкоцитов до нормального уровня, тогда как после введения 2п80.) такое восстановление не было зарегистрировано.

Таблица 1

Количество лейкоцитов (х109/л) в крови мышей в различные периоды

Время контроль СсЮЬ РЬ(СНзСОО)2

3 часа 7,08±0,52 7,65±0,40 10,65±1,10 7,57±0,45

1 сутки 7,23±0,64 14,48±0,45 4,51 ±0,43 10,16±0,74

5 суток 7,20±0,56 4,410,52 4,89±0,б5 4,26±0,66

15 суток 6,95±0,76 6,92±0,25 6,0±0,88 3,47±0,15

Кривые изменения кдвс, в зависимости от времени после введения растворов солей металлов, представлены на рис. 2. Анализируя этот рисунок, можно отметить, что после введения С<1С12 или РЬ(СН3СОО)2 (рис. 2, кривые 1 и 2) кдвс сначала увеличивается, достигая максимума на первые сутки,

а в дальнейшем уменьшается и к 15 суткам почти достигает 1, то есть уровень ДБС приближается к контрольному уровню. Иная картина наблюдается после введения гпБОд (рис. 2, кривая 3). В этом случае величина кдас уже через 3 часа после облучения увеличивается в -1,5 раза и, практически, остается без изменений в течении всего периода наблюдений.

При вскрытии животных, подвергнутых воздействию соли Хп, на 5 и 15 сутки отмечалось крайнее их истощение. Жировые отложения отсутствовали, животные к 15 суткам потеряли в весе от 20 до 30 %. Подобных изменений не отмечалось при введении солей РЬ и С<1.

Так как наиболее выраженные изменения уровня ДБС регистрировались через 1 сутки после введения солен тяжелых металлов, нами было изучено образование ДБС в этот срок в зависимости от дозы металлов. В связи с тем, что уровни ДБС при первоначальных дозировках металлов изменялись довольно значительно, было исследовано действие 2п804 и РЬ(СН3СОО)2 в дозах на один и два порядка ниже, а для СёСЬ были использованы как на порядок меньшие, так и на порядок большие дозы.

Рис. 2. Изменения кдтс от времени после введения растворов солей тяжелых металлов: 1 - Сс1С12, 2 - РЬ(СН3СОО)2, 3 - гпБО.,.

Как видно из рис.3, образование ДБС под действием солей металлов прямо пропорционально логарифму дозы. В ведение животным в дозе 0,8 мг/кг и РЬ(СН3СОО)2 в дозе 0,5 мг/кг практически не вызывает изменений как количества лейкоцитов в крови, так и уровня ДБС в них. Если при увеличении дозы вводимого гпБО^ наблюдается соответствующая динамика лейкоцитоза, то С(Ю2 вызывает лейкоцитоз через сутки после введения только в дозе 1 мг/кг (табл. 2). Более высокая доза Сс1С 12, очевидно, вызывает лейкоцитоз, сменяющийся лейкопенией, в более ранние сроки.

РЬ(СН3СОО)2 во всем исследуемом диапазоне доз через сутки после введения вызывал лейкопению.

0,5

0 -,-,-,

0,1 1 10 МГ/КГ 100

Рис. 3. Зависимости кдвс от дозы тяжелых металлов (мг на кг веса животных) в полулогарифмических координатах: 1 - Сс1С12, 2 - РЬ(СН3СОО)2, 3 -гпБОф

Таблица 2

Количество лейкоцитов в крови мышей через 1 сутки после введеш£я

сась РЬ(СН3СОО)2 гпзо4

доза, Количество доза, Количество доза, Количество

мг/кг лейкоцитов, мг/кг лейкоцитов, мг/кг лейкоцитов,

х109/л х109/л х109/л

0 7,23±0,64 0 7,19±0,61 0 7,2510,63

0,1 6,5510,45 0,5 5,58Ю,25 0,8 7,8910,23

I 14,4810,45 5 5,1310,53 8 8,8510,48

10 7,05±0,15 50 4,51Ю,43 80 10,1610,74

Обобщая вышеизложенное, можно сделать следующее заключение Однократное введение растворов РЬ(СН3СОО)2, Сс1С12 и 2п504 в изученных дозах приводит к увеличению количества ДБС в лейкоцитах мышей. Максимальный уровень ДБС отмечается через сутки после введения животным Сс1С1; и РЬ(СН3СОО)2. После введения ?Л1504 высокий уровень ДБС сохраняется I течение 15 суток, что может быть связано с особенностями образования и репарации 2п-индуцированных ДБС. В изученном диапазоне доз образованш ДБС через сутки после подкожного введения РЬ(СН3СОО)2, Сс1С12 и 2и804 I целом подчинятся зависимости «доза-эффект».

ДНК-белковые сшивка в клетках различных органов мышеи при комбинированном воздействии Cd >1 у-юлучеиия

В результате эксперимента было установлено, что поступление в течение 10, 20 и 30 суток в организм мышей ионов Cd с питьевой водой в дозе 10 ПДК приводит к дозозависимому увеличению значения кдве для клеток исследуемых органов (рис. 4, кривая 2). Известно, что Cd относится к полит-ропным металлам (Chubatsu L.S., Gennari М. and Meneghini R. 1992). Однако, степень увеличения значения к две для клеток печени несколько ниже, чем для клеток лимфоидных органов и головного мозга, что может быть связано с более высокой чувствительностью клеток лимфоидных органов и головного мозга к образованию ДБС под действием ионов Cd или (и) с более низкой скоростью репарации ДБС в клетках этих органов по сравнению с клетками печени.

£ 4

3.5

3 -2,5 2 1,5 1

0,5 0

сутки зо

сутки зо

Рис. 4. Изменение значений кдес для клеток селезенки (а), тимуса (б), головного мозга (в) и печени (г) в зависимости от времени воздействия (дозы); у-нзлучения (1), Cd2+ (2), Cd2+ и у-излучения (3).

Из рис. 4, а-в (кривая 3) видно, что при комбинированном воздействии ионов Cd и у-излучения значения кдвс для клеток лимфоидных органов и головного мозга значительно меньше, чем при воздействии только ионов Cd или у-излучения. Полученные результаты, вероятно, обусловлены усилением защитного ответа клеток при комбинированном воздействии ионов Cd и у-излучения. Одним из проявлений защитного ответа клеток на воздействие как ионов Cd, так и ионизирующего излучения является индукция синтеза ме-таллотионеинов (МТ) - белков с низкой молекулярной массой (6-7 кДа) и высоким (-30%) содержанием цистеина, являющихся перехватчиками свободных радикалов при окислительном стрессе (Hamer D.H. 1986; Sato M., Bremner I. 1993). Исследования, проведенные Котеровым А.Н. и др., (1997), показали что при комбинированном воздействии ионов Cd и у-излучения концентрация МТ в клетках значительно выше, чем при воздействии только Cd или у-излучения. Радиопротекторное действие ионов Cd, отмеченное в ряде работ на уровне отдельных клеток in vitro и на уровне целостного организма, авторы связывают именно с индукцией синтеза металлотионеинов (Привезевенцев К.В. и др., 1996; Matsubara J. et al., 1987; Renan M.J., Dowman P.I. 1989). Полагают, что образование ДБС в клетках под действием у-излучения происходит по свобод-норадикальному механизму (OleinickN.L. et al., 1987). МТ, инактивируя свободные радикалы, могут предотвращать образование ДБ С. С другой стороны, МТ, образуя меркаптвды, способны связывать ионы тяжелых металлов (до семи ионов на одну молекулу), тем самым уменьшая повреждающие действие тяжелых металлов (Kagi J.H.R., Scliaffer А. 1988). Возможно, что именно этот факт, наряду' с увеличением концентрации МТ, обуславливает более низкие значения кдвс для клеток печени при комбинированном воздействии ионов Cd и у-облучения, по сравнению со значениями кдес при воздействии только ионов Cd (рис. 4, г (кривая 3)). Не исключено, что за наблюдаемые эффекты могут быть ответственны не только повышенный синтез МТ, но и другие факторы, как, например, ускорение процессов репарации и активизация альтернативных защитных механизмов. Так, существуют данные, что соли кадмия повышают в клетках и тканях содержание эндогенного глутатиона (Seagrade J. et al., 1983; Chubatsu L.S et al., 1992), что может определять устойчивость к облучению, окислительным стрессам и ионам тяжелых металлов (Meister A., Anderson М.Е. 1983). Другим объяснением может служить синтез прочих стрессорных белков, например белков теплового шока (Courgeon А.-М., Maisonliaute С., Best-Belpomme M. (1984)), «белков острой фазы» (Yiangou M., Ge X., Carter K.C. (1991).

ДНК-белковые сшивки в клетках различных органов мышей

при комбинированном воздействии РЬ н у-излучення На рис. 5 представлены данные, полученные в ходе эксперимента по изучению изменения уровня сшивок ДНК-белок в клетках различных органов мышей при комбинированном воздействии ионов РЬ и у-излучения.

Как видно из рис. 5 (кривая 2), хроническое поступление ионов свинца в организм мышей с питьевой водой в дозе 10 ПДК приводит к дозозависи-мому увеличению уровня ДНК-белковых сшивок в клетках лнмфоидных органов, головного мозга и печени. Причем, наиболее выраженное изменение уровня ДНК-белковых сшивок отмечается в клетках лнмфоидных органов. В целом, можно отметить, что хроническое воздействие ионов свинца в вышеуказанных дозах вызывает увеличение количества сшивок ДНК-белок, близкое к действию фракционированного облучения.

¿4,5 -2 4 3.5 3 2,5 2 1.5 1

0,5 0

04 5 , о4' ^

3 43,5 3 2,5 2 1.5 1

0,5 0

сутки

сутки

Рис. 5. Изменение значений кдвс для клеток селезенки (а), тимуса (б), головного мозга (в) и печени (г) в зависимости от времени воздействия (дозы); у-излучения (1), РЬ2+ (2), РЬ2" и у-излучения (3).

При комбинированном воздействии РЬ и у-излучения значения кдес для клеток лимфоидных органов и головного мозга меньше, чем при воздействии только ионов РЬ или у-излучения (рис. 5, а-в (криваяЗ)). Полученные результаты, вероятно, так же как в случае комбинированного воздействия ионов Cd и у-излучения, обусловлены ускорением процессов репарации и (или) активизацией защитных механизмов клеток, препятствующих образованию ДНК-белковых сшивок (синтез металлотионеинов, белков острой фазы, белков теплового шока и т.п.). В случае печени, скорее всего, происходит уменьшение повреждающего действия свинца за счет его инактивации металлотионеинами.

ДНК-белковые сшивки в клетках различных органов мышей при комбинированном воздействии Zn и у-излучения

Результаты нашего эксперимента, представленные на рис. 6 (кривая 2), показывают, что в течение первых 10 суток в клетках всех исследуемых органов не отмечается увеличения уровня ДНК-белковых сшивок. Однако, при дальнейшем увеличении концентрации ионов цинка в организме мышей происходит увеличение количества сшивок ДНК-белок (20-е и 30-е сутки). Причем, начиная с 10 суток, накопление сшивок ДНК-белок подчиняется закону «доза-эффекг». Увеличение уровня ДНК-белковых сшивок менее всего выражено в клетках головного мозга (рис. 6, в (кривая 2)), вероятной причиной может служоть медленный метаболизм клеток этого органа.

При комбинированном воздействии ионов цинка и у-излучения значения кдБс, как и следовало ожидать, значительно меньше, чем при воздействии только ионов цинка или у-излучения (рис.6, криваяЗ). Причем, в клетках головного мозга и печени значение к две понижается до 1 (контрольное значение). Данные результаты можно объяснить, например, тем, что при окислительном стрессе (воздействие у-излучения) происходит мобилизация ионов цинка (Shiraiclii N, et al., 1986), то есть запросы организма в ионах цинка многократно возрастают (как известно цинк является кофактором различных защитных ангиоокислительных ферментов, синтез которых при облучении усиливается). С другой стороны, как у-излучение так и ионы цинка вызывают экспрессию генов металлотионеинов (МТ), и, как следствие, увеличение уровня цинк-МТ (Котеров А.Н. и др., 1995). Возможно, что МТ депонируют избыток цинка, который потом расходуется при репарации и репликации ДНК, пролиферации и дифференцировки клеток (Karin М. 1985; Kagi J.H.R., Schaffer А. 1988). Доказано, что цинкзависимые полипегтгиды играют роль в репарации и репликации ДНК у эукариот (Новорадовская H.A. и др., 1989), и, хотя сами МТ не способны связываться с ДНК (Thiele D.J. et al., 1986), с помощью передачи ионов цинка они, вероятно, могут модулировать

ДНК-связывающие свойства ДНК-факторов репарации и репликации ДНК. Вполне возможно, что цинк-МТ способны также активировать и ДНК-полимеразы, что важно для процессов постлучевой репарации ДНК (КапиМ. 1985; Ка& ШЛ., БсЬайег А. 1988).

сутки

сутки

Рис. 6. Изменение значений кдвс для клеток селезенки (а), тимуса (б), головного мозга (в) и печени (г) в зависимости от времени воздействия (дозы); гп2+ (1), у-излучения (2), Хп2+ и у-излучения (3).

ДНК-белковые сшивки в лейкоцитах и клетках лимфоидных органов мелких млекопитающих, обитающих на загрязненных р адионуклидамн территориях.

У рыжих полевок, обитающих на территории зоны строгого режима (ЗСР) ПЗРО, отмечаются большие колебания удельной р-активносги (от 80 до 1600 Бк/кг), что вероятно обусловлено неравномерным распределением р-излучателей по территории ЗСР ПЗРО. Колебания значений удельной р-акгивности полевых мышей, обитающих в той же зоне, существенно меньше (80-200 Бк/кг). Различия значений удельных р-активностей рыжих полевок и полевых мышеи, возможно, связаны с особенностями питания этих видов. В целом можно отметить, что у животных, обитающих на

территории ЗСР и ХРАО, уровень удельной р-активности выше, чем у животных тех же видов, обитающих на контрольных территориях (табл. 3-4).

Статистически достоверных изменений в количестве лейкоцитов крови полевых мышей и рыжих полевок в зависимости от зоны обитания не обнаружено (табл. 3-4). Проведенное нами изучение лейкоформулы крови животных показало, что состав белой крови у мышей и полевок, обитающих в различных зонах, существенно не меняется.

Таблица 3

Удельная радиоактивность, количество лейкоцитов и уровни ДБС

( ДНК сшитая с белком, %) у полевых мышей_

Зона обитания Количество лейкоцитов, х 109/л ДНК сшитая с белком, % Удельная радиоактивность, Бк/кг

лейкоциты клетки тимуса клетки селезенки Бета-нуклиды Альфа-нуклиды

ЗСР ПЗРО 5,37 1,42 1,54 1,40 146,5 5,6

±а 1,88 0,42 0,39 0,41 44,3 4,7

п 67 67 15 15 67 67

СЗЗПЗРО X 4,61 1,03 1.11 0,97 94,7 0.7

±ст 2,49 0,27 0,26 0,28 14,8 1,8

п 35 35 14 14 35 35

Кузьшппш, ХРАО X 5,01 1,48 1,60 1,45 196,2 3,9

±а 2,11 0,51 0,61 0,37 196,6 3,8

п 43 43 11 11 43 43

Кузьминки, кмпроль X 5,28 1,02 1,13 0,97 98,2 1,4

±ст 1,47 0,16 0,17 0,20 25,1 8,3

п 134 134 26 26 134 134

Лосиный остров X 5,66 1,09 - - 101,7 1,1

±а 3,10 0,19 - - 11,9 2,1

и 24 24 - - 24 24

Покровское-Стрешнево X 4,96 0,99 - - 98,5 0,9

±а 2,71 0,29 - - 9,0 2,2

п 23 23 - - 23 23

Примечание: п - количество исследованных животных,

Х- среднее арифметическое, ±а - стандартное отклонение

Таблица 4

Удельная радиоактивность, количество лейкоцитов и уровни ДБС

( ДНК сшитая с белком, %) у рыжих полевок_

Зона Количество ДНК сшитая с белком, Удельная

обитания лейкоцитов, х109/л % радиоактивность, Бк/кг

лейкоциты клетки тимуса клетки селезенки Бета-нуклиды Альфа-нуклиды

ЗСР ПЗРО X 3,92 1,73 1,81 1,76 579,6 4,2

±ст 1,75 0,63 0,72 0,69 542,1 6,2

п 41 41 17 17 41 41

СЗЗ ПЗРО X 4,12 1,02 1,16 0,99 98,1 0,8

±ст 1,64 0,35 0,38 0,29 25,4 2,5

п 43 43 16 16 43 43

Примечание: п - количество исследованных животных,

Х- среднее арифметическое, ±ст - стандартное отклонение

Анализируя результаты определения уровней ДБС в лейкоцитах и клетках лимфоидных органов, представленные в табл. 3,4, можно отметить, что уровни ДБС в лейкоцитах и клетках лимфоидных органов мышей и полевок, обитающих на контрольных территориях, практически не отличаются, и во всех случаях близки к 1% (за 100% принято общее количество ДНК в пробе). Эта результаты можно рассматривать как фоновые ДБС, которые согласно 01еписк Ы.Ь. е1 а1. (1987), всегда обнаруживаются в клетках и являются естественным следствием нормального клеточного метаболизма. В норме количество ДБС более или менее постоянно для каждого типа клеток живых организмов. Более высокие уровни ДБС в лейкоцитах и клетках лимфоидных органов были отмечены у животных, обитающих в ЗСР ПЗРО и ХРАО. У полевок наблюдалось увеличение уровня ДБС в среднем в 1,7-1,8 раз, а у мышей в 1,4-1,6 раза. Значения удельной (}-активности у рыжих полевок, обитающих в ЗСР, значительно выше чем у полевых мышей, обитающих в той же зоне, этим можно объяснить более высокие уровни ДБС у рыжих полевок.

Как видно из табл. 5,6, между уровнями ДБС и удельной Р-активностью мышевидных грызунов, обитающих в ЗСР ПЗРО и ХРАО, существует отчетливо выраженная корреляционная связь. Статистически достоверной корреляции между уровнями ДБС и удельными (5-активностями животных, обитающих в контрольных зонах, не обнаружено.

Таблица 5

Коэффициенты корреляции между уровнями ДБС и удельными ___Р-активностями полевых мышей (г ± шг)_

Участок обитания

ЗСР ПЗРО сзз ПЗРО Кузьминки Серебряный бор Покровское-Стрешнево

ХРАО контроль

лейкоциты 0,78±0,22* 0,25Ю,48 0,71 ±0,18* 0,33+0,24 0,2910,39 0,3510,44

клетки тимуса 0,8210,17* 0,1910,37 0,67Ю,15* 0,2610,43 - -

клетки селезенки 0,7010,25* 0,2810,51 0,7610,20* 0,35±0,38 - -

Примечание: * - р<0,05

Таблица 6

Коэффициенты корреляции между уровнями ДБС и удельными ___Р-активностями рыжих полевок (г ± шг)_

Участок обитания

ЗСР ПЗРО СЗЗ ПЗРО

лейкоциты 0,91Ю,13* 0,3910,22

клетки тимуса 0,8610,19* 0,4410,36

клетки селезенки 0,8010,23* 0,3910,22

Примечание: * - р<0,05

Количественные измерения однонитевых разрывов ДНК в лейкоцитах полевых мышей и рыжих полевок, обитающих на исследованных территориях, дают возможность }тверждать, что у мышей и полевок, обитающих в ЗСР ПЗРО и ХРАО, отсутствует статистически достоверное увеличение количества однонитевых разрывов ДНК, по сравнению животными, обитающими на контрольных территориях. Полученные данные подтверждают выводы Смотряевой М.А. и др. (1995) о том, что при облучении в малых дозах наблюдается преимущественное образование сшивок ДНК-белок, а не однонитевых разрывов ДНК. Другим возможным объяснением может служить установленный в работах СЫи Б. М. й а1. (1984,1986) тот факт, что ДБС репарируются гораздо медленнее однонитевых

разрывов ДНК. Поэтому при длительном воздействии ионизирующего излучения в малых дозах происходит накопление ДБС в клетках животных.

Для того, чтобы оценить влияние тяжелых металлов на уровни ДНК-белковых сшивок, одноннтевых разрывов ДНК и щелочнолабильных сайтов нами совместно с Центральной химической лабораторией Сергиево-Посадского филиала МосНПО «Радон» было проведено измерение концентрации РЬ, Сс1 и Н§ у отловленных полевых мышей и рыжих полевок. Результаты измерений показали, что не наблюдается изменений содержания тяжелых металлов у грызунов в отловленных на территории зоны строго режима ПЗРО и санитарно-защитной зоны ПЗРО, что позволяет считать приоритетной причиной повреждений генетического аппарата клеток у изученных животных воздействие ионизирующих излучений в местах обитания грызунов.

Обобщая вышесказанное, можно сделать вывод о том, что дозовые нагрузки, получаемые рыжими полевками и полевыми мышами в ЗСР ПЗРО и ХРАО, приводят к увеличению уровня ДБС в лейкоцитах и клетках лимфо-идных органов этих животных. Количество ДНК-белковых сшивок достоверно коррелирует с содержанием р-излучающих нуклидов в организме животных. Проведенные исследования показали, что уровень ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах является чувствительным тестом для оценки влияния техногенных радионуклидных загрязнений и может послужить предпосылкой для разработки метода биологической индикации радиационного поражения живых организмов и предсказания возможных отдаленных последствий.

ВЫВОДЫ

1. Найдено, что фракционированное воздействие у-излучения в суммарных поглощенных дозах 0,5; 1 и 1,5 Гр приводит к зависимому, от дозы облучения, образованию ДБС в клетках селезенки, тимуса и головного мозга мышей. В зависимости от степени увеличения уровня ДНК-белковых сшивок при фракционированном облучении исследованные органы можно расположить в следующий ряд - лимфоидные органы > головной мозг > печень.

2. Установлено, что однократное подкожное введение СсЮЬ и РЬ(СН3СОО)2 (1 и 80 мг на кг веса животных соответственно) приводит, наряду со значительными изменениями в картине крови, к увеличению количества ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах мышей через 1 сутки. Снижение уровня ДНК-белковых сшивок до контрольного наблюдали к 15 суткам. Напротив, после введения 2п804 (50 мг/кг) высокий уровень ДБС сохраняется в течение всего срока наблюдений (15 суток). В изученном диапазоне доз (РЬ(СН3СОО)2 - 0,5-50, Сс1С12 - 0,1-10 и гпБО., - 0,8- 80 мг/кг, соответственно) образование ДНК-белковых сшивок прямо пропорционально логарифму дозы.

3. Поступление в организм мышей ионов Сё, РЬ и Zn с питьевой водой в дозе 10 ПДК в течении 10, 20 и 30 суток приводит к дозозависимому увеличению уровня ДБС в клетках печени, головного мозга, тимуса и селезенки.

4. При комбинированном воздействии тяжелых металлов и у-излучения уровень ДНК-белковых сшивок в клетках лимфоидных органов и головного мозга значительно меньше, чем при воздействии только тяжелых металлов или у-излучения. По-видимому, это происходит за счет активизации защитных механизмов, предотвращающих образование ДБС и (или) ускоряющих репарацию этого типа повреждений ДНК.

5. У полевых мышей и рыжих полевок на территории зоны строгого режима пункта захоронения радиоактивных отходов Сергиево-Посадского филиала МосНПО «Радон» и хранилища радиоактивных отходов обнаружено увеличение уровня ДБС в лейкоцитах и клетках лимфовдных органов в среднем в 1,7-1,8 раз и 1,4-1,6 раза, соответственно, по сравнению с контролем. Увеличение количества ДНК-белковых сшивок достоверно коррелирует с содержанием р-излучающих нуклидов в организме животных.

6. Полученные данные указывают на возможность использования ДНК-белковых сшивок в лейкоцитах и клетках лимфовдных органов в качестве чувствительного теста для оценки влияния техногенных радионуклидных загрязнений и создает предпосылки для разработки, метода биологической индикации радиационного поражения живых организмов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты исследований уровня ДНК-белковых сшивок в клетках различных органов мышей могут быть использованы в радиобиологии, биохимик и молекулярной биологии при изучении влияния ионизирующих излучений на генетические структуры животных.

2. Результаты исследований уровня ДНК-белковых сшивок индуцированных ионами Zn, С(1 и РЬ в лейкоцитах мышей могут быть использованы в токсикологии при изучении генотоксичности данных металлов

3. Результаты исследований комбинированного воздействия ионов тяжелых металлов и у-излучения быть в использованы при изучении защитных ответов клеток на воздействие повреждающих агентов как химической, так и физической природы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Осипов А.Н., Коломийцева Г.Я. Пострадиационные изменения ДНК-белковых сшивок и однонитевых разрывов ДНК в клетках различных органов у-облученных крыс. // Биохимия. -1996. - Т. 61. - Вып. 5. -С. 927-931.

2. Осипов А.Н., Сыпин В.Д., Коломийцева Г.Я., Польский О.Г., Ильинов А.Н. ДНК-белковые сшивки в лейкоцитах мышей, индуцированные действием Хп, Сс1 и РЬ. // Биохимия. -1997. - Т. 62. - Вып. 6. - С. 796-799.

3. Осипов А.Н., Сыпин В.Д., Польский О.Г., Коломийцева Г.Я., Илышов А.Н., Тихомиров В.А., Соболев И.А. ДНК-белковые сшивки и однонитевые разрывы ДНК в лейкоцитах мелких млекопитающих, обитающих на территориях, загрязненных радионуклидами. // Третий съезд по радиационным исследованиям. .Тезисы докладов. -Пущино. -1997. -Т. 2.-С. 116.

4. Осипов А.Н., Сыпин В.Д., Коломийцева Г.Я., Польский О.Г., Лютова Е.Ю., Рязанов И.А. ДНК-белковые сшивки в клетках селезенки и печени мышей при комбинированном воздействии С(1 и у-облучения. // Токсикологический вестник (в печати).

5. Осипов А.Н., Ильинов А.Н., Коломийцева Г.Я., Сыпин В.Д., Польский О.Г. ДНК- белковые сшивки в лейкоцитах и клетках лимфоид-ных органов рыжих полевок (ОеШпопотуэ £1агео1ш), обитающих на территории пункта захоронения радиоактивных отходов. // Вопросы ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. / МГАВМиБ им. К.И. Скрябина (в печати).

6. Осипов А.Н., Сыпин В.Д., Польский О.Г., Коломийцева Г.Я., Ильинов А.Н., Тихомиров В.А., Соболев И.А. ДНК- белковые сшивки в лейкоцитах полевых мышей (АросЗетш а§гагш5) и рыжих полевок (СкИшопотуБ §1агео1из), обитающих на территории пункта захоронения радиоактивных отходов. И Радиационная биология. Радиоэкология (в печати).

Подписано в печать 09.02.98 г. Объем 1 п. л. Тираж 100 экз. Заказ 12.

Отпечатано в МосНПО «Радон» 119121, Москва, 7-й Ростовский пер., 2/14