Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Флуоресцентная характеристика изменений структуры ДНК клеток кроветворной системы облученных крыс

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кованько, Елена Георгиевна

ШН (i н J-Twf" А ' • ' "

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.Í

1.1. Патологические последствия острого тотального облучения в кроветворной системе животных.

1.2. Изменения нуклеиновых кислот лейкоцитов крови и миелокариоиитов костного мозга после острого облучения организма.

1.2.1. Изменения содержания НК лейкоцитов крови.

1.2.2. Пострадиационные изменения структуоы ДНК.

1.2.3. Пострадиационные изменения ЛНК клеток костного мозга.

1.3. Диалогические изменения в костном Мозге и периферической крови при хроническом облучении.

1.4. Изменения нуклеиновых кислот лейкоцитов периферической крови и миелокариоиитов костного мозга при хроническом радиационном воздействии.

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Материалы и реактивы.

2.2.1. Получение материала.

2.3. Облучение в опытах in vitro.

2.4. Облучение в опытах in vivo.

2.5. Фракционирование клеток крови.

2.6. Определение концентрации ДНК в лизатах клеток крови.

2.6.1. Определение содержания ДНК нуклеоидов лейкоцитов крови и ДНК нуклеоидов клеток костного мозга.

2.7. Двухпараметровый флуоресцентный анализ структуры

ДНК нурж?оидов.

- 3

2.8. Сравнительный анализ структурных параметров ДНК нуклеоидов лейкоцитов крови и клеток костного мозга после облучения.

2.9. Цитологические методы.

2.10. Статистическая обработка результатов.

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Ранние гематологические и биохимические эффекты острого однократного облучения.

3.1.1. Изменение количества лейкоцитов крови в течение

1 суток после облучения.

3.1.2. Изменение популящонного состава лейкоцитов периферической крови в 1 сутки после острого гамма-облучения.

3.1.3. Изменение количества миелокариопитов в течение 1 суток после облучения животных.

3.1.4. Изменение популяционного состава миелокариопитов костного мозга крыс в первые сутки после облучения.

3.1.5. Изменение количества ДНК клеток коови и костного мозга в первые сутки после острого гамма-облучения.

3.1.6. Изменения структурных параметров ДНК нуклеоилов клеток крови и костного мозга в течение первых суток после острого облучения.

3.1.7. Изменение структурных показателей ДНК лейкоцитов периферической крови и клеток костного мозга после гамма-облучения в опытах in vitro.

3.2. Цитологические и биохимические изменения крови и костного мозга в течение 12 мес после острого облучения.

3.2.1. Выживаемость крыс после острого облучения.

3.2.2. Изменения количества лейкоцитов в течение 12 мес после острого облучения.

3.2.3. Изменение количества миелокаоиоштов в течение 12 мес

- 4 после острого облучения.

3.2.4. Изменение допуляшюнного состава лейкоцитов периферической крови.

3.2.5. Изменение состава миелокариопитов костного мозга крыс в течение 12 мес после острого облучения.

3.2.6. Изменение уоовня ДНК в лейкоцитах периферической крови крыс в течение 12 мес после острого облучения.

3.2.7. Изменение уровня ДНК в клетках костного мозга облученных крыс в течение 12 мес после острого облучения.

3.2.8. Изменения этилий бромил - связывающей способности ГЭС'С) ДНК лейкоцитов периферической крови и клеток костного мозга после острого облучения.

3.2.3. Изменение величины КОФ ДНК лейкоцитов крови и ДНК костного мозга крыс в течение 12 мес после острого облучения.

3.3. Последствия хронического облучения.

3.3.1. Выживаемость крыс после хронического облучения.

3.3.2. Изменения количества и клеточного состава лейкоцитов и миелокариопитов в течение 12 мес после окончания хронического облучения.

3.3.3. Изменение содержания ДНК нуклеоидов лейкоцитов периферической крови и ДНК клеток костного мозга после окончания хронического облучения крыс.

3.3.4. Изменения флуоресцентных показателей структуры ДНК лейкоиитов перишеоической крови и клеток костного мовга в течение 12 мес после окончания хронического облучения.

Глава IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Флуоресцентная характеристика изменений структуры ДНК клеток кроветворной системы облученных крыс"

Актуальность проблемы. В последние голы значительно возросло число людей, пострадавших от различных радиационных аварий и проживающих в загрязненных радионуклидами районах. В связи с этим особую актуальность приобретает изучение последствий острого и хронического облучения живых организмов, результаты которых проявляются в большей степени в отдаленные сроки после радиационных воздействий и связаны с сокращением продолжительности жизни. Это является одной из главных задач радиобиологической науки и радиоэкологии и отражено в решениях Радиобиологического съезда (1993). Решение этих проблем невозможно без изучения кроветворной системы облученных животных и человека, как наиболее радиочувствительной в организмах млекопитающих (Мукси-новаК.М., Мушкачева Г. С., 1990; Дешевой Ю.Б., 1995). Вместе с тем широко используемые цитологические методы не всегда способны обеспечить быстрое получение достаточной информации о состоянии поврежденной радиацией кроветворной системы.

Прогнозирование отдаленных эффектов хронического облучения может быть основано на определении ряда индивидуальных реакций облученного организма. Имеющиеся подходы основываются на регистрации иммунных нарушений организма fКириллова E.H.и др. 1989; Новиченко Н.Л. 1983), и некоторых параметров лимфоцитов периферической крови (Калинин Н.Л. 1989). Однако эти подходы не всегда информативны в ранние сроки после облучения (Комар В.Е. 1987).

Для оценки состояния организма, подвергнутого облучению малыми дозами радиации, используют также питогенетические тесты - хромосомные аберрации, подсчет числа микроядер (Севанькаев A.B. 1984; Bert-¿äche U. 1985: Lloyd D.C. et al. 1988). Однако сложность и трудоемкость этих методов и вариабельность полученных с их помощью результатов затрудняют широкое применение этих тестов при массовых наблюдениях, и требуют разработки новых технологических подходов на осно 7 ванмм анализа генетического материала.

Одной из основных мишеней биологического действия излучений является ДНК (Лайта Л. 1962: Федорова Т.Д. и др., 1972; Федоров H.A. 1381). Исследование изменений содержания тотальных нуклеиновых кислот крови облученных животных (Критский Г.А. и др., 1970-1980: Тен-чова Б. и др.,1976-1988; Минкова М. и др., 1982-1988; Пучкова С.М. и др., 1384; 1986), основанное на результатах катаболизма ДНК радиочувствительных органов (Мазурик В.К. 1980-1989) или выхода полиде-зоксирибонуклеотидов из лейкоцитов ГИванник Б.П. и до. 1983), показали, что эти параметры информативны в качестве показателей лучевого поражения, но мало эффективны в плане прогноза отдаленной лучевой патологии. Отчасти это связано с тем, что показатели состояния облученного ооганизма, основанные на опоеделении числа пеовичных повоеж-дений структуры ДНК лим<Ьопитов - разрывы, сшивки, наоушения суперс-пирадизапии (Рябченко Н.И. 1979; Вашенко В.И. и др., 1980; Гришенко 10. Д. и др. 1981: Tempel К., Helnzelmanri R., 1988), изменяются во времени, так кар; репарационные процессы и смена клеточных популяций нивелируют первоначальный эффект, наблюдаемый в ДНК лейкоцитов облученных животных и человека.

Судьбу облученного организма, причиной гибели которого являются, чаше всего, иншекыии, в значительной мере определяет гранулоиитарный компонент кроветворной системы. Снижение числа этих клеток в периферической крови служит эффективным ранним индикатором радиационного воздействия (Килмен С.А., 1974; Hülse E.V., 1959). Показано, что функциональные изменения в нейтрошилах могут иметь значение для оаз-вития отдаленных последствий облучения ('Фарафонов Г.В. 1977: Жербин Е.А. Чухловин А.Б. 1989). Имеются также сведения о нарушенном состоянии хроматина нейтрофилов периферической крови как после острого, так и хронического облучения - пикноз, гиперсегментоз, наличие гра-нулопитов с "косматым" (в виде петель) хроматином, гигантские нейт

- 8 рофилы Шушницина А. Д., 1963; Инграл M., 1974; Гольлберг Е.Д. и др. 1977, 1978). которые сохраняются нередко на протяжении довольно длительного времени. В этом плане интересны немногочисленные сведения о значении некоторых особенностей структуры ДНК (постлучевые изменения в AT-обогащенных Фрагментах ДНК) для индикации риска преждевременного старения (Потапенко A. PL и др., 1989) и показателя плотности упаковки суперспиральной структуры ДНК - для неопластической трансформации (Hartwig М., 1986: Melio M.L.S., Russo J.,1990). Кроме того известно, что в ранние сроки после острого облучения в пролиферирую-щх клетках происходит блок синтеза ДНК (Полищук A.M., 1986; Ягунов A.C., Токалов C.B., 1993), тогда как после лучевого воздействия при низких мощностях доз имеет место стимуляция пролиферации и увеличение доли пролиферируюпшх клеток костного мозга (Токалов C.B., 1994).

Приведенные выше данные позволяют предположить, что изучение состояния структуры ДНК в системе кровь - костный мозг может иметь принципиальное значение для понимания интеграционных процессов, обеспечивающих целостность гематопоэтической системы, которая в свою очередь является одним из компонентов, обеспечивающих жизнеспособность организма. В связи с отсутствием таких данных, полученных путем изучения облученных организмов в процессе онтогенеза при одновременном определении показателей содержания и структуры ДНК, а также цитологических характеристик клеток крови и костного мозга, проведение подобного исследования представляется особенно актуальным. Это позволит выявить наиболее информативные показатели лучевого пораженная пои разных режимах облучения. а также для прогноза возможного сокращения продолжительности жизни экспериментальных животных, используемых для тестирования неблагоприятных условий окружающей среды В настоящей работе мы применили ряд быстрых и простых методов, в том числе, нуклеоидную технику и флуоресцентные зонды для двухпара-метровой характеристики структуры ДНК клеток периферической крови и

- 9 костного мозга (Иванов С.Д. 1992: Иванов и др., 1999; Cook P.R., Brazell I.A., 1976, 1978; Zimmer С., Wahnert U., 1986; Ahnstorm G., 1988; Gilligan et al. 1996).

Пелъ исследования: Установить закономерности изменения структурных показателей IHK клеток кроветворной системы в ранние и отдаленные сроки после острого и хронического лучевого воздействия.

Основные задачи исследования:

1. Изучить дозо-временные зависимости изменения показателей структуры ДНК клеток костного мозга и лейкоцитов периферической крови в ранние сроки после острого однократного гамма-облучения в диапазоне доз 2 - 11 Гр с использованием системы из двух флуоресцентных красителей - интеркадирующего и AT-специфичного ДНК лиганда.

2. Оценить пострадиационные изменения структуры ДНК в основных популяциях лейкоцитов крови и клеток костного мозга после облучения in vitro.

3. Изучить изменения показателей содержания и структуры ДНК клеток костного мозга и периферической крови в период острой лучевой болезни и в процессе развития отдаленной лучевой патологии.

4. Исследовать влияние лучевого воздействия с низкой мощностью дозы на изменение показателей содержания и структуры ДНК клеток костного мозга и периферической крови у крыс.

5. На основании полученных характеристик структуры ДНК лейкоцитов крови и клеток костного мозга выявить информативные показатели пострадиационных изменений клеток кроветворной системы при различных режимах облучения.

Научная новизна:

1. Впервые о помощью двухпараметрового флуоресцентного анализа

- 40 структурного состояния ДНК нуклеоидов клеток кроветворной системы установлено, что в первые сутки после общего однократного облучения крыс показатель структуры ДНК изменяется как в костном мозге, так и в периферической крови.

2. В опытах in vitro продемонстрировано, что конформационные изменения ДНК лимфоцитов восстанавливаются за 3 ч после облучения, тогда как флуоресцентные показатели структуры ДНК гранулоцитов и клеток костного мозга не меняются после радиационного воздействия. Изменения лейкоцитов периферической крови к концу первых суток после гамма-облучения животных обусловлено сменой популяций ядросодержащих клеток кроветворной системы.

3. Впервые показано, что после острого общего однократного облучения крыс имеют место структурные изменения ДНК клеток кроветворной системы в течение 1 мес. тогда как в более отдаленные сроки (2-12 мес) после гамма-воздействия значения структурных показателей не отличаются от контрольных.

4. Отношение показателя структуры ДНК клеток костного мозга к аналогичному показателю в лейкоцитах периферической крови может быть свидетельством изменения транспорта клеток кроветворной системы в облученном организме.

Теоретическая и практическая значимость:

Полученные в настоящем исследовании результаты с использованием системы ив интеркалирующего и неинтеокалируюшего флуоресцентных красителей позволили установить закономерности изменения структуры ДНК клеток кроветворной системы после острого и хронического лучевого воздействия. Показано, что после острого облучения изменения конфор-мационного состояния ДНК нуклеоидов обусловлены преимущественно по-¡реляционными изменениями состава клеток как в костном мозге, так и в периферической крови.

- и

Разработанные показатели для характеристики ЛНК клеток кроветвоо-ной системы могут оыть применены лля оценки радиационных повреждающих воздействий в широком диапазоне доз. Использование радиоактивной индикации, обеспечивающей высокую чувствительность измерений, может привести к значительным артефактам при изучении эффектов малых доз, поэтому предлагаемый подход, включающий применение флуоресцентной индикации, является ценным с практической точки зрения.

Новизна и практическая значимость исследования зашщена авторским свидетельством N 1403798, 1988 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. В ранние сроки после острого облучения в дозах 2, 4 и 10,8 Гр имеют место значительные изменения клеточных параметров и показателей структуры ЛНК в метках кроветворной системы крыс. Анализ этих параметров свидетельствует о ведущей роли популяционных клеточных изменений, происходящих в ранние сроки после острого облучения в системе костный мозг - периферическая кровь.

2. Изменения структуры ЛНК, выявляемые в период острой лучевой болезни у облученных в дозах 2 и 4 Гр животных, имеют место и в клетках костного мозга, и в лейкоцитах периферической крови. В отдаленный период после острого облучения они практически отсутствуют.

3. Снижение мощности дозы хронического облучения существенно изменяет величину и временную динамику структурных изменений ЛНК-содержащих клеток в системе костный мозг - кровь.

Апробация диссертационного материала:

Материалы представлены на: 1-м Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва. Пущино 1989), Х-й научной конференции "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях" (Санкт-Петербург, 1992), конференции "Regulation of euKariotic DNA replication"

- 12

Montreal, Canada, 1994), конгрессе "American Society for Bioche-inistry and Molecular Blology" (San Francisco, USA, 1995).

По теме диссертации опубликовано 14 работ (в том числе статей - 4, авторское свидетельство - 1, тезисов в материалах и сборниках - 9).

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 166 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, из которых первая посвящена обзору литературы, вторая - описанию методов, третья - изложению материалов собственных исследований, четвертая - обсуждению результатов. Диссертация завершена выводами. Работа содержит 22 таблицы и 22 рисунка. Библиографический указатель включает 205 работ, в том числе 120 на русском языке.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Кованько, Елена Георгиевна

Результаты исследования уровня ДНК в пунктатах костного мозга у этих же животных представлены в табл.10. Острое гамма-воздействие в дозе 2 Гр через сутки вызывало снижение уровня ДНК до 26,3% по отношению к контролю (103+14 мкг/мл разбавленного пунктата), а облучение з дозе 4 Гр - до 13,8%. Обе величины биохимического параметра достоверно различались между собой и зависели от дозы облучения. Через 15сут уровень ДНК не отличался достоверно от контрольного как после облучения в дозе 2 Гр, так и после облучения в дозе 4 Гр. В последующие сроки (до 12 мес) не наблюдалось достоверного отклонения уровня ДНК от контрольных значений. Таким образом, сопоставление цитологического и биохимического показателей свидетельствует о том, что возвращение уровня тотальной ДНК в костном мозге к контрольным значениям опережает таковое в периферической крови, по крайней мере, на 2 недели. Аналогичные данные были получены Мишуровой, Габор и соавторами (Misurova Е., Gabor J. et al., 19891 б случае острого нейтронного облучения крыс в аналогичных дозах.

- 97