Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение функционального состояния синтетического аппарата иммунокомпетентных клеток животных in situ под действием ионизирующего излучения

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сергиевич, Лариса Анатольевна, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ

На правах рукописи

Сергиевич Лариса Анатольевна

ИЗМЕНЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ IN SITU ПОД ДЕЙСТВИЕМ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ. МИКРОСПЕКТРАЛЬНОЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ.

03.00.02-биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель кандидат биологических наук Карнаухов В.Н.

Пущино 1999

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. Литературный обзор

1.1. Общая характеристика клеток иммунной системы 7

1.2. Действие ионизирующей радиации на лимфоциты

1.2.1. Особенности действия острого и хронического у-облучения на лимфоциты крови и клетки тимуса 14

1.2.2. Механизмы действия малых доз ионизирующей радиации на живые организмы 19

1.2.3. Радиационная гибель лимфоцитов 21

1.2.4. Подавление функциональной активности лимфоцитов под действием облучения 27

1.2.5. Активирующее действие облучения на лимфоциты 30

1.3. Флуоресцентные методы исследований

1.3.1. Связывание флуорохромов с нуклеиновыми кислотами 35

1.3.2. Основные методы флуоресцентной цитохимии нуклеиновых кислот и области их применения 38

1.3.3. Флуоресцентный микроспектральный анализ 45 ГЛАВА 2. Материалы и методы

2.1. Животные и условия облучения 50

2.2. Приготовление образцов крови 51

2.3. Приготовление препаратов тимуса 51

2.4. Флуоресцентный микроспектральный анализ 52

2.5. Статистическая обработка данных 2.6. Метод проточной цитометрии 56

ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение

3.1. Действие острого у-облучения на имму некомпетентные клетки

животных

3.1.1. Лимфоциты периферической крови 57

3.1.2. Модель апоптоза на тимоцитах крыс 63

3.1.3. Клетки тимуса 67

3.2. Действие хронического у-облучения на лимфоциты крови животных

3.2.1. Хроническое у-облучение с мощностью дозы 14,4сГр/сут 70

3.2.2. Действие хронического облучения с различными мощностями доз на лимфоциты крови крыс в отдаленный период облучения 76

3.2.3. Сравнительное исследование действия хронического у-облучения на лимфоциты крови кроликов и крыс 77

3.3. Обсуждение полученных результатов 81 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 87 ВЫВОДЫ 89 ЛИТЕРАТУРА 91

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМ - активационные маркеры АГ - антиген

НК - нуклеиновые кислоты

ЛПС - липополисахарид

ФГА - фитогемагглютинин

ПТЛ - предшественники Т-лимфоцитов

АО - акридиновый оранжевый

ЭБ - этидиум бромид

ВВЕДЕНИЕ.

Изменения физико-химических параметров среды обитания приводят к изменениям состояния живых организмов. Первичные процессы, вызывающие патологические изменения органов и тканей, развиваются в клетке. Поэтому именно на клеточном уровне можно обнаружить неблагоприятные для организма изменения на самой ранней стадии, когда существует возможность определить причины этих процессов и ликвидировать их до того, как они вызовут необратимые изменения организма (Карнаухов, 1988).

Изучение функциональной устойчивости иммунной системы организма, которая является основным фактором защиты от неблагоприятных условий внешней среды, очень важно в связи с возрастающим техногенным влиянием на организм. Многочисленные функции иммунной системы определяются не только контактами с различными антигенами и связью с нейроэндокринной системой, а также тем фактом, что сами клетки иммунной системы обладают регуляторными свойствами, опосредуемыми через систему синтезируемых ими растворимых медиаторов - лимфокинов (Абрамов, 1991; Савина и Хоптынская, 1995, Пальцев, 1996). Поэтому иммунокомпетентные клетки имеют такие специфические свойства, которые могут служить индикаторами состояния организма, отражая его адаптивные и патологические изменения.

Кровь является тканью, обеспечивающей интеграцию различных органов и клеток в единый, гармонически функционирующий организм, реагирующий на любые нарушения нормального функционирования многочисленных систем организма, а также на различные внешние воздействия. Через кровяное русло лимфоциты поступают в места своего функционирования. Следовательно, кровь отражает все процессы, происходящие в иммунной системе и в организме в целом. Исследование синтетической активности лимфоцитов непосредственно в мазках крови позволяет избежать негативных воздействий на клетки в процессе их выделения, сохранить их нативное окружение.

Проблема сходства и различия в механизмах действия острого и хронического облучения в низких и высоких дозах является одной из наиболее дискуссионных в настоящее время (РетеМедеп а1., 1988; Спитковский, 1993; Кузин, 1995; Бурлакова и др., 1996). Несмотря на многочисленные исследования, проводимые в этой области, проблема индивидуального реагирования организма на облучение в течение длительного периода времени является недостаточно изученной. На основании биохимических данных можно лишь предполагать, что при облучении происходит разобщение согласованных в норме процессов синтеза ДНК, РНК и белка. Исследование синтетической активности лимфоцитов крови флуоресцентным микроспектральным методом является таким способом интегральной оценки развития патогенеза, который позволяет судить о процессах, происходящих в целом организме на ранних стадиях развития деструктивных изменений.

Данная работа посвящена исследованию функционального состояния синтетического аппарата иммунокомпетентных клеток индивидуального организма под действием разных доз острого и хронического ионизирующего излучения, вызывающих различную степень повреждения клеток иммунной системы, а следовательно, и различные процессы их восстановления.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. 1.1. Общая характеристика клеток иммунной системы.

Реакции иммунитета, осуществляемые лимфоцитами, делятся на две основные группы - реакции клеточного типа и реакции гуморального типа. Реакции клеточного типа развивают тимусзависимые или Т-лимфоциты. Они формируют Т-систему иммунитета. Т-лимфоциты происходят из тимуса, заселяют Т-зависимые области периферических лимфоидных органов и под влиянием антигенной активации накапливаются в них в виде сенсибилизированных клеток. Т-лимфоциты являются эффекторами Т-системы иммунитета -обеспечивают развитие реакций гиперчувствительности замедленного типа, отторжение пересаженных тканей, противоопухолевый иммунитет, защиту организма против ряда бактерий и вирусов.

Реакции гуморального типа развивают В-лимфоциты. Они формируют В-систему иммунитета. В-лимфоциты происходят у млекопитающих из костного мозга или пейеровых бляшек, заселяют В-зависимые области периферических лимфоидных органов и под влиянием антигенного стимула накапливаются в них в виде плазматических клеток -продуцентов антител, дифференцирующихся из В-лимфоцитов. Таким образом, В-лимфоциты являются эффекторами В-системы иммунитета, они вырабатывают специфические антитела. Как в случае В-системы, так и в случае Т-системы функционирование периферических лимфоидных органов зависит от центральных (Чередеев, 1984).

Помимо эффекторных клеток, каждая из указанных популяций лимфоцитов содержит регуляторные клетки, усиливающие или угнетающие клеточные или гуморальные реакции иммунитета. В Т-системе иммунитета таковыми являются Т-хелперы (вспомогательные) и Т-супрессоры (супрессирующие) лимфоциты. Вспомогательные и тормозящие клетки обнаружены и в популяции В-лимфоцитов. Большинство эффекторных и регуляторных

клеток Т-системы формируется в результате взаимодействия предшественников и вспомогательных лимфоцитов (клетки-няньки, клетки стромы тимуса и др.).

Лимфоидная система не ограничена популяциями Т- и В-клеток. Она содержит также большую группу эффекторных лимфоидных клеток, не относящихся к типичным Т-и В-лимфоцитам (нуль, Ь, К и ЫК-лимфоциты). Считается, что наряду с Т-лимфоцитами ЫК-клетки осуществляют функции иммунологического надзора.

Распространенным приемом идентификации субпопуляций иммунокомпетентных клеток является определение их поверхностных структур - антигенов и рецепторов. Электронно-микроскопический анализ не обнаружил признаков, позволяющих идентифицировать лимфоциты Т- и В-систем иммунитета или субпопуляции клеток в пределах этих систем.

Помимо выявления мембранных молекул, другим широко используемым приемом идентификации субпопуляций иммунокомпетентных клеток является определение их функциональной активности. С помощью именно таких исследований среди Т- и В-лимфоцитов кроме эффекторных клеток обнаружены клеточные элементы со вспомогательными и супрессорными функциями и начато исследование их свойств и особенностей (Манько, Хаитов, 1987).

Поддержание пула функционально активных клеток кроветворной и лимфоидной систем с ограниченным жизненным циклом обеспечивается кроветворными стволовыми клетками. Такие клетки обладают следующими основными свойствами. Они способны к самоподдержанию, миграции, к быстрому размножению, дифференцировке в зрелые формы, обладают полипотетностью. Исключительно важная роль полипотетнтных стволовых клеток в становлении и функционировании систем кроветворения и иммунитета неизбежно ставит вопрос о механизмах, контролирующих процессы их самоподдержания, миграции, размножения и дифференцировки. Ранее, в качестве одного из главных регулирующих

механизмов рассматривалось гемопоэтическое индуктивное микроокружение (Чертков, Гуревич и др., 1984). В последующем экспериментально были выявлены регуляторные лимфоциты среди клеток Т-ряда. В-лимфоциты не влияют ни на пролиферацию стволовых клеток, ни на их дифференцировку (Петров и др., 1978; Манько и др., 1981).

Важный вклад в понимание механизмов регуляции дифференцировки и активации стволовых клеток внесло открытие растворимых медиаторов - цитокинов. Цитокины представляют собой полипептиды, которые продуцируются многими типами клеток, но преимущественно лимфоцитами и макрофагами. Цитокины способны действовать внутри клетки-продуцента (интракринный механизм). Одни воздействуют на собственную клетку-продуцент (аутокринный механизм), другие - на близлежащие клетки (паракринный механизм), третьи - на удаленные клетки-мишени, что роднит их с гормонами (эндокринный механизм). Не случайно некоторые цитокины и гормоны имеют сходное строение, одинаковый механизм передачи сигнала в клетке (связывание со специфическим рецептором - последовательная активация клеточных киназ - активация транскрипции в ядре) и эндокринный механизм действия (Пальцев, 1996).

Процессы миграции, рециркуляции и дифференцировки кроветворных стволовых клеток в значительной степени также определяются гормональным статусом организма и зависят от глюкокортикоидной функции надпочечников. Действие глюкокортикоидов на функции стволовых клеток опосредуется через лимфоциты Т-системы иммунитета (Петров и др., 1981).

Основным итогом дифференцивйровки Т-клеток в тимусе является формирование функциональных субпопуляций Т-лимфоцитов в результате образования комплекса Т-клеточного рецептора (ТКР) с дополнительными молекулами (CD4 и CD8), обеспечивающего распознавание антигена (АГ), а также приобретения клетками способности дифференцироваться под влиянием антигенной стимуляции в эффекторные и

регуляторные клетки. В осуществлении этого этапа развития тимоцитов, наряду с гуморальными продуктами лимфоцитов и других клеток стромы, необходимо взаимодействие созревающих лимфоцитов с элементами микроокружения (Ярилин и др., 1990).

Тимоциты, созревающие в тимусе, или покидают орган и включаются в рециркулирующий пул Т-лимфоцитов, или остаются в тимусе, локализуясь в его мозговом слое. Процессы эмиграции, по-видимому, осуществляются в кортико-медулярной зоне, в меньшей степени - в мозговом слое и, возможно, в субкапсулярной зоне коры.

Полагают, что недавние эмигранты из тимуса функционально недозрелы. Завершение их созревания происходит под влиянием микроокружения периферических лимфоидных органов и особенно - воздействия гормонов тимуса (Stutman О., 1978; Bach J.-F., 1985). Таким образом, посттимусный этап созревания Т-клеток в значительной степени обеспечивается гуморальными факторами тимуса.

Итак, сочетание мембранных процессов и функционального созревания обеспечивают возникновение субпопуляций зрелых тимоцитов, которые покидают тимус и включаются в функциональный рециркулирующий пул периферических Т-клеток. Часть зрелых тимоцитов остается в тимусе и обеспечивает некоторые внутритимусные процессы, являясь в частности, источником лимфокинов, важных для созревания Т-клеток. Факторами, обеспечивающими осуществление дифференцинировки Т-лимфоцитов в тимусе, наряду с гуморальными продуктами лимфоцитов, макрофагов и эпителия, являются прямые контакты с клетками стромы (Ярилин и др., 1990).

В обычных условиях в здоровом организме колебания численности клеток в тимусе невелики. Однако при стрессе и заболеваниях опустошение тимуса достигает значительной степени. При этом практически не нарушается состояние стромы, что служит основой для последующего возвращения к исходному содержанию тимоцитов в органе. Поскольку

процессы опустошения, связанные со стрессом или болезнью, развиваются довольно часто, выработались стандартные механизмы восстановления структуры тимуса после его опустошения. Эти механизмы срабатывают и в тех случаях, когда повреждающий фактор не является физиологическим, например, после радиационного опустошения тимуса (Ярилин и ДР., 1990).

Подавляющее большинство Т- и В- лимфоцитов все время переходит из крови в лимфу и обратно. Они покидают кровоток, проходя между специализированными эндотелиальными клетками, имеющимися в некоторых малых венах, и попадают в различные ткани, в том числе в лимфатические узлы. Пройдя через ткань, они накапливаются в малых лимфатических сосудах, связанных с лимфатическими узлами. Переходя во все более и более крупные сосуды, лимфоциты в конце концов попадают в главный лимфатический сосуд (грудной проток), по которому возвращаются в кровь. Такая постоянная циркуляция, по-видимому обеспечивает контакт как можно большего числа соответствующих лимфоцитов с антигеном (и друг другом) и служит для распределения Т- и В- клеток, активированных в результате этого контакта, по лимфоидным тканям всего тела. В составе периферической крови циркулируют 75-80% Т-лимфоцитов, 10-20% В-лимфоцитов и 5% NK (Иммунология под ред. Пола, 1987).

Состояние устойчивого динамичного равновесия любой клеточной популяции в живом организме, необходимое для нормальной жизнедеятельности, поддерживается системами обновления клеток. Любая потеря клеток (вследствие их гибели или миграции) количественно восполняется возникновением новых клеток, что и обеспечивает неизменность функции (Ярмоненко, 1984). Клетки каждого типа имеют свою характерную для них продолжительность жизненного цикла и соответственно различаются темпом обновления. Так В- клетки рециркулируют в системе вторичных лимфоидных органов 3-5 дней, Т- хелперы - 3-4 недели, Т- киллеры - 3-4 месяца.

В настоящее время широко применяется фенотипирование клеток, позволяющее определить не только количество отдельных субпопуляций лимфоцитов, но и содержание в них интактных и активированных клеток. Активация является одним из ранних этапов включения лимфоцитов в развитие иммунного ответа (Ляшенко и др., 1988). Без стадии активации невозможны в последующем пролиферация, дифференцировка и накопление соответствующего клона эффекторных иммунокомпетентных клеток. Состояние активации лимфоцитов можно оценить по количеству клеток, экспрессирующих на своей мембране активационные маркеры (AM). К ним относятся рецепторы для интерлейкина-2 (CD25), трансферрина (CD71) и HLA-DR (антигены главного комплекса гистосовместимости класса И). Рецепторы к ИЛ-2 и трансферрину появляются на мембране Т-лимфоцитов в Gi -стадии клеточного цикла и их экспрессия необходима для перехода Т-лимфоцитов из Gi в S-стадию и последующей пролиферации (Neckers & Cossman, 1983; Нага et al., 1986; Bich-Thuy et el., 1987; Zeher et al., 1990). HLA-DR экспрессируется на поверхности Т-лимфоцитов в течение S-фазы клеточного цикла или после нее. Предполагается антиген-представляющая роль HLA-DR молекул на активированных Т-клетках и их функционирование в качестве рецептора для трансдукции активирующего сигнала (Нага et al., 1986.; Bich-Thuy et el., 1987; Robbins et al., 1988; Herme & Sihvola, 1989; Odum et al., 1991).

По данным Павлюк и др. (Павлюк и др., 1993) число лимфоцитов, экспрессирующих ранние AM (CD25 и CD71) не превышало 3% всех лимфоцитов, а содержание лимфоцитов, экспрессирующих поздний AM (DR), составило 8%. Отсюда следует, что активированные Т-лимфоциты в периферической крови здоровых доноров представлены в крайне незначительных количествах. После активирования ФГА в культуре in vitro в течение 72 часов выявлено достоверное нарастание CD8+ лимфоцитов и боле