Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние электромагнитного и ионизирующего излучений с низкой интенсивностью на систему клеточного иммунитета животных

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние электромагнитного и ионизирующего излучений с низкой интенсивностью на систему клеточного иммунитета животных"

РГБ Ой

I 2 М№ 1938

На правах рукописи

Макар Вера Романовна

Влияние электромагнитного и ионизирующего излучений с низкой интенсивностью на систему клеточного иммунитета животных.

Биофизика 03.00.02

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г. Пущино 1997

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Научные руководители:

Доктор биологических наук Новоселова Е.Г.

Доктор биологических наук, профессор Фесенко Е. Е.

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, профессор Печатников В. А. Кандидат биологических наук Заичкина С. И.

Ведущая организация - Филиал Института Биоорганической Химии имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ФИБХ) РАН, г. Пущино.

Защита состоится ^ <МЯХ-'в час на заседании Диссертационного совета Д 200.23.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142292, г. Пущино, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке НЦБИ РАН, г. Пущино.

Автореферат разослан " " января, 1998.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических каук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Главная задача настоящей работы направлена на исследование механизмов регуляции клеточного иммунитета как обшей системы адаптации клетки и целого организма к изменениям внешней среды. Изменение устойчивости н лабильности живых систем при увеличении техногенного "давления", вызванного различными факторами, в том числе ионизирующими и электромагнитными излучениями, является ключевой проблемой сохранения биоценоза.

Ионизирующие и электромагнитные излучения, обладая проникающим действием, оказывают влияние на основные функции клетки, такие как рост, дифференцировка, синтез макромолекул, а также вызывают хромосомные аберрации. Биотропное действие этих факторов не вызывает сомнения (Кузин. 1973; Голант. Девятков. 1990; Акоев. 1995; Фесенко, 1995). Считается общепринятым, что ионизирующая радиация, а в некоторых случаях и электромагнитные излучения, способствуют возникновению иммунодефицита п могут повышать риск возникновения злокачественных новообразований. Однако, исследования иммунной системы животных и человека, особенно при неионизирующих воздействиях, проводятся недостаточно и несистемно, характеризуются, в основном, феноменологией и их результаты крайне противоречивы. Между тем. изучение функциональной устойчивости иммунной системы организма, которая является основным фактором защиты от патогенных условий внешней среды, очень важно с учетом возрастающего использования источников электромагнитных излучений и атомной энергии в сфере деятельности человека. Большинство исследований действия физических полей малой интенсивности (электромагнитных и радиационных) проводятся в условиях т \ч1го на трансформированных культурах лимфоцитов, что не может служить адекватной моделью и экстраполироваться на организм животного При исследовании действия магнитных полей на уровне организма обычно используют интенсивности излучений, которые на несколько порядков превышают реально существующие мощности при проведении эпидемиологического мониторинга.

Целью нашей работы было исследование состояния клеточного иммунитета животных в условиях воздействия , на целый организм электромагнитного; и ионизирующего излучений очень низкой интенсивности. По нашему мнению, слабые физические поля, для которых не характерно поражающее действие, способны вызывать изменения тонких регуляторных звеньев клеточного гомеостаза. Можно предположить, что изучение механизмов действия физических полей, в особенности электромагнитных, на устойчивость иммунной системы организма не только приблизит решение данной

фундаментальной проблемы, но будет иметь прикладное значение. например. в медицине.

Цель и основные ¡идти тс.Ч'дошпшн. Целью работы было изучение влияния слабого электромагнитного переменного поля сантиметрового диапазона и хронического у-пзлученпя с низкой мощностью дозы на функциональную активность иммунокомпетентных клеток. При этом были решены следующие задачи:

1. Определена динамика изменения ФНО - секретирующей активности клеток -продуцентов (перитонеальных макрофагов и Т-лимфоцитов) в зависимости от длительности экспозиции животных в электромагнитном поле.

2. Проведено сравнение эффективности иммуностимулирующего действия электромагнитного поля н антпоксидантов.

3. Изучено действие ЭМИ нетермального уровня in vivo на уровень спонтанной и митоген-индуцированной пролиферации Т-лимфоцптов мышей.

4. Показано, что электромагнитное и радиационное воздействие с низкими интенсивностями оказывают разнонаправленное действие на систему клеточного иммунитета животных.

Научная ноеита. Впервые показана активация синтеза ФНО в макрофагах и Т-лнмфоцитах животных при воздействии электромагнитного поля сантиметрового диапазона с мощностью излучения 1 мкВт/см". Выяснены закономерности пролонгированных эффектов ЭМИ, а также возможность их модификации при использовании комплекса природных жирорастворимых антпоксидантов. Научно - практическая ценность Результаты работы вносят существенный вклад в решение проблемы, касающейся механизмов регуляции клеточного иммунитета в условиях воздействия на организм физических факторов малой интенсивности, что имеет несомненный практический интерес.

Во-первых, все возрастающее применение систем, использующих электромагнитные излучения, происходит одновременно с увеличением уровня радиационного фона, что вызывает крайнюю необходимость выяснения биологических механизмов действия этих физических факторов для построения моделей защиты, а также для использования терапевтических эффектов этих полей.

Во-вторых, исследования механизмов модулирования радиационных эффектов природными иммуностимуляторами (антиоксидантами) могут способствовать решению фундаментальной задачи о физиологической роли окислительных процессов в патологии иммуногенеза.

В-третьих, повышением уровня эндогенной секреции ФНО под действием электромагнитных полей с определенными параметрами можно моделировать противоопухолевый эффект, не отягощенный побочной интоксикацией, что имеет практическое значение в клинике канцерогенеза.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на второй Международной конференции "Radiobiological conséquences of nuclear accidents", Москва, 14-15 ноября, ¡994; на Всероссийской конференции "Действие ионизирующей радиации на иммунную и кроветворную систему", Москва, 1995; на Международном конгрессе: "International Congress of Physiological Sciences", Санкт-Петербург, 1997г; на 3 Съезде по радиационным исследованиям, Москва, 14-17 октября, 1997. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 115 страницах, включает 7 рисунков и 4 таблицы; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных экспериментальных данных и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы содержит 249 ссылок. Список сокращении: АО - антиоксиданты; ЭМИ - электромагнитное излучение; ЭМП -электромагнитное поле; ЛПС - липополисахариды; ФНО - фактор некроза опухолей; К'онА - конканавалин A; Q-n - убихиноны.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Птияние слабого электромагнитного шлучения сантиметрового диапазона на состояние клеточного иммунитета мышей.

В настоящее время имеются многочисленные факты, указывающие на зависимость биологического эффекта электромагнитных излучений (ЭМИ) от физических параметров поля, и прежде всего от интенсивности и частоты электромагнитного сигнала. Естественно, что наибольшее число исследований, касающихся иммунотропного эффекта ЭМИ , было выполнено при крайне низких частотах (50-60 Гц), широко используемых в сфере деятельности человека. Анализ данных по изучению слабых электромагнитных полей (ЭМП) крайне низкой частоты (КНЧ) на иммунную систему человека и животных позволяет сделать вывод, что изменения иммунного статуса могут наблюдаться лишь при достаточно длительной экспозиции организма в этих условиях. Угнетение системы клеточного иммунитета при длительном действии ЭМИ КНЧ на живые организмы может быть одной из причин возрастания частоты злокачественных образований, показанной при эпидемиологических исследованиях.

В отличии от преобладающего иммунодепрессивного действия низкочастотных электромагнитных полей волны миллиметрового диапазона вызывают, обычно, активацию иммунокомпетентных клеток. Менее изучено действие СВЧ-излучений с более низкой частотой и длинами волн, относящихся к сантиметровому диапазону (3-30 ГГц). Между тем, в последние годы эти излучения стали успешно использовать в клинике, в частности, в онкологии. Результаты исследований указывают на актуальность изучения механизма действия электромагнитных волн СВЧ сантиметрового диапазона на иммунную систему.

Как известно, повышение противоопухолевой активности в значительной степени определяется уровнем секреции фактора некроза опухолей (ФНО). основными продуцентами которого являются макрофаги и Т-лимфоциты. В данной работе мы изучали эффекты ЭМИ нетермального действия в диапазоне частот 8-18 ГГц на уровень секреции ФНО макрофагами, а также на величину пролиферативного ответа Т-лимфоцитов. В опытах использовали мышей-самцов КМЖ весом 25 г. Источником ЭМИ служил генератор качаюшейся частоты Я2Р - 7612 с диапазоном частот 8,15 - 18 ГГц. Волновод соединялся с рупором, и расстояние от основания рупора до объекта составляло 80 см. Средняя величина интенсивности излучения составляла 1 мкВт/см*.

1.1. Продукция фактора некроза опухо лей.

На рис. 1 показана динамика изменения секреции ФНО макрофагами в зависимости от длительности периода экспозиции животных (от 0,5 час. до 7) суток в условиях ЭМИ с моночастотой сантиметрового диапазона (10 ГГц) Цитотоксическая активность лизатов макрофагов контрольных мышей по отношению к трансформированным клеткам Ь-929, которые являются высокочувствительными к ФНО, в среднем составляла 15%.

Облучение мышей приводило к 2-3-х кратному увеличению продукции ФНО. Активация наблюдалась при длительности экспозиции, составляющей не менее 3 часов. Максимальную активацию синтеза ФНО наблюдали после 5 часов облучения. При длительности СВЧ-воздействия в интервале от 10 часов до 3 суток отмечено двукратное повышение продукции ФНО.

В следующей серии экспериментов измеряли уровень секреции ФНО макрофагами перитонеального экссудата и Т-лимфоиитами селезенки в течении 72 часов после окончания экспозиции животных ЭМИ в диапазоне частот 8-18 ГГЦ в режиме качания и мощности 1 мкВт/см2. Длительность облучения составляла 24 часа.

0 -í-н-1—i-i--1—r/VsH-

23 5 S 10 72 120 168

Время экспозиции животных, час

Рис. 1. Продукция ФИО макрофагами перлтонеального экссудата мышей, после экспозиции в ЭМП с частотой 10 ГГц. 1 мкВт/см". Каждое значение - среднее от 5 мышей, изменение цитотоксичности каждого лизата проводили в 12 повторах. Для цнтотоксического теста клетки L-929 культивировали в 96 луночных планшетах по ЗхЮ"1 клеток в 0,1 мл на каждую лунку в среде RPMI. содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. 1% L- глютамина. 100 мкг/мл стрептомицина при 37° С, 5% СОг Через 24 часа культивирования к образованному монослою клеток L-929 добавляли 1 мкг/мл актнномицина D (Sigma. США) и затем по 0.1 мл макрофагального лизата или ФНО. К контрольным лункам добавляли только среду. 100% лизис достигали добавлением 3 M раствора гуаннднн гндрохлорида. Затем планшеты инкубировали в течение 24 часов, и выживаемость клеток определялась окрашиванием при добавлении 20 мкл раствора МТТ (5 мкг/мл. Sigma. США), после чего планшеты инкубировали еще 4 часа при 37° С, 5% СО;. Затем среда с МТТ удалялась, и в каждую лунку добавляли 100 мкл диметилсульфоксида. Оптическую плотность измеряли при 546 нм на спектрофотометре для планшетов (Titertek Multiscan МСС/340, Flow Laboratories). Цитотоксичность макрофагов рассчитывали по формуле:

Оптическая плотность в экспериментальных л\'нках

1---------:- - 100

Оптическая плотность в контрольных лунках

Подсчет клеток в процессе выделения проводили после окрашивания смесью растворов 0,1% эозина и 0,1% трипанового синего 1:1. Статистический анализ проводили с использованием критерия Стьюдента.

Для подтверждения того, что клетки L-929 лизируются ФНО, паралельно клетки-мишени инкубировали с моноклональными антителами к ФНО-а (Anti-Human TNF-а, Sigma). Цитотоксическая активность лизатов была нейтрализована при добавлении антител с разведением 1:1000. Добавление антител без лизатов не вызывало лизиса клеток L-929.

На рис. 2 представлены результаты измерений спонтанной и активированной липополисахаридом (ЛПС) цитотоксическоП активности перптонеальных макрофагов, выделенных из интактных н облученных животных.

Результаты показывают, что воздействие ЭМИ in vivo в течении 24 часов вызывает повышение ФНО-продукции в макрофагах облученных мышей, которое сохраняется на протяжении 3 суток после прекращения экспозиции животных. Уровень активации -

20 т 0 час после 24 час после 72 час после

облучения облучения облучения

:ппНнШп I

+ЛП С +ЛПС +ЛПС +ЛПС контроль ЭМИ контроль ЭМИ контроль ЭМ

80

§6° i 404

20

+ЛПС ЭМИ контроль

11

I

ЭМИ

L

контроль ЭМИ

контроль ЭМИ

контроль ЭМИ

Рис. 2. Продукция ФИО макрофагами и Т-лимфоцитами в разные сроки после окончания облучения мышей ЭМИ с частотой 8,15-18 ГГц, мощность 1 мкВт/см2 ЛПС добавляли в культуральную среду в концентрации 1 мкг/мл. Вверху - макрофаги перитонеального экссудата, внизу - Т-лимфоциты селезенки..Каждое значение - среднее от 4 животных, измерение цитотоксичности клеток проводили в 12 повторах.

примерно такой же, как и при облучении длительностью 5 часов (рис. 1). Интересно, что по уровню стимуляции ФНО-продуцирующей способности макрофагов ЭМИ даже эффективнее, чем добавленный in vitro к клеткам ЛПС, обладающий способностью активировать синтез ФИО. Следует отметить, что при стимулировании макрофагов ЛПС эффект ЭМИ также проявляется, хотя он ниже, чем для интактных клеток. В этих же экспериментах была обнаружена ЭМИ-вызванная стимуляция цитотоксической активности Т-клеток селезенки мышей (рис. 2) Уровень активации в Т-лимфоцитах был гораздо выше, чем в макрофагах, но через 3 суток после окончания облучения стимуляция секреторной активности в этой популяции клеток была незначительно выше контрольной. Таким образом, мы наблюдали разную динамику стимуляции синтеза ФНО в двух основных популяциях клеток- продуцентов.

Повышение продукции ФНО и пролонгирование этого эффекта в течении 72 часов после окончания ЭМИ воздействия, показанное в данной работе, свидетельствует, по нашему мнению, об активации защитного потенциала иммунной системы при использовании СВЧ-излучений с. длиной волны сантиметрового диапазона. Такое заключение подтверждают результаты измерения стимулированной и нестимулированной

-л 60 'О

| 50

1 «

Î 30 &

о 20

2 я

О час после облучения

П111,6

ПИ 1,6

ii

24 час после 72 час после

облучения облучения

ПИ 2,8

ПИ 2,0

ПИ 2,0

ПИ 2,0

п

+КонА +КонА +КонА +КонА +КонА +КоиЛ контроль ЭМИ контроль ЭМИ контроль ЭМИ

10

Рис. 3. Включение "'Н-метилтимидина в Т-лимфоциты селезенки интактных и подвергнутых ЭМИ мышей (8-18ГГц, 1 мкВт/см2, время экспозиции 24 часа) в разные срок» после воздействия. Пролиферативный индекс (ПИ) определяли как отношение: КонА- стимулированное включение TdR / нестимулированное включение TdR По оси ординат - имп/млн /5х 10'л клеток.

Т-клетки культивировали в среде RPMI-1640 (Sigma, США), содержащей 1% IM HEPES, 40МЕ/мл гентамицина, 5% эмбриональной телячьей сыворотки при 37" С и 5 % СО: на протяжении 3 дней. В каждую лунку %-луночного планшета помешали по 100 мкл суспензии Т-клеток, Там. где необходимо, добавляли 5 мкг/мл конканавалина А (Sigma. США). За 24 часа до сбора культивируемых Т-клеток в лунки добавляли по 10мкКи/мл Н- мгтилтнмидина с удельной активностью 130 ГБк/мМ. Клетки собирали с помощью харвестера на стекловолоконные фильтры GFS и радиоактивность включенной метки подсчитывали на сцинтпляционном счетчике SL-20. Каждое значение 1 среднее от 4-х мышей, измерение радиоактивности провозили в 9 повторах.

пролиферации Т-лимфоцитов селезенки по регистрации включения 'Н-тимидина в эти клетки (рис. 3).

1.2. Иммунный ответ.

Сразу после воздействия ЭМП наблюдали резкую активацию спонтанной пролиферации Т-клеток, что свидетельствует о значительном повышении уровня метаболизма этих клеток (рис. 3). При этом пролиферативный индекс, который показывает величину ответа клетки на митогенный стимул, не отличался от контрольного. Через сутки после прекращения действия ЭМИ мы наблюдали достоверное увеличение иммунного ответа' Т-лимфоцитов, выделенных из селезенки облученных животных. Через 3 суток после экспозиции пролиферативный ответ этих клеток не отличался от контроля (рис.3).

Таким образом, показана стимуляция клеточного иммунитета после воздействия на организм животного слабого электромагнитного поля сантиметрового диапазона. Очевидно, что существует различная чувствительность двух клеточных популяций, являющихся основными продуцентами ФНО в организме, к действию ЭМИ. 2. Участие антиоксидантов в регуляции клеточного иммунитета.

Известно, что угнетение функциональной активности иммунокомпетентных клеток при некоторых патологических состояниях может быть в значительной степени редуцировано применением экзогенных антиокислителей. Было показано, что внутриклеточный окислительно-восстановителный баланс является регуляторным ■фактором в процессах Т-клеточной активации, секреции лимфокинов макрофагами, а также клеточной гибели по апоптозному типу. Известно, что в клетке существует ряд антиоксидантов, способных детоксифицировать активные формы кислорода. Из ряда липорастворимых антиоксидантов наибольший интерес при исследовании иммунофармокологического действия представляют убихиноны как единственные полипреноиды, способные к синтезу Je novo и обладающие ферментной системой регенерации окисленных форм этих коферментов до восстановленных.

С учетом того, что индукция иммунного ответа реализуется через кооперативное взаимодействие различных субпопуляций клеток, мы исследовали действие убихинонов на иммунные реакции Т-лимфоцитов и макрофагов in vivo и in vitro. Известно, что эти клетки отличаются высокой чувствительностью к изменению уровня активных форм кислорода, и их жизнедеятельность в значительной степени предопределена способностью забуферить окислительный сдвиг. В настоящей работе мы изучали влияние антиоксидантов на уровень иммунного ответа Т-лимфоцитов и на степень цитотоксичности макрофагов к ФНО - чувствительным клеткам L-929.

2.1. 1'-:тыфоциты.

После того, как животные получали диету с повышенным содержанием убихинона Q9, митоген-стимулированное включение меченого тимидина в Т-клетки было значительно увеличено (Табл. 1). Величина иммуностимулирующего действия убихинона не зависела от длительности диеты с антиоксидантом, но достоверное увеличение числа лимфоцитов селезенки наблюдали после 30-ти, но не 10-ти дневной нагрузки убихиноном. Эти результаты указывают на отсутствие строгой корреляции между клеточностью органа и функциональной активностью Т-лимфоцитов селезенки. По-видимому, определяющим фактором для повышения уровня иммунного ответа Т-клеток является обнаруженное нами увеличение концентрации убихинона в лимфоцитах селезенки (Табл. 1).

Таблица 1. Влияние диеты с убцхиноном Q<> на пролиферацию Т-лимфоцитов селезенки крыс._

Контроль 10 дней диеты 30 дней диеты

а) Т-клетки 47941251 50721346 6428+500

Т-клегки + КонА 71911538 •1913511248 '1837411 127

б) 518152 538135 '640143

в) 160112 '490135 '520142

а) включение 'Н-тимидина, имп/мин/5х105 клеток;

б) количество лимфоцитов селезенки (количество клеток * 10"6 ),

в) концентрация убихинона в лимфоцитах селезенки (рМ/мг белка).

Убихинон измеряли после экстракции липидов, разделения на ТСХ и спектрофото-метрирования, как описано ранее (Новосёлова, 1992). Каждое значение - среднее от 5 животных; * - отличие достоверно при р< 0,05

Активация пролиферативного ответа Т-лимфоцитов была показана при добавлении антиоксндантов (убихинонов и p-каротина) in vitro в среду культивирования этих клеток. При этом было обнаружено стимулирующее действие не только эндогенного для крыс убихинона Q9, но и полипреноидов с более короткой (Qi и СЬ) и длинной (Qm) боковой цепью (данные не показаны). При использовании этого ряда антиоксндантов показано, что их влияние in vitro на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов не зависело от степени их гидрофобности, поскольку наименьшую активацию показали при действии растворимой в воде молекулы убихинона Qi и водонерастворимого полипреноида Р-каротина.

2.2. Макрофаги.

Заметное угнетение цитотоксичности макрофагов было обнаружено при добавлении убихинонов in vitro к культивируемым макрофагам, причем более значительное снижение цитолиза клеток L-929 макрофагальными лизатами показано при включении в среду убихинонов с длинной боковой цепью - Q.>. и Qm (Рис.4).

Снижение цитотоксичности макрофагов при обработке антиокснантами in vitro. показанное в данной работе, доказывает регуляторную роль окислительно-восстановительного баланса в реализации киллерной активности макрофагов по отношению к опухолевым клеткам. Прямое подтверждение этого предположения мы получили, обнаружив достоверное уменьшение гибели клеток L-929 под действием рекомбинантного ФНО при добавлении в среду 50 мкМ убихинона (Табл. 2).

Таким образом, наряду с известными системами, предохраняющими клетку от активных метаболитов кислорода, образующихся в норме и при патологических состояниях, очевидна важная роль кофермента Q. как активного природного антиоксиданта, регулирующего метаболизм и функциональную активность иммунокомпетентных клеток.

т

i д.

ю

Д-, л

Qi Q2 Qs QW

Рис. 4. Влияние убихинонов in vitro на шгготоксичность перитонеальных макрофагов мышей. По оси ординат - количество погибших клеток L-929. в %. Белый столбик-активность контрольных макрофагов, черные столбики - активность макрофагов в присутствие убихинонов. Каждое значение - среднее от 5 мышей, каждый макрофагальный лизат тестировался в 12 повторах.

Таблица 2. Влияние in vitro убихпнона Qo на цитолиз клеток линии L-929, инкубируемых в присутствии ФИО.

Концентрация ФНО. Пг/мл 156 312 1250 12500

без Q■> 17 ±0.9 46±5.1 68+3.0 80±7.5

50 мкМ О» •|2±1.4 'J0±2.8 '56±4.9 74±6,9

Каждое значение - процент погибших клеток 1.-929, среднее из 6 измерений. * - огличие достоверно при р < 0.05

.?. Исследование сочетанпого действия природных антиоксидантов и СВЧ-и ¡лучения пикой интенсивности.

Использовали диету с микродобавками убихинона Оч, а-токоферола и Р-каротина, природными полипреноидами. которые способны взаимно повышать иммуностимулирующие и протнЕорадикальные свойства. Предполагалось выяснить, существует ли синергизм иммуностимулирующих эффектов слабого СВЧ-излучения сантиметрового диапазона и комплекса антиоксидантов.

На рис 5 показана динамика изменения продукции ФНО в макрофагах и Т-лимфоцитах мышей, подвергнутых ЭМИ в течении 5 часов, в интервале 0-72 часа после прекращения воздействия. Через 72 часа после окончания экспозиции мышей в сантиметровом диапазоне СВЧ- излучения уровень секреции ФНО оставался повышенным почти на 100% от контроля.

Как видно из рис. 5, использование диеты с комплексом лчпорастворимых природных антноксидантов повышает уровень секреции ФНО в макрофагах в 2 раза. Облучение мышей, получающих антиоксиданты (АО), не выявило аддитивного эффекта облучения и АО. Однако через 3 суток после действия ЭМИ показано достоверное увеличение степени активации макрофагов на фоне использования диеты с АО. Таким образом, применение АО может усиливать пролонгированный стимулирующий эффект электромагнитного излучения.

Макрофаги

3

диета

контроль

24 48

Время после облучения, час

Т-лимфоцнты Т

__-х-

20-|Г----II------------диета

' контроль

24 48

Время после облучения, час

72

Рис. 5. Цитотоксическая активность макрофагов перитонеального экссудата и Т-лимфоиитов селезенки мышей.

■------животные, подвергнутые ЭМИ, 8-18 ГГц, 1мкВт/см2, 5 час.

х---животные, получавшие диету с антиоксидантами (4 мг/кг веса - СЬ, по 1мг/кг веса

- Р-каротина и а-токоферола) на протяжении 1 месяца перед облучением. Каждое значение - среднее от 3-4 животных; в каждом случае цитотоксическую активность определяли в 12 повторах.

V

5 юоо

р 600 §

= 200 о

0 часов после облучения

I I I

контроль ЭМИ

АО АО+ЭМИ

1400

С 1000

600

200

¿4 часа после о&тучения

шит

контроль ЭМИ

АО

АО+ЭМИ

72 часа после облучения

контроль ЭМИ АО АО+ЭМИ

Рис. 6. Включение 3Н-метилтпмидина в Т-лимфоциты селезенки мышей. Белые столбики -спонтанная пролиферация, черные столбики - стимулированная КонА пролиферация. ЭМИ - облучение при 8-18 ГГц, 1 мкВт/см*, 5 час.; АО - диета с комплексом антиоксидантов; АО+ЭМИ - комбинированное воздействие.

Подобные результаты были получены при изучении продуктивности Т-лимфоцитов (рис. 5). Надо отметить, что диета с АО активирует цитотоксическую активность Т-лимфоцитов в меньшей степени, чем это показано для макрофагальных клеток. Воздействие ЭМИ ведет к двукратному увеличению продукции ФИО Т-клетками в течение всего срока исследования, а максимальный эффект электромагнитных волн наблюдали через 3 суток после окончания экспозиции в Т-лимфоцитах мышей, получающих АО.

Таким образом, как в макрофагах, так и в Т-клетках показано достоверное активирующее влияние АО на отдаленные эффекты слабого ЭМП.

Измерение спонтанной и митоген-стимулированной пролиферации Т-клеток селезенки также показало стимулирующее действие ЭМИ и диеты с АО в течении периода 0-72 часа после облучения. Как видно из рис. 6, применение диеты не изменяет уровень спонтанной пролиферации Т-лимфоцитов, а величина ответа клеток на митоген увеличена в этом случае примерно на 25%. Применение СВЧ-излучения in vivo приводит к значительным сдвигам в пролиферативной активности Т-клеток. Сразу после облучения наблюдается заметное повышение иммунного ответа Т-лимфоцитов мышей, и в это же время наблюдается резкое повышение уровня митогенной пролиферации под действием ЭМИ на фоне применения АО. Таким образом, после окончания экспозиции животных в электромагнитном поле наблюдали синергизм действия антиоксидантов и СВЧ-излучения. Через 24 часа после облучения иммунный ответ Т-клеток был ниже контрольного уровня, однако спонтанная пролиферация лимфоцитов селезенки была активирована как у мышей, получающих нормальную диету, так и при нагрузке АО. Через 72 часа после окончания экспозиции в электромагнитном поле уровень спонтанной пролиферации Т-клеток нормализуется, но резко повышается величина митоген-стимулированного включения меченого тимидина в Т-лимфоцитах, причем степень активации не зависела от того, получали ли облученные животные диету с АО.

Таким образом, СВЧ-излучение в сантиметровом диапазоне с весьма низкой интенсивностью вызывает достоверную активацию иммунного потенциала макрофагов и Т-клеток, а применение диеты с АО способно усилить иммуностимулирующие эффекты микроволн при их субоптимальном воздействии, в том числе при ослаблении ЭМИ-эффектов в отдаленные сроки.

4. Угнетение функциональной активности клеток иммунной системы в условиях хронического действия малых доз ионизирующей радиации.

Известно, что при общем облучении животных в диапазоне доз от минимально летальной до абсолютно смертельной клетки иммунной системы являются главными

мишенями ионизирующей радиации. Точка зрения об особой уязвимости лимфоцитов животных, перенесших облучение, является общепринятой.

В настоящей работе представлены результаты исследования действия малых доз хронического у-облучения на пролиферативную активность Т-клеток селезенки крыс линии Вистар, массой 150-180г. Первая часть экспериментов проводилась сразу после прекращения воздействия. Исследовали эффекты радиации в суммарных дозах 11, 23 и 35 сГр. Вторая часть экспериментов проводилась для оценки отдаленных последствий хронического действия облучения. Для этого после окончания экспозиции в радиационном поле животные содержались в нормальных условиях в течении ], 2, и 3 месяцев после суммарных доз 11, 23, и 35 сГр, соответственно.

Как известно, ионизирующее излучение индуцирует в тканях цепные свободнорадикальные процессы, в ходе которых исчерпываются возможности ферментативных антиокислительных систем, а также расходуются низкомолекулярные антиоксидан ты. Все эксперименты проводились с использованием природного антиоксиданта (убихинона), иммуномодулирующие свойства которого хорошо известны. При измерении пролиферативных ответов, стимулированных КонА, мы обнаружили значительное угнетение сразу после облучения в дозах 11 и 23 сГр, однако, доза 35 сГр не вызывала достоверного отличия иммунного ответа от контрольного уровня (табл. 4).

Для того, чтобы выяснить способность к пострадиационному восстановлению пролиферативной активности Т-клеток, измеряли иммунный ответ через 1, 2 и 3 месяца после облучения в дозах 11, 23 и 35 сГр, соответственно. Обоснованность такой схемы, по нашему мнению, заключается в том, что время восстановления функций клеток должно быть более длительным после воздействия более высоких доз облучения. Наблюдали значительное восстановление Т-клеточного иммунитета через 2 месяца после облучения в дозе 23 сГр, но через 1 и 3 месяца после доз 11 и 35 сГр уровень иммунной супрессии был даже больше, чем сразу после облучения (табл. 3).

Диета с убихиноном вызывала полную нормализацию иммунного ответа в Т-клетках животных, получивших дозу 11 сГр. При общей дозе 23 сГр нагрузка антиоксидантами вызывала частичное восстановление сразу по завершению облучения, но не оказывала эффекта через 2 месяца после окончания экспозиции. Таким образом, мы не обнаружили пролонгированного эффекта действия диеты с убихиноном (табл. 3).

Исследовали связь между двумя важными показателями состояния клеточного иммунитета, а именно: пролиферат. ,,ий активностью Т-лимфоцитов и клеточностыо селезенки облученных крыс. Уменьшение количества спленоцитов крыс, облученных в

Таблица 3. Влияние хронического у-облучения с мощностью дозы 0,43 сГр/сутки и диеты с убихиноном на мнтогеннын ответ Т-лимфоцитов селезенки.

Накопленная доза. сГр Облучение Облучение + диета

11 а б. *81±7.8 114±12

*65±5.5 "67±8.2

23 а 02 "64±7,1 "72+6.9

87±9.1 96±9.3

35 а бд 95±11 96-8.4

"33±4.1 *35±3.9

Животные получали убихннон с диетой (8 мг/кг веса) ежедневно. Митогенный ответ определяли как на рис. 3. Данные представлены в процентах по отношению к контролю (средние значения от 5 животных в каждой группе).

(а) - эксперимент, проведен сразу по завершению облучения (0 дней после облучения); (б:) - отдаленные последствия (¡, время после облучения, месяцы); (61) - один месяц; (б;) - два месяца; (б;) - три месяца после хронического ■у-облучения. * Значения достоверно отличаются от контроля. р<0.05.

дозе 23 и 35 сГр. составляло 25% и 40% от контрольного уровня, соответственно (табл. 4). Хроническое облучение в дозе 11 сГр вызывало лишь тенденцию к уменьшению числа клеток, тогда как через месяц после воздействия уменьшение клеточности было достоверным и составляло 20%. Напротив, спустя 2 н 3 месяца после облучения в дозах 23 и 35 сГр наблюдали тенденцию к восстановлению числа спленоцптов у облученных животных. Эти данные указывают на волнообразный характер протекания процессов восстановления клеточности органов при хроническом облучении в малых дозах. Более того, следует отметить, что мы наблюдали некоторое восстановление числа лимфоцитов селезенки сразу после облучения в дозах 23 и 35 сГр у животных, получавших в течении экспозиции в радиационном поле диету с убихиноном (табл. 4).

Таблица 4. Изменение числа Т-лимфоцитов селезенки облученных и получавших диету с убихиноном Од крыс.

Накопленная доза. сГр Облучение Облучение + диета

11 а б. 96±8.3 *68±5,4

81±7,8 85±8,1

23 ' а 0: *75±5,9 87±7.4

106±9.8 *124±10,4

3? а б.! *60+5,8 *72±6.3

89±9.4 105+8,5

Данные представлены в процентах по отношению к контролю (средние значения от 5 животных в каждой группе). Все обозначения как в табл. 5. * Значения достоверно отличаются от контроля, р<0.05.

Таким образом, исследование ранних эффектов малых доз хронического облучения показало, что происходит угнетение иммунного ответа, причем величина эффекта не имела прямой зависимости от общей дозы облучения (табл. 4).

Полученные нами результаты дают возможность заключить, что хроническое облучение малыми дозами вызывает структурные и функциональные изменения иммунокомпетентных клеток, свидетельствующие о пострадиационной иммуносупрессии.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые показано, что электромагнитное излучение в сантиметровом диапазоне электромагнитного спектра вызывает значительное увеличение секреции фактора некроза опухолей в макрофагах и Т-лимфоцитах облученных мышей.

2. Доказано, что активация системы клеточного иммунитета сохраняется в отдаленные сроки после экспозиции животных в переменном магнитном поле слабой интенсивности.

3. Применение длительной диеты с комплексом антиоксидантов усиливает иммуностимулирующие эффекты ЭМИ при их воздействии на субоптимальном уровне, например, при ослаблении ЭМИ-эффектов в отдаленные сроки после облучения.

4. Слабое радиационное у-поле, в отличии от ЭМИ, вызывает достоверный пролонгированный иммунодепрессивный эффект, который в значительной степени редуцируется применением природных антиоксидантов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ-

1. Novoselova Е. G., Semiletova N. V., Safonova М. V., Makar V. R. 1996. Effect of dietary ubiquinone on immune function and lipid metabolism in rat T lymphocytes. Bull. Mol. Biol. Med. v. 21, No 1-4, p. 350-359.

2. Makar V. R., Semiletova N. V., Novoselova E. G. Immune system and CNS under chronic low-dose irradiation and antioxidants protection. //Int. Cong, of Physiological Sciences, St. Petersburg, July, 1997, p. 019.23.

3. Макар В. P., Семилетова H. В., Галибина И. В., Новоселова Е. Г. Цитотоксические эффекты острого у-облучения.// Тезисы доклада на 3 Съезде по радиационным исследованиям, Москва, 1997, т. 1, с. 60.

4. Новоселова Е. Г., Семилетова Н. В., Макар В. Р., Фесенко Е. Е. Влияние электромагнитного СВЧ-излучения на уровень секреции фактора некроза опухолей в макрофагах мышей.// Тезисы доклада на 3 Съезде по радиационным исследованиям, Москва, 1997, т. 3, с. 74.

5. Новоселова Е. Г., Макар В. Р., Семилетова Н. В., Галибина И В., Вакулова JI. А.. Садовников В. Б.. Фесенко Е. Е. 1998. Участие антиоксидантов в регуляции клеточного иммунитета. Иммунология, Л"» 3.

6. Novoselova Е„ Semionova Т.. Semiletova N.. Makar V., Medvinskaya. Antioxidant (ubiquinone-9) protection of immune system and CNS under chronic low-dose irradiation. //Report in ¡international Conference en Radiation and Health, Beer Sheva, Israel, 3-7 November, 1996, p. 107.

7. Макар В. P. Роль антиокендантов в процессах активации Т-клеток. //Тетпсы доклада на Городской научной конференции молодых ученых, Пущино. 1996, с 56.

8. Макар В.. Р., Семилетова Н. В., Галибина И. В., Новоселова Е. Г. Природные антиоксиданты и клеточный иммунитет в условиях ионизирующих и неионизирующих излучений. // Тезисы доклада на Городской научной конференции молодых ученых, Пущино, 1997. с. 107.

9. Novoselova Е. G, Semiletova N. V., Makar V. R, Gordon R. Ya. Early and long-term effects of chronic radiation and coenzyme Q diet on the immunological response in rat splenic T cells. //Ind. J. Biochem. Biophys., 1997, v. 35.

10..Novoselova E. G, Makar V. R, Galibina 1. V., Fesenko E. E. Effect of low power density microwaves on the mouse cellular immunity: II. Immunostimulating effects of microwaves and naturally - occuring antioxidants nutrients. Bioelectromagnetics., 1998. (in press).

11.Makar V. R., Novoselova E. G, Fesenko E. E. Effect of whole-body short-term microwave exposure on the Tumour Necrosis Factor production in the mice cells. Bioelectromagnetics., 1998. (in press).

12.Новоселова E Г, Семилетова H. В., Макар В. P. Ранние и отдаленные эффекты хронического у-оолучения в малых дозах на иммунный статус Т-клеток селезенки крыс. // Тезисы доклада на Всероссийской конференции "Действие ионизирующей радиации на иммунную и кроветворную систему", Москва, 14-15 ноября, 1995, с. 18.

13.Новоселова Е. Г., Макар В. Р., Семилетова Н. В., Колаева С. Г., Садовников В. Б. Продукция фактора некроза опухолей макрофагами и Т-лимфоцитами грызунов в условиях острого у-облучения. Радиац. Биол Радиоэкология. (В печати)

Научное издание

Автореферат Макар В.Р.

ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО И ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЙ НА СИСТЕМУ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА ЖИВОТНЫХ

Налоговая льгота - общероссийский классификатор прод}'кции ОК-005-93; том 2; 953000 - книги и брошюры.

9.01.98 г. 3. 7833Р. Т. 100 экз. Усл.печ.л. 1,0. Отпечатано с оригинала-макета в Отделе научно-технической информации Путинского научного центра РАН. 142299 г. Пущино Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ ПНЦ РАН.