Экспериментальное исследование клеточных механизмов кроветворения в онтогенезе

Домарацкая, Елена Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспериментальное исследование клеточных механизмов кроветворения в онтогенезе
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное исследование клеточных механизмов кроветворения в онтогенезе"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 591.85

ДОМАРАЦКАЯ Елена Ивановна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ КРОВЕТВОРЕНИЯ В ОНТОГЕНЕЗЕ

03.00.25 - гистология, цитология и клеточная биология

ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ БЕСПЛАТНЫЙ ЭКЗЕМПЛЯР

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (директор Института - доктор биологических наук Н.Д. Озернюк, зав. лабораторией гистогенеза -академик Н.Г. Хрущов).

Официальные оппоненты:

академик РАЕН доктор медицинских наук, профессор А.Г.Бабаева доктор биологических наук, профессор В.Я.Бродский доктор медицинских наук, профессор А.А.Иванов

Ведущее учреждение:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «_»_2004 г. в_часов

на заседании специализированного совета Д002.238.01 при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБР РАН

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Е.В.Волина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема клеточной дифференцировки является крайне актуальной для современной биологии и медицины. Интерес к ней специалистов разнообразного профиля (молекулярных биологов, генетиков, цитологов, биологов развития, и т.п.) резко возрос в связи с последними успехами в изучении эмбриональных и тка-неспецифических стволовых клеток и не в последнюю очередь связан с поиском методов клеточной терапии для восстановления поврежденных органов и тканей.

Кроветворная ткань представляет собой уникальную и наиболее экспериментально продвинутую модель для изучения механизмов дифференцировки и регенерации. Для нее характерно многообразие клеточных форм, различающихся по степени зрелости и специфике обменных процессов, а также линий (ростков) дифференцировки (эритроидная, гранулоцитарная, моноцитарная, мегакариоцитарная, лимфоидная). Клеточную основу, обеспечивающую восстановление зрелых клеток крови и кроветворной ткани в целом после естественной гибели терминально дифференцированных клеток, в ходе патологических процессов или действия различных повреждающих агентов, составляют кроветворные стволовые клетки (КСК). Основные их свойства - способность к самоподдержанию и полипотентность. Благодаря самоподдержанию КСК, возникнув в эмбриогенезе, не исчезают из кроветворной ткани и служат источником пополнения зрелых клеток на протяжении жизни организма. Полипотентность, т.е. способность давать потомство клеток, дифференцирующихся по многим направлениям, обеспечивает многообразие форменных элементов крови. Другое отличительное свойство кроветворной ткани - способность менять место локализации. Перемещение кроветворной ткани происходит в эмбриональном развитии, когда циркулирующие клетки репопулируют (заселяют) закладки кроветворных органов, а также в экспериментальных условиях и патологии при формировании эктопических очагов гемопоэза. Непременным условием нормально протекающего кроветворения является взаимодействие кроветворных стволовых и родоначальных клеток с клетками стромы, составляющими основу так называемого кроветворного микроокружения (КМО) (Старостин, 1986). Распознавание и удержание кроветворных клеток, их миграция осуществляется клетками КМО при участии молекул клеточной адгезии. Клетки КМО обеспечивают не только пространственную организацию кроветворных органов, но, контактируя с кроветворными клетками, выделяют и аккумулируют разнообразные факторы роста, регулирующие процессы пролиферации и дифференцировку КСК.

Исследования последнего десятилетия показали, что популяция КСК гетероген-на и включает два подотдела (компартмента)

тигенам характеристикам), продолжительности жизни, способности к дифференциров-ке и степени самообновления (Morrison, Weissman, 1994; Randal, Weissman, 1998; Kondo et al., 2003). Первый компартмент составляют КСК с неопределенно длительным самоподдержанием; второй - КСК, самоподдерживающиеся не более 3-6 недель. Мультипотентные (родоначальные) клетки входят в компартмент, который следует в диффероне за стволовым, и не обладают экстенсивным самоподдержанием. Часть мультипотентных клеток (общие миелоидные предшественники) дифференцируются в эритроидном, мегакариоцитарном и миелоидном направлениях, способны образовывать в селезенке облученного животного клоны кроветворных клеток (колонии), различимые визуально, и представляют собой так называемые колониеобразующие единицы селезенки - КОЕ-С, давшие название методу их количественного учета in vivo. Хотя КОЕ-С не идентичны КСК, метод селезеночных колоний, используется для анализа КСК и в настоящее время. Его модификация, предложенная японскими исследователями, позволила продемонстрировать, что истинные КСК также способны формировать визуально различимые кроветворные клоны-колонии в селезенке в более поздние сроки по сравнению с мультипотентными предшественниками (Liang et al., 1999; Ikehara, 2000; Yang et al., 2002). Таким образом, метод селезеночных колоний остается адекватной моделью исследования клоногенных кроветворных клеток разной степени зрелости и в зависимости от срока наблюдения позволяет вести дифференцированный учет как - родоначальных клеток, так и КСК.

Принципиальная организация кроветворного дифферона, как последовательного ряда клеточных форм со специфическими для каждой потенциями к дифференци-ровке и размножению, не вызывает сомнений. Однако к началу нашего исследования были неясны некоторые вопросы организации компартмента родоначальных клеток, свойства отдельных их категорий, их цитофизиологические особенности, а также изменения, которые происходят в популяции КОЕ-С в индивидуальном развитии.

чается по содержанию клоногенных клеток от костного мозга взрослых животных (Micklem, 1972, Gaidul et al., 1984). Однако данные о составе популяции эмбриональных КОЕ-С были весьма скудны и касались, в основном, печени зародышей одного срока развития (Metcalf et al., 1983; Johnson, Nicola, 1984; Gaidul et al., 1986). Наиболее полный труд Меткалфа и Мура, посвященный эмбриональным аспектам кроветворения, был создан, когда КОЕ-С рассматривались как однородная популяция клеток (Metcalf, Moore, 1971). Поэтому весьма актуальным представляется детальное исследование изменений в составе родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах в разные сроки пренатального онтогенеза, завершающиеся формированием дефинитивной кроветворной ткани. В постнатальном периоде, однако, в печени - органе, утратившим кроветворную функцию, Хрущевым с соавторами были описаны КОЕ-С и получены данные, что по некоторым характеристикам КОЕ-С печени половозрелых животных близки таковым из периферической крови (Хрущов и др., 1977; Старостин, 1986). Окончательный ответ на этот вопрос могло дать сравнительное исследование цитофизиологических характеристик индивидуальных КОЕ-С из различных кроветворных источников.

Как известно, одним из важных показателей клеточной активности является интенсивность синтеза РНК, меняющаяся в зависимости от стадии дифференцировки клетки, потребностей в белковом синтезе, фазы митотического цикла и т.д. В норме КСК и КОЕ-С представляют собой покоящиеся популяции клеток (Hodgson, Bradley, 1979; van Zant, 1984; Lerner, Harrison, 1990; Berardi et al., 1995; Ross et al., 1982; Morrison et al., 1997). Предполагалось, что синтез РНК в митотически инертных КОЕ-С, находится на достаточно низком уровне и для вступления в пролиферацию необходима его активация. Однако эта цитофизиологическая особенность КОЕ-С оставалась практически не изученной, и ее исследование нуждалось в новых подходах, поскольку традиционная радиоавтография не может быть использована для анализа клоногенных кроветворных клеток, не имеющих характерных морфологических признаков в отличие от дифференцированных клеток таких, например, как малые лимфоциты.

го органа (Van Den Heuvel et al., 1987). Другой методический прием - эктопическая пересадка - позволяет вывить мезенхимные стволовые клетки функционально по их способности к дифференцировке в несколько типов стромальных клеток и формированию КМО, поддерживающего гемопоэз. Этот метод может быть с успехом использован для определения дифференцировочных потенций мезенхимных клеток, имеющихся в печени зародыша.

В рамках общей проблемы стволовых клеток и их роли в восстановлении кроветворной ткани значительный интерес представляет исследование, помимо кроветворных, также и стволовых клеток стромы, которые также являются мишенью для различного рода повреждающих факторов. Проблема резистентности (или напротив) чувствительности к тому или иному повреждающему фактору и репаративных потенций кроветворной и соединительной тканей, в целом, не теряет своей актуальности и является основополагающей не только для экспериментальной биологии, но и практической медицины. Так, например, успех терапии злокачественных заболеваний крови определяется правильным выбором лекарственного препарата, введением его в чувствительной фазе клеточного цикла, учетом избирательности его действия на те или иные категории клеток. Знание цитофизиологических особенностей КСК, структуры их популяции, антигенных характеристик, пролиферативного статуса, времени обновления и т.д. позволяет выбрать стратегию применения тех или иных цитостатических веществ таким образом, чтобы сочетать максимальную чувствительность к препарату дефектных клеток с максимальной сохранностью стволовых элементов. Не менее остро проблема КСК стоит при трансплантации кроветворных клеток реципиенту с иммунодефицитом, разрушенной (поврежденной) облучением или токсическими агентами кроветворной тканью, поскольку положительный эффект трансплантации зависит от качества трансплантируемого материала, т.е. от присутствия в инокулуме достаточного числа клоногенных клеток, обладающих потенциями стволовых. Именно донорские КСК, репопулируя кроветворные органы, обеспечивают восстановление гемопоэза. Исследование дифференцировочных и пролиферативных потенций кроветворных и стро-мальных СК после действия тех или иных неблагоприятных факторов позволяет оценить полноту репаративной регенерации кроветворной ткани.

цифику действия таких цитотоксических препаратов как 5-фторурацил и дипин, представляется весьма продуктивным использовать их для определения принадлежности исследуемых клеток к той или иной стадии развития, их места в ряду кроветворной дифференцировки, а также участия в регенераторном процессе.

Еще одной фундаментальной и практически значимой проблемой, связанной с функционированием кроветворной ткани, является адаптация организма к несвойственной ему среде обитания. Способность быстро отвечать на функциональные запросы, изменения окружающей среды, стрессовые и экстремальные воздействия позволяют считать кроветворную и соединительную ткани уникальными объектами и адекватными тест-системами и для изучения различных внешних воздействий. В частности, нормальное функционирование кроветворной системы является одним из непременных условий космических полетов. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют, что пребывание в космическом полете вызывает изменения в периферической крови у человека и млекопитающих (Berry, 1970; Газенко и др., 1974; Johnson et al., 1975; Leon et al., 1978, 1980; Илюхин, Бурковская 1981; Udden et al., 1995). Некоторые изменения, зарегистрированные в наиболее зрелом, периферическом, звене кроветворной системы могут быть вторичными и являться результатом более глубоких процессов, происходящих в кроветворной системе под влиянием факторов космического полета. Поэтому актуальность приобретают исследования других отделов кроветворного дифферона и, в первую очередь, отделов стволовых и родоначальных клеток, обеспечивающих обновление кроветворной ткани и поддержание кроветворения на постоянном уровне. Модельные эксперименты на лабораторных животных дают уникальную возможность на обширном и однородном материале получить максимально полную картину изменений в кроветворной системе, связанных с действием факторов полета. В экспериментах на биоспутниках серии «Космос», выполненных нами совместно с учеными Чехословацкой академии наук, было оценено влияние космического полета на стволовые кроветворные клетки млекопитающих (крыс) и плодов, развитие которых частично проходило в условиях полета.

Одним из наиболее значимых для кроветворной системы и постоянных космических факторов, помимо микрогравитации, является ионизирующее космическое излучение. Однако его влияние на кроветворную и соединительную ткани до настоящего времени остается практически не изученным. Следует подчеркнуть, что исследование подобного рода выходит за рамки космической программы и имеет медико-биологический, в том числе и экологический, аспект, поскольку облучение малой интенсивности является одним из компонентов радиоактивного природного фона, под

воздействием которого живые организмы находятся в наземных условиях (Гусаров, Иванов, 2001; Кузин, 2002).

Из сказанного следует, что для понимания закономерностей клеточной диффе-ренцировки весьма актуально проведение многоплановых исследований кроветворной и соединительной тканей, включающих характеристику составляющих их клеточных популяций, детализацию дифферона в пре - и постнатальном развитии, участие отдельных субпопуляций в регенераторном ответе на разнообразные внешние воздействия. Результаты подобных исследований позволят дать более точную картину гистогенеза кроветворной и соединительной тканей.

Цели и задачи исследования. Основной целью работы явилось исследование:

- структурной (иерархической) организации некоторых этапов кроветворного и стро-мального дифферонов в индивидуальном развитии млекопитающих (мышей);

- влияния воздействий различной химической и физической природы на родоначаль-ные кроветворные и стромальные клетки.

Конкретными задачами работы были следующие:

1. Исследование состава популяции родоначальных кроветворных клеток -КОЕ-С-и свойств отдельных их категорий на разных сроках пре - и постнатального развития.

2. Характеристика уровня синтеза РНК в популяции КОЕ-С.

3. Исследование чувствительности отдельных категорий КОЕ-С зародышей и взрослых животных к цитотоксическим препаратам (5-фторурацилу и дипину).

4. Исследование чувствительности родоначальных стромальных клеток (КОЕ-Ф) к действию цитотоксических препаратов (5-фторурацилу и дипину).

5. Характеристика потенций к дифференцировке мезенхимы печени в зависимости от уровня ее гемопоэтической активности.

6. Исследование влияния факторов космического полета на родоначальные кроветворные клетки в плодном периоде развития и постнатальном онтогенезе млекопитающих (крыс).

7. Изучение влияния непрерывного у- облучения в низких дозах на родоначальные кроветворные и стромальные клетки.

Научная новизна исследования. В ходе работы получены новые данные об иерархической организации кроветворного дифферона в пре- и постнатальном онтогенезе, ци-тофизиологических особенностях родоначальных кроветворных и стромальных клеток,

об участии отдельных их категорий в репаративном процессе и реакции на различные воздействия.

1. Впервые в кроветворной ткани зародышей мыши и особей раннего постна-тального периода выявлены клоногенные клетки, отсутствующие в дефинитивной кроветворной ткани и образующие в селезенке мелкие колонии недифференцированных клеток в поздние после трансплантации сроки. Охарактеризованы свойства новой категории клоногенных клеток, названных по месту их обнаружения - эмбриональной печени - КОЕ-С-эп. Показано, что КОЕ-С-эп находятся вне пролиферативного цикла, не самоподдерживаются, резистентны к 5-фторурацилу и кроличьей антисыворотке к головному мозгу мыши и на основании математического анализа их распределения могут быть причислены к стадии дифференцировки, предшествующей КОЕ-С - пре-КОЕ-С.

2. Получены данные об особенностях состава компартмента родоначальник клеток (КОЕ-С) в кроветворных органах (желточном мешке, печени, селезенке и костном мозге) на разных этапах онтогенеза. Они касаются соотношения разных типов клоногенных клеток (КОЕ-С-эп, КОЕ-С-7, КОЕ-С-11), пролиферативного статуса и т.д. и отражают функциональное состояние кроветворной системы, свойственное тому или иному этапу индивидуального развития особи.

3. Установлено, что КОЕ-С-11, присутствующие в печени в постнатальном онтогенезе, представляют собой более зрелые клетки по сравнению с КОЕ-С-11 из костного мозга половозрелых животных или печени зародышей, и идентичными КОЕ-С-11 из периферической крови. Таким образом, очевидно, КОЕ-С поступают в печень из циркуляции и не являются «дремлющими» эмбриональными.

4. Исследован синтез РНК в морфологически неидентифицируемых родоначаль-ных клетках, как один из важнейших показателей их готовности к вступлению в митоз и колониеобразованию. Установлено, что популяция КОЕ-С характеризуется интенсивным синтезом РНК и способностью к его быстрой активации, что свидетельствует о соответствия состояния пролиферативного покоя КОЕ-С 01- периоду клеточного цикла. В стационарных условиях популяция КОЕ-С гетерогенна по содержанию рРНК и содержит клетки, как с относительно низким, так и высоким уровнем синтеза рРНК. Обнаружена стимуляция колониеобразования под влиянием актиномицина Д в дозах, подавляющих синтез рРНК.

дящие на протяжении жизни мыши периодические спады и подъемы численности КОЕ-С - транзиторной популяции клеток - дают основание заключить, что, во-первых, КСК, которые их генерируют, неоднородны по чувствительности к дипину, во-вторых, диф-ференцировка КСК осуществляется на основе клональной сукцессии

6. В популяции стромальных клеток костного мозга выделены категории клеток, различающихся по устойчивости к цитотоксическим препаратам (5-фторурацилу и дипину) и участию в регенерации эктопических трансплантатов. Наиболее чувствительные к дипину и резистентные к 5-фторурацилу клетки обладают высокими репаратив-ными потенциями и, очевидно, могут быть отнесены к стволовым клеткам стромы.

7. Впервые показано, что мезенхима печени зародышей в период активного кроветворения обладает широкими дифференцировочными потенциями. При трансплантации печени 14-суточных зародышей мыши под капсулу почки или в подкожную соединительную ткань половозрелых реципиентов происходит последовательное новообразование гиалинового хряща, кости и кроветворных очагов.

8. Впервые установлено снижение уровня миелопоэза у крыс после кратковременного космического полета, выражающееся в значительном сокращение численности кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С). Впервые также исследовано содержание КОЕ-С в кроветворных органах в пре- и раннем постнатальном развитии после экспозиции на борту биоспутника в плодном периоде.

9. Впервые обнаружен феномен стимулирующего действия непрерывного у- облучения в малых дозах (радиационный гормезис) на стромальные родоначальные клетки костного мозга, который выражается в активации пролиферации, увеличении численности популяции КОЕ-Ф и усиление регенераторных потенций стромальных родо-начальных клеток.

Теоретическая значимость работы. В данной работе проведено комплексное исследование родоначальных кроветворных и стромальных клеток, согласованная работа которых обеспечивает нормальное функционирование кроветворной ткани как единой системы.

В кроветворном ряду дифференцировки обнаружена ранее неописанная в литературе категория клоногенных кроветворных клеток, являющаяся стадией дифферен-цировки, предшествующей КОЕ-С, и характерная для кроветворной ткани пренаталь-ного и раннего постнатального периодов развития. Получены экспериментальные данные, объективно свидетельствующие в пользу концепции функционирования КСК на основе клональной сукцессии. В стромальном диффероне выявлены категории клеток,

различающихся по регенераторным потенциям и чувствительности к цитотоксическим агентам. Предложена гипотетическая модель стромального ряда дифференцировки.

Выявлено негативное воздействие факторов космического полета на миелопоэз, которое заключается в резком уменьшении численности родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах млекопитающих.

Обнаружен феномен радиационного гормезиса, проявляющийся в увеличении пролиферативной активности и численности родоначальных клеток стромы, а также усиление их способности к регенерации. Установление этого факта кардинально меняет сложившееся представление о радиации в сверхмалых дозах, как незначимом для кроветворной и соединительной тканях воздействии, и диктует необходимость расширения исследований в данном направлении.

Результаты углубляют и детализируют представления об организации стволового отдела, отдельных этапах дифференцировки кроветворных и стромальных клеток, цитофизиологических особенностях родоначальных кроветворных и стромальных клеток. Представленные в работе данные способствуют пониманию ведущей роли стволовых и родоначальных (мультипотентных) клеток в восстановительных процессах, связанных с действием разнообразных факторов. В практических целях кроветворную и стромальную ткани можно использовать как тест-системы для регистрации влияния разнообразных факторов внешней среды на организм животных и человека. Оценка резистентности клеточных популяций, входящих в их состав, позволяет определить репа-ративные возможности кроветворной и стромальной тканей, предвидеть и в перспективе предотвращать последствия неблагоприятных воздействий.

СССР, 1987 г.), 1-й Республиканской научной конференции «Управление морфогенезом тканей и органов в процессе адаптации» (Иркутск, СССР, 1989 г.), Симпозиуме «Volga-Wilsede» (Москва, СССР, 1990), 33-м Международном конгрессе физиологических наук (Скт-Пб, Россия, 1997 г.), Международной конференции по регенерации (Кельн, Германия, 1997), Конференции «Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей» (Москва, Россия, 1998 г.), 33-й Ассамблее С08РЛЯ (Варшава, Польша, 2000), III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), 34-й Ассамблее С08РЛЯ (Хьюстон, США, 2002), 1-м съезде Общества клеточной биологии (С.-Пт., Россия, 2003 г.), 35-й Ассамблее С0-8РЛЯ (Париж, Франция, 2004). Апробация диссертации проведена на семинаре отдела цитологии и гистологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 19 января 2004 года.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, общего заключения и выводов. Приведен список цитированной литературы и публикаций автора по теме диссертации. Работа содержит_страниц,_таблиц,_рисунков. В списке литературы приведены_работы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. В работе использованы 10-, 14- и 18-суточные зародыши, 2-х и 7-ми дневные мышата и половозрелые лабораторные мыши гибриды (СВАхС57ВУ6) самцы и самки, а также 18-суточные зародыши и половозрелые самцы и самки крыс линии Wistaг.

Получение зародышей мышей. Скрещивали 3-месячных самок СВА с самцами С57В1/6. Срок зародышевого развития определяли, считая первым днем развития день обнаружения влагалищной пробки. Зародышей извлекали из матки, помещали в среду 199, освобождали от оболочек и под бинокулярной лупой извлекали кроветворные органы (желточный мешок, печень и селезенку).

Рентгеновское облучение. Сингенных мышей-реципиентов облучали на рентгеновской установке РУМ-17 (175 кВт, 15 мА, фильтры 1,0 А1 + 0,5 Си, мощность дозы - 53 Р/мин) в дозе 7,1 Гр. Дозу облучения контролировали с помощью клинического дозиметра 27012 (Германия).

Гамма-облучение. Животные-доноры костного мозга (10-15 жив) подвергались непрерывному 10-суточному гамма- излучению от радионуклида 60Со (энергия гамма- квантов 1,17 и 1,33 МэВ, среднесуточная поглощенная доза 0,15-0,2 сГр, суммарная доза

1,5-2 сГр). Часть доноров (10-15 жив) служила контролем и находилась в соседнем помещении, где радиационные условия соответствовали естественному радиационному фону. Радиационный фон в помещении при закрытом источнике гамма- облучения составлял 7,7 мкГр/сут.

Трансплантация кроветворнойткани и кроветворные колонии в селезенке. Содержание родоначальных кроветворных клеток определяли методом Тилла и МакКаллока (Till, McCulloch, 1961). Взвесь кроветворных клеток вводили внутривенно в дозе 0,5-2х105 клеток мышам и 1-2Х106 клеток крысам. Подсчет колоний в селезенках проводили на 711-е сутки после облучения реципиентов.

Определение самообновления КОЕ-С. Облученным первичным реципиентам вводили внутривенно взвесь клеток печени 14-суточного зародыша или костного мозга. Через 7 и 11 суток животных забивали. На каждый исследуемый срок половину селезенок использовали для определения числа колоний, другую половину - для приготовления взвеси клеток и ретрансплантации их в дозе 106 клеток/жив (0,2-3,7 колоний/жив) вторичным реципиентам. На 11 сутки проводили раздельную ретрансплантацию клеток крупных и мелких колоний. Для этого под бинокулярной лупой вырезали участки селезенки с крупными колониями и отдельно приготовляли взвесь клеток из ткани селезенки, содержащей крупные и мелкие колонии. Величину индекса самообновления каждой категории КОЕ-С определяли, как соотношение числа вторичных КОЕ-С, приходящихся на одну первичную КОЕ-С.

Н3-тимидиновое и Н}-уридиновое «самоубийство». Взвесь клеток костного мозга экспонировали с радиотоксическими дозами изотопа in vitro в течение 30-60 минут. Доза Н3-тимидина составляла 50 мкКю/мл (удельная активность — 12,5 Кю/мМ), доза Н3-уридина - 50-75 мкКю/мл (удельная активность 16-23 Кю/мМ). Затем суспензию дважды центрифугировали, отмывая осадок средой 199 с холодным уридином или тимиди-ном. При введении Н3-тимидина и Н3-уридина in vivo животные получали соответственно 50мкКю/г (удельная активность - 12,5 Кю/мМ) и 50-75 мкКю/г (удельная активность 16-23 Кю/мМ). Контрольные животные или образцы клеточной взвеси экспонировали с холодным тимидином, соответственно с 400 мкг/жив или 30 мкг/мл. Оксимочевиновое «самоубийство». Оксимочевину в дозе 0,9 мг/г вводили

а) внутривенно в 0,3 мл среды 199 облученным реципиентам непосредственно после трансплантации взвеси кроветворных клеток (Monette, Demers, 1982). Контрольным животным вводили соответствующий объем среды 199.

б) внутрибрюшинно в 0,2 мл среды 199 за 1 час до забоя. Контрольным животным вводили 0,2 мл среды. Число клеток в костном мозге от каждого животного-

донора подсчитывали отдельно и объединяли равное число клеток от 5-10 животных для последующего введения летально облученным реципиентам или культивирования в жидкостной культуре.

Долю КОЕ-С и КОЕ-Ф в S-фазе рассчитывали как разность между числом колоний в селезенке (матрасе), образованных клетками контрольного и обработанного ок-симочевиной костного мозга, деленную на число колоний в контрольном варианте. Обработка антибиотиками.

А) Экспозиция in vitro. Взвесь кроветворных клеток кратковременно (30-60 мин) инкубировали с антибиотиками (3 мкг/мл и 0,04-0,4 мкг/г/мл для актиномицина и сиби-ромицина соответственно). Время экспозиции составляло 30-60 мин. при 37° С. Затем суспензию дважды центрифугировали, отмывая осадок средой 199.

Б) Экспозиция in vivo. Мышам-донорам костного мозга актиномицин Д вводили внутрибрюшинно в дозах 0,04-0,4 мкг/г за 2 часа до забоя.

Обработка 5-фторураиилом С5-ФУ). Кроветворные клетки подвергали воздействию 5-ФУ in vivo (А) и in vitro (Б).

А) мышам-донорам клеток костного мозга и селезенки, а также беременным самкам 5-ФУ вводили внутривенно в дозе 150 мг/кг за 24 часа до извлечения кроветворных органов и трансплантации кроветворных клеток.

Б) взвесь клеток костного мозга и печени в концентрации 10x106 кл/мл инкубировали с различными дозами 5-ФУ (0, 5, 10,25, 50 и 100 мкг/мл) в 90% среде 199 или Игла и 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37° С 2 часа. Затем клетки дважды отмывали средой, центрифугируя при 2 тыс. об/мин в течение 5 минут. Обработка дипином. Дипин в дозе 0,03 мг/г вводили внутрибрюшинно донорам клеток костного мозга и селезенки однократно. Содержание КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11 в кроветворных органах (костном мозге и селезенке) определяли через 1 сутки, 2, 4, 7, 14, 22, 54 и 91 недели. Содержание КОЕ-Ф определяли через 1 сутки, 4,6,8,12 и 24 месяца. Анемия. Анемию вызывали у доноров костного мозга двукратным (с интервалом 24 часа) взятием 0,3-0,5 мл крови из орбитального синуса. Гематокрит определяли рутинным способом, центрифугируя пробы крови на гематокритной центрифуге. Эктопическая трансплантация.

А) трансплантация кроветворной ткани от половозрелых доноров. Под капсулу почки сингенных половозрелых самцов-реципиентов помещали: (1) содержимое бедренных костей в виде костномозговой «колбаски» («трансплантат костного мозга»), (2) бедренную кость с диафизом («бедренная кость») и (3) селезенку. Селезенку пересаживали целиком на почку реципиентов III группы, закрепляя ее пояском из почечной

капсулы (Старостин, 1984). Контролем служили трансплантаты животных, получивших инъекцию раствора Хенкса. Все операции проводили на наркотизированных животных в операционной. Через 2 и 4 мес трансплантаты извлекали, определяли их размер (по числу кариоцитов) и содержание в них КОЕ-С по методу Тилла и Маккаллока (Till, McCulloch, 1961), что давало возможность судить о так называемой «стромальной функции» фибробластов (Chamberlin et al., 1974).

Б)трансплантация печени 14-суточныхзародышей. Печень помещали под капсулу почки половозрелым самцам-реципиентам, предварительно (за 24 часа) облученным в дозе 650 р. Через 1 и 4 суток трансплантаты извлекали и исследовали на содержание КОЕ-С вышеописанным методом.

В части экспериментов печень трансплантировали под капсулу почки и в подкожную соединительную ткань передней брюшной стенки необлученным реципиентам. Трансплантаты вместе с окружающими тканями фиксировали жидкостью «суза», заливали в парафин и приготовляли серийные срезы. Срезы окрашивали по методу Гимза и в некоторых случаях водным раствором толуидинового синего, альциановым синим 8GS ("Merck", Германия) на 3% уксусной кислоте для выявления гликозоаминоглика-нов, а также по методу шифф-иодная кислота (ШИК) (Лилли, 1969). Культивирование клеток костного мозга. КОЕ-Ф определяли методом клонирования стромальных клеток в монослойной культуре (Фриденшетйн, Лурия, 1980). Суспензии клеток из костного мозга или селезенки, полученные от 6-7 животных, вносили в культуральные матрасы в конечной концентрации соответственно 1x106 или 6-10x106 ядерных клеток в 1мл полной питательной среды, состоящей из среды Фишера или альфа-MEM и с 10% эмбриональной телячьей сывороткой. В каждый матрас с площадью дна 25 см3 помещали по 10 мл взвеси костномозговых клеток. До начала культивирования матрасы продували смесью 5% СО2 и воздуха и инкубировали в термостате при 37° С 10-12 суток с однократной сменой среды через 5-7 суток. По окончании культивирования среду удаляли, клетки фиксировали метанолом и окрашивали по Гимза. Колонии фибробластов, выросшие в 5-10 матрасах, подсчитывали под бинокулярной лупой.

Получение кроличьей антисыворотки к головному мозгу мыши (КАСММ) и экспозиция с ней кроветворных клеток. Антисыворотку получали после подкожной иммунизации кролика гомогенатом головного мозга мышей по стандартной методике (Golub, 1972) и адсорбировали эритроцитами и тимоцитами мыши до полного исчезновения реакции с этими клетками в гемагглютинации и цитотоксическом тесте соответственно. Клетки

печени 14-суточных зародышей обрабатывали КАСММ (40 мин., 20° С) и комплементом (60 мин., 37° С).

Обработка результатов проведена с помощью формул математической статистики (Севастьянов, 1982). Сравнение экспериментальных и теоретических данных проводили с помощью критериев х2 и Колмогорова-Смирнова X. Достоверность различий определяли с помощью критерия Стыодента.

Список сокращений:

КСК - кроветворная стволовая клетка

МСК - мезенхимная (стромальная) стволовая клетка

КМО - кроветворное микроокружение

КОЕ-С - колониеобразующая единица селезенки

КОЕ-Ф - колониеобразующая единица фибробластов

БОЕ-Э - бурстобразующая единица эритроцитов

КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроцитов

КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцитов-макрофагов

КОЕ-ГЭММ — колониеобразующая единица гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов,

мегакариоцитов

8-колонии - колонии стволовых клеток

КАСММ - кроличья антисыворотка против (головного) мозга мыши ОМ - оксимочевина 5-ФУ - 5-фторурацил

РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ В ПРЕ - И ПОСТНАТАЛЬ-НОМ ОНТОГЕНЕЗЕ МЫШИ. 1. Гетерогенность селезеночных колоний, образуемых клоногенными кроветворными клетками эмбриональной печени.

К началу нашего исследования данные о составе популяции КОЕ-С в пренаталь-ном онтогенезе были весьма скудны и касались, в основном, печени зародышей одного срока развития (Metcalf et al., 1983; Johnson, Nicola, 1984; Gaidul et al., 1986). Данный раздел нашей работы был посвящен исследованию формирования популяции КОЕ-С в кроветворных органах в индивидуальном развитии мыши. Были исследованы селезеночные колонии на разных сроках (7-13-е сутки) после трансплантации кроветворных клеток печени 14-суточных зародышей мыши. Контролем служили две группы облученных животных: одной из них взвесь клеток не вводили (эндогенный контроль), а

другая получала взвесь клеток печени, предварительно облученных 14,2 Гр (контроль на стимулирующие эмбриональные факторы).

В поздние сроки наблюдений (11 и 13 дней) на поверхности селезенки наряду с крупными колониями (1 мм и более в диаметре) выявлены колонии, четко отличающиеся меньшими размерами (менее 1 мм в диаметре) (рис. 1). В контрольных опытах оба типа колоний не регистрируются.

Крупные колонии определяются, начиная с 7-х суток, на всех сроках наблюдения, относятся к эритроидному и смешанному типу и не отличаются существенно от многократно описанных колоний, образуемых КОЕ-С из различных дефинитивных кроветворных тканей. Число их зависит от дозы введенных кроветворных клеток и прогрессивно уменьшается (в 4 раза) с 7 по 13 день, т.о., большая часть крупных 7-ми суточных колоний является транзиторными (рис. 2). Методом оксимочевинового самоубийства было установлено, что около 20-30 % КОЕ-С, образующих крупные колонии, находятся в 8- периоде клеточного цикла (достоверность различий р<0,05).

Мелкие колонии впервые обнаруживаются на 11-13-й день, значительно увеличиваются в числе к 13 дню (рис. 2) и состоят из недифференцированных (бластных) клеток. Для мелких колоний не удалось выявить четкую дозовую зависимость. Число их при одной и той же дозе введенных клеток в разных опытах варьирует в широких пределах (табл. 1). КОЕ-С, формирующие эти колонии, по-видимому, не пролифери-

ГШ

Рис. 1.

Колонии на поверхности селезенки облученных мышей через 9 (вверху) и 11 (внизу) суток после введения кроветворных клеток эмбриональной печени.

Рис. 2.

Число колоний в селезенке после трансплантации 1х105 клеток печени 14-сут. зародыша мыши. Ордината: слева - крупные колонии (темные кружки), справа - мелкие колонии (светлые кружки). Абсцисса: дни после трансплантации.

Таблица 1. Число мелких колоний на поверхности селезенки через 11 суток после введения 105 клеток эмбриональной печени.

№ опыта Число животных (п) Среднее число холоний на селезенку (*) Дисперсия (/) о2/* Число селезенок без колоний

1 15 50.6 1173 23.2 0

2 14 31.6 758 24.0 2

3 12 42.6 937 22.0 1

4 7 38.4 928 24.2 0

5 9 62.2 919 14.8 1

6 16 53.9 1437 26.7 0

7 14 34.3 808 23.6 0

8 9 8.3 160 19.2 4

9 6 33.3 1507 45.2 3

10 9 14.4 128 8.9 2

И 12 15.5 299 19.2 2

12 15 42.8 1082 25.3 0

13 14 37.1 564 15.2 0

14 16 46.9 1300 27.7 1

15 9 19.4 140 7.2 0

16 18 36.2 2004 55.4 3

17 9 30.6 605 19.8 0

18 12 16.0 319 19.9 1

19 11 32.2 2104 65.3 2

20 8 22.3 259 11.6 0

Сум-

марные 235 34.9 945 27.1 22

данные

Примечание. Суммарные х и о определяли по формулам: х —;

2 £ £

г £(»-1)<тг - ,

° = -г-, где х- среднее значение, о - дисперсия числа колоний для каждого

2 2Л"-1 )

опыта с числом животных - п. Число мелких колоний в эндогенном контроле - 0.2 ± 0.1 (п=123).

руют, поскольку достоверного уменьшения их числа под действием оксимочевины (ОМ) не выявлено. В литературе этот тип селезеночных колоний ранее не было описан. Клоногенные кроветворные клетки, формирующие мелкие 11-суточные колонии, мы назвали КОЕ-С-эп (КОЕ-С из эмбриональной печени).

2. Характеристика свойств различных категорий эмбриональных кроветворных клеток, образующих колонии в селезенке.

Для определения положения нового типа клоногенных клеток в иерархии кроветворных клеток, мы провели сравнительные исследования КОЕ-С-эп и других категорий эмбриональных КОЕ-С, а именно КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11, образующими колонии в

селезенке соответственно на 7-е и 11-е сутки после трансплантации. Критериями оценки служили некоторые их антигенные характеристики, потенции к самоподцержанию и дифференцировке, чувствительность к 5-фторурацилу, а также закономерности распределения числа мелких и крупных колоний эмбрионального происхождения. Действие кроличьей антисыворотки к головному мозгу мыши (КАСММ) на различные типы КОЕ-С эмбриональной печени и костного мозга. При инкубации кле -ток эмбриональной печени с КАСММ происходит достоверное уменьшение (на 8090%, р<0,001) числа крупных колоний в селезенке, тогда как число мелких колоний практически не изменяется. Таким образом, наблюдается явная гетерогенность КОЕ-С эмбриональной печени по отношению к действию антисыворотки. Причем, КОЕ-С, образующие крупные колонии, сходны по этому признаку с КОЕ-С костного мозга взрослых животных, число которых сокращается на 93-98%, тогда как клетки, ответственные за образование мелких колоний, отличаются по этому признаку и от КОЕ-С эмбриональной печени, формирующих крупные колонии, и от КОЕ-С костного мозга. Показано, что в кроветворном ряду дифференцировки к действию КАСММ резистентны КОЕ-С с высокой способностью к самоподдержанию, а также клетки предшествующей стадии, - пре-КОЕ-С, восстанавливающие гемопоэз у анемичных W/W мышей (Monnette, 1979; Monnette, Stockel, 1981; Saxe et al., 1985). Это позволяет предположить, что обнаруженные нами клетки эмбриональной печени, ответственные за образование мелких колоний и резистентные к действию КАСММ, могут быть менее зрелыми, нежели КОЕ-С.

Способность к самоподдержанию эмбриональных КОЕ-С различных категорий была оценена по образованию ими дочерних КОЕ-С при ретрансплантации клеток селезеночных колоний вторичному облученному реципиенту (рис. 3). КОЕ-С-11 обладают способностью к самоподдержанию и образуют дочерние клоногенные клетки двух типов - КОЕ-С-11 и КОЕ-С-7. Напротив, КОЕ-С-7 образуют только транзиторные колонии, не давая дочерних колоний. По индексам самообновления эти две категории эмбриональных КОЕ-С сходны с аналогичными категориями дефинитивных КОЕ-С. При ретрансплантации клеток мелких 11-суточных колоний в селезенках вторичных реципиентов возникают только 7- и 11-суточные колонии обычных размеров. Таким образом, вторичные КОЕ-С-эп в сколько-нибудь заметных количествах не были обнаружены, и вопрос о способности их к самоподдержанию остается не ясным. Чувствительность к 5-фторурацилу родоначальных кроветворных клеток (КОЕ-С) зародышей мышей. Адекватным инструментом, позволяющим оценить положение клетки в ряду дифференцировки, является 5-фторурацил (5-ФУ). Исследования чувст-

140 120 100 80 60 40 20 0

а -б в

Число дочерних КОЕ-С-7 (А) т КОЕ-С-11 (Б), образуемых эмбриональными КОЕ-С-7, КОЕ-С-11, КОЕ-С-эп и КОЕ-С-11 из костного мозга взрослых животных. По оси абсцисс - категория исходных КОЕ-С: а -КОЕ-С-7 эмбр.; б - КОЕ-С-11 эмбр.; в -КОЕ-С-эп; г - КОЕ-С-11 из костного мозга. По оси ординат - число дочерних КОЕ-С в расчете на одну исходную КОЕ-С.

Рис.3.

120 100 80 60 40 20 0

95 ■ч

вительности КОЕ-С костного мозга к 5-ФУ и ОМ показали, что способность клеток костного мозга репопулировать кроветворную систему облученного реципиента не обязательно коррелирует с образованием колоний в селезенке. Эти факты были положены в основу концепции пре-КОЕ-С (Hodgson, Bradley, 1979; Hodgson et al., 1982). Пре-КОЕ-C устойчивы к цитостатикам, при трансплантации облученному реципиенту заселяют костный мозг, пролиферируют в нем и дают популяцию КОЕ-С, которые мигрируют в селезенку и ответственны за подъем численности «поздних» колоний. В костном мозге 5-ФУ поражает преимущественно наиболее "зрелые", относительно слабо затрагивая более "молодые" КОЕ-С, что легко регистрируется визуально по разнице в числе колоний, возникающих в селезенке в ранние и поздние сроки после трансплантации кроветворной ткани (van Zant 1984). Мы надеялись с помощью 5-ФУ определить положение новой категории клоногенных клеток в кроветворном ряду и провели сравнительное исследование чувствительности к нему различных категорий КОЕ-С из печени 17-19-суточных зародышей и селезенки и костного мозга половозрелых мышей.

Через 1 сут после введения препарата in vivo половозрелым мышам в бедренной кости сохраняется 1.7х10"3 КОЕ-С-7 и 1.5-2.2х10'2 КОЕ-С-11. Отношение КОЕ-С-11/КОЕ-С-7 возрастает в несколько раз, что свидетельствует о большей устойчивости к 5-ФУ КОЕ-С-11, чем КОЕ-С-7, и согласуется с литературными данными (Hodgson, Bradley, 1979; van Zant, 1984). В популяции КОЕ-С селезенки 5-ФУ вызывает сходные изменения. Таким образом, в условиях in vivo соответствующие категории КОЕ-С дефинитивных кроветворных органов одинаково чувствительны к препарату.

Через сутки после введения 5-ФУ беременным самкам в печени зародышей сохраняется незначительное число КОЕ-С-7 (3.0x10-4), а КОЕ-С-11 практически не выявляются. Низкие цифры могут быть связаны не только с различиями в чувствительности к 5-ФУ двух категорий КОЕ-С, но с более низкой их концентрацией в печени по сравнению с КОЕ-С-7, что затрудняет оценку результатов. Поэтому мы оценили влияние 5-ФУ на кроветворные клоногенные клетки in vitro, что позволило в одних и тех же условиях провести сравнение чувствительности к нему аналогичных категорий КОЕ-С в индивидуальном развитии. В условиях in vitro КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11, как из эмбриональной, так и дефинитивной кроветворных тканей, одинаково чувствительны к 5-ФУ, тогда как КОЕ-С-эп резистентны к нему. Устойчивость к 5-ФУ позволяет отнести КОЕ-С-эп к стадии дифференцировки, предшествующей КОЕ-С, т.е. — пре-КОЕ-С. Закономерности распределения числа крупных и мелких колоний эмбрионального происхождения и возможная природа клоногенных клеток, ответственных за их образование. При исследовании распределения числа селезеночных колоний обратил на себя внимание факт значительно большей вариабельности числа мелких колоний по сравнению с крупными колониями (табл. 1). Показано (Barnes et al., 1968; Rosendaal et al., 1981), что число селезеночных колоний, образуемых клетками костного мозга, подчиняется распределению Пуассона, характерным признаком которого является равенство х=<72, где х - среднее число колоний на селезенк^, - дисперсия числа селезеночных колоний. Согласно нашим экспериментам, это равенство справедливо и для крупных селезеночных колоний, формируемых клетками эмбриональной печени, независимо от срока исследований. Кроме того, распределение числа крупных колоний и распределение Пуассона практически совпадают, что подтверждается критериями и

X. С другой стороны, для мелких колоний соотношение х1аг колеблется от 7,2 до 65,3 (в среднем 27,1), и, следовательно, распределение числа этих колоний не может быть описано с помощью закона Пуассона. Наиболее вероятное объяснение такой гипервариабельности, на наш взгляд, состоит в том, что клетки эмбриональной печени, ответственные за образование этих колоний, попадая в облученный организм, сначала вступают в пролиферацию, и лишь затем потомки этих клеток образуют колонии в селезенке. Косвенно в пользу этого утверждения свидетельствуют относительно поздние сроки появления мелких колоний и их небольшие размеры. Если это объяснение верно, то клетки эмбриональной печени, формирующие мелкие селезеночные колонии, представляют собой пре-КОЕ-С. С другой стороны, крупные селезеночные колонии, по-видимому, сформированы непосредственно КОЕ-С эмбриональной печени.

Для доказательств этих утверждений был проведен математический анализ распределения числа колоний в селезенке (Зотин и др., 1988). Он показал, что пуассонов-ское распределение наблюдается тогда и только тогда, когда введенные клетки образуют колонии без предварительной пролиферации, т.е. являются истинными КОЕ-С. Таким образом, закон Пуассона хорошо описывает распределение числа крупных селезеночных колоний и неприменим для мелких колоний. Следовательно, можно считать доказанным, что крупные колонии образованы непосредственно из КОЕ-С, тогда как мелкие - за счет пре-КОЕ-С. Методами математической статистики на основе стохастической модели дифференцировки клеток было оценено распределение мелких колоний, число пре-КОЕ-С в эмбриональной печени и число КОЕ-С, которые они образуют, попадая в организм реципиента. Теоретические расчеты распределения числа мелких колоний полностью совпали с экспериментальными данными (рис. 4). Было вычислено, что среднее число пре-КОЕ-С в эмбриональной печени составляет 2,67 на 105 клеток. Пре-КОЕ-С пролиферируют в организме реципиента (именно поэтому они устойчивы к действию ОМ и 5-ФУ, которые вводились донору), и лишь затем их потомки (КОЕ-С) образуют колонии в селезенке. С учетом фактора оседания для КОЕ-С, равным по литературным данным для клеток из эмбриональной печени ~ 0,05, среднее число КОЕ-С, образованных из одной пре-КОЕ-С составляет около 260.

Позднее появление мелких колоний, увеличение их числа со временем после трансплантации, устойчивость к ОМ и 5-ФУ говорит о возможности близкого родства КОЕ-С-эп и клеток-предшественников, формирующих, так называемые, «экстраколонии». Клетки, образующие экстраколонии, представляют еще одну категорию КОЕ-С и отличаются от других КОЕ-С, образующих колонии в поздние сроки, повышенной устойчивостью к цитотоксиче-ским агентам, более высоким самоподдержанием и нуждаются для своего созревания в кратковременном пребывании в костном мозге (van Zant, 1984). Однако характер распределения экстра-

Рис. 4.

Распределение числа мелких селезеночных колоний на 11-е сутки после введения клеток эмбриональной печени. 1 - экспериментальные данные, 2 - расчетные данные.

колоний соответствует распределению Пуассона (Rosendaal et al., 1981). Иными словами, одна клетка-предшественник образует только одну экстраколонию, и, следовательно, является истинной КОЕ-С. В отличие от предшественников экстраколоний, делящихся, в организме донора, вероятнее всего, в его костном мозге, эмбриональные КОЕ-С-эп, по данным проведенного математического анализа их распределения, пролифе-рируют в организме реципиента. Таким образом, КОЕ-С-эп могут быть причислены к категории пре-КОЕ-С, которые после введения реципиенту пролиферируют, давая популяцию истинных КОЕ-С. Еще одна характерная особенность КОЕ-С-эп состоит в том, что они присутствуют в заметных количествах в интактной эмбриональной кроветворной ткани, тогда как в костном мозге клетки-предшественники экстраколоний выявляются только после введения животному 5-ФУ или ОМ и гибели большого числа КОЕ-С. Мы полагаем, что КОЕ-С-эп могут быть категорией клеток, близкой некоторым клеткам-предшественникам in vitro. Возможно, они соответствуют S-клеткам (стволовым) костного мозга, описанным Ogawa и соавторами (Nakahata, Ogawa, 1982; Ogawa et al., 1985). Косвенно об этом свидетельствует морфология S-колоний и мелких селезеночных колоний (те и другие представляют собой колонии бластных клеток), а также сходный характер распределения КОЕ-ГЭММ (экспоненциальное распределение) в составе S-колоний (Ogawa et al., 1985) и числа КОЕ-С, образованных из одной пре-КОЕ-С.

Таким образом, на основании своих характеристик и сопоставления их с другими клоногенными клетками исследуемые нами клетки в ряду дифференцировки могут

быть расположены в следующей последовательности: КСК—»...........—» пре-КОЕ-С —»

коммитированные предшественники созревающие и зрелые клетки.

3. Структура популяции клоногенных кроветворных клеток в пре- и постнаталь-ном онтогенезе.

В индивидуальном развитии в кроветворение последовательно вовлекаются желточный мешок, печень, селезенка и костный мозг. Однако к началу нашего исследования оставалось неизвестным, какие изменения происходят в структуре популяции КОЕ-С в процессе формирования дефинитивной ткани, а также когда впервые выявляются обнаруженные нами КОЕ-С-эп и в каких кроветворных органах кроме печени они существуют. С этой целью содержание трех категорий клоногенных клеток (КОЕ-С-7, КОЕ-С-11 и КОЕ-С-эп) определяли в кроветворных органах мыши в эмбриональном (10,14 и 18 сутки) и постнатальном (2,3 и 7 сутки, 1,2,3 и 18 месяцев) онтогенезе.

Родоначальные клетки, образующие крупные селезеночные колонии, - КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11 - обнаруживаются в кроветворных органах на всех исследованных сроках пре- и постнатального онтогенеза (за исключением желточного мешка и тела зародышей на 10-е сутки развития). В каждом органе изменение концентрации и отношения КОЕ-С-7/КОЕ-С-11 (индекс КОЕ-С, Инд) имеет специфические черты (рис. 5). Печень. На 13-е сутки зародышевого развития содержание КОЕ-С в печени не превышает нескольких десятков. Между 13-ми и 18-ми сутками печень интенсивно растет: количество кроветворных клеток и КОЕ-С удваивается каждые 24 часа, и к 18-м суткам по числу КОЕ-С печень не отличается от бедренной кости 1-2-месячного животного. Начальные этапы гемопоэза в печени (14-е сутки) характеризуются значительным пре-

М г а

Ни Ни Ыа 2мк ¿мп /1лт

Рис. 5.

Концентрация КОЕ-С в печени (а), селезенке (б) и костном мозге (в) на разных сроках пре- и постнатального развития мыши. Светлые столбики — КОЕ-С-7, заштрихованные столбики - КОЕ-С-11. Каждая пара столбиков — один эксперимент. По вертикали число КОЕ-С/105.

вышением концентрации КОЕ-С-7 над концентрацией КОЕ-С-11 (Инд=2,46) (рис. 5а). К 18-м суткам соотношение обоих категорий КОЕ-С выравнивается (Инд=1,23). Затухание кроветворения в печени, происходящее в первые две недели после рождения, сопровождается резким уменьшением концентрации и содержания КОЕ-С, более значительным для КОЕ-С-11 (Инд=2,03). На 7-е сутки после рождения количество КОЕ-С обеих категорий составляет не более 10-15 % их содержания в печени в период расцвета ее кроветворной функции.

Изменение в составе популяции КОЕ-С соответствует уровню функциональной активности печени как кроветворного органа. Начало гемопоэза в печени совпадает с завершением кроветворения в желточном мешке и исчезновением из него КОЕ-С (Metealf, Moore, 1971). К 14-м суткам печень становится единственным органом, продуцирующим зрелые эритроциты. Помимо БОЕ-Э и КОЕ-Э, безусловно, только моно-потентные, образующие преимущественно эритроидные колонии КОЕ-С-7 могут обеспечить быстрое появление новых клеток эритроидного ряда. Именно с этим, как мы полагаем, связано преобладание КОЕ-С-7 в печени 14-суточного зародыша. Аналогичную роль играют, по-видимому, и КОЕ-С-5, также находящиеся в печени зародыша в значительно большей концентрации, чем другие категории КОЕ-С (Gaidul et al., 1984). На пике кроветворной активности печени, в конце плодного периода (18 сутки), в популяции КОЕ-С возрастает доля относительно молодых и потентных КОЕ-С-11. Изменение кроветворной активности печени происходит параллельно с морфофункциональным преобразованием печеночной ткани и, следовательно, с изменением микроокружения, пригодного для кроветворения. С 11 по 15 сутки рост кроветворной ткани значительно опережают печеночную, и увеличение веса печени связано с нарастанием ее гемопо-этической активности (Sonoda et al., 2001). Интенсивный рост кроветворной ткани приводит к увеличению локальной концентрации онкостатина М, который, в свою очередь, индуцирует гепатоцитарную дифференцировку, что сопровождается снижением продукции клетками печени кроветворных ростовых факторов (Kinoshita et al., 1999). После 15-х суток значительно увеличивается масса гепатоцитов и поверхность их взаимодействия (Sonoda et al., 2001). Нарушаются связи кроветворных и печеночных клеток, что пагубно отражается на поддержании гемопоэза, одним из непременных условий которого является непосредственный контакт кроветворных и печеночных клеток (Nanno et al., 1994). Кроветворение оттесняется из паренхимы в околосинусоидальные пространства и постепенно входит в фазу инволюции. С завершением построения печеночной ткани кроветворение в печени прекращается (Sasaki, Iwatsuki, 1997). При этом не только происходит массовая миграция КОЕ-С в развивающиеся кроветворные органы (Metealf, Moore, 1971; Руке, Bach, 1979; Potworowski, Руке, 1985), но и, вероятно, ухудшаются условия для самоподдержания стволовых и родоначальных кроветворных клеток. Снижение концентрации и численности КОЕ-С-11, в большей степени, чем КОЕ-С-7 (Инд=2.0), в печени 7-суточных мышат свидетельствует в пользу такой возможности.

Селезенка. Динамика изменений состава популяции КОЕ-С в селезенке подтверждает существование двух периодов гемопоэтической активности этого органа, описанных в

литературе (Metcalf, Moore, 1971). Согласно нашим данным, первый период (18 сутки пренатального-1 месяц пост-натального развития) характеризуется высокими темпами удвоения численности КОЕ-С (рис. 6). В начале этого периода (18 сут-1 неделя) обе категории КОЕ-С удваиваются каждые 72 часа. В результате к 1 месяцу жизни содержание КОЕ-С в селезенке превышает таковое в костном мозге почти в 8 раз. Во втором периоде (1 мес-18 мес), совпадающем с переходом селезенки к лим-фопоэзу, концентрация КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11 снижается до минимальных значений. Характерной особенностью селезенки, выявленной в наших экспериментах, является преобладание в популяции КОЕ-С-7 над КОЕ-С-11 на всех исследованных сроках развития (Инд=1,9) (рис. 56, рис. 6).

Костный мозг. Кроветворение в костном мозге начинается на 17-е сутки эмбриогенеза, однако до рождения популяция КОЕ-С не увеличивается и эритропоэз не возникает (Metcalf, Moore, 197I). Активация гемопоэза в костном мозге начинается в первую неделю жизни и характеризуется быстрым увеличением содержания ядерных клеток и КОЕ-С. Время удвоения КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11, по нашим данным, составляет соответственно 48 и 72 часа, и на протяжении первых 2-х месяцев жизни в популяции преобладают КОЕ-С-7 (Инд=1.5-1.93) (рис. 4в). Начиная со второй половины постнатального развития, темпы роста обеих категорий КОЕ-С замедляются, к 3-м месяцам концентрация и содержание их практически уравнивается (Инд=1.08). В этом возрасте в бедренной кости содержится почти столько же КОЕ-С, сколько в селезенке. Учитывая, что на долю бедренной кости приходится только около 5% всех КОЕ-С, имеющихся в костном мозге, можно заключить, что к 3-х месяцам жизни, он становится главным источником КОЕ-С. К 18-ти месяцам содержание КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11 в костном мозге увеличивается, но их соотношение в популяции остается неизменным (рис.5в, рис. 7).

Изменения в компартменте родоначальных клеток в костном мозге в индивидуальном развитии, отражают, как и в печени, уровень функциональной активности. Так,

Рис. 6.

Изменения числа КОЕ-С в селезенке мыши в онтогенезе. По оси абсцисс - срок развития, стрелкой указан момент рождения, по оси ординат - число КОЕ-С в логарифмической шкале, х102; 1 и темные точки — КОЕ-С-7, 2 и светлые точки - КОЕ-С-11. Каждая точка - один эксперимент.

начало эритропоэза в костном мозге после рождения совпадает по времени с завершением кроветворения в печени. Потребности в снабжении кислородом тканей быстро растущего организма стимулируют эритропоэз. Очевидно, что с этим связано преобладание в популяции наиболее продвинутых в диф-

ференцировке клеток, формирующих в основном эритроидные колонии, т.е.

КОЕ-С-7, и значительно более высокий темп роста их числа по сравнению с КОЕ-С-11. Известно, что именно КОЕ-С-7 характеризуются повышенной чувствительностью к стимуляторам пролиферативной активности (Wright et al., 1985; Lord, 1986; Wright, Lord, 1986). Вполне логично заключить, что в условиях органогенеза костного мозга, как и при экспериментально вызванном повышении запроса на кроветворение, в первую очередь будет увеличиваться численность КОЕ-С-7.

Клетки, формирующие мелкие селезеночные колонии, - КОЕ-С-эп - присутствуют в пренатальном развитии в желточном мешке и зародыше (10 сут), печени (14 и 18 сут) и селезенке (18 сут). После рождения в первую неделю жизни они регистрируются в печени, селезенке и костном мозге, т.е. в относительно раннем онтогенезе. В селезенке и костном мозге половозрелых животных КОЕ-С-эп либо не выявляются, либо обнаруживаются в незначительном числе.

4. Кроветворные клоногенные клетки (КОЕ-С) печени зародышей мыши при кратковременном культивировании in vivo.

Судьба КОЕ-С-эп в индивидуальном развитии остается не вполне ясной. Возможно, их содержание в селезенке и костном мозге в постнатальном онтогенезе снижается до величины, выходящей за пределы разрешающей способности метода селезеночных колоний. С другой стороны, нельзя исключить, что они являются транзиторной популяцией, не самоподдерживающихся клеток, поскольку в наших экспериментах при ретрансплантации мелких 11-суточных колоний существенного числа дочерних колоний не было обнаружено. Для экспериментальной проверки такой возможности мы исследовали компартмент клоногенных кроветворных клеток печени в относительно замкнутой системе, культивируя ее в организме облученных реципиентов, т.е. когда кроветворная ткань была лишена притока кроветворных клеток через циркуляцию. Че-

Рис. 7.

Изменение числа КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11 в костном мозге мыши в онтогенезеГОоозна-

чения те же, что и на рис. 6.

рез 1 сутки содержание в трансплантатах КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11 снижается соответственно до 1,5 и 3,6%. На 4-е сутки (18-е сутки развития in situ) число КОЕ-С-11 по сравнению с предыдущим сроком уменьшается незначительно тогда, как число КОЕ-С-7 увеличивается почти в 7 раз, а КОЕ-С-эп полностью исчезают. Динамика количественных изменений трех категорий клоногенных клеток позволяет заключить, что в замкнутой системе созревание кроветворных клеток сопровождается выходом КОЕ-С в диф-ференцировку и не компенсируется воспроизведением последних за счет более ранних стадий или собственного размножения. Таким образом, в отсутствии миграции кроветворных клеток из других кроветворных источников, собственных резервов печени оказывается не достаточно для компенсации дифференцировки, созревания и последующей гибели зрелых клеток крови. Возможно, определенную роль в этом играет нарушение трофики, в частности, гипоксия, и, как следствие, дегенеративные изменения в ткани эксплантата. Кроме того, как было установлено выше, при ретрансплантации клеток мелких колоний вторичные колонии исходного типа не выявляются. Мы склонны расценить наши данные в пользу того, что КОЕ-С-эп представляет транзиторную популяцию клеток, не способных к самоподдержанию. Однако какова бы ни была природа КОЕ-С-эп, стабильное выявление колоний малого размера - характерная особенность кроветворной ткани ранних этапов онтогенеза и может служить морфофункцио-нальным маркером присутствия в ткани пре-КОЕ-С.

5. Дифференцировочные потенции мезенхимы печени зародышей мышей.

Тесная связь гемопоэза в печени, основного кроветворного органа зародыша, с микроокружением установлена на различных моделях in vivo и in vitro (Emura et al., 1984; Ohneda, Bautch, 1997; Kitajima et al., 1999; Sicurella et al., 2001; Chagraoui et al., 2003). Способность строить кроветворное МО de novo, обеспечивающее комплекс необходимых условий для поддержания кроветворения, служит экспериментальным доказательством существования стволовых стромальных клеток (Фриденштейн, Лу-рия, 1980). Мы использовали этот подход для оценки наличия стволовых мезенхим-ных клеток в печени и зависимости ее гемопоэтической функции от КМО. С этой целью сравнили морфогенетические преобразования в эктопических трансплантатах печени, выделенной в периоды ее максимальной (14-суточный зародыш) и минимальной (мыши 1-2 дня жизни) кроветворной активности. При гистологическом анализе был выявлен процесс новообразования хряща, кости и ретикулярной ткани в трансплантатах печени зародышей, помещенных под капсулу почки или в подкожную соединительную ткань половозрелых реципиентов (рис. 8). В первые сутки после пересадки большая часть гепатоцитов подвергается некрозу и постепенно

Рис 8

Последовательные стадии новообразования хряща, кости и костномозгового органа при трансплантации печени 14-суточных зародышей мышей под капсулу почки и в подкожную соединительную ткань половозрелых реципиентов А — 5-суточный трансплантат под капсулой почки, скопление мезенхимных клеток, видны многочисленные капилляры, Б - 7-суточный трансплантат в подкожной соединительной ткани, новообразованный гиалиновый хрящ, видны митозы хондробластов, В - 5-суточный трансплантат печени под капсулой почки, участок гипертрофированного гиалинового хряща, рядом губчатая кость

лизируется. Погибает также и основная масса кроветворных клеток. Однако эпителий желчных протоков, синусоидные капилляры и мезенхимные клетки остаются жизнеспособными. К 3-м суткам появляются первые небольшие островки гиалинового хряща. Начиная с 5-х суток и позднее, гиалиновый хрящ гипертрофируется, разрушается и постепенно замещается губчатой костью с активным остеобластиче-ским слоем и синусоидными капиллярами в ее интерстиции. В последующие сроки центральные балки губчатой кости резорбируются многочисленными остеокластами и замещаются ретикулярной тканью, которую заселяют кроветворные клетки трех линий дифференцировки: эритроидной, гранулоцитарной и мегакариоцитарной. Таким образом, к 12-14-м суткам после трансплантации процессы хондро - и остеоге-неза завершаются формированием костномозгового органа - кроветворящего костного мозга, окруженного костным панцирем. В трансплантатах печени, полученных от 1-2-х суточных мышей и пересаженных под капсулу почки, новообразования хряща и кости не происходит.

Таким образом, широкий спектр дифференцировочных потенций свойственен мезенхиме печени в период ее наиболее активного функционирования как кроветворного органа, когда в ней, по литературным сведениям, содержится максимальное число КОЕ-Ф (Van Den Heuvel et al., 1985). Напротив, при эктопической трансплантации печени новорожденных мышей, в которой практически нет КОЕ-Ф (Van Den Heuvel et al., 1985), нам не удалось обнаружить признаки хондро- и остеогенной дифференцировки. Поскольку, популяция КОЕ-Ф включает в себя мезенхимные (стромальные) стволовые клетки, наши результаты экспериментально демонстрируют наличие таких клеток в печени зародышей и исчезновение их в ранний постнатальный период. Вместе с тем, хон-дро- и остеогенез реализовывались при эктопической трансплантации целого органа в экспериментальных условиях, оценить которые затруднительно (влияние погибающих гепатоцитов, жизнеспособность клеток желчных протоков и других клеток самого трансплантата, тканей и гуморальных факторов реципиента). В будущем для исследования потенций мезенхимы зародыша мы планируем использовать более информативные подходы, в частности, методы культивирования in vivo и in vitro клеток эмбриональной печени в виде клонов, гомогенных или гетерогенных популяций.

6. Сравнительная характеристика КОЕ-С из разных кроветворных источников и происхождение КОЕ-С в печени в постнатальном онтогенезе.

Несмотря на исчезновение стволовых стромальных клеток и очевидное отсутствие условий, обеспечивающих гемопоэз (в норме кроветворные очаги в печени не наблюдаются), КОЕ-С продолжают определяться в печени половозрелых мышей (Хрущов

и др., 1977; Старостин и др., 1984). Долгое время оставалось неясным, являются ли КОЕ-С печени половозрелых животных персистирующими эмбриональными или происходят из дефинитивной кроветворной ткани. Ответ на этот вопрос мог быть получен в сравнительном исследовании цитофизиологических характеристик КОЕ-С из различных кроветворных источников. Попытки такого рода делались, когда не существовало представления о генерационно-возрастной организации кроветворного дифферона, и исследователи, не подозревая того, имели дело с относительно «старой» категорией клеток (КОЕ-С-8 или КОЕ-С-9) с низкой способностью к самоподдержанию (Gidali et al., 1974; Micklem et al., 1975). Как известно, именно индекс самообновления (т.е. число вторичных колоний, приходящихся на одну первичную колонию) служит одним из наиболее важных критериев степени зрелости и, следовательно, положения клетки в кроветворном ряду дифференцировки. Учитывая тот факт, что число КОЕ-С в печени может существенно увеличиваться, например, при регенерации или компенсаторном кроветворении (Хрущов и др., 1988; Старостин и др., 1984), мы провели сравнение индексов самообновления наиболее потентной и «молодой» категории КОЕ-С-11 из печени , периферической крови и костного мозга. В отличие от других немногочисленных работ, посвященных этой теме (Wolf, Priestley, 1986; Старостин и др., 1985), мы ретрансплантировали вторичным реципиентам индивидуальные колонии, которые иссекали из селезенки под бинокулярной лупой. Это позволило получить более точные данные, поскольку исследуемая взвесь кроветворных клеток не была «засорена» КОЕ-С из межколониальных пространств. Индекс самообновления для КОЕ-С-11 из печени составляет в среднем 21,2±3,8 и практически не отличается от такового для КОЕ-С-11 из периферической крови (23,4±6,9), но примерно в 2 раза ниже, чем индекс для КОЕ-С-11 из печени зародыша и костного мозга (47,3+11,0). С позиций генерационно-возрастной теории, исследованные нами КОЕ-С-11 из печени половозрелых животных представляются, как более зрелые по сравнению с таковыми из костного мозга половозрелых животных или печени зародышей, и идентичными КОЕ-С-11 из периферической крови. Наряду с утратой мезенхимой печени после рождения способности создавать эффективное кроветворное МО, полученные в данном разделе результаты приводят к заключению, что фиксированные в печени половозрелых животных КОЕ-С, не являются исходно печеночными и, вероятно, поступают в печень из циркуляции. Следует заметить, что физиологическое значение циркулирующих в крови стволовых и ро-доначальных кроветворных клеток весьма велико. В случае недостаточности костномозгового кроветворения они немедленно могут быть извлечены из кровотока для участия в экстрамедуллярном гемопоэзе (Wright et al., 2001).

ИССЛЕДОВАНИЕ СИНТЕЗА РНК В РОДОНАЧАЛЬНЫХ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТКАХ КОСТНОГО МОЗГА. 1. Синтез РНК в популяции КОЕ-С костного мозга интактных животных.

К началу нашего исследования в литературе практически отсутствовали сведения об уровне синтеза РНК, как одного из важнейших показателей готовности морфологически неидентифицируемых КОЕ-С к вступлению в митоз. Нам представлялось интересным более подробно рассмотреть этот вопрос и исследовать синтез РНК в КОЕ-С костного мозга в различных экспериментальных условиях. Стимулом к вступлению КОЕ-С в пролиферацию служит трансплантация кроветворных клеток облученному реципиенту. Наглядным проявлением этого процесса является образование колоний в селезенке облученного животного (Till, McCulloch, 1961). Для оценки синтеза РНК в КОЕ-С были использованы ингибиторы ДНК-зависимого синтеза РНК антибиотики сибиромицин и актиномицин Д, а также Н3-уридин в дозах, вызывающих уридиновое «самоубийство». Разница в числе колоний между группами животных, которым трансплантировали экспонированные с этими препаратами клетки и клетки нативного костного мозга, позволяет определить число КОЕ-С, синтезирующих РНК.

Отсутствие изменений колониеобразования при воздействии радиотоксических доз 3Н-тимидина (3Н-тимидиновое «самоубийство») клетки костного мозга in vivo и in vitro подтвердило, что в норме КОЕ-С находятся вне митотического цикла. Однако в интактном костном мозге популяция КОЕ-С оказалась неоднородной по уровню синтеза РНК. Токсический эффект высоких доз актиномицина Д, подавляющих синтез всех типов РНК (3 мкг/мл/г), и радиотоксических доз 3Н-уридина значительно более выражен при экспозиции клеток in vitro, нежели in vivo. In vivo около 40% КОЕ-С интенсивно синтезируют РНК, остальные клетки способны быстро активировать рибонуклеиновый обмен при выделении их во взвесь (рис. 9).

Наши данные, характеризующие КОЕ-С, как клетки с интенсивным синтезом РНК, подтверждают, что состояние пролиферативного покоя КОЕ-С соответствует G1. Очевидно, что именно положение в G1 дает возможность КОЕ-С быстро вступать в пролиферацию в ответ на разнообразные факторы (Lahiri, van Putten, 1972; Vassort et al., 1973; Briganti et al., 1975; Hodgson et al., 1982; Harrison, Lerner, 1991; Randall, Weissman, 1997). По этой характеристике КОЕ-С близки мобилизованным в кровь КСК, которые, судя по общему содержанию РНК и уровню экспрессии циклина Д, также находятся в фазе Gj (Wright et al., 2001). Однако КОЕ-С отличаются от популяции малых лимфоцитов крови, которые хотя и высокочувствительны к сибиромицину и актиномицину Д, не повреждаются высокими дозами Н3-уридина и, следовательно, находятся в G0 (По-

ликарпова, Хрущов, 1975; Поликарпова, Домарацкая, 1979). Хотелось бы отметить, что полученные нами результаты о синтезе РНК в покоящейся популяции КОЕ-С были одними из первых свидетельств гетерогенности популяции КОЕ-С, отождествляемых в то время со стволовыми кроветворными клетками. Позднее было показано, что стволовые кроветворные клетки также гетерогенны по содержанию РНК и интенсивности ее синтеза и могут быть разделены на О0- и С1- субпопуляции (ОоШо1 й а1., 1997).

Рис.9

Влияние условий экспозиции с актиномицином Д (3 мкг/г/мл) и радиотоксическими дозами 3Н -уридина на КОЕ-С костного мозга.

Колониеобразующая активность КОЕ-С после экспозиции с актиномицином Д в дозе 0,04 МКГ/МЛ/Г, блокирующей синтез рибосомальной РНК. При экспозиции с малыми дозами актиномицина Д, блокирующими синтез рРНК (0,04 мкг/мл/г), не происходит полного подавления образования колоний, и значительная доля КОЕ-С устойчива к антибиотику, как in vivo, так и in vitro. Из этого следует, что в норме в популяции КОЕ-С имеются клетки синтезирующие и не синтезирующие рРНК. После трансплантации облученному реципиенту резистентные к антибиотику КОЕ-С, осев в селезенке, беспрепятственно вступают в пролиферацию и формируют клон кроветворных клеток -колонию. Они либо изначально обладают достаточным содержанием рибосом, либо начинают синтезировать рРНК, вступая в пролиферацию после трансплантации. Специфичность действия низких доз актиномицина Д. В части экспериментов, однако, малые дозы актиномицина Д стимулировали колониеобразующую активность. Поэтому, чтобы исключить неспецифическое действие препарата в малых дозах, был

поставлен контрольный эксперимент. Суть его сводилась к следующему. Поскольку актиномицин Д и 3Н-уридин обладают одной точкой приложения действия (в обоих случаях мишенью оказывается участок молекулы ДНК, на котором осуществляется синтез РНК), они должны конкурировать за ДНК, как матрицу для синтеза РНК. Следовательно, если антибиотик специфически связывается с ДНК, он должен защитить клетки от Н3-уридинового «самоубийства». Наши опыты показали, что при инкубации с изотопом клеток, предварительно обработанных актиномицином Д, токсический эффект не отличается от эффекта одного актиномицина. Следовательно, антибиотик действует специфически.

Устранив сомнения в неспецифическом влиянии малых доз актиномицина Д, мы предположили, что увеличение колониеобразования может быть связано с пролифера-тивным статусом КОЕ-С, учитывая их способность быстро вступать в цикл под воздействием разнообразных стимулов. Однако в каждом конкретном опыте состояние кроветворения и долю КОЕ-С в митотическом цикле мы не определяли. Поэтому в следующей серии экспериментов мы поставили задачу - оценить чувствительность КОЕ-С к актиномицину Д в зависимости от их пролиферативной активности и состояния кроветворения.

2. Синтез рРНК в родоначальных кроветворных клетках (КОЕ-С) при экспериментально вызванной анемии. Известно, что дефицит эритроидных клеток, вызванный серией инъекций актиномицина Д или введением цитозинарабинозида, увеличивает численность КОЕ-С (Preysler, Henderson, 1972; Ben Ishey, 1975; Glick et al., 1977). Для стимуляции регенерации кроветворной ткани мы применили физиологическое воздействие - взятие крови из орбитального синуса, предполагая вызвать пролифератив-ный ответ со стороны КОЕ-С, поскольку эритроидная дифференцировка является одним из направлений их развития.

Потеря крови снижает гематокрит с 50 до 25%. Однако недостаток зрелых клеток крови стимулировал пролиферацию КОЕ-С не во всех экспериментах Причиной этого, очевидно, является существование компартмента коммитированных эритроид-ных клеток-предшественников, играющих роль буферного отдела (Lajtha, 1979). Дефицит зрелых клеток может удовлетворяться за счет пролиферации клеток этого промежуточного компартмента, поскольку на анемию его клетки отвечают прежде стволовых и родоначальных клеток. В тех случаях, когда резервы этого компартмента оказываются недостаточными, начинается пролиферация более примитивных предшественников. В нашем исследовании мы имели оба варианта развития событий (рис. 10).

Рис 10.

Чувствительность КОЕ-С анемичных животных к актиномицину Д Белые столбики пролиферирующие КОЕ-С, темные столбики - покоящиеся КОЕ-С.

В пролиферируюшей ПОПУЛЯЦИИ КОЕ-С уровень 3Н-тимидинового «самоубийства» достигает 40-80%. Такой высокий процент клеток в S-фазе свидетельствует, что в пролиферацию вовлечены практически все КОЕ-С. Низкие дозы антибиотика (0,04 мкг/мл), ингибирующие, синтез рибосомальной РНК, высоко токсичны для делящихся клеток: число КОЕ-С уменьшается на 40-80%. Из этого следует, что митотически активные КОЕ-С синтезируют рРНК весьма интенсивно. Напротив, в популяции КОЕ-С. сохранивших, несмотря на потерю крови, состояние цитокинетического покоя, токсическое действие антибиотика не проявляется. У таких мышей актиномищш вызывает достоверное увеличение колониеобразующей активности КОЕ-С на 20-60%.

Получив эти результаты, мы предположили, что существует гипотетическая РНК, ответственная за синтез белка, препятствующего вступлению клеток в митоз, и ее образование блокирует актиномицин Д (Домарацкая, Поликарпова, 1983). В результате большее число КОЕ-С формирует клоны-колонии в селезенке. С позиций современных представлений о клеточном цикле белком, контролирующим вступление клетки в цикл, может быть продукт гена р53, регулирующего транскрипцию и ответственный за апоп-тоз Известно, что р53 через цепь процессов вызывает связывание транскрипционного фактора E2F ретинобластомным белком Rb в точке рестрикции G1-периода Снижение активности р53 приводит к высвобождению транскрипционного фактора E2F, который поступает в ядро, индуцирует транскрипцию белков

S-фазы (Israels, Israels, 1999, 2001). При отсутствии другого гена-регулятора точки контроля Gj - р21 — повреждение миелотоксическими агентами вызывает резкое сокращение пула покоящихся стволовых клеток (Cheng et al., 2000). Мы полагаем, что актино-мицин Д, может ингибировать образование белка р53 и/или р21, блокируя синтез рРНК или специфических мРНК, что запускает каскад процессов, вызывающих деление КОЕ-С и, как следствие, увеличение числа селезеночных колоний.

Если запрос на кроветворение очень велик, пул непрерывно выходящих в диф-ференцировку или гибнущих клеток должен пополняться за счет чрезмерной пролиферации клеток родоначального и стволового отделов, что может вызвать истощение последних. Так происходит, например, при хроническом и необратимом дефиците эритроцитов, возникающем при введении 55Fe (Reineke et al., 1975), или при хроническом облучении клеток костного мозга осевшем в костях 226 Ra (Svoboda, Kofranek, 1975). Поэтому значение механизма, контролирующего циклирование, трудно переоценить. Он не только регулирует численность, но и защищает популяцию стволовых и родона-чальных клеток от истощения, вызванного гемопоэтическим стрессом, предотвращая гибель особи от недостатка клеток крови.

АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ЭТАПОВ КРОВЕТВОРНОГО И СТРОМАЛЬНОГО РЯДОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ С ПОМОЩЬЮ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ

ПРЕПАРАТОВ

Одной из ключевых проблем биологии и медицины продолжает оставаться проблема резистентности клеток к повреждению и способности тканей восстанавливать свои морфофункциональные характеристики в полном объеме. Экспериментальное удаление клеток определенной стадии дифференцировки с помощью цитотоксических препаратов служит адекватным приемом, который позволяет установить положение той или иной клеточной категории в диффероне и определить ее роль в восстановлении кроветворной ткани. Примером таких исследований являются работы, выполненные с использованием дипина (Урываева, Фактор, 1988; Фактор и др., 1992) и 5-фторурацила (Hodgson, Bradley, 1979; van Zant 1984).

Цитотоксический эффект препаратов на клетки стромы исследовали, используя два экспериментальных подхода. В жидкостной культуре определяли число клоноген-ных стромальных предшественников (КОЕ-Ф) в кроветворной ткани, а на модели эктопической трансплантации оценивали способность стромальных клеток восстанавливать (переносить) исходное кроветворное микроокружение (Фриденштейн, 1982). Размер

кроветворного микроокружения определяли по числу ядерных клеток и КОЕ-С в трансплантате.

1. Динамика содержания КОБ-С в костном мозге и селезенке после введения ди-пина.

Через 1 сутки после введения препарата в костном мозге сохраняется не более 7% КОЕ-С-11 и 0,54% КОЕ-С-7; в селезенке - 7,8% КОЕ-С-11, КОЕ-С-7 не обнаруживаются. Дальнейшее исследование содержания КОЕ-С-11 и КОЕ-С-7 в кроветворных органах взрослых животных в разные сроки после однократного введения препарата выявило длительное нарушение стационарного состояния кроветворной ткани (рис. 11). Оно проявляется в периодических (синусоидальных) изменениях содержания КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11 в костном мозге и селезенке. В обоих кроветворных органах популяция КОЕ-С не приходит в равновесное состояние на протяжении времени, соизмеримого с жизнью мыши (23 месяцев). Согласно теории клональной сукцессии (Кау, 1965), в кроветворной ткани существуют активный и покоящийся резерв, последовательно выходящих в дифференцировку КСК. Дифференцировка тесно связана с пролиферацией: чем больше делений проходит исходная клетка, тем дальше она продвигается по пути созревания. Исчезающие вследствие терминальной дифференцировки клоны сменяются клонами из покоящегося резерва. В пользу правильности этих представлений говорят данные многих авторов. Так, осцилляция КОЕ-С обнаружена после облучения мышей или введения им винбластина (Breivick, 1972; Gidali et al, 1985). Выявлены регулярные изменения доли лимфоидных и миелоидных клеток различных генотипов (Mintz et al., 1984). Значительные вариации в представительстве кроветворных клеток по одному из типов изофермента описаны у кошек, гетерозизотных по глюкозофосфат-дегидрогеназе, после введения им бусульфана (Abkowitz et al., 1993). Колебания в фе-нотипической принадлежности БОЕ-Э и КОЕ-ГМ происходят у кошек-мозаиков по X-хромосоме (Abkowitz et al., 1990, 1998, 2000). Аналогичные данные получены при анализе выхода в дифференцировку кроветворных клонов, маркированных ретровирусами (Snodgrass, Keller, 1987; Drize et al., 2001).

Колебания содержания КОЕ-С, обнаруженные нами, по-видимому, отражают динамику функционирования наиболее ранних кроветворных клеток, а именно стволовых (КСК). Поскольку способность к самообновлению популяции КОЕ-С весьма ограничена, КОЕ-С, регистрируемые в отдаленные сроки после введения дипина, являются потомками КСК, пережившими его воздействие. После введения дипина события в популяции кроветворных клеток, по-видимому, развиваются следующим образом. Гибель части КСК приводит к резкому снижению численности КОЕ-С в костном мозге и селе-

а)

время после введения дипина (нед)

Рис.11.

Динамика изменения содержания КОЕ-С в костном мозге (а) и селезенке (б) после однократного введения дипина.

зенке. Устойчивые к дшгану КСК генерируют новые клоны, достигающие стадий, которые идентифицируются нами in vivo (КОЕ-С). Из этого следует, что КСК, во-первых, гетерогенны по чувствительности к дипину и, во-вторых, вступают в пролиферацию не одновременно, что в итоге и дает картину периодических спадов и подъемов численно-

ста их потомков - КОЕ-С. Таким образом, периодические изменения в кроветворных органах численности популяции КОЕ-С, как клоногенных клеток с ограниченной способностью к самоподдержанию, вероятнее всего, есть следствие клоногенной активности последовательно выходящих в дифференцировку КСК, устойчивых к дипину. 2. Повреждение клеток стромы 5-ФУ и дипином и регенерация кроветворной ткани.

5-ФУ. Через 1 сутки после введения 5-ФУ в костном мозге и селезенке сохраняются соответственно около 50 и 60% КОЕ-Ф. В этой серии экспериментов мы сравнили регенерацию кроветворной ткани трансплантатов: а) содержимого бедренной кости в виде костномозгового цилиндра («трансплантат костного мозга»), б) костного мозга в виде бедренной кости с диафизом («бедренная кость») и в) селезенки, помещенных под капсулу почки сингенных реципиентов. Гибель части популяции стромальных механо-цитов значительно меняет динамику регенерации и роста трансплантатов от экспериментальных животных по сравнению с таковыми от контрольных (рис. 12). Это, несомненно, свидетельствует об участии 5-ФУ-чувствительных КОЕ-Ф в переносе органо-

Более выраженная регенераторная активность трансплантата бедренной кости по сравнению с таковым костного мозга связана, по-видимому, с содержанием в нем популяции «молодых» и потентных стромальных клеток в кости и надкостнице (Хрущев и др., 1988). Наиболее интенсивный рост характерен для трансплантата селезенки, что, как мы полагаем, подтверждает существование различий в составе стромальных клеток-предшественников между этими органами, хотя и те и другие способны поддерживать миелоид-ное кроветворение (Arnold et al., 1982; Keller et al., 1983).

типического кроветворного микроокружения. %

300

Рис. 12.

Число кариоцитов и КОЕ-С в эктопических трансплантатах костного мозга (а), бедренной кости (б) и селезенки (в) после введения 5-ФУ. По оси ординат - доля клеток в % от контроля, по оси абсцисс - срок трансплантации. Светлые кружки и прерывистые линии - число кариоцитов. Темные кружки и сплошные линии - число КОЕ-С. - введение 5-ФУ.

Дипин. Через 1 сутки после введения дипина в костном мозге сохраняется не более 1518% исходного числа КОЕ-Ф. Значительные колебания их численности прослеживаются в течение, по крайней мере, одного года наблюдения и достаточно хорошо соответствует динамике КОЕ-С, что свидетельствует о глубоких и однонаправленных изменениях в системе кроветворных и стромальных клеток. Способность к регенерации и построению кроветворных территорий de novo, оцененная по размеру эктопических трансплантатов костного мозга резко снижена по сравнению с таковыми от интактных животных. Через 2 месяца после введения препарата размеры трансплантатов составляли около 35% от контроля, и на протяжении последующих сроков наблюдения восстановления их размеров до контрольного уровня не происходит (рис. 13). Полученные результаты позволяют заключить, что популяция стромальных родоначальных клеток неоднородна и содержит как высоко чувствительные, так и относительно устойчивые к 5-ФУ и дипину клетки. Резистентные к 5-ФУ клетки, как и клетки кроветворного диф-ферона, скорее всего, являются наиболее молодыми родоначальными (возможно, стволовыми) клетками, поскольку именно они и их потомки могут обеспечить регенерацию и рост трансплантата в более поздний период. Напротив, чувствительные к 5- ФУ клетки, хотя и участвуют в переносе кроветворного микроокружения в ранние сроки после трансплантации, но не являются необходимыми для его регенерации в полном объеме и, по-видимому, представляют собой транзиторную популяцию. Дипин, в отличие от 5-ФУ помимо транзиторной популяции, необратимо повреждает наиболее молодую категорию стромальных клеток с высоким репаративным потенциалом (очевидно,

стволовых). Справедливость такого за-

ключения подтверждается тем, что ус-

% 60

50 40 30 20

тойчивые к дипину стромальные клет-

ки, хотя и создают кроветворную территорию, не способны обеспечить ее вос-

10 -

о ь-

становление до контрольного уровня в течение 8-10 месяцев. Можно предпо-

2 мес 4 мес 10 мес

Число кариоцитов и КОЕ-С в эктопических трансплантатах после введения дипина. По оси ординат - доля клеток в % от контроля, по оси абсцисс - срок трансплантации. Светлые столбики - кариоциты, темные -КОЕ-С.

Рис. 13.

ложить, что выжившие после воздействия дипина стромальные клетки либо исходно обладают ограниченной способностью к репарации, либо имеют в

генетическом аппарате скрытые, нане-

сенные дипином повреждения, которые

хотя и совместимы с жизнедеятельно-

стью клетки, но существенно ограничивают ее потенции.

Основываясь на результатах, полученных с использованием цитотоксических препаратов, мы предлагаем по аналогии с иерархической организацией кроветворных клеток следующую гипотетическую модель стромального дифферона (рис. 14).

Рис. 14.

Гипотетическая схема дифферона стромальных клеток. МСК-1 - мезенхимные стволовые клетки с высоким репаративным потенциалом, МСК-2 - мезенхимные стволовые клетки с ограниченным репаратиЕным потенциалом.

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА НА РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Пребывание в космическом полете вызывает значительные изменения в периферической крови у человека, млекопитающих и низших позвоночных (Вепу, 1970; Га-зенко и др., 1974; Johnson et al., 1975; Leon et al., 1978,1980; Илюхин, Бурковская 1981; Домарацкая и др. 1984; Udden et al., 1995; Michurina et al., 1996; Frippiat, Dournon, 2004). Некоторые изменения (например, численность форменных элементов), зарегистрированные в наиболее зрелом, периферическом, звене кроветворной системы, могут иметь вторичный характер и быть результатом более глубоких процессов, происходящих в кроветворной системе под влиянием факторов полета. В этой связи особую актуальность приобретает исследование других отделов кроветворного дифферона, а именно, отделов стволовых и родоначальных клеток, обеспечивающих обновление кроветворной ткани и поддержание кроветворения на постоянном уровне.

Содержание КОЕ-С в кроветворных органах крыс определяли после 5-19-ти суточных полетов на советских биоспутниках серии «Космос». Соответствующие наземные контроли - синхронный (имитирующий на земле условия жизни на борту и факторы, связанные с запуском и приземлением), а также виварный контроль (обычные условия содержания) - позволили вычленить изменения, связанные с неспецифическими факторами полета, такими как гипергравитация, шум, вибрация, ударные перегрузки.

Различия между животными полетной и контрольных групп позволяют полагать, что именно специфические факторы полета вызывают существенное уменьшение числа КОЕ-С в костном мозге, тогда как на содержание КОЕ-С в селезенке действуют, в основном, неспецифические факторы (Рис. 15 а и б).

Рис. 15.

Число КОЕ-С в костном мозге (а) и селезенке (б) самок крыс после космического полета на биоспутнике «Космос- 1514». ВК - виварный контроль, СК - синхронный контроль, П - полет.

Особый интерес представляет формирование кроветворной системы в прена-тальном онтогенезе при действии факторов космического полета на мать, поскольку ряд изменений в ее организме (активизация катаболических процессов, развитие анемии, дефицит кальция, снижение устойчивости эритроцитов) может быть неблагоприятен для развития плода в целом и его кроветворной системы, в частности. Пребывание в невесомости в плодном периоде развития (13-18 сут) вызывает небольшие, быстро нормализующиеся изменения в содержании КОЕ-С в печени и селезенке и не влияет существенно на возрастную динамику этих клеток в кроветворных органах в постна-тальном развитии.

Достоверное уменьшение КОЕ-С у взрослых крыс полетной группы не только в костном мозге, но и в селезенке и печени делает маловероятным их перераспределение их между этими органами. Не исключено, что снижение численности КОЕ-С может быть обусловлено их гибелью, миграцией в периферическую кровь или изменением

способности «оседать» (репопулировать) в селезенке. В отделах клоногенных клеток, коммитированных к дифференцировке в эритроидном и гранулоцитарном направлениях, также обнаружена значительная редукция числа КОЕ-ГМ, БОЕ-Э и КОЕ-Э (Vacek et al., 1990). Анализ кроветворных и лимфоидных клеток (в том числе и стволовых) в экспериментах на спутниках, при клиностатировании или в ротационных культурах указывает на снижение уровня их пролиферативной активности (Газенко и др., 1980; Макеева и др., 1976, 1988; Cogoli, Cogoli-Greuter, 1997; Plett et al., 2001). Совокупность этих фактов приводит к мысли, что в условиях полета стволовые кроветворные клетки, хотя бы временно, теряют способность поддерживать численность компартментов ро-доначальных и коммитированных клеток на постоянном уровне.

В этой связи представляется весьма интересным оценить состояние кроветворного микроокружения, поскольку кроветворная ткань находится под регуляторным влиянием стромальных клеток, его составляющих (Quesenberry et al., 1991; Dexter, 1991; Whetton, Spooncer, 1998). Установлено, что в условиях микрогравитации в костной ткани крыс нарушается минерализация, уменьшается число и величина трабекул, редуцируется губчатая кость, развивается остеопороз (Оганов и др., 1988; Arnaud et al., 1990; Kaplansky et al., 1990; Zerath et al., 1990; Terner, 2000; Vico et al., 2000). Большинство авторов склоняется к мнению, что это связано, в основном, с подавлением новообразования кости и в меньшей степени с ее резорбцией. Не исключено, что в состоянии невесомости блокируется дифференцировка преостеобластов в остеогенные клетки-предшественники (Vico, Alexander, 1990). Эти изменения сопровождаются увеличением содержания жирового, но не кроветворного компонента и до настоящего времени в известной нам литературе мы не встречали ни одного случая замещения костной массы кроветворными клетками у животных, перенесших космический полет. Одновременно с деструктивными изменениями костной ткани у крыс выявлено резкое сокращение в костном мозге числа КОЕ-Ф (Vacek et al., 1990). Возможно, именно с этим связано многократное уменьшение числа КОЕ-ГМ, дифференцировка которых происходит в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), вырабатываемого фибробластами (Vacek et al., 1990; 1991).

Совокупность полученных к настоящему времени данных (значительное сокращении численности кроветворных родоначальных и коммитированных клеток, числа родоначальных стромальных клеток и изменения костной ткани) приводит к заключению, что факторы космического полета, из которых наиболее сильным, по-видимому, является микрогравитация, существенно подавляют миелопоэз.

ВЛИЯНИЕ НЕПРЕРЫВНОГО ГАММА- ОБЛУЧЕНИЯ В НИЗКИХ ДОЗАХ НА РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ И СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ.

Одной из наиболее значимых для организма и для кроветворной системы составляющих космического полета является ионизирующее излучение. Поэтому следующий раздел наш работы был посвящен исследованию влияния непрерывного у- облучения в дозах, соответствующих тем, которые организм получает на борту космического аппарата на родоначальные кроветворные и стромальные клетки костного мозга. Стромальные родоначальные клетки. Непрерывное 10-ти суточное у- облучение (суммарная доза 1,5 сГр, мощность дозы 0,15-0,2 сГр/сут) вызывает в костном мозге значительное увеличение числа КОЕ-Ф (рис. 16) и доли их в S-фазе клеточного цикла (с 11,9+3,1 % в контроле до 51,2±1,8 % после облучения). Размеры эктопических трансплантатов костного мозга от облученных мышей-доноров, оцененные по содержанию кариоцитов, увеличиваются вдвое, а содержание в них КОЕ-С-11 и КОЕ-С-7 возрастает от 2 до 7 раз (рис. 17).

Стимулирующий эффект малых доз различных химических и физических агентов, в том числе и радиации, на биологические объекты, так называемый гормезис, хорошо известен (The «Data Documents" produced by Radiation, Science and Health, 1998; Гусаров, Иванов, 2001; Эйдус, 2001; Calabrese, Baldwin, 2002). Радиационный гормезис наиболее изучен на примере клеток иммунной системы. Установлено, что рентгеновское и у- облучение в интервале доз 75-125 мГр стимулирует синтез ДНК и РНК, ускоряют переход из Go/Gj в S-фазу, редуцирует апоптоз тимоцитов (Liu et al., 1995; Xu et al., 1997; Park et al., 1999; Ye, Liu, 1999, 2000). На молекулярном уровне выявлена ранняя экспрессия белков и стимуляция транскрипции ряда цитокинов (Liu et al., 1995; Chen et al., 1996; Bai et al., 1998; Liu et al., 2000).

Сведения о воздействии облучения на строму костного мозга практически отсутствуют. Эффект гормезиса на стромальные клетки костного мозга описан при остром облучении и состоит в увеличении пролиферативной активности КОЕ-Ф, большей эффективности культурального подслоя поддерживать КОЕ-ГМ in vitro и улучшении адгезионной способности клеток костного мозга (Ma et al., 1999). В отличие от авторов этой работы мы наблюдали эффект стимуляции КОЕ-Ф при пролонгированном облучении и в дозах более низкой интенсивности.

Механизм активирующего действия малых доз облучения остается не достаточно изученным. В основе его может лежать изменение свойств цитоплазматической мембраны (Эйдус, 2001). В частности, дозы у- облучения, сравнимые с использованными в нашей работе, активизируют аденилатциклазный комплекс и повышают

Рис.16.

Число КОЕ-Ф в костном мозге через 10 суток после непрерывного у- облучения в суммарной дозе 1,5 сГр. Каждый столбик -один эксперимент.

Рис. 17.

Размеры эктопических трансплантатов костного мозга у- облученных мышей.

чувствительность рецепторов аденилатциклазы к изопротеренолу - их специфическому стимулятору (Руда, Кузин, 1991). С другой стороны, показано, что непродолжительное облучение низкой мощности сопровождается усилением экспрессии различных изо-форм протеинкиназы С, тогда как сигнальная трансдукция через аденилатциклазу-цАМФ подавляется (Liu, Xie, 2000).

Одной из причин повышения пролиферативной активности и увеличения численности КОЕ-Ф, обнаруженных в нашей работе, может быть стимуляция синтеза некоторых цитокинов (Liu et al., 2000). Установлено прямое действие макрофагального колониестимулирующего фактора (М-КСФ) на родоначальные клетки стромы (Tanaka-Douzono et al., 2001). Поскольку часть гетерогенной популяции КОЕ-Ф представлена мезенхимными стволовыми клетками (Gronthos et al., 2003), увеличение размеров трансплантатов от облученных животных, по нашему мнению, свидетельствует о воздействии облучения, прежде всего, на клетки этой категории.

Кроветворные родоначальные клетки. В отличие от КОЕ-Ф, непрерывное 10-суточное облучение в использованных дозах не влияет на содержание и пролифера-тивную активность КОЕ-С-11 и КОЕ-С-7. Не исключено, что эти дозы слишком малы, как и для В- и Т- лимфоцитов, длительно облучавшихся дозой очень низкой мощности (Courtade et al., 2001), и в кроветворных клетках, в отличие от стромальных, гормезис имеет место при более высоких дозах радиации. Так, например, в лимфоцитах тимуса и селезенки стимуляция синтеза ДНК происходила после непродолжительного f- облучения в дозе, в несколько раз превышающую таковую в нашей работе (Ye, Liu, 1999, 2000). С другой стороны, следовало бы ожидать, что увеличение численности стро-

мальных родоначальных клеток может повлиять на кроветворную функцию, поскольку кроветворные клетки функционально тесно связаны с кроветворной стромой. Возможно, опосредованное стромой облучение влияет на более дифференцированные клетки, например, коммитированные в гранулоцитарном и эритроидном направлениях КОЕ-ГМ и КОЕ-Э, однако, их исследования мы не проводили. Кроме того, мы анализировали ответ на радиационное воздействие непосредственно после его окончания. Поэтому нельзя исключить, что изменения в популяции кроветворных клеток могут проявиться в более поздние сроки. В дальнейшем мы планируем провести исследование кроветворного и стромального рядов дифференцировки с использованием методов клонирования in vitro для более детальной характеристики процессов, происходящих в кроветворной ткани под воздействием облучения.

Значение последствий облучения человека дозами низкой интенсивности в полетах большой продолжительности, по-видимому, до конца еще не осознано. Единственная известная нам работа, которая рассматривает облучение в низких дозах с позиций космической радиобиологии, выполнена in vitro на клетках лимфобластомы человека (линия ТК-6) и находится в стадии публикации (Ohnishi et al., 2004). При хроническом облучении низкой мощности, в отличие от однократного облучения в той же суммарной дозе, апоптоз не наблюдается; напротив, индуцируется экспрессия генов, его подавляющих. Таким образом, если подавление апоптоза в тимоцитах и спленоци-тах может стимулировать иммунную систему и повышать устойчивость организма к неблагоприятным воздействиям, то в случае опухолевых клеток его, вряд ли, можно считать полезным. Известны случаи, когда облучение в низкой дозе приводило к увеличению числа мутаций (Furuno-Fukushi et al., 1988) и стерильности (Braun et al., 1963).

Различия в постановке экспериментов (мощность дозы, продолжительность и условия облучения, гистогенетические различия исследуемых клеток, разнообразие биологических моделей и пр.) создают объективные трудности для сравнения результатов, полученных разными исследователями. Однако следует подчеркнуть, что в наших экспериментах мы наблюдали стимулирующее действие непрерывного облучения в дозах на порядок ниже тех, для которых в настоящее время описан радиационный горме-зис. В известной нам литературе мы не нашли примеров столь сильного стимулирующего эффекта столь малых дозах радиации, а для стромальных родоначальных, а, вероятно, и стволовых клеток, он, по-видимому, обнаружен впервые.

Важность изучения эффектов малых доз не ограничивается рамками космических программ, хотя хроническое воздействие радиации на организм космонавтов, несомненно, должно учитываться. Гамма- облучение низкой мощности является одним из

компонентов радиоактивного природного фона. Его источниками являются радон и продукты его распада, радиоактивный изотоп 40К, уран, продукты радиоактивного распада урана и тория; они присутствуют в биосфере в очень малых количествах и дают малую интенсивность излучения (Кузин, 2002). Постоянной частью фоновой радиации становится техногенное загрязнение Земли. Поэтому радиация в низких дозах делается экологической проблемой, что диктует необходимость оценивать воздействие на организм человека радиоактивного излучения низкой интенсивности и в наземных условиях в местах постоянного проживания.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В проведенном экспериментальном исследовании получены новые сведения о цитофизиологических особенностях и структуре популяции родоначальных кроветворных клетках в индивидуальном развитии, а также реакции родоначальных кроветворных и стромальных клеток на воздействия химической и физической природы (антибиотики, цитотоксические препараты, микрогравитацию, радиацию).

Наше исследование объединяет несколько направлений, связанных общей проблемой дифференцировки родоначальных кроветворных и стромальных клеток.

1. Впервые проведено подробное исследование популяции родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах в пре- и постнатальном онтогенезе. В кроветворной ткани зародышей (желточном мешке, печени и селезенке) и животных первых дней жизни (селезенке и костном мозге), помимо известных категорий родоначальных кроветворных клеток - КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11, характерных и для кроветворных органов половозрелых мышей, выявлен новый, не описанный ранее тип клеток - КОЕ-С-эп. Эти клетки образуют в селезенке мелкие колонии бластного типа в поздние сроки после трансплантации. В селезенке и костном мозге половозрелых животных КОЕ-С-эп практически отсутствуют. По своим свойствам КОЕ-С-эп относятся к стадии дифференци-ровки, предшествующей КОЕ-С. В отличие от эмбриональных КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11, они не пролиферируют, устойчивы к 5-ФУ и антисыворотке против головного мозге мыши. Для КОЕ-С-эп характерна высокая вариабельность числа образуемых ими колоний по сравнению с колониями, формируемыми КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11. С помощью методов математической статистики показано, что распределение числа мелких колоний, в отличие от крупных колоний, не подчиняется закону Пуассона. Это позволило заключить, что крупные колонии образованы непосредственно КОЕ-С, тогда как мелкие колонии - за счет пролиферации клеток предыдущих стадий, т.е. пре-КОЕ-С. Расчеты по-

казали, что концентрация пре-КОЕ-С в печени зародыша составляет 2,67 на 105 клеток, а среднее число КОЕ-С, образованных из одной пре-КОЕ-С - около 260.

Структура компартмента родоначальных клеток, т.е. относительное содержание КОЕ-С различных категорий в кроветворных органах, отражает функциональное состояние кроветворной ткани той или иной стадии развития и меняется в соответствии с потребностями организма. Так, например, в период интенсивного роста зародыша и, в связи с этим, большой потребности тканей и органов в кислороде, в популяции КОЕ-С-7 печени преобладают, ближайшие предшественники коммитированных к эритроидной дифференцировке БОЕ-Э и КОЕ-Э. Перемещение гемопоэза в костный мозг также сопровождается активацией эритропоэза. Когда формирование и рост кроветворной ткани (печени зародыша или костного мозга взрослого животного) заканчивается, в популяции возрастает относительное содержание более потентных КОЕ-С-11, а доля более дифференцированных КОЕ-С-7 уменьшается. Присутствие КОЕ-С-эп является отличительным свойством кроветворной ткани ранних этапов развития и, по всей видимости, КОЕ-С-эп представляют собой транзиторную популяцию клеток, исчезающую из кроветворных органов вскоре после рождения.

Сохраняется ли популяция КОЕ-С в печени после перемещения гемопоэза в костный мозг? Сравнение КОЕ-С-11 из различных источников (костного мозга, периферической крови, печени зародышей и половозрелых животных), а также эксперименты по эктопической трансплантации печени дают отрицательный ответ на этот вопрос. Во-первых, уже в первые дни после рождения мезенхима печени утрачивает способность к созданию кроветворного микроокружения, эффективно поддерживающего кроветворение. Во-вторых, КОЕ-С-11 печени взрослых мышей по способности давать вторичные КОЕ-С соответствуют таковым из периферической крови. Таким образом, тестируемые в печени в постнатальный период КОЕ-С не могут быть признаны резидентными и, скорее всего, поступают в нее из циркуляции.

2. Изучены цитофизиологические особенности КОЕ-С - стадии дифференци-ровки, не идентифицируемой морфологически. Исследован синтез РНК, как одно из условий, необходимых для вступления в цикл покоящейся популяции КОЕ-С. Применив метод 3Н-уридинового «самоубийства» в сочетании с ингибиторами ДНК-зависимого синтеза РНК, мы оценили синтез РНК в КОЕ-С в зависимости от уровня пролиферативной активности и состояния кроветворения. Впервые КОЕ-С были охарактеризованы как неоднородная по уровню синтеза РНК (в том числе и рРНК) популяция. В ней содержатся клетки, интенсивно синтезирующие РНК, и клетки, способные быстро активировать этот синтез. Высокий уровень синтеза РНК и способность к быст-

рой его активации в покоящейся популяции КОЕ-С подтверждает представление о соответствии состояния покоя КОЕ-С G1- периоду клеточного цикла.

Вступление КОЕ-С в пролиферацию под влиянием экспериментально вызванной анемии сопровождается активацией синтеза рРНК и, как следствие, значительным повышением доли КОЕ-С, чувствительных к актиномицину Д. В ряде случаев в кроветворной ткани, получившей сигнал к регенерации, КОЕ-С сохраняют состояние цито-кинетического покоя, но реагируют на актиномицин увеличением колониеобразования. Этот ответ на антибиотик-ингибитор синтеза РНК мы рассматриваем, как экспериментальную демонстрацию на примере КОЕ-С механизма, регулирующего численность клеток в популяции и защищающего ее от истощения при функциональном стрессе. Не исключено, что актиномицин Д выступает, как ингибитор синтеза РНК белков, блокирующих переход клетки из Gt в S-фазу (возможно, белка р53 и/или р21).

3. Другое направление нашей работы было посвящено исследованию некоторых этапов дифференцировки кроветворных и стромальных клеток. С этой целью мы использовали цитотоксические препараты, обладающие избирательным действием на клетки разной степени зрелости, а именно, 5-ФУ и дипин, поражающие соответственно более зрелые и более молодые клетки.

В стромальном ряду с помощью этого подхода выявлено несколько категорий клеток, различающихся по степени зрелости и участию в восстановлении кроветворной ткани костного мозга. Критерием дифференцировочных и регенераторных потенций стромальных клеток служило построение de novo полноценного кроветворного микроокружения, завершающегося образованием кроветворного органа.

Установлено, что стромальные клетки, ответственные за регенерацию трансплантата в полном объеме, чрезвычайно чувствительны к дипину, но относительно резистентны к 5-ФУ. Высокий репаративный потенциал позволяет отнести их к категории наиболее молодых мезенхимных (вероятнее всего, стволовых) клеток. Напротив, стро-мальные клетки с ограниченными репаративными потенциями устойчивы к дипину; они, хотя и создают кроветворную территорию, но не способны восстановить ее размер до контрольного уровня. Среди популяции стромальных клеток обнаружены клетки, участвующие в построении кроветворной территории в ранние сроки после трансплантации. Они чувствительны к 5-ФУ, однако, их отсутствие не влияет на восстановление трансплантата. Полученные результаты послужили основой для построения гипотетической модели гистогенетического ряда мезенхимных клеток.

Весьма продуктивным оказалось исследование с помощью дипина кроветворного дифферона. Однократное воздействие дипином вызывает длительное нарушение

стационарного состояния кроветворной ткани, что выражается в периодических спадах-подъемах численности исследованных категорий КОЕ-С в костном мозге и селезенке. Характер изменений содержания КОЕ-С, клеток с ограниченным самоподдержанием, свидетельствует о чрезвычайно высокой токсичности дипина в отношении наиболее молодых и потентных клеток кроветворного ряда и отражает клоногенную активность последовательно выходящих в дифференцировку выживших стволовых кроветворных клеток. Мы расцениваем подобную динамику численности КОЕ-С, как экспериментальное подтверждение того, что функционирование кроветворного дифферона осуществляется на основе клональной сукцессии.

4. Впервые в модельных экспериментах на млекопитающих оценено влияние факторов космического полета на морфологически неидентифицируемые кроветворные родоначальные клетки. Показано, что краткосрочный космический полет приводит к достоверному уменьшению содержания КОЕ-С в кроветворных органах. В костном мозге это вызвано действием специфических, тогда как в селезенке - неспецифических факторов полета. Вместе с тем, кратковременная экспозиция в невесомости в плодном периоде не влияет существенно на возрастную динамику содержания КОЕ-С в кроветворных органах, свойственную животным, пренатальное развитие которых прошло в наземных условиях.

5. Установлено, что непрерывное у- облучение в низких дозах (мощность дозы 0,15 сГр/сут, суммарная доза —1,5 сГр) обладает стимулирующим действием на стромальные родоначальные клетки (КОЕ-Ф). Оно проявляется в усилении пролифератив-ной активности и увеличении численности КОЕ-Ф в костном мозге. Регенераторная способность стромы костного мозга, оцененная методом эктопической трансплантации по размеру вновь создаваемой кроветворной территории, существенно увеличивается под влиянием непрерывного гамма-излучения низкой мощности. Поскольку за рост эктопических трансплантатов, как было показано в наших экспериментах с цитотоксиче-скими препаратами дипином и 5-ФУ, ответственны, очевидно, стволовые клетки стро-мы, с большой долей уверенности можно утверждать, что мы обнаружили эффект радиационного гормезиса именно для этой популяции клеток. В отличие от стромальных, кроветворные родоначальные клетки не чувствительны к использованным дозам радиации: изменения числа КОЕ-С в S-фазе и их содержания в костном мозге не происходит.

клеток иной тканеспецифической природы. Обнаружение феномена радиационного гормезиса открывает новые перспективы в исследовании мезенхимных клеток, имеющих разнообразную тканевую локализацию. Активация клеток, способных к миграции и обладающих гистогенетической пластичностью, может представлять серьезную медико-биологическую проблему. Наша работа открывает перспективы для этого направления исследований, которое потребует более детального изучения с помощью привлечения адекватных модельных систем и методов анализа, специфичных для клеток того или иного гистогенетического ряда.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены отличия кроветворной ткани эмбрионального и раннего постна-тального развития лабораторных мышей.

• Впервые в кроветворной ткани (желточном мешке, печени, селезенке и костном мозге) ранних этапов индивидуального развития (в пренатальном периоде и в первую неделю после рождения) обнаружена особая категория клоногенных кроветворных клеток - КОЕ-С-эп и охарактеризованы их свойства. КОЕ-С-эп образуют небольшие клоны клеток бластного типа, которые регистрируются на поверхности селезенки в поздние сроки после трансплантации (на 11 сутки). КОЕ-С-эп находятся вне пролиферативного цикла, резистентны к оксимочевине, 5-фторурацилу (5-ФУ) и к антисыворотке к головному мозгу мыши, что характеризует их как менее зрелые, по сравнению КОЕ-С, клетки. Математический анализ распределения числа мелких селезеночных колоний подтвердил, что клетки, ответственные за их образование - КОЕ-С-эп - представляют собой стадию дифференцировки, предшествующую КОЕ-С - пре-КОЕ-С.

• На разных этапах онтогенеза компартмент КОЕ-С характеризуется определенным соотношением входящих в него трех категорий клоногенных кроветворных клеток (КОЕ-С-7, КОЕ-С-11 и КОЕ-С-эп), что отражает функциональное состояние кроветворной системы, свойственное тому или иному периоду индивидуального развития особи.

2. Впервые показано, что мезенхима печени 14-суточных зародышей в период ее активного кроветворения обладает широкими дифференцировочными потенциями. При эктопической трансплантации половозрелым реципиентам среди мезенхимных клеток выявлены предшественники гиалинового хряща, кости и кроветворной стромы.

3. С помощью ретрансплантации индивидуальных селезеночных колоний показано, что КОБ-С-11 из печени половозрелых животных по способности к самоподдержанию КОЕ-С-11 идентичны таковым из периферической крови, т.е. не являются исходно печеночными и, вероятнее всего, поступают в печень из циркуляции.

4. При анализе вступления родоначальных кроветворных клеток (КОЕ-С) костного мозга в клеточный цикл, проведенном с помощью ингибиторов ДНК-зависимого синтеза РНК и радиотоксических доз 3Н-уридина, выявлен интенсивный синтез РНК и способность к быстрой его активации у значительной части популяции КОЕ-С. Это подтверждает представление о том, что состояние пролиферативного покоя КОЕ-С соответствует Gr периоду клеточного цикла.

5. При изучении синтеза рРНК в популяции КОЕ-С костного мозга интактных мышей и после стимуляции кроветворения кровопотерей установлено, что а) в стационарных условиях среди КОЕ-С имеются клетки, как синтезирующие, так и не синтезирующие рРНК, б) в популяции КОЕ-С, вступивших под воздействием кровопотери в пролиферацию, число клеток, синтезирующих рРНК, возрастает. В популяции КОЕ-С, сохранившей, несмотря на кровопотерю, состояние покоя, актиномицин Д в дозах, ин-гибирующих синтез рРНК, стимулирует колониеобразование.

6. Проведено сравнительное исследование цитотоксического действия 5-ФУ на способность различных категорий родоначальных кроветворных клеток (КОЕ-С-7, КОЕ-С-11, КОЕ-С-эп) из кроветворной ткани зародышей и половозрелых мышей к образованию кроветворных колоний. Показано, что целостность структурной организации кроветворной ткани повышает резистентность КОЕ-С-11 к цитотоксическому действию 5-ФУ. В условиях in vitro эмбриональные КОЕ-С-11 и КОЕ-С-7 одинаково чувствительны к 5-фторурацилу и не отличаются по этой характеристике от соответствующих категорий КОЕ-С костного мозга. КОЕ-С-эп - устойчивы к действию 5-ФУ.

7. Изучено действие алкилирующего препарата дипина на родоначальные кроветворные клетки костного мозга и селезенки взрослых мышей. Установлено, что дипин вызывает длительное нарушение стационарного состояния кроветворной ткани, которое проявляется в периодических изменениях содержания КОЕ-С-11 и КОЕ-С-7 в костном мозге и селезенке. Происходящие на протяжении жизни мыши спады и подъемы численности КОЕ-С - транзиторной популяции клеток, дает основание заключить, что, во-первых, кроветворные стволовые клетки неоднородны по чувствительности к дипи-ну, во-вторых, их дифференцировка осуществляется на основе клональной сукцессии.

8. Исследованы содержание КОЕ-Ф в костном мозге и регенераторные потенции костномозговой кроветворной стромы после воздействия 5-ФУ и дипина - препаратов, избирательно токсичных для клеток разной степени зрелости. На основании различий в чувствительности (устойчивости) стромальных клеток к 5-ФУ и дипину, а также в характере восстановления кроветворной ткани после удаления той или иной субпопуляции дана цитофизиологическая характеристика стромальных клеток, обладающих разными потенциями, и предложена гипотетическая модель гистогенетического ряда стромальных (мезенхимных) клеток.

9. Изучено влияние космического полета на кроветворную ткань млекопитающих (крыс). У взрослых животных обнаружено снижение уровня миелопоэза, что выражается в значительном сокращении численности родоначальных кроветворных клеток (КОЕ-С) в костном мозге и селезенке. Кратковременное пребывание в невесомости в плодном периоде развития (13-18 суток) не влияет существенно на возрастную динамику этих клеток в кроветворных органах в постнатальном развитии.

10. Исследовано влияние сверхмалых доз непрерывного у- облучения низкой интенсивности на родоначальные кроветворные и стромальные клетки костного мозга. Впервые обнаружен феномен стимулирующего действия у- облучения в малых дозах (мощность дозы - 0,15 сГр, суммарная доза— 1,5 сГр) на стромальные клетки, который выражается в повышении пролиферативной активности и увеличении численности КОЕ-Ф в костном мозге, а также в усилении регенераторных потенций стромы, что проявляется в увеличении размеров создаваемой de novo кроветворной территории. Ро-доначальные кроветворные клетки устойчивы к у- облучению в использованных дозах. Пролиферативная активность и содержание как более «молодых» (КОЕ-С-11), так и более «зрелых» (КОЕ-С-7) кроветворных клеток под влиянием облучения существенно не меняются.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (94-04-12796, 96-04-50351, 98-04-49133, 01-04-48950) и Фонда президента по поддержке ведущих научных школ (96-15-97806,00-15-97749, НШ-1629.2003.4).

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Polikarpova S.I., Domaratskaya E.I., Khrashchov N.G. Effects of inhibitors of DNA-dependent RNA synthesis on the transition of G0 cells into the cell cycle. In: Molecular mechanism and control of cell proliferation. 6-th meeting of the European study group for cell proliferation. Moscow, 1973, p. 43.

2. Домарацкая Е.И. Цитофизиология стволовых кроветворных клеток. В кн.: Морфология человека и животных. Антропология, т. 7: Соединительная ткань и кровь. М, ВИНИТИ АН СССР, 1977, стр. 111-131.

3. Домарацкая Е.И., Поликарпова С.И., Хрущов Н.Г. Синтез РНК в стволовых кроветворных клетках костного мозга. Онтогенез, т. 9, № 5, стр. 470-475.

4. Поликарпова С.И., Домарацкая Е.И. Сравнительный цитофизиологический анализ покоящихся и активно пролиферирующих клеток. В сб.: Цитологические механизмы гистогенезов. М, Наука, 1979, стр. 214-217.

5. Домарацкая Е.И., Поликарпова С.И. Действие актиномицина Д на стволовые кроветворные клетки. Онтогенез, 1981, т. 12, № 1, стр. 66-71.

6. Домарацкая Е.И., Поликарпова С.И. Реакция стволовых кроветворных клеток на ак-тиномицин Д в норме и при стимуляции кроветворения анемией. В сб.: Структурные и функциональные изменения в клетках мезенхимы. Тез. докл. Республ. кон-фер., Киев, 1982, ч. 2-я, стр. 74-76.

7. Домарацкая Е.И., Поликарпова С.И. Влияние актиномицина Д на дифференцировку и число стволовых кроветворных клеток. В сб.: Цитологические механизмы гистогенезов. Ташкент, Фан, 1983, стр. 56-57.

8. Домарацкая Е.И., Поликарпова С.И. Чувствительность стволовых кроветворных клеток анемичных животных к актиномицину Д. Онтогенез, 1983, т. 14, № 2, стр. 162-165.

9. Вацек А., Бартоничкова А., Ротковска Д., Ткадлечек Л., Виклицка III., Мичурина Т.В., Домарацкая Е.И., Серова Л.В. Влияние невесомости и гипергравитации на стволовые клетки кроветворения крыс и мышей. Тез. 5-го Ежегодн. симп. комиссии по гравитац. физиол. Междунар. союза физиол. наук, Москва, 1983 г., стр. 26.

10. Вацек А., Бартоничкова А., Ротковска Д., Мичурина Т.В., Домарацкая Е.И. и др. Пролиферативная активность стволовых клеток кроветворения у крыс на раннем этапе развития. Тез. докл. 17-го Совещания постоянно действ, рабочей группы соц-стран по космич. биол. и мед. программы «Интеркосмос», Брно, 1984 г., стр. 22.

11. Вацек А. и др. Ранние изменения стволовых клеток кроветворения у крыс, находившихся в период эмбриогенеза в невесомости на биоспутнике «Космос-1514». Матер, симп. 18-го Совещания постоянно действ, рабочей группы соцстран по космич. биологии и медицине программы «Интеркосмос», Гагра, 1985 г., стр. 111.

12. Vacek A., Serova L., Rotcovska D., Mitchurina Т., Domaratskaya E., et al. Changes in number haemopoietic stem cells (CFU-S) in bone marrow and spleen ofpregnant rats after

a short space flight onboard the Cosmos-1514 biosatellite. Folia biologica (Praha), 1985, v. 31, N5, p. 1361-1365.

13. Вацек А., Мичурина Т.В., Серова Л.В. Ротковска Д., Домарацкая Е.И. и др. Влияние полета на биоспутнике 1887 на клоногенные клетки костного мозга крыс. Матер. XXI симпоз. по космич. биол. и мед. «Интеркосмос», Баранов-Сандомирски, 1988, стр.84.

14. Vacek A. Rotcovska D., Bartonickova A., Serova L., Mitchurina Т., Domaratskaya E. Haemopoietic stem cell (CFU-S) measurements in pregnant rats flown on Cosmos-1514 biosatellite. The Physiologist, 1988, v. 31, N 1, suppl., p. 116-117.

15. Вацек А., Бартоничкова А., Ротковска Д., Мичурина Т.В., Домарацкая Е.И., Серова Л.В. Состояние крыс-самок, экспонированных в невесомости во время беременности. Стволовые клетки кроветворения. В сб.: Онтогенез млекопитающих в невесомости, М, Наука, 1988, стр. 44-45.

16. Вацек А., Бартоничкова А., Ротковска Д., Мичурина Т.В., Домарацкая Е.И., Серова Л.В. Структура и метаболизм органов животных на различных этапах постнатально-го онтогенеза. Стволовые клетки кроветворения. Там же, стр. 118-120.

17. Домарацкая Е.И., Прянишникова О.Д. Колониеобразующие клетки-предшественники (КОЕ-С) эмбриональной печени мыши. Цитология, 1984, т. 26, № 9, стр. 1067.

18. Домарацкая Е.И., Прянишникова О.Д., Старостин В.И., Соколова Е.А., Хрущов Н.Г. О гетерогенности селезеночных колоний, образуемых клоногенными кроветворными клетками эмбриональной печени. Докл. АН СССР, 1985, т. 281, № 5, стр. 12161218.

19. Домарацкая Е.И., Прянишникова О.Д., Старостин В.И., Зотин А.А. Характеристика КОЕ-С из эмбриональных и дефинитивных кроветворных органов мышей. В сб.: Кроветворная стволовая клетка в норме и при патологии. Томск, 1988, стр. 3-5.

20. Прянишникова О.Д., Домарацкая Е.И., Зотин А.А. Антигенная гетерогенность КОЕ-С печени зародыша мыши. В сб.; Закономерности индивидуального развития живых организмов. Матер.7-го Всесоюзн. совещ. эмбриологов. М, 1986, ч. 2-я, стр. 90.

21. Прянишникова О.Д., Домарацкая Е.И., Зотин А.А. Гетерогенность гемопоэтических клеток-предшественников (КОЕ-С) печени зародыша. Матер, научн. конфер. «Методологические основы изучения и преподавания морфогенеза тканей и органов в адаптивных процессах», Иркутск, 4-6 сент. 1987, стр. 155-156.

22. Домарацкая Е.И., Прянишникова О.Д. Гистологическое исследование селезеночных колоний в разные сроки после трансплантации кроветворных клеток эмбриональной печени. Онтогенез, 1988, т. 19, № 4, стр. 381-384.

23. Зотин А.А., Домарацкая Е.И., Прянишникова О.Д. О существовании пре-КОЕ-С в печени зародышей мыши. Онтогенез, 1988, т. 19, № 1, стр. 21-29.

24. Домарацкая Е.И. Иерархия ранних кроветворных клеток-предшественников. В кн.: Морфология человека и животных, т. 13: Стволовые клетки крови. М., ВИНИТИ АН СССР, 1988, стр. 12-48.

25. Домарацкая Е.И., Прянишникова О.Д., Старостин В.И. Действие 5-фторурацила на КОЕ-С дефинитивной и эмбриональной кроветворной ткани. Тез. докл. 1-й Республ. научн. конфер. «Управление морфогенезом тканей и органов в процессе адаптации», Иркутск, 1989. ч. 2-я, стр. 74-75.

26. Домарацкая Е.И., Прянишникова О.Д., Хрущов Н.Г. Клоногенные кроветворные клетки (КОЕ-С) в пре- и постнатальном онтогенезе мыши. Онтогенез, 1990, т. 21, № 1, стр. 81-88.

27. Domaratskaya E.I., Pryanishnikova O.D. The heterogeneity of CFU-S in pre- and postnatal ontogenesis of mice. In: Molecular factors of hemopoiesis and stem cell. Symposium Volga-Wilsede 1990, Moscow, p. 48.

28. Мичурина Т.В., Домарацкая Е.И., Никонова Т.А., Хрущов Н.Г. Влияние микрогравитации и других факторов космического полета на кровь и клоногенные кроветворные клетки иглистых тритонов. Космическая биология и медицина. Тез. докл. 10-й конфер., Москва, 1994, стр. 155-156.

29. Домарацкая Е.И., Старостин В.И., Прянишникова О.Д. Влияние 5-фторурацила на клоногенные кроветворные клетки (КОЕ-С) зародышей и взрослых мышей. Известия РАН, серия биологическая, 1995, № 4, стр. 398-402.

30. Старостин В.И., Домарацкая Е.И., Буеверова Э.И., Братина Е.В. Чувствительность к 5-фторурацилу кроветворной стромы костного мозга и селезенки. Известия РАН, серия биологическая, 1995, № 4, стр. 496-500.

31. Старостин В.И., Янушевская М.И., Домарацкая Е.И. Сходная способность к самоподдержанию клоногенных кроветворных клеток (КОЕ-С-11) из печени и периферической крови половозрелых мышей. Известия РАН, серия биологическая, 1997, № 1, стр.100-102.

32. Домарацкая Е.И., Старостин В.И., Прянишникова О.Д. Кроветворные клоногенные клетки (КОЕ-С) печени зародышей мыши при кратковременном культивировании in vivo. Известия РАН, серия биологическая, 1997, № 3, стр. 261-265.

33. Khrushchov N.G., Michurina T.V., Domaratskaya E.I., Nikonova T.M. Effects of microgravity and other spaceflight factors on hemopoiesis in vertebrates. NASA/RSA Science and Technical Advisory Council Research. 1996. P. 81.

34. Michurina T.V., Domaratskaya E.I., Vacek A., Khrushchov N.G. Specific effects of spaceflight factors on hemopoiesis in rats. Abstracts of XXXIII Int. Congr. Physiol. Sci. 1997. PO45.11.

35. Domaratskaya E.I., Starostin V.I. Dynamics of CFU-S restoration following dipin administration. Abstracts of Internat. - Europe- an A.I.R.R. Conference 1997 at Cologne, Germany. 1997, p. 9.

36. Starostin V.I., Domaratskaya E.I., Bueverova E.I., Bragina E.I. Effects of cytotoxic drugs, 5-fluorouracil and dipin on regeneration ofectopic bone marrow grafts. Ibid., p. 38.

37. Домарацкая Е.И., Мичурина Т.В., Никонова Т.М., Хрущов Н.Г. Использование метода трансплантации кроветворной ткани для анализа клоногенных кроветворных клеток тритонов, экспонированных на борту биоспутника «Бион-11». Тез. докл. конфер. «Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей». Москва, 1998, стр. 12-13.

38. Старостин В.И., Домарацкая Е.И. Дифференцировка мезенхимы печени зародышей в хрящевую, костную и ретикулярную ткани при эктопической трансплантации половозрелым реципиентам. Там же, стр. 30.

39. Старостин В.И., Домарацкая Е.И. Существование в печени зародышей полипотент-ных клеток-предшественников механоцитов, реализующих дифференцировку при эктопической трансплантации. В кн.: «Развитие научных исследований на медицинских факультетах университетов России», Матер. 1-й Всеросс. научн. конф., 2000.

40. Domaratskaya E.I., Michurina T.V., Bueverova E.I., Bragina E.V., Nikonova T.M., Starostin V.I., Khrushchov N.G. Studies on clonogenic hemopoietic cells of vertebrate in space: Problems and perspectives. Adv. Space Res., 2002, v. 30, N 4, p. 771-776.

41. Domaratskaya E.I., Michurina T.V., Bueverova E.I., Bragina E.V., Nikonova T.M., Sta-rostin V.I., Khrushchov N.G. Studies on clonogenic hemopoietic cells of vertebrate in space: Problems and perspectives. Abstracts of the 33d COSPAR Scientific Assembley. Warsaw, Poland, 2000. Fl.2-0015.

42. Старостин В.И., Домарацкая Е.И. Хондро- и остеогенез в эктопических трансплантатах печени зародышей мышей. Онтогенез, 2001, т. 32, № 2, стр. 114-117.

43. Домарацкая Е.И., Старостин В.И., Буторина Н.Н. Эмбриональные источники дефинитивных кроветворных стволовых клеток. Изв. РАН, серия биологическая. 2001, № 6, стр. 672-678.

44. Домарацкая Е.И., Старостин В.И., Цетлин В.В., Буторина Н.Н., Буеверова Э.И., Бра-гина Е.В., Хрущов Н.Г. Эффект непрерывного у- облучения в низких дозах на кло-

ногенные кроветворные (КОЕ-С) и стромальные (КОЕ-Ф) клетки костного мозга. Известия АН, серия биологическая, 2002, № 4, стр. 402-406.

45. Домарацкая Е.И., Старостин В.И., Цетлин В.В., Буторина Н.Н., Буеверова Э.И., Бра-гина Е.В., Хрущов Н.Г. Влияние непрерывного у- облучения в низких дозах на кроветворные и стромальные родоначальные клетки костного мозга. Матер. ХП конференции по космической биологии и авиакосм, медицине. Москва, 2002,стр. 136-137.

46. Домарацкая Е.И., Старостин В.И., Цетлин В.В., Буторина Н.Н., Буеверова Э.И., Бра-гина Е.В., Хрущов Н.Г. Действие низких доз непрерывного у- облучения на родоначальные кроветворные (КОЕ-С) и стромальные клетки костного мозга. III Международ, симпозиум «Механизмы действия сверхмалых доз». Москва, 2002, стр. 75.

47. Е. Domaratskaya, V. Starostin, V. Tsetlin, N. Butorina, E. Bueverova, E. Bragina, N. Khrushchov. Changes in compartments of hemopoietic and stromal marrow progenitor cells after continuous low dose gamma-irradiation. 34-th COSPAR Scientific Assembly. The Second World Congress. Huston, TX, USA, 2002. C0SPAR02-A-01753.

48. Старостин В.И., Домарацкая Е.И., Цетлин В.В., Буеверова Э.И., Хрущов Н.Г. Стволовые (родоначальные) клетки из костного мозга при действии непрерывного у- облучения в сверхмалых дозах. Тез. Докл. и сообщ., представленных на 1-й съезд Общества клеточной биологии (С.-Пт., 2003 г.) Цитология, 2003, т. 45, № 9, стр. 930.

49. Домарацкая Е.И., Старостин В.И., Цетлин В.В., Буеверова Э.И., Хрущов Н.Г. Эффект 10-суточного у- облучения в низких дозах на костномозговые клетки мыши. Радиационная биология. Радиоэкология, 2003, т.42, № 2, стр. 213-215.

50. Domaratskaya E.I., Tsetlin V.V., Bueverova E.I., Payushina O.I., Butorina N.N., Khrush-chov N.G., Starostin V.I. Gamma- and Neutron Continuous Irradiations at Low Doses Can Increase Stromal Progenitor Cell (CFU-F) Number in Mouse Bone Marrow. Abstracts of 35th COSPAR Scientific Assembly 2004, Paris, France, 2004, C0SPAR04-A-02665.

51. Domaratskaya E.I., Tsetlin V.V., Bueverova E I., Payushina O.I., Butorina N.N., Khrushchov N.G., Starostin V.I. Gamma- and neutron continuous irradiations at low doses can increase stromal progenitor cell (CFU-F) number in mouse bone marrow. Adv. Space Res., (in press).

52. Домарацкая Е.И., Буеверова Э.И., Паюшина О.Д., Старостин В.И. Повреждение ал-килирующим препаратом дипином кроветворных и стромальных клеток костного мозга. Изв. РАН, серия биологическая (в печати).

Издательство 00 0 "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 16.11.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 3,0. Тираж 100 экз. Заказ 1137. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова. 2-й учебный корпус, 627 к.

8 л ?

ЧГ

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Домарацкая, Елена Ивановна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. ПОЛУЧЕНИЕ ЗАРОДЫШЕЙ МЫШЕЙ.

3. РЕНТГЕНОВСКОЕ ОБЛУЧЕНИЕ.

4. ГАММА-ОБЛУЧЕНИЕ.

5. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КРОВЕТВОРНОЙ ТКАНИ И КРОВЕТВОРНЫЕ КОЛОНИИ В СЕЛЕЗЕНКЕ.

6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ САМООБНОВЛЕНИЯ КОЕ-С.

7. Н3-ТИМИДИНОВОЕ И Н3-УРИДИНОВОЕ «САМОУБИЙСТВО».

8. ОКСИМОЧЕВИНОВОЕ «САМОУБИЙСТВО».

9. ОБРАБОТКА АНТИБИОТИКАМИ.

10. ОБРАБОТКА 5-ФТОРУРАЦИЛОМ (5-ФУ).

11. ОБРАБОТКА ДИПИНОМ.

12. АНЕМИЯ.

13. ЭКТОПИЧЕСКАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ.

14. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА.

15. ПОЛУЧЕНИЕ КРОЛИЧЬЕЙ АНТИСЫВОРОТКИ К ГОЛОВНОМУ МОЗГУ МЫШИ (КАСММ) И ЭКСПОЗИЦИЯ С НЕЙ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК.

16. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КРОВЕТВОРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК.

2. ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ СТАТУС КРОВЕТВОРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК.

2.1. Исследование кроветворных стволовых клеток с помощью мультипараметрического анализа.

2.2. Содержание РНК.

2.3. Фенотипические различия покоящихся и пролиферирующих КСК.

2.4. Положение КСК в клеточном цикле и способность к репопуляции.

2.5. Исследование пролиферативной активности КСК с помощью цитотоксических препаратов.

2. 6. Сочетанный эффект цитотоксических препаратов и цитокинов.

2.7. Кинетика клеточного цикла КСК.

3. РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ, ОБРАЗУЮЩИЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КОЛОНИИ В СЕЛЕЗЕНКЕ (КОЕ-С).

3.1. Метод селезеночных колоний и его применение для исследования популяции родоначальных клеток.

3.2. Фенотипическая характеристика КОЕ-С.

3.3. Сравнительная характеристика КОЕ-С, образующих ранние и поздние селезеночные колонии.

3.3.1. Экспрессия антигенов клеточной поверхности.

3.3.2. Пролиферативный статус КОЕ-С и регуляция их пролиферации.

3.3.3. Чувствительность к цитотоксическим агентам.

3.4. Положение КОЕ-С в гистогенетическом ряду кроветворных клеток.

4. КРОВЕТВОРНОЕ МИКРООКРУЖЕНИЕ И ГЕМОПОЭЗ.

4.1. Характеристика кроветворного микроокружения и его регуляторной функции.

4.2. Мезенхимные (стромальные) стволовые клетки.

4.2.1. Фенотипическая и функциональная характеристика мезенхимных (стромальных) стволовых клеток.

4.2.2. КОЕ-Ф - стромальная стволовая клетка.

4.2.3. Эктопическая трансплантация костного мозга в виде фрагмента.

4.2.4. Гистогенетические отношения МСК и КСК.

4.2.5. МСК и мезенхимные сосудистые гладкомышечные клетки (МСГК).

5. КРОВЕТВОРНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ В ПРЕНАТАЛЬНОМ РАЗВИТИИ.

5.1. Происхождение КСК в эмбриональном развитии млекопитающих.

5.2. Печень как основной кроветворный орган в пренатальном онтогенезе.

5.2.1. Развитие кроветворения в печени.

5.2.2. Кроветворное микроокружение эмбриональной печени и миграция кроветворных клеток в кроветворные органы в пренатальном развитии.

5.2.3. Характеристика КСК из фетальной печени.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ (КОЕ-С) В ПРЕ - И ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ МЫШИ.

1.1. Характеристика популяции КОЕ-С печени зародыша мыши.

1.1.1. Гетерогенность селезеночных колоний, образуемых клоногенными кроветворными клетками эмбриональной печени.

1.1.2. Морфологическое типирование колоний через 7 и 11 суток после трансплантации кроветворных клеток эмбриональной печени.

1.1.3. Характеристика свойств различных категорий эмбриональных кроветворных клеток, образующих колонии в селезенке.

1.2. Структура популяции клоногенных кроветворных клеток в пре - и постнатальном онтогенезе.

1.2.1. КОЕ-С, образующие крупные селезеночные колонии.

1.2.2. КОЕ-С-эп, ответственные за образование мелких селезеночных колоний.

1.2.3. Сравнительная характеристика КОЕ-С из разных кроветворных источников и происхождение КОЕ-С в печени в постнатальном онтогенезе.

1.3. Родоначальные кроветворные и стромальные клетки печени зародыша при эктопической трансплантации.

1.3.1. Кроветворные клоногенные клетки (КОЕ-С) печени зародышей мыши при кратковременном культивировании in vivo.

1.3.2. Дифференцировочные потенции мезенхимы печени зародышей мышей.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ СИНТЕЗА РНК В РОДОНАЧАЛЬНЫХ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТКАХ КОСТНОГО МОЗГА.

2.1. Синтез РНК в популяции КОЕ-С костного мозга интактных животных.

2.1.1. Пролиферативная активность КОЕ-С.

2.1.2. Действие ингибиторов ДНК-зависимого синтеза РНК — антибиотиков сиби-ромицина и актиномицина Д на КОЕ-С.

2.1.3. Действие радиотоксических доз ЗН- уридина на КОЕ-С.

2.1.4. Синтез РНК в КОЕ-С на разных этапах выделения кроветворных клеток ех vivo.

2.1.5. Колониеобразующая активность КОЕ-С после экспозиции с актиномицином Д в дозе 0,04 мкг/мл/г, блокирующей синтез рибосомальной РНК.

2.1.6. Специфичность действия низких доз актиномицина Д.

2.2. Синтез рРНК в родоначальных кроветворных клетках (КОЕ-С) при экспериментально вызванной анемии.

3. АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ЭТАПОВ КРОВЕТВОРНОГО И СТРОМАЛЬНОГО РЯДОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ С ПОМОЩЬЮ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ.

3.1. Динамика содержание КОЕ-С в костном мозге и селезенке после однократного введения дипина.

3.2. Повреждение клеток стромы 5-фторурацилом и дипином и регенерация кроветворной ткани.

4. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА НА РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

4.1. Содержание КОЕ-С в кроветворных органах половозрелых животных.

4.2. Динамика возрастных изменений содержания КОЕ-С в кроветворных органах крыс, экспонированных на борту биоспутника в плодном периоде развития.

5. ВЛИЯНИЕ НЕПРЕРЫВНОГО ГАММА- ОБЛУЧЕНИЯ В НИЗКИХ ДОЗАХ НА РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ (КОЕ-С) И СТРОМАЛЬНЫЕ (КОЕ-Ф) КЛЕТКИ.

5.1. Содержание кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С) в костном мозге.

5.2. Содержание родоначальных стромальных клеток (КОЕ-Ф) в костном мозге.

5.3. Величина эктопических трансплантатов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспериментальное исследование клеточных механизмов кроветворения в онтогенезе"

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема клеточной дифференцировки является крайне актуальной для современной биологии и медицины. Интерес к ней специалистов разнообразного профиля (молекулярных биологов, генетиков, цитологов, биологов развития, и т.п.) резко возрос в связи с последними успехами в изучении эмбриональных и тканеспецифи-ческих стволовых клеток и не в последнюю очередь связан с поиском методов клеточной терапии для восстановления поврежденных органов и тканей.

Кроветворная ткань представляет собой уникальную и наиболее экспериментально продвинутую модель для изучения механизмов дифференцировки и регенерации. Для нее характерно многообразие клеточных форм, различающихся по степени зрелости и специфике обменных процессов, а также линий (ростков) дифференцировки (эритроидная, гра-нулоцитарная, моноцитарная, мегакариоцитарная, лимфоидная). Клеточную основу, обеспечивающую восстановление зрелых клеток крови и кроветворной ткани в целом после естественной гибели терминально дифференцированных клеток, в ходе патологических процессов или действия различных повреждающих агентов, составляют кроветворные стволовые клетки (КСК). Основные их свойства - способность к самоподцержанию и по-липотентность. Благодаря самоподцержанию КСК, возникнув в эмбриогенезе, не исчезают из кроветворной ткани и служат источником пополнения зрелых клеток на протяжении жизни организма. Полипотентность, т.е. способность давать потомство клеток, дифференцирующихся по многим направлениям, обеспечивает многообразие форменных элементов крови. Другое отличительное свойство кроветворной ткани — способность менять место локализации. Перемещение кроветворной ткани происходит в эмбриональном развитии, когда циркулирующие клетки репопулируют (заселяют) закладки кроветворных органов, а также в экспериментальных условиях и патологии при формировании эктопических очагов гемопоэза. Непременным условием нормально протекающего кроветворения является взаимодействие кроветворных стволовых и родоначальных клеток с клетками стромы, составляющими основу так называемого кроветворного микроокружения (КМО) (Старостин, 1986). Распознавание и удержание кроветворных клеток, их миграция осуществляется клетками КМО при участии молекул клеточной адгезии. Клетки КМО обеспечивают не только пространственную организацию кроветворных органов, но, контактируя с кроветворными клетками, выделяют и аккумулируют разнообразные факторы роста, регулирующие процессы пролиферации и дифференцировку КСК.

Исследования последнего десятилетия показали, что популяция КСК гетерогенна и включает два подотдела (компартмента) клеток, различающихся по фенотипу (антигенным характеристикам), продолжительности жизни, способности к дифференцировке и степени самообновления (Morrison, Weissman, 1994; Randal, Weissman, 1998; Kondo et al., 2003). Первый компартмент составляют КСК с неопределенно длительным самоподцер-жанием; второй — КСК, самоподдерживающиеся не более 3-6 недель. Мультипотентные (родоначальные) клетки входят в компартмент, который следует в диффероне за стволовым, и не обладают экстенсивным самоподдержанием. Часть мультипотентных клеток (общие миелоидные предшественники) дифференцируются в эритроидном, мегакариоци-тарном и миелоидном направлениях, способны образовывать в селезенке облученного животного клоны кроветворных клеток (колонии), различимые визуально, и представляют собой так называемые колониеобразующие единицы селезенки — КОЕ-С, давшие название методу их количественного учета in vivo. Хотя КОЕ-С не идентичны КСК, метод селезеночных колоний, используется для анализа КСК и в настоящее время. Его модификация, предложенная японскими исследователями, позволила продемонстрировать, что истинные КСК также способны формировать визуально различимые кроветворные клоны-колонии в селезенке в более поздние сроки по сравнению с мультипотентными предшественниками (Liang et al., 1999; Ikehara, 2000; Yang et al., 2002). Таким образом, метод селезеночных колоний остается адекватной моделью исследования клоногенных кроветворных клеток разной степени зрелости и в зависимости от срока наблюдения позволяет вести дифференцированный учет как родоначальных клеток, так и КСК.

Принципиальная организация кроветворного дифферона, как последовательного ряда клеточных форм со специфическими для каждой потенциями к дифференцировке и размножению, не вызывает сомнений. Однако к началу нашего исследования были неясны некоторые вопросы организации компартмента родоначальных клеток, свойства отдельных их категорий, их цитофизиологические особенности, а также изменения, которые происходят в популяции КОЕ-С в индивидуальном развитии.

Прижизненное наблюдение кроветворных клонов-колоний в селезенке, образованных костномозговыми КОЕ-С показало, что колониеобразование является динамическим процессом появления и исчезновения клонов, образуемых клоногенными клетками, различающимися по степени зрелости и времени формирования клона (Magli et al., 1982; Priestley, Wolf, 1985; Molineux et al., 1986; Wolf, Priestley, 1986). Было обнаружено, что у половозрелых животных популяция КОЕ-С костного мозга гетерогенна, и в зависимости от срока регистрации колоний можно анализировать категории более «молодых» и более «старых» КОЕ-С (Magli et al., 1982). К началу нашего исследования немногочисленные 8 факты указывали на то, что эмбриональная кроветворная ткань отличается по содержанию клоногенных клеток от костного мозга взрослых животных (Micklem, 1972, Gaidul et al., 1984). Однако данные о составе популяции эмбриональных КОЕ-С были весьма скудны и касались, в основном, печени зародышей одного срока развития (Metcalf et al., 1983; Johnson, Nicola, 1984; Gaidul et al., 1986). Наиболее полный труд Меткалфа и Мура, посвященный эмбриональным аспектам кроветворения, был создан, когда КОЕ-С рассматривались как однородная популяция клеток (Metcalf, Moore, 1971). Поэтому весьма актуальным представляется детальное исследование изменений в составе родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах в разные сроки пренатального онтогенеза, завершающиеся формированием дефинитивной кроветворной ткани. В постнатальном периоде, однако, в печени - органе, утратившим кроветворную функцию, Хрущовым с соавторами были описаны КОЕ-С и получены данные, что по некоторым характеристикам КОЕ-С печени половозрелых животных близки таковым из периферической крови (Хрущов и др., 1977; Старостин, 1986). Окончательный ответ на этот вопрос могло дать сравнительное исследование цитофизиологических характеристик индивидуальных КОЕ-С из различных кроветворных источников.

Костный мозг половозрелых животных является источником наряду с КСК и других стволовых клеток, в частности мезенхимных (стромальных), которые тестируются in vitro по образованию колоний фибробластоподобных клеток (КОЕ-Ф) и обладают, как и кроветворные клетки, определенной иерархической организацией (Owen, 1988). В прена-тальном и раннем постнатальном развитии стволовые клетки стромы выявлены в печени и селезенке, причем их численность, оцененная по числу формируемых ими колоний in vitro, соответствует гемопоэтической активности кроветворного органа (Van Den Heuvel et 9 al., 1987). Другой методический прием - эктопическая пересадка — позволяет вывить ме-зеихимные стволовые клетки функционально по их способности к дифференцировке в несколько типов стромальных клеток и формированию КМО, поддерживающего гемопоэз. Этот метод может быть с успехом использован для определения дифференцировочных потенций мезенхимных клеток, имеющихся в печени зародыша.

В рамках общей проблемы стволовых клеток и их роли в восстановлении кроветворной ткани значительный интерес представляет исследование, помимо кроветворных, также и стволовых клеток стромы, которые также являются мишенью для различного рода повреждающих факторов. Проблема резистентности (или напротив) чувствительности к тому или иному повреждающему фактору и репаративных потенций кроветворной и соединительной тканей, в целом, не теряет своей актуальности и является основополагающей не только для экспериментальной биологии, но и практической медицины. Так, например, успех терапии злокачественных заболеваний крови определяется правильным выбором лекарственного препарата, введением его в чувствительной фазе клеточного цикла, учетом избирательности его действия на те или иные категории клеток. Знание цитофи-зиологических особенностей КСК, структуры их популяции, антигенных характеристик, пролиферативного статуса, времени обновления и т.д. позволяет выбрать стратегию применения тех или иных цитостатических веществ таким образом, чтобы сочетать максимальную чувствительность к препарату дефектных клеток с максимальной сохранностью стволовых элементов. Не менее остро проблема КСК стоит при трансплантации кроветворных клеток реципиенту с иммунодефицитом, разрушенной (поврежденной) облучением или токсическими агентами кроветворной тканью, поскольку положительный эффект трансплантации зависит от качества трансплантируемого материала, т.е. от присутствия в инокулуме достаточного числа клоногенных клеток, обладающих потенциями стволовых. Именно донорские КСК, репопулируя кроветворные органы, обеспечивают восстановление гемопоэза. Исследование дифференцировочных и пролиферативных потенций кроветворных и стромальных СК после действия тех или иных неблагоприятных факторов позволяет оценить полноту репаративной регенерации кроветворной ткани.

Помимо практического применения цитотоксические препараты могут использоваться в качестве адекватного инструмента для изучения иерархической организации клеточных популяций. Экспериментальное удаление клеток определенной стадии дифферен-цировки позволяет не только определить их роль в восстановлении ткани, но и установить положение той или иной клеточной категории в диффероне. Учитывая специфику действия таких цитотоксических препаратов как 5-фторурацил и дипин, представляется весьма продуктивным использовать их для определения принадлежности исследуемых клеток к

10 той или иной стадии развития, их места в ряду кроветворной дифференцировки, а также участия в регенераторном процессе.

Одним из наиболее значимых для кроветворной системы и постоянных космических факторов, помимо микрогравитации, является ионизирующее космическое излучение. Однако его влияние на кроветворную и соединительную ткани до настоящего времени остается практически не изученным. Следует подчеркнуть, что исследование подобного рода выходит за рамки космической программы и имеет медико-биологический, в том числе и экологический, аспект, поскольку у- облучение малой интенсивности является одним из компонентов радиоактивного природного фона, под воздействием которого живые организмы находятся в наземных условиях (Гусаров, Иванов, 2001; Кузин, 2002).

Из сказанного следует, что для понимания закономерностей клеточной дифференцировки весьма актуально проведение многоплановых исследований кроветворной и со

11 единительной тканей, включающих характеристику составляющих их клеточных популяций, детализацию дифферона в пре - и постнатальном развитии, участие отдельных субпопуляций в регенераторном ответе на разнообразные внешние воздействия. Результаты подобных исследований позволят дать более точную картину гистогенеза кроветворной и соединительной тканей.

Цели и задачи исследования. Основной целью работы явилось исследование:

- структурной (иерархической) организации некоторых этапов кроветворного и стромаль-ного дифферонов в индивидуальном развитии млекопитающих (мышей);

- влияния воздействий различной химической и физической природы на родоначальные кроветворные и стромальные клетки.

Конкретными задачами работы были следующие:

1. Исследование состава популяции родоначальных кроветворных клеток - КОЕ-С - и свойств отдельных их категорий на разных сроках пре - и постнатального развития.

2. Характеристика уровня синтеза РНК в популяции КОЕ-С.

Научная новизна исследования. В ходе работы получены новые данные об иерархической организации кроветворного дифферона в пре - и постнатальном онтогенезе, цитофи-зиологических особенностях родоначальных кроветворных и стромальных клеток, об участии отдельных их категорий в репаративном процессе и реакции на различные воздействия.

1. Впервые в кроветворной ткани зародышей мыши и особей раннего постнатального периода выявлены клоногенные клетки, отсутствующие в дефинитивной кроветворной ткани и образующие в селезенке мелкие колонии недифференцированных клеток в поздние после трансплантации сроки. Охарактеризованы свойства новой категории кло-ногенных клеток, названных по месту их обнаружения - эмбриональной печени - КОЕ-С

12 эп. Показано, что КОЕ-С-эп находятся вне пролиферативного цикла, не самоподдерживаются, резистентны к 5-фторурацилу и кроличьей антисыворотке к головному мозгу мыши и на основании математического анализа их распределения могут быть причислены к стадии дифференцировки, предшествующей КОЕ-С - пре-КОЕ-С.

2. Получены данные об особенностях состава компартмента родоначальных клеток (КОЕ-С) в кроветворных органах (желточном мешке, печени, селезенке и костном мозге) на разных этапах онтогенеза. Они касаются соотношения разных типов клоногенных клеток (КОЕ-С-эп, КОЕ-С-7, КОЕ-С-11), пролиферативного статуса и т.д. и отражают функциональное состояние кроветворной системы, свойственное тому или иному этапу индивидуального развития особи.

4. Исследован синтез РНК в морфологически неидентифицируемых родоначальных клетках, как один из важнейших показателей их готовности к вступлению в митоз и коло-ниеобразованию. Установлено, что популяция КОЕ-С характеризуется интенсивным синтезом РНК и способностью к его быстрой активации, что свидетельствует о соответствия состояния пролиферативного покоя КОЕ-С Gi- периоду клеточного цикла. В стационарных условиях популяция КОЕ-С гетерогенна по содержанию рРНК и содержит клетки, как с относительно низким, так и высоким уровнем синтеза рРНК. Обнаружена стимуляция колониеобразования под влиянием актиномицина Д в дозах, подавляющих синтез рРНК.

5. Выявлено, что однократное введение алкилирующего препарата дипина вызывает длительное нарушение стационарного состояния кроветворной ткани, проявляющееся в периодических (синусоидальных) изменениях содержания кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11) в костном мозге и селезенке. Происходящие на протяжении жизни мыши периодические спады и подъемы численности КОЕ-С - транзиторной популяции клеток - дают основание заключить, что, во-первых, КСК, которые их генерируют, неоднородны по чувствительности к дипину, во-вторых, дифференцировка КСК осуществляется на основе клональной сукцессии

13 дипину и резистентные к 5-фторурацилу клетки обладают высокими репаративными потенциями и, очевидно, могут быть отнесены к стволовым клеткам стромы.

8. Впервые установлено снижение уровня миелопоэза у крыс после кратковременного космического полета, выражающееся в значительном сокращении численности кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С). Впервые также исследовано содержание КОЕ-С в кроветворных органах в пре- и раннем постнатальном развитии после экспозиции на борту биоспутника в плодном периоде.

В кроветворном ряду дифференцировки обнаружена ранее неописанная в литературе категория клоногенных кроветворных клеток, являющаяся стадией дифференцировки, предшествующей КОЕ-С, и характерная для кроветворной ткани пренатального и раннего постнатального периодов развития. Получены экспериментальные данные, объективно свидетельствующие в пользу концепции функционирования КСК на основе кло-нальной сукцессии. В стромальном диффероне выявлены категории клеток, различающихся по регенераторным потенциям и чувствительности к цитотоксическим агентам. Предложена гипотетическая модель стромального ряда дифференцировки.

Обнаружен феномен радиационного гормезиса, проявляющийся в увеличении про-лиферативной активности и численности родоначальных клеток стромы, а также усиление их способности к регенерации. Установление этого факта кардинально меняет сложившееся представление о радиации в сверхмалых дозах, как незначимом для кроветворной и

14 соединительной тканях воздействии, и диктует необходимость расширения исследований в данном направлении.

Результаты углубляют и детализируют представления об организации стволового отдела, отдельных этапах дифференцировки кроветворных и стромальных клеток, цито-физиологических особенностях родоначальных кроветворных и стромальных клеток. Представленные в работе данные способствуют пониманию ведущей роли стволовых и родоначальных (мультипотентных) клеток в восстановительных процессах, связанных с действием разнообразных факторов. В практических целях кроветворную и стромальную ткани можно использовать как тест-системы для регистрации влияния разнообразных факторов внешней среды на организм животных и человека. Оценка резистентности клеточных популяций, входящих в их состав, позволяет определить репаративные возможности кроветворной и стромальной тканей, предвидеть и в перспективе предотвращать последствия неблагоприятных воздействий.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих рабочих, Всесоюзных, Всероссийских и Международных конференциях, совещаниях и симпозиумах: 6-м Совещании европейской группы по изучению клеточной пролиферации (Москва, СССР, 1973), Республиканской конференции «Структурные и % функциональные изменения в клетках мезенхимы» (Киев, СССР, 1982), 5-м Ежегодном симпозиуме комиссии по гравитационной физиологии международного союза физиологических наук (Москва, СССР, 1983 г.), 17-м Совещании постоянно действующей рабочей группы соцстран по космической биологии и медицине программы «Интеркосмос» (Брно, Чехословакия, 1984 г.), 18-м Совещании постоянно действующей рабочей группы соцстран по космической биологии и медицине программы «Интеркосмос» (Гагра, СССР, 1985 г.), 7-м Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, СССР, 1986), Научной конференции «Методологические основы изучения и преподавания морфогенеза тканей и органов в адаптивных процессах» (Иркутск, СССР, 1987 г.), 1-й Республиканской научной конференции «Управление морфогенезом тканей и органов в процессе адаптации» (Иркутск, СССР, 1989 г.), Симпозиуме «Volga-Wilsede» (Москва, СССР, 1990), 33-м Международном конгрессе физиологических наук (Скт-Пб, Россия, 1997 г.), Международной конференции по регенерации (Кельн, Германия, 1997), Конференции «Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей» (Москва, Россия, 1998 г.), 33-й Ассамблее COSPAR (Варшава, Польша, 2000), III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), 34-й Ассамблее COSPAR (Хьюстон, США, 2002), 1-м съезде Общества клеточной биологии (С.-Пт., Россия, 2003 г.), 35-й Ассамблее COSPAR (Париж, Франция, 2004). Апробация диссертации проведена на семина

15 ре отдела цитологии и гистологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 19 января 2004 года.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Домарацкая, Елена Ивановна

выводы

1. Выявлены отличия кроветворной ткани эмбрионального и раннего постнаталь-ного развития лабораторных мышей.

• Впервые в кроветворной ткани (желточном мешке, печени, селезенке и костном мозге) ранних этапов индивидуального развития (в пренатальном периоде и в первую неделю после рождения) обнаружена особая категория клоногенных кроветворных клеток - КОЕ-С-эп и охарактеризованы их свойства. КОЕ-С-эп образуют небольшие клоны клеток бластного типа, которые регистрируются на поверхности селезенки в поздние сроки после трансплантации (на 11 сутки). КОЕ-С-эп находятся вне пролифера-тивного цикла, резистентны к оксимочевине, 5-фторурацилу (5-ФУ) и к антисыворотке к головному мозгу мыши, что характеризует их как менее зрелые, по сравнению КОЕ-С, клетки. Математический анализ распределения числа мелких селезеночных колоний подтвердил, что клетки, ответственные за их образование - КОЕ-С-эп - представляют собой стадию дифференцировки, предшествующую КОЕ-С - пре-КОЕ-С.

3. С помощью ретрансплантации индивидуальных селезеночных колоний показано, что КОЕ-С-11 из печени половозрелых животных по способности к самоподдержанию КОЕ-С-11 идентичны таковым из периферической крови, т.е. не являются исходно печеночными и, вероятнее всего, поступают в печень из циркуляции.

5. При изучении синтеза рРНК в популяции КОЕ-С костного мозга интактных мышей и после стимуляции кроветворения кровопотерей установлено, что а) в стационарных условиях среди КОЕ-С имеются клетки, как синтезирующие, так и не синтезирующие рРНК, б) в популяции КОЕ-С, вступивших под воздействием кровопотери в пролиферацию, число клеток, синтезирующих рРНК, возрастает. В популяции КОЕ-С, сохранившей, несмотря на кровопотерю, состояние покоя, актиномицин Д в дозах, ингибирующих синтез рРНК, стимулирует колониеобразование.

7. Изучено действие алкилирующего препарата дипина на родоначальные кроветворные клетки костного мозга и селезенки взрослых мышей. Установлено, что дипин вызывает длительное нарушение стационарного состояния кроветворной ткани, которое проявляется в периодических изменениях содержания КОЕ-С-11 и КОЕ-С-7 в костном мозге и селезенке. Происходящие на протяжении жизни мыши спады и подъемы численности КОЕ-С - транзиторной популяции клеток, дает основание заключить, что, во-первых, кроветворные стволовые клетки неоднородны по чувствительности к дипину, во-вторых, их дифференцировка осуществляется на основе клональной сукцессии.

8. Исследованы содержание КОЕ-Ф в костном мозге и регенераторные потенции костномозговой кроветворной стромы после воздействия 5-ФУ и дипина - препаратов, избирательно токсичных для клеток разной степени зрелости. На основании различий в чувствительности (устойчивости) стромальных клеток к 5-ФУ и дипину, а также в характере восстановления кроветворной ткани после удаления той или иной субпопуляции дана ци-тофизиологическая характеристика стромальных клеток, обладающих разными потенциями, и предложена гипотетическая модель гистогенетического ряда стромальных (мезенхимных) клеток.

10. Исследовано влияние сверхмалых доз непрерывного у- облучения низкой интенсивности на родоначальные кроветворные и стромальные клетки костного мозга. Впервые обнаружен феномен стимулирующего действия у- облучения в малых дозах (мощность дозы — 0,15 сГр, суммарная доза - 1,5 сГр) на стромальные клетки, который выражается в повышении пролиферативной активности и увеличении численности КОЕ-Ф в костном мозге, а также в усилении регенераторных потенций стромы, что проявляется в увеличении размеров создаваемой de novo кроветворной территории. Родоначальные кроветворные клетки устойчивы к у- облучению в использованных дозах. Пролиферативная активность и содержание как более «молодых» (КОЕ-С-11), так и более «зрелых» (КОЕ-С-7) кроветворных клеток под влиянием облучения существенно не меняются.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В проведенном экспериментальном исследовании получены новые сведения о ци-тофизиологических особенностях и структуре популяции родоначальных кроветворных клетках в индивидуальном развитии, а также реакции родоначальных кроветворных и стромальных клеток на воздействия химической и физической природы (антибиотики, ци-тотоксические препараты, микрогравитацию, радиацию).

1. Впервые проведено подробное исследование популяции родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах в пре- и постнатальном онтогенезе. В кроветворной ткани зародышей (желточном мешке, печени и селезенке) и животных первых дней жизни (селезенке и костном мозге), помимо известных категорий родоначальных кроветворных клеток - КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11, характерных и для кроветворных органов половозрелых мышей, выявлен новый, не описанный ранее тип клеток - КОЕ-С-эп. Эти клетки образуют в селезенке мелкие колонии бластного типа в поздние сроки после трансплантации. В селезенке и костном мозге половозрелых животных КОЕ-С-эл практически отсутствуют. По своим свойствам КОЕ-С-эп относятся к стадии дифференцировки, предшествующей КОЕ-С. В отличие от эмбриональных КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11, они не пролифери-руют, устойчивы к 5-ФУ и антисыворотке против головного мозге мыши. Для КОЕ-С-эп характерна высокая вариабельность числа образуемых ими колоний по сравнению с колониями, формируемыми КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11. С помощью методов математической статистики показано, что распределение числа мелких колоний, в отличие от крупных колоний, I не подчиняется закону Пуассона. Это позволило заключить, что крупные колонии образованы непосредственно КОЕ-С, тогда как мелкие колонии — за счет пролиферации клеток предыдущих стадий, т.е. пре-КОЕ-С. Расчеты показали, что концентрация пре-КОЕ-С в печени зародыша составляет 2,67 на 105 клеток, а среднее число КОЕ-С, образованных из одной пре-КОЕ-С - около 260.

Структура компартмента родоначальных клеток, т.е. относительное содержание КОЕ-С различных категорий в кроветворных органах, отражает функциональное состояние кроветворной ткани той или иной стадии развития и меняется в соответствии с потребностями организма. Так, например, в период интенсивного роста зародыша и, в связи с этим, большой потребности тканей и органов в кислороде, в популяции КОЕ-С-7 печени преобладают, ближайшие предшественники коммутированных к эритроидной дифференцировке БОЕ-Э и КОЕ-Э. Перемещение гемопоэза в костный мозг также сопровождается активацией эритропоэза. Когда формирование и рост кроветворной ткани (печени зародыша или костного мозга взрослого животного) заканчивается, в популяции возрастает относительное содержание более потентных КОЕ-С-11, а доля более дифференцированных КОЕ-С-7 уменьшается. Присутствие КОЕ-С-эп является отличительным свойством кроветворной ткани ранних этапов развития и, по всей видимости, КОЕ-С-эп представляют собой транзиторную популяцию клеток, исчезающую из кроветворных органов вскоре после рождения.

2. Изучены цитофизиологические особенности КОЕ-С - стадии дифференцировки, не идентифицируемой морфологически. Исследован синтез РНК, как одно из условий, необходимых для вступления в цикл покоящейся популяции КОЕ-С. Применив метод 3Н-уридинового «самоубийства» в сочетании с ингибиторами ДНК-зависимого синтеза РНК, мы оценили синтез РНК в КОЕ-С в зависимости от уровня пролиферативной активности и состояния кроветворения. Впервые КОЕ-С были охарактеризованы как неоднородная по уровню синтеза РНК (в том числе и рРНК) популяция. В ней содержатся клетки, интенсивно синтезирующие РНК, и клетки, способные быстро активировать этот синтез. Высокий уровень синтеза РНК и способность к быстрой его активации в покоящейся популяции КОЕ-С подтверждает представление о соответствии состояния покоя КОЕ-С Gi- периоду клеточного цикла.

Вступление КОЕ-С в пролиферацию под влиянием экспериментально вызванной анемии сопровождается активацией синтеза рРНК и, как следствие, значительным повышением доли КОЕ-С, чувствительных к актиномицину Д. В ряде случаев в кроветворной ткани, получившей сигнал к регенерации, КОЕ-С сохраняют состояние цитокинетическо-го покоя, но реагируют на актиномицин увеличением колониеобразования. Этот ответ на антибиотик-ингибитор синтеза РНК мы рассматриваем, как экспериментальную демонстрацию на примере КОЕ-С механизма, регулирующего численность клеток в популяции и защищающего ее от истощения при функциональном стрессе. Не исключено, что актиномицин Д выступает, как ингибитор синтеза РНК белков, блокирующих переход клетки из Gi в S-фазу (возможно, белка р53 и/или р21).

Установлено, что стромальные клетки, ответственные за регенерацию трансплантата в полном объеме, чрезвычайно чувствительны к дипину, но относительно резистентны к 5-ФУ. Высокий репаративный потенциал позволяет отнести их к категории наиболее молодых мезенхимных (вероятнее всего, стволовых) клеток. Напротив, стромальные клетки с ограниченными репаративными потенциями устойчивы к дипину; они, хотя и создают кроветворную территорию, но не способны восстановить ее размер до контрольного уровня. Среди популяции стромальных клеток обнаружены клетки, участвующие в построении кроветворной территории в ранние сроки после трансплантации. Они чувствительны к 5-ФУ, однако, их отсутствие не влияет на восстановление трансплантата. Полученные результаты послужили основой для построения гипотетической модели гистогене-тического ряда мезенхимных клеток.

Весьма продуктивным оказалось исследование с помощью дипина кроветворного дифферона. Однократное воздействие дипином вызывает длительное нарушение стационарного состояния кроветворной ткани, что выражается в периодических спадах-подъемах численности исследованных категорий КОЕ-С в костном мозге и селезенке. Характер изменений содержания КОЕ-С, клеток с ограниченным самоподдержанием, свидетельствует о чрезвычайно высокой токсичности дипина в отношении наиболее молодых и потентных клеток кроветворного ряда и отражает клоногенную активность последовательно выходящих в дифференцировку выживших стволовых кроветворных клеток. Мы расцениваем подобную динамику численности КОЕ-С, как экспериментальное подтверждение того, что функционирование кроветворного дифферона осуществляется на основе клональной сукцессии.

4. Впервые в модельных экспериментах на млекопитающих оценено влияние факторов космического полета на морфологически неидентифицируемые кроветворные родо-начальные клетки. Показано, что краткосрочный космический полет приводит к достоверному уменьшению содержания КОЕ-С в кроветворных органах. В костном мозге это вызвано действием специфических, тогда как в селезенке - неспецифических факторов полета. Вместе с тем, кратковременная экспозиция в невесомости в плодном периоде не влияет существенно на возрастную динамику содержания КОЕ-С в кроветворных органах, свойственную животным, пренатальное развитие которых прошло в наземных условиях.

5. Установлено, что непрерывное у- облучение в низких дозах (мощность дозы 0,15 сГр/сут, суммарная доза - 1,5 сГр) обладает стимулирующим действием на стромальные родоначальные клетки (КОЕ-Ф). Оно проявляется в усилении пролиферативной активности и увеличении численности КОЕ-Ф в костном мозге. Регенераторная способность стромы костного мозга, оцененная методом эктопической трансплантации по размеру вновь создаваемой кроветворной территории, существенно увеличивается под влиянием непрерывного гамма-излучения низкой мощности. Поскольку за рост эктопических трансплантатов, как было показано в наших экспериментах с цитотоксическими препаратами дипином и 5-ФУ, ответственны, очевидно, стволовые клетки стромы, с большой долей уверенности можно утверждать, что мы обнаружили эффект радиационного гормезиса именно для этой популяции клеток. В отличие от стромальных, кроветворные родоначальные клетки не чувствительны к использованным дозам радиации: изменения числа КОЕ-С в S-фазе и их содержания в костном мозге не происходит.

Безусловно, накопление фундаментальных знаний в области биологии стволовых и родоначальных клеток мезенхимного и кроветворного рядов дифференцировки может служить основой для понимания закономерностей функционирования стволовых клеток иной тканеспецифической природы. Обнаружение феномена радиационного гормезиса открывает новые перспективы в исследовании мезенхимных клеток, имеющих разнообразную тканевую локализацию. Активация клеток, способных к миграции и обладающих гистогенетической пластичностью, может представлять серьезную медико-биологическую проблему. Наша работа открывает перспективы для этого направления исследований, которое потребует более детального изучения с помощью привлечения адекватных модельных систем и методов анализа, специфичных для клеток того или иного гистогенетиче-ского ряда.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Домарацкая, Елена Ивановна, Москва

1. Ахмадиева А.Х., Тяжелова В.Г. Изменение способности КОЕ-С образовывать макроколонии при длительном хроническом облучении. Радиобиология, 1989, т. 29, №. 2, стр. 211-214.

2. Бондаренко В.А., Митрикас В.Г., Цетлин В.В. Радиационная обстановка на ОК "Мир" на фазе минимума 22-го цикла солнечной активности (1994-1996 гг.). Авиакосм. биология и эколог, медицина. 2000, т. 34, №1, стр. 21-25.

3. Бутомо Н.В., Иванов В.Б. Некоторые характеристики стволовых кроветворных клеток мышей в фазе повышенной радиорезистентности после сублетального облучения. Радиобиология, 1989, т. 29, № 2, стр. 266- 268.

4. Газарян Л.Г., Шуппе Н.Г., Кульминская А.С. Синтез РНК в присутствии малых доз актиномицина. ДАН СССР, 1965, т. 160, № 6, стр. 1411-1413.

5. Газенко О.Г., Ильин Е.А., Парфенов Г.П. Биологические исследования в космосе (некоторые итоги и перспективы). Изв. АН СССР (серия биол.), 1974, № 4, стр. 461475.

6. Газенко О.Г., Генин A.M., Ильин Е.А. и др. Адаптация к невесомости и ее физиологические механизмы (по материалам экспериментов с животными на биологических спутниках Земли). Изв. АН СССР, серия биол., 1980, № 1, стр. 5-18.

7. Гаузе Г.Г., Дудник Ю.В., Долгилевич С.М. Подавление синтеза нуклеиновых кислот противоопухолевым антибиотиком сибиромицином. Антибиотики, 1972, т. 17, № 5, стр. 413-419.

8. Гусаров И.И., Иванов С.И. О защитных эффектах действия малых доз ионизирующего излучения. АНРИ, 2001, № 4 (27), стр. 8-17.

9. Декстер Т.М. Кроветворные ростовые факторы: их биологическое действие и возможности клинического использования. Онтогенез, 1991, т. 22, № 4, стр. 341-364.

10. Домарацкая Е.И., Мичурина Т.В., Никонова Т.А., Хрущов Н.Г. Влияние факторов космического полета на периферическую кровь тритона Pleurodeles waltlii. Изв. Академии наук, серия биологическая, 1994, № 4, стр. 644-649.

11. Дризе Н.И., Гуревич О. А., Удалов Г.А., Чертков И.Л. Иерархия ранних кроветворных предшественников: пре-КОЕ-С и родоначальная кроветворная клетка. Онтогенез, 1987, т. 18, № 1, стр. 42-50.

12. Дурнова Г.Н., Капланский А.С., Португалов В.В. Влияние 22-суточногокосмического полета на лимфоидные органы крыс. Косм. биол. и авиакосм. мед., 1977, т. 11, № 2, стр. 53-57.

13. Епихина С.Ю, Лациник Н.В. Пролиферативная активность стромальных клеток-предшественников костного мозга, обладающих клоногенными свойствами. Бюлл. эксперим. биол., 1976, № 1, с.55.

14. Зотин А.А. Иммунологические маркеры в исследованиях гистогенеза кроветворной ткани. Успехи совр. биол., 1985, т. 100, №4, стр. 145-159.

15. Зотин А.А., Домарацкая Е.И., Прянишникова О.Д. О существовании пре-КОЕ-С в печени зародышей мыши. Онтогенез, 1988, т. 19, стр. 21.

16. Илюхин А.В., Бурковская Т.Е. Цитокинетическая оценка эритропоэза при длительных орбитальных полетах. Косм. биол. и авиакосм, мед., 1981, т. 6, стр. 42-46.

17. Кейлис-Борок И.В., Лациник Н.В., Епихина С.Ю., Фриденштейн А.Я. Динамика образования колоний фибробластов в монослойных культурах костного мозга по данным включения 3Н-тимидина. Цитология, 1971, т. 13, стр. 1402-1411.

18. Кузин A.M. Роль природного радиоактивного фона и вторичного биогенного излучения в явлениях жизни. М, «Наука», 2002, 79 стр.

19. Лациник Н.В., Епихина С.Ю. Адгезивные свойства клеток кроветворной и лимфоид-ной ткани, образующих колонии фибробластов в монослойных культурах. Бюлл. эксперим. биол., 1973, № 12, стр. 86-90.

20. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М., «МИР», 1969,645 стр.

21. Макеева В.Ф., Комолова Г.С., Серова Л.В. и др. Активность деполимераз ДНК в селезенке крыс после полета на спутнике «Космос-605». Космич. биол. авиакосм, мед., 1976, т. 17, №3, стр. 32-36.

22. Макеева В.Ф., Комолова Г.С., Егоров И.А. Биосинтез нуклеиновых кислот. В кн.: Онтогенез млекопитающих в невесомости. М. «Наука», 1988, стр. 51-53.

23. Малыжев В.А., Пелевина И.И., Афанасьев Г.Г. и др. Состояние иммунной системы при воздействии малых уровней ионизирующей радиации: исследования в 16-километровой зоне аварии на ЧАЭС. Радиац. биол. радиоэкол. 1993, т. 33, вып. 1(4), стр. 470-478.

24. Митрикас В.Г., Цетлин В.В. Проблемы обеспечения радиационного контроля на ОПС «МИР» в 22-м цикле солнечной активности. Косм, исслед. 2000, №2, стр. 113118.

25. Оганов В.С, Бакулин А.В., Ильин Е.А. и др. Структура и механические свойства костной ткани. В кн.: Онтогенез млекопитающих в невесомости. М., «Наука», 1988, стр.56-60.26.

Информация о работе

Домарацкая, Елена Ивановна
доктора биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.25

Диссертация

Экспериментальное исследование клеточных механизмов кроветворения в онтогенезе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы